[0001] 本发明专利主要涉及使用化学发光法检测微量细胞及组织中过氧化氢酶的活性。

[0002] 过氧化氢酶是人体内广泛存在的一种酶，是抗氧化系统的主要组成部分。在病理条件下，我们要无时无刻的防止氧化应激反应，包括癌症，糖尿病，白内障，动脉粥样硬化，缺血性再灌注损伤，关节炎，神经退行性疾病，营养缺乏，和老化这些疾病都会引起氧化应激反应。过氧化氢在铁或其他金属离子存在下，对细胞产生氧化毒性，而过氧化氢酶催化过氧化氢为氧和水。

[0003] 临床实验室越来越多得检测血浆和组织中的氧化应激生物标志物和抗氧化系统活性来检测体内氧化应激水平，作为疾病发展和预后的一个指标。而过氧化氢酶作为抗氧化系统中重要的一种酶，它的活性很大程度上代表了氧化应激的水平。

[0004] 关于过氧化氢酶活性的测定现主要分为以下几种：（1）化学滴定法
化学滴定法是一种最为经典的定量测定方法。过氧化氢酶的化学滴定法主要为高锰酸钾滴定法和碘量滴定法。根据国家标准GB/T 5522-85，使用高锰酸钾滴定法具有相对权威性，但是操作过程过于繁琐。碘量法的原理是利用H2O2能将KI中的I-氧化生成I2，以用淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成I2的量，在换算成H2O2的量。化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低,不适于大批量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器,适用性比较广泛。

[0005] （2）光度法紫外分光光度法原理是在紫外波长范围内,随着波长的缩短, H2O2对光的吸收逐渐增加在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。紫外分光光度法也可采用294nm处波长测定CAT的活性。

[0006] 目前市场上所应用的过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)也是利用该方法来计算CAT的活性。随着科学技术的不断提高,利用CAT能催化联苯胺或者四甲基联苯胺/双氧水体系而明显呈蓝色的现象,有科研工作者将其应用在CAT活性的检测上,目前已取得一定的进展。

[0007] 荧光分析法的原理是以喹啉为底物，经Fenton反应产生的羟自由基与喹啉发生芳香羟基化反应产生强荧光物质羟基喹啉，耦合过氧化氢酶催化分解H2O和O2。该方法操作较紫外分光光度计耗时段，灵敏度高。

[0008] 化学发光法作为一种高灵敏性检测过氧化氢-鲁米诺产生羟自由基的体系，在特定的pH和底物浓度下快速对过氧化氢酶的活性进行检测的方法，也已经收到了各方面的重视。

[0009] （3）电化学法电化学法主要采用极谱氧电极法，电流测定法，电泳-染色法。

[0010] 极谱氧电极法通过氧气记录仪检测过氧化氢分解为氧和水时的氧气生成量，测定过氧化氢酶的活性，方法简便灵敏性高，但是对过氧化氢酶提取的要求较高。

[0011] 电泳染色法利用电泳活性蛋白样品中过氧化氢酶的活性将过氧化氢分解为水和氧气，而没有被分解的过氧化氢则可使三价铁离子还原为二价铁离子的过程，通过凝胶背景鉴定过氧化氢酶活性。

[0012] （4）放射化学测定法与滴定法类似，使用同位素标记底物，随着酶反应的进行定量检测放射标记产物。

[0013] 大部分现存的过氧化氢酶检测方法大都存在检测方法复杂，检测所需样本量较大，样品提取过程复杂等情况，大部分应用广泛的方法主要为检测血液和土壤中微生物过氧化氢酶的活性。胡晓捷,等.流动注射化学发光法测定过氧化氢酶活性[J].浙江大学学报.2003.30.6.”使用鲁米诺过氧化氢反应检测过氧化氢酶活性，虽然灵敏度提高，但该方法主要应用范围在土壤中对微生物呼吸作用的研究，未在微量组织和细胞上进行测量。。

