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一种脱氢酶及其制备方法

热词 醛脱氢酶 脱氢酶 脱氢 重组 基因 纯化 表达 培养 序列 载体
专利类型 发明公开 法律事件 公开; 实质审查; 申请权转移; 授权; 未缴年费;
专利有效性 失效专利 当前状态 权利终止
申请号 CN201310026030.5 申请日 2013-01-23
公开(公告)号 CN103114056A 公开(公告)日 2013-05-22
申请人 国家海洋局第三海洋研究所; 申请人类型 科研院所
发明人 曾润颖; 刘洋; 丁志新; 第一发明人 曾润颖
权利人 国家海洋局第三海洋研究所 权利人类型 科研院所
当前权利人 国家海洋局第三海洋研究所,中国大洋矿产资源研究开发协会 当前权利人类型 科研院所
省份 当前专利权人所在省份:福建省 城市 当前专利权人所在城市:福建省厦门市
具体地址 当前专利权人所在详细地址:福建省厦门市思明区大学路178号 邮编 当前专利权人邮编:361005
主IPC国际分类 C12N1/20 所有IPC国际分类 C12N1/20C12N15/53C12N9/02C12N15/70C12R1/01
专利引用数量 2 专利被引用数量 4
专利权利要求数量 10 专利文献类型 A
专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 专利代理人 马应森;
摘要 一种 醛 脱氢酶及其制备方法,涉及一种醛脱氢酶。所述醛脱氢酶Fwaldh的生产菌株为太平洋火色杆菌H2。克隆所述醛脱氢酶基因fwaldh;将所述醛脱氢酶基因fwaldh插入表达载体,构建携带所述醛脱氢酶基因fwaldh的重组表达载体;将所述重组表达载体转化到E.coli BL21中;选取转化后E.coli BL21中的阳性克隆于培养基中进行 发酵 培养;离心收集发酵后的E.coli BL21细胞,重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解;将裂解后的悬液进行离心,收集上清液;将上清液与Ni-NTA Agarose混匀,按照纯化 试剂 盒 说明书 进行纯化,得所述醛脱氢酶Fwaldh。
权利要求

1.脱氢酶Fwaldh的生产菌株为太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2,该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:
M2012229。
2.醛脱氢酶基因fwaldh的序列(SEQ ID No.1)如下:
SEQ ID No.1的信息:
1)名称:Flammeovirga Pacifica醛脱氢酶基因;
2)分子类型:DNA;
3)序列特征:
A)长度:1440bp;
B)类型:核酸;
C)链性:双链;
D)拓扑结构:线性。
3.醛脱氢酶基因fwaldh编码的醛脱氢酶Fwaldh的基酸序列(SEQ ID No.2)如下:
SEQ ID No.2的信息:
1)名称:Flammeovirga Pacifica醛脱氢酶;
2)分子类型:蛋白质
3)序列特征:
A)长度:479aa;
B)类型:氨基酸。
4.醛脱氢酶Fwaldh的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)克隆所述醛脱氢酶基因fwaldh;
2)将所述醛脱氢酶基因fwaldh插入表达载体,构建携带所述醛脱氢酶基因fwaldh的重组表达载体;
3)将所述重组表达载体转化到E.coli BL21中;
4)选取转化后E.coli BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养;
5)离心收集发酵后的E.coli BL21细胞,重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解;
6)将步骤5)中裂解后的悬液进行离心,收集上清液;
7)将上清液与Ni-NTA Agarose混匀,按照纯化试剂说明书进行纯化,即得所述醛脱氢酶Fwaldh。
5.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法,其特征在于在步骤2)中,所述表达载体为pET-His载体。
6.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法,其特征在于在步骤4)中,所述培养基为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
7.如权利要求6所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法,其特征在于所述培养基,当诱导时补加100μg/mL氨苄青霉素。
8.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法,其特征在于在步骤4)中,所述发酵条件为:37℃下振荡培养至A600=0.6,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为
50μg/mL,并添加0.2%葡萄糖,而后于28℃诱导至A600=0.8,再改至在16℃诱导至A600=
1.2。
9.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法,其特征在于在步骤5)中,所述裂解缓冲液配方为:0.3mol/L NaCl,10mmol/L咪唑,50mmol/L NaH2PO4,pH 8.0。
10.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法,其特征在于在步骤6)中,所述离心的条件为18000g,离心20min。

