一种高温碱性蛋白酶及其制备方法
| 热词 | 碱性蛋白酶 蛋白酶 蛋白 碱性 活力 重组 基因 高温 培养 ph | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; 权利转移; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN201310268933.4 | 申请日 | 2013-06-28 |
| 公开(公告)号 | CN103436511A | 公开(公告)日 | 2013-12-11 |
| 申请人 | 国家海洋局第三海洋研究所; | 申请人类型 | 科研院所 |
| 发明人 | 曾润颖; 徐辉; | 第一发明人 | 曾润颖 |
| 权利人 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 权利人类型 | 科研院所 |
| 当前权利人 | 自然资源部第三海洋研究所 | 当前权利人类型 | 科研院所 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：福建省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：福建省厦门市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：福建省厦门市思明区大学路178号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：361005 |
| 主IPC国际分类 | C12N9/52 | 所有IPC国际分类 | C12N9/52 ; C12N15/57 ; C12N15/70 |
| 专利引用数量 | 5 | 专利被引用数量 | 2 |
| 专利权利要求数量 | 9 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 厦门南强之路专利事务所 | 专利代理人 | 马应森; |
| 摘要 | 一种高温 碱 性蛋白酶及其制备方法，涉及蛋白酶。提供一种高温碱性蛋白酶Fppro1及制备方法，以及高温碱性蛋白酶基因Fppro1。高温碱性蛋白酶Fppro1的生产菌株为太平洋火色杆菌Flammeovirga Pacifica H2。制备时，克隆高温碱性蛋白酶基因Fppro1，将其插入表达载体，构建携带高温碱性蛋白酶基因Fppro1的重组表达载体；将高温碱性蛋白酶基因Fppro1的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取阳性克隆于培养基中培养；离心收集 发酵 后的大肠杆菌BL21细胞，重悬大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中，将裂解后的悬液离心，收集上清液，再与Ni－NTA Agarose混匀，纯化。 | ||
| 权利要求 | 1.一种高温碱性蛋白酶，其特征在于所述高温碱性蛋白酶命名为Fppro1，其生产菌株为太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2012229。 |
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| 说明书全文 | 一种高温碱性蛋白酶及其制备方法技术领域[0001] 本发明涉及蛋白酶，特别涉及一种高温碱性蛋白酶及其制备方法。 背景技术[0003] 碱性蛋白酶最早发现于猪胰脏中，1913年，Rohm首先将胰岛蛋白酶用于洗涤浸泡剂。1945年Jaag等在微生物中发现了碱性蛋白酶，使得该酶的研究与应用得到快速发展。1963年，诺和诺德公司（现诺维信公司）发现了高效的、适用于洗涤剂的碱性蛋白酶Alcalase。目前用于洗涤剂的碱性蛋白酶商品也越来越多，例如诺维信公司的Sabinase、Kannase、Durazyme等，花王公司的KAP，GENENCOR公司的Properase CT，NOVO公司的Savinase4.OT高温碱性蛋白酶等。目前，蛋白酶是工业用酶中应用得最多的一类酶，约占酶总量的60％，其中碱性蛋白酶就占了25％。除了洗涤剂以外，它还广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。它在商业中的应用前景，以及在科学研究中的重要作用使其得到研究人员和国内外公司的长期关注。 [0004] 最适作用温度在30～40℃的中温碱性蛋白酶和最适作用温度低于30℃的低温碱性蛋白酶在目前的研究报道和申请/授权的专利中最为常见。而最适作用温度在50℃以上的高温碱性蛋白酶的研究报道和申请/授权的专利较少。中国专利ＣＮ103013960A提供了一种高温碱性蛋白酶及其重组表达工程菌，其最适作用温度为60℃，最适pH值为12。酶在添加了各种稳定剂制成混合制剂后，在40℃下存放30天仍有95％的剩余酶活力，但没有提供原始酶的热稳定性特征。中国专利ZL200620111116.8提供一种耐高温金属蛋白酶基因工程菌及其获得方法，其最适作用温度为65℃，最适pH值为7.2，不属于碱性蛋白酶，没有提供热稳定性的特征。