[0014] 本发明主要针对上述现有技术中检测CAT活力时，检测方法复杂，检测所需样本量较大，样品提取过程复杂等问题，提供一种可用于动物细胞和组织中过氧化物酶活力的检测方法。该方法操作简便，灵敏度高，可以用于检测动物细胞及组织在应激及干预后微量的过氧化物酶含量的变化。可检测到最低20U/ml。

[0015] 该方法可主要分为以下几个步骤：（1）化学发光法检测动物细胞核组织提取物中过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，该方法的步骤和条件如下：
步骤一、取新鲜或超低温保存的组织和细胞，加入10% NP-40，pH为8.0的磷酸盐缓冲液，使用组织匀浆器粗提；
步骤二、使用超声破碎仪200w，5s，5次；13000rpm/min，4℃条件下离心10min后取上清液即为含过氧化氢酶的混合酶液，保存于0~4℃备用；
步骤三、将含有过氧化氢酶的酶混合液与过氧化氢在室温下孵育3min；
步骤四、将步骤三中孵育过的过氧化氢反应液加入鲁米诺-过氧化氢-氯化钴反应液中，形成化学发光体系；
步骤五、将步骤四中的反应体系注入到化学发光仪中，对其化学发光值进行检测1min，以此间接检测CAT的活性。

[0016] （2）根据权利要求1所述的化学发光法检测动物细胞和组织提取物中过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，该方法的过氧化氢酶来源为动物细胞和组织提取物。

[0017] （3）根据权利要求1所述的化学发光法检测动物细胞即组织提取物中过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，该方法反应体系（即鲁米诺-过氧化氢-氯化钴）中的各溶液终浓度为：① 过氧化氢浓度为2.68mM
② 氯化钴的浓度为15uM
③ 鲁米诺的浓度为54uM
（4）根据权利要求1所述的化学发光法检测动物细胞及组织提取物中过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，该方法所使用的过氧化氢酶的范围为：20U/ML~100000U/ML（5）化学发光法测定组织样品中过氧化氢酶活性的应用
（6）化学发光法测定细胞样品中过氧化酶活性的应用
附图说明
附图1：不同浓度过氧化氢酶标准液(Sigma 产品编号：C1345)对过氧化氢的抑制作用附图2：不同加样量的Hep3B细胞裂解液中过氧化氢酶对过氧化氢的抑制作用（不同时间）
附图3：不同加样量的动物肝脏组织匀浆液中过氧化氢酶的活性（匀浆样品稀释500倍）附图4：缺氧细胞过氧化氢酶活性变化，以及加抗氧化剂干预后过氧化氢酶活性变化。

[0018] 附图5：正常与糖尿病大鼠肝脏过氧化氢酶活性变化，以及加抗氧化剂干预后过氧化氢酶活性变化。

[0019]  4、具体实施方式实施例1：化学发光法检测不同浓度的过氧化物酶
使用已知的不同浓度过氧化氢酶对相同浓度过氧化氢溶液孵育，再通过鲁米诺过氧化氢反应检测其对过氧化氢量的抑制作用。拟合成相关线性曲线公式为y = -117.83x + 
12191。过氧化氢酶浓度过高后由于底物含量不足的原因，其抑制率无法体现，故该方法检测灵敏，线性范围的过氧化氢酶活性是10~60u/ml。活性单位较高的样品可稀释后进行检测，附图1为相关线性曲线。

[0020] 实施例2：化学发光法检测细胞中过氧化氢酶活性样品：Hep3B细胞（人肝癌细胞）
细胞裂解：1% NP-40，pH8.0，100ul将细胞从培养皿上刮取收集，使用超声破碎仪200w，
5s，5次；13000rpm/min，4℃条件下离心10min后取上清液即为含过氧化氢酶的混合酶液检测过程：
①取不同量的细胞裂解液（样品加样量统一为30ul，以pH 8.0的PBS补足）与2.68Mm的过氧化氢在检测管中室温孵育3min
②依次在检测管中加入15uM氯化钴溶液，54uM鲁米诺后，于化学发光仪中检测90s附图2结果显示：虚线代表过氧化氢浓度为2.68mM时体系内鲁米诺-过氧化氢所产生的发光值，实线代表加入不同的细胞裂解液后鲁米诺-过氧化氢所产生的发光值，过氧化氢含量的减少使其发光值减少，代表了过氧化氢酶的活性。