说明书全文

一种脱氢酶及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种醛脱氢酶,尤其是涉及来源于深海的太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2的新型醛脱氢酶基因,及其重组表达所得到的醛脱氢酶及其制备方法。

背景技术

[0002] 醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)(EC1.21.3)是能够催化内源和外源醛化的NAD(P)+依赖型的酶超家族。迄今为止,已经从人类发现了19种醛脱氢酶基因,这些基因参与内生和外生乙醛的代谢(Crabb,Matsumoto,Chang,&You,2004)。研究者发现,醛脱氢酶在植物生物抗环境压(干旱,高盐)方面也具有重要的作用(Huang et al.,2008;Li,Gao,Yu,Wang,&An,2003),Yang 等 (Yang,Zhang,Wang,Wood,&Zhang,2012) 将齿肋赤藓中的醛脱氢酶基因转化到大肠杆菌中,转化菌得到重组菌也具有抗干旱和高盐的能力。Tomohisa kato等(Kato,Miyanaga,Kanaya,&Morikawa,2010)从Geobacillus thermoleovorans B23得到了能够降解长链链烷的醛脱氢酶基因,Jyumpei Kokayashi等从Rhodobacter sphaeroides可以在低浓度醋酸盐中提高氢产量的醛脱氢酶。在专利方面,不同来源的醛脱氢酶基因已经被克隆、测序和表达,主要应用于利用L-山梨糖生产维生素C或2-KGA,解酒的保健品等。