中国专利ZL200610069339.2提供一种高产耐高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌筛选及培养方法，其中所述的蛋白酶最适作用温度为55℃，在55℃条件下1h基本不失活，在60℃条件下1h仍有60％以上的活力，没有提供作用pH值的特征。 [0005] 高温碱性蛋白酶在高温下能发挥最大催化效率，具有较好的热稳定性，比中温和低温碱性蛋白酶具有更广泛的应用价值。在实际应用中，除了酶在不同温度、不同pH条件下的活力之外，酶的稳定性是评估应用潜力的关键指标之一，包括热稳定性、对有机溶剂的耐受性等。因此，碱性、热稳定的高温蛋白酶具有重要的开发应用价值。 发明内容[0006] 本发明旨在提供一种高温碱性蛋白酶基因Fppro1。 [0007] 本发明的第二个目的是提供一种由所述高温碱性蛋白酶基因Fppro1编码的重组高温碱性蛋白酶Fppro1。 [0008] 本发明的第三个目的是提供一种所述重组高温碱性蛋白酶Fppro1的制备方法。 [0009] 所述高温碱性蛋白酶命名为Fppro1，其生产菌株为太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2012229。 [0010] 所述高温碱性蛋白酶基因Fppro1的序列如下： [0011] 1 ATGAAAAATA CAATTTCAAA AATCTTATTG GGTGCTGCTA TTTTTACCCA TATAGGTTTT[0012] 61 ACTGCAAACG CACAAGAAGA ACCTCGTAAA GAAGCTCCAA AGAATTGGTT TAACCTTAGC[0013] 121 TATGAACAAG ATGGTGTTTA TGGAGTTGGA ACCGAAAGAG CATACGACGA GATTTTAAAA[0014] 181 AATAAAAAAT CAAAAAAAGT TGTGGTTGCA GTGATTGATA GCGGAATCGA TATCGATCAT[0015] 241 GAAGATCTTA AGGACGTTAT CTGGAAAAAT AAAAAGGAAG TTGCAGGTAA CGGTAAAGAT[0016] 301 GATGATAACA ACGGTTATGT TGATGACGTA AACGGTTGGA ACTTTATTGG TGGTGCTGAT[0017] 361 GGATCAATGG TGAATGAAGA AAACCTTGAG GTAGCTCGTC TTTATGGAAA ACTTAGTAAG[0018] 421 AAGTTTGAAG GAGTAGCTGA AGGTGATGTA GCAAAAGCGG ATAAAAAAGA ATACACTTTG[0019] 481 TGGTTAGAAG TGAAAAAAGC TTTCGAAGAA GGCTACACTA AAGCAGAAGA AAACTATACA[0020] 541 CGTTACTCTA CATATTTACA CCAATTTCAA AGAGGAAAAG CATTATTTAT GGCTTATTTC[0021] 601 GATTTAGAAG ATGAAGGTGA AATTGTTGGT GCGTTAGAAT CATTTGATTC TAGTGATGAA[0022] 661 GTACTGATGG GAATGAAGGA GATGACATTA GGTCTTCTTT CACAAGGTGT TACAGATGAT[0023] 721 CAGCTTCAAG AAGGTGTTGA CTACTTTGAA GGTCAGGTGA AATCCAATTA TAATTATGAG[0024] 781 TTAAATACTC GTGAAATTGT TGGTGATGAT ATCGACAATA AGTCTCAAAG AGATTATGGT[0025] 841 AATAATAAAG TAACAGGTCC TGATGCTCTT CATGGTACTC ATGTTGCTGG AATTATTGCT[0026] 901 GCCTCAAGAG GAAATGAAAT TGGTATGGAT GGTGTTGCCG ACAATGTAGA AATTATGGTT[0027] 961 GTCAGAACTG TACCTAACGG TGATGAACGT GATAAAGATG TTGCAAATTC AATTATTTAT[0028] 1021 GCTGTTGATA ATGGTGCACA AATCATTAAT ATGAGCTTTG GTAAACCTTA TTCGCCATAC[0029] 1081 AAAGGAACAG TAGATAAAGC TGTTAAGTAT GCTGAATCAA AAGGAGTACT TCTAGTACAT[0030] 1141 GCCGCTGGTA ATGACCATAA GAATACAGAT AAAGGAAATA ATTTCCCAAG AGATAAATAT[0031] 1201 GATTCTGGCA AAACTGCAAA GAATTGGATA GAGGTTGGAG CATCAACTTG GATGACTGAT[0032] 