[0021]实施例3：化学发光法检测肝组织中过氧化氢酶活性
样品：肝组织（SD系大鼠肝脏）
组织裂解：1% NP-40，Tris-HCL，100mM，EDTA.Na2 50Mm，MgCl2 50mM，KCL 0.150mM，PMSF 0.10mM，NaF 200mM，pH8.0；使用组织匀浆器粗提（每20g加入1ml NP-40裂解液），使用超声破碎仪200w，5s，5次；13000rpm/min，4℃条件下离心10min后取上清液即为含过氧化氢酶的混合酶液
检测过程：
①取不同量的组织裂解液（样品加样量统一为80ul，以pH 8.0的PBS补足）与2.68Mm的过氧化氢在检测管中室温孵育3min
②依次在检测管中加入15uM氯化钴溶液，54uM鲁米诺后，于化学发光仪中检测90s附图3结果显示：取90s检测终点的数值，并将其化学发光值代入标准曲线（y = -
117.83x + 12191）中，计算出过氧化氢酶的活性。图示可见过氧化氢酶活性随加样量上升而上升
实施例4：化学发光法检测不同细胞缺氧及缺氧干预后过氧化氢酶活性
样品：Hep3B细胞（黑人肝癌细胞）L02（人正常肝细胞）Huh7（日本人肝癌细胞）缺氧处理：使用Binder CB系列二氧化碳培养箱（三气培养箱）
缺氧后干预处理：线粒体靶向自由基捕获剂mitoPBN
细胞裂解：1% NP-40，pH8.0，100ul将细胞从培养皿上刮取收集，使用超声破碎仪200w，
5s，5次；13000rpm/min，4℃条件下离心10min后取上清液即为含过氧化氢酶的混合酶液检测过程：
①取不同量的细胞裂解液（样品加样量统一为30ul，以pH 8.0的PBS补足）与2.68Mm的过氧化氢在检测管中室温孵育3min
②依次在检测管中加入15uM氯化钴溶液，54uM鲁米诺后，于化学发光仪中检测90s附图4结果显示：可检测到不同细胞系之间过氧化氢酶活性的差别，以及在缺氧应激和干预情况下过氧化氢酶的变化状态。肝癌细胞（Huh7，Hep3B）缺氧及线粒体靶向抑制后行为一致，皆与正常肝细胞（L02）的行为相反
实施例5：化学发光法检测STZ诱导的糖尿病大鼠及抗氧化干预后肝脏组织的过氧化氢酶活性
样品：肝组织（SD系大鼠肝脏）
动物干预模型：
糖尿病大鼠为30mg/kg链尿佐菌素诱导（链尿佐菌素；sigma；S0130）
抗氧化剂1为线粒体靶向自由基清除剂mitoPBN，抗氧化剂2为葡萄籽提取物组织裂解：1% NP-40，Tris-HCL，100mM，EDTA.Na2 50Mm，MgCl2 50mM，KCL 0.150mM，PMSF 0.10mM，NaF 200mM，pH8.0；使用组织匀浆器粗提（每20g加入1ml NP-40裂解液），使用超声破碎仪200w，5s，5次；13000rpm/min，4℃条件下离心10min后取上清液即为含过氧化氢酶的混合酶液
检测过程：
②取不同量的组织裂解液（样品加样量统一为80ul，以pH 8.0的PBS补足）与2.68Mm的过氧化氢在检测管中室温孵育3min
②依次在检测管中加入15uM氯化钴溶液，54uM鲁米诺后，于化学发光仪中检测90s附图5结果显示：取90s检测终点的数值，并将其化学发光值代入标准曲线（y = -
117.83x + 12191）中，计算出过氧化氢酶的活性。图中显示可见糖尿病大鼠过氧化酶含量上升，而不同的抗氧化剂干预对其所产生的影响效果不同。。