发明内容

[0003] 本发明的第一目的是提供一种新型醛脱氢酶基因fwaldh。
[0004] 本发明的第二目的是提供一种由所述醛脱氢酶基因fwaldh编码的醛脱氢酶Fwaldh。
[0005] 本发明的第三目的是提供醛脱氢酶Fwaldh的制备方法。
[0006] 所述醛脱氢酶Fwaldh的生产菌株为太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2,该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M2012229,地址为武汉,武汉大学,邮编430072。
[0007] 所述新型醛脱氢酶基因fwaldh的序列(SEQ ID No.1)如下:
[0008]
[0009]
[0010] SEQ ID No.1的信息:
[0011] 1)名称:Flammeovirga Pacifica醛脱氢酶基因;
[0012] 2)分子类型:DNA;
[0013] 3)序列特征:
[0014] A)长度:1440bp;
[0015] B)类型:核酸;
[0016] C)链性:双链;
[0017] D)拓扑结构:线性。
[0018] 所述醛脱氢酶基因fwaldh编码的醛脱氢酶Fwaldh的基酸序列(SEQ ID No.2)如下:
[0019]
[0020] SEQ ID No.2的信息:
[0021] 1)名称:Flammeovirga Pacifica醛脱氢酶;
[0022] 2)分子类型:蛋白质
[0023] 3)序列特征:
[0024] A)长度:479aa;
[0025] B)类型:氨基酸。
[0026] 所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法包括以下步骤:
[0027] 1)克隆所述醛脱氢酶基因fwaldh;
[0028] 2)将所述醛脱氢酶基因fwaldh插入表达载体,构建携带所述醛脱氢酶基因fwaldh的重组表达载体;
[0029] 3)将所述重组表达载体转化到E.coli BL21中;
[0030] 4)选取转化后E.coli BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养;
[0031] 5)离心收集发酵后的E.coli BL21细胞,重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解;
[0032] 6)将步骤5)中裂解后的悬液进行离心,收集上清液;
[0033] 7)将上清液与Ni-NTA Agarose混匀,按照纯化试剂说明书进行纯化,即得所述醛脱氢酶Fwaldh。
[0034] 在步骤2)中,所述表达载体可为pET-His载体。
[0035] 在步骤4)中,所述培养基可为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基,诱导时补加100μg/mL氨苄青霉素,所述发酵条件可为:37℃下振荡培养至A600=0.6,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为50μg/mL,并添加0.2%葡萄糖,而后于28℃诱导至A600=0.8,再改至在16℃诱导至A600=1.2。
[0036] 在步骤5)中,所述裂解缓冲液配方可为:0.3mol/L NaCl,10mmol/L咪唑,50mmol/L NaH2PO4,pH8.0。
[0037] 在步骤6)中,所述离心的条件可为18000g,离心20min。
[0038] 本发明中新型醛脱氢酶的突出特点表现为:
[0039] 1.新型的基因序列,在NCBI数据库中没有相似的完整ORF基因序列。
[0040] 2.新型醛脱氢酶Fwaldh能够在大肠杆菌中稳定表达,制备方法步骤4)中加入葡萄糖可大幅降低本地表达并能够维持质粒在大肠杆菌中的稳定性。诱导时补加100μg/mL氨苄青霉素补充由表达分泌的β-内酰胺酶对氨苄青霉素的降解,从而防止重组质粒的丢失。
[0041] 3.纯化后的醛脱氢酶活力很高,在低温条件下稳定性强,在性条件下具有高活性,可以克服现有醛脱氢酶活力低下,易发生自发氧化,酶分离纯化过程繁琐等不足。
[0042] 4.重组表达的醛脱氢酶可高效催化甲醛、乙醛降解为甲酸,乙酸,可广泛应用于环境中醛类污染物的降解以及细胞乙醛代谢解毒等。
[0043] 本发明从深海微生物Flammeovirga Pacifica基因组中克隆得到新型醛脱氢酶基因fwaldh,转化到大肠杆菌中进行稳定大量的外源表达,得到一种醛脱氢酶Fwaldh。该酶能高效催化乙醛、丙醛、丁醛和正戊醛分别生成乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸,在食品、化工领域,细胞乙醛代谢及生物抗环境压力中发挥着重要的作用。本发明提供一种醛脱氢酶基因克隆表达、蛋白快速纯化的方法。附图说明
[0044] 图1为醛脱氢酶Fwaldh重组表达纯化的SDS-PAGE图谱,M为蛋白Marker,1为BL21pET-his空载,2为重组载体pET-Fwaldh在菌株BL21中的表达(未进行诱导),3为重组载体pET-Fwaldh在菌株BL21中的诱导表达。
[0045] 图2为重组醛脱氢酶Fwaldh纯化后的SDS-PAGE,M为蛋白Marker,1为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白Fwaldh(55kDa)。
[0046] 图3为醛脱氢酶Fwaldh重组蛋白的最适pH。在图3中,横坐标为pH值,纵坐标为酶活力(%)。
[0047] 图4为醛脱氢酶Fwaldh重组蛋白最适反应温度。在图4中,横坐标为温度(℃),纵坐标为酶活性(%)。