1261 GAGAAACTCC CTGCAACGTT TTCTAACTAT GCTAAGAAAA GTGTAGACTT ATTTGCTCCA[0033] 1321 GGTTTTGATA TTTACTCAAC AATTCCAGGT TCAGAATATA CTAATTTAAA TGGTACAAGT[0034] 1381 ATGGCATGTC CTGTTGTTGC AGGTTGTGCA GCTGTATTAA TGTCATATTA TCCGAACTTG[0035] 1441 TCAGCAGTAC AAGTGAAGAA GATTTTAATG AAAACAGTAA CTCCATTGAA GAGTAAGGAA[0036] 1501 GTATTGTTAC CTGGTTATAA TAGTTTAGAA GAAGGTGAAG AGCCTCAAAA AGTTAAATTT[0037] 1561 GGATCATTAT CAGTAAGTGG TGGTGTAGTT AACTTATATG AAGCTGTAAA ATACGCTGAA[0038] 1621 AAGATCTCAA AATAG [0039] 所述高温碱性蛋白酶基因Fppro1编码的高温碱性蛋白酶基因Fppro1的氨基酸序列如下： [0040] 1 MKNTISKILL GAAIFTHIGF TANAQEEPRK EAPKNWFNLS YEQDGVYGVG[0041] 51 TERAYDEILK NKKSKKVVVA VIDSGIDIDH EDLKDVIWKN KKEVAGNGKD[0042] 101 DDNNGYVDDV NGWNFIGGAD GSMVNEENLE VARLYGKLSK KFEGVAEGDV[0043] 151 AKADKKEYTL WLEVKKAFEE GYTKAEENYT RYSTYLHQFQ RGKALFMAYF[0044] 201 DLEDEGEIVG ALESFDSSDE VLMGMKEMTL GLLSQGVTDD QLQEGVDYFE[0045] 251 GQVKSNYNYE LNTREIVGDD IDNKSQRDYG NNKVTGPDAL HGTHVAGIIA[0046] 301 ASRGNEIGMD GVADNVEIMV VRTVPNGDER DKDVANSIIY AVDNGAQIIN[0047] 351 MSFGKPYSPY KGTVDKAVKY AESKGVLLVH AAGNDHKNTD KGNNFPRDKY[0048] 401 DSGKTAKNWI EVGASTWMTD EKLPATFSNY AKKSVDLFAP GFDIYSTIPG[0049] 451 SEYTNLNGTS MACPVVAGCA AVLMSYYPNL SAVQVKKILM KTVTPLKSKE[0050] 501 VLLPGYNSLE EGEEPQKVKF GSLSVSGGVV NLYEAVKYAE KISK [0051] 所述高温碱性蛋白酶基因Fppro1的制备方法包括以下步骤： [0052] 1）克隆高温碱性蛋白酶基因Fppro1； [0053] 2）将高温碱性蛋白酶基因Fppro1插入表达载体，构建携带所述高温碱性蛋白酶基因Fppro1的重组表达载体； [0054] 3）将重组表达载体转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中； [0056] 5）离心收集发酵后的E.coli BL21细胞，重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解； [0058] 在步骤2）中，所述表达载体可选自pCold I载体等。 [0059] 在步骤4）中，所述培养基可选自含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，所述发酵培养的条件可为：温度为37°C，摇床培养至A600=0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至终浓度为50μmol/L，在16°C条件下诱导12h。 [0060] 在步骤5）中，所述裂解缓冲液配方可为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/LNaH2PO4，pH8.0。 [0061] 在步骤6）中，所述离心的条件可为18000×g，离心20min，4℃。 [0062] 本发明具有以下突出优点： [0063] 1.所述高温碱性蛋白酶Fppro1具有新的基因序列，在NCBI数据库中没有相似的完整ORF基因序列。 [0064] 2.所述高温碱性蛋白酶Fppro1能够在E.coli中稳定表达，诱导后上清液中酶的活力可达38600U/mL。重组酶Fppro1的最适作用温度为60℃，在40～70℃范围内能保持60℃以上的活力，在50～65℃范围内保持约90％以上的活力，具有较宽的作用温度范围。 [0065] 3.重组酶Fppro1具有很好的热稳定性：在不加任何稳定剂的条件下，在30℃下至少保持24h不失活；在40℃下12h后酶活力剩余95%以上；50℃下保温1h后活力反而有略微的上升，2h后活力可保持85％，4h后保持约75％；60℃保温1h仍能保持约65％的活力。 [0066] 4.最适作用pH值为9，在pH8～10范围内能保持80％以上的活力；在pH7时能保持约65％的活力，具有较宽的pH作用范围。 [0068] 图1为高温碱性蛋白酶基因Fppro1重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。在图1中，M为蛋白Marker，泳道1为重组载体pColdI-Fppro1在E.coli BL21中的表达（未进行诱导），泳道2为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白Fppro1（～60kDa），泳道3为重组载体pColdI-Fppro1在E.coli BL21中的诱导表达。 [0069] 图2为重组酶Fppro1的最适作用温度。在图2中，横坐标为温度（℃），纵坐标为酶的相对活性（％）。 [0070] 图3为重组酶Fppro1的热稳定性。在图3中，横坐标为保温时间（h），纵坐标为酶的相对活力（％）；各标记为：■30℃；●40℃；◆50℃； [0071] 图4为重组酶Fppro1的最适作用pH值。在图4中，横坐标为pH值，纵坐标为酶的相对活性（％）。 具体实施方式[0072] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。 [0073] 用于制备所述高温碱性蛋白酶基因Fppro1的生产菌株为太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2。该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2012229。 [0074] 1.高温碱性蛋白酶Fppro1的制备 [0075] 1）Flammeovirga Pacifica H2基因组DNA的提取 [0076] 用接种环挑取-80℃保存的Flammeovirga Pacifica H2菌种，在LB培养基平板（一种细菌培养基，含有1%的胰蛋白胨，1%的氯化钠，0.5%的酵母提取物，1.5%的琼胶糖）上划线分离单菌落。划线后的平板置37℃培养过夜，挑取一个单菌落接种到5mL的LB培养液管中（一种细菌培养基，含有1%的胰蛋白胨，1%的氯化钠，0.5%的酵母提取物），37℃摇动培养过夜。取1.5mL的培养物2000r/min离心2min；再加入500μL6mol/L盐酸胍，轻轻混匀，直至裂解清亮（可酌量增加盐酸胍用量）；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，15000r/min离心4～5min，将上层水相移入新管；缓慢加入等体积异丙醇，混匀后放置5min；15000r/min离心15s，去除上清，沉淀用70%乙醇洗两次，吹干；加入200μL TE溶液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/LEDTA)，2μL RNase A，37℃酶解1h；加入120μL异丙醇， 2μL1mol/L MgCl2，轻轻混匀，静置10min；15000r/min离心5min，去除上清，沉淀用70%乙醇洗两次，吹干；沉淀溶解于50μL TE溶液。 [0077] 2）高温碱性蛋白酶基因Fppro1的PCR扩增和序列分析 [0078] 根据Flammeovirga Pacifica H2菌株基因组测序后的基因注释结果，设计引物F：5’-CGGGATCC ATG AAA AAT ACA ATT TCA-3’（划线为BamH I酶切位点）（SEQIDNo.3）和R：5’-ACAAGCTT CTA TTT TGA GAT CTT TTC-3’（划线为Hind III酶切位点）(SEQIDNo.4)。 以提取的Flammeovirga Pacifica H2基因组DNA为模板，用引物F和R扩增全长的Fppro1基因。PCR反应条件为：在50μL的反应体系中含有，100ng模板，400nmo/L引物F，400nmo/ 2+ L引物R，200μmo/L dNTP，2.5mmo/L Mg ，5U Primer Star HSTaq酶（购自TaKaRa公司）， 5mL10×PCR反应缓冲液；反应条件：94℃5min预变性；98℃10s、55℃45s、72℃2min循环 30圈；72℃延伸10min。所得PCR产物纯化后用BamH I和Hind III进行酶切，并与同样用BamH I和Hind III酶切后的pColdI载体连接，得到pColdI-Fppro1表达载体，采用CaCl2法将pColdI-Fppro1转化到E.coli DH5α中，挑取阳性克隆进行测序。 [0079] 3）重组酶Fppro1的表达和纯化 [0080] 将步骤2）中获得的序列正确的重组表达载体pColdI-Fppro1转化E.coli BL21，选取阳性克隆在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C摇培至A600＝0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至终浓度100μmol/L，16°C诱导12h后将菌液收集至200mL的离心管中，5000×g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的裂解缓冲液（裂解缓冲液配方为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，pH8.0）中，超声波处理至菌液成半透明，18000×g离心20min，上清与预先用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀，4°C结合1小时，纯化过程按照纯化试剂盒（购自Qiagen公司）说明进行。纯化的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为60kDa，纯度达95％以上（结果参见图1） [0081] 2.重组酶Fppro1基本酶学性质分析的实施例 [0082] 1）蛋白酶活力的测定方法 [0083] 以酪蛋白为底物，采用福林酚法测定。所用溶液包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42.4g/L），三氯乙酸（65.4g/L），梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0g/L）。反应过程如下：在1.5mL小离心管中加入800μL酪蛋白溶液，放入已调至反应温度的水浴锅中预热5min，加入200μL酶液，缓慢摇匀，放回水浴锅中反应10min。加入270μL三氯乙酸，混合均匀以终止反应。 [0084] 另外设置一对照管，在对照管中加入800μL酪蛋白溶液，放入已调至反应温度的水浴锅中预热5min，加入200μL水，缓慢摇匀，放回水浴锅中反应10min。加入270μL三氯乙酸和用100℃处理5min后的酶液，混合均匀。 [0085] 将实验管和对照管以13,000r/min离心2min，分别取1mL上清液于相应编号的空试管中，之后再依次加入5mL碳酸钠溶液和0.5mL福林使用溶液，混匀后于40°C水浴显色20min。测定各管的OD680值。并从已做好的Tyr标准曲线中读出反应中产生的Tyr的量，计算酶活。 [0086] 蛋白酶活力单位（U）的定义为每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。 [0087] 2）重组酶Fppro1的最适作用温度分析 [0088] 采用Tris-HCl缓冲液（pH8.0），将经纯化后的重组酶Fppro1在不同温度下进行酶促反应并测定酶活。以最高酶活为100％，计算相对酶活，绘制温度－相对酶活曲线（见图2）。结果表明本发明中的重组酶Fppro1的最适作用温度为60℃，且具有较宽的作用温度范围：在40℃～70℃范围内能保持60℃以上的活力；在50℃～65℃范围内保持约90％以上的活力；在30℃时可保持约40％的活力。 [0089] 3）重组酶Fppro1的热稳定性分析 [0090] 采用Tris-HCl缓冲液（pH8.0），将经纯化后的重组酶Fppro1在不同温度下保温一定时间，然后进行酶促反应，测定剩余蛋白酶的活力，检测在最适反应温度下反应。绘制保温时间－相对活力曲线（见图3）。结果表明本发明中的重组酶Fppro1具有非常好的热稳定性。在30℃下保温24h后活力没有丧失；在40℃下12h后酶活力剩余95%以上；50℃下保温1h后活力反而有略微的上升，2h后活力可保持85％，4h后保持约75％，8h后可保持约50％的活力；60℃保温1h酶活剩余约65％，2h后酶活剩余40％。 [0091] 在Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中添加0.1mmol/L Ca2+，再按相同步骤检测重组酶2+ Fppro1在60℃下的稳定性（图3），结果表明Ca 显著提高重组酶Fppro1的热稳定性，在 2+ 60℃保温1h后酶活剩余76％，保温2h后剩余酶活为65%，均比没有Ca 时的65％和40％高。 [0092] 目前为止的研究报道和申请/授权的专利中，如果不添加稳定剂，初始蛋白酶在40℃以上的热稳定性都较差，最好的一种是中国专利ZL200610069339.2所提供的由苏云金芽孢杆菌所产的耐高温蛋白酶，其最适作用温度为55℃，在55℃条件下1h基本不失活，在60℃条件下1h剩余活力为60％。因此本发明中的重组酶Fppro1具有非常突出的热稳定性。 [0093] 4）重组酶Fppro1的最适作用pH分析 [0094] 经纯化的重组酶Fppro1在不同pH值的缓冲液中，于60℃下进行反应以测定其最适pH，以最高酶活为100％，计算相对酶活，绘制pH－相对酶活曲线（见图4）。结果表明本发明中的重组酶Fppro1的最适作用pH值为9，在pH8～10范围内能保持80％以上的活力；在pH7时能保持约65％的活力，具有较宽的pH作用范围。 |
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