具体实施方式

[0048] 下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的实验条件,或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。
[0049] 1.Flammeovirga Pacifica基因组DNA的提取
[0050] 用接种环挑取-80℃保存的Flammeovirga sp.wpaga001菌种,在2216E培养基平板(一种细菌培养基,含有1%的胰蛋白胨,0.2%的酵母提取物,1.5%琼脂粉,100mL)上划线分离单菌落。划线后的平板置37℃培养过夜,挑取单菌落接种到5mL的2216E培养液管中(一种细菌培养基,含有1%的胰蛋白胨,0.2%的酵母提取物,海水100mL),37℃摇动培养过夜,收集菌,6000g离心8min后弃去上清,沉淀重新悬浮于567μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0),加30μL 10%SDS,摇匀,再加入3μL蛋白酶K(20mg/mL),轻轻混匀,37℃水浴1h。加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀,再加入80μL CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)/NaCl,轻柔混匀,65℃水浴10min。用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提两次,15000g离心10min,上清小心转移至另一个离心管中。用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提一次,15000g离心10min,用异丙醇沉淀DNA,再用乙醇洗涤两次,沉淀溶于重蒸水中,-20℃保存。
[0051] 2.醛脱氢酶fwaldh基因的PCR扩增和序列分析
[0052] 根据Flammeovirga Pacifica菌株基因组测序后的基因注释结果,设计醛脱氢酶的引物F:5’-GCGCGGATCCATGGAAAATGTAATTATTACTTC-3’(划线为BamHI酶切位点)(SEQ ID No.3),R:5’-CCGGAAGCTAGCTCAAAGCTTTGTAATG-3’(划线为NheI酶切位点)(SEQ ID No.4)。以提取的Flammeovirga Pacifica基因组DNA为模板,用引物F和R扩增全长的fwaldh基因。PCR反应条件为:在50μL的反应体系中含有,100ng模板,400nmo/L引物F,2+
400nmo/L引物R,200μmo/L dNTP,2.5mmo/L Mg ,5U Primer Star HSTaq酶(购自TaKaRa公司),5μL10×PCR反应缓冲液;反应条件:94℃5min;98℃10s、52℃45s、72℃1.5min(30cycles);72℃10min;4℃保存。纯化后的PCR产物进行酶切,与同种酶酶切后的pET-His载体连接,CaCl2法转化到大肠杆菌Top10中,挑阳性克隆进行测序。
[0053] 根据得到的核苷酸序列推导出醛脱氢酶Fwaldh的氨基酸序列,共479个氨基酸残基,其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。
[0054] SEQ ID No.3的信息:
[0055] 1)分子类型:寡核苷酸;
[0056] 2)序列特征:
[0057] A)长度:33bp;
[0058] B)类型:核酸;
[0059] C)链性:单链;
[0060] D)拓扑结构:线性。
[0061] SEQ ID No.4的信息:
[0062] 1)分子类型:寡核苷酸;
[0063] 2)序列特征:
[0064] A)长度:28bp;
[0065] B)类型:核酸;
[0066] C)链性:单链;
[0067] D)拓扑结构:线性。
[0068] 3.重组Fwaldh的表达和纯化
[0069] 克隆醛脱氢酶基因fwaldh,将其插入表达载体pET-His中,构建携带醛脱氢酶基因fwaldh的重组表达载体。将携带fwaldh基因的重组表达载体pET-Fwaldh转化E.coli BL21,选取阳性克隆在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇培至A600=0.6时,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度50μmol/L,诱导前补加100μg/mL氨苄青霉素,28℃诱导至A600=0.8,16℃诱导至A600=1.2,后将菌液收集至200mL的离心管中,5000g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的裂解缓冲液(裂解缓冲液配方为:
0.3mol/L NaCl,10mmol/L 咪唑,50mmol/L NaH2PO4,pH8.0)中,声波处理至菌液成半透明,18000g离心20min,上清与预先用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀,4℃结合1h,纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳分析,其分子量约为55kDa,纯度达95%以上(结果参见图1)。
[0070] 4.重组醛脱氢酶Fwaldh的酶学性质
[0071] 4.1重组醛脱氢酶Fwaldh酶活力的测定方法如下:
[0072] 稀释纯化后的Fwaldh(150μg/mL),2mM辅酶NAD+,2mM乙醛,丙醛,丁醛或正戊醛,1mM DTT(二硫苏糖醇),50mmol/L Glycine-NaOH缓冲液(pH9.0),反应总体积1mL。35℃下反应15min后,340nm处测吸光值。酶活性定义为每分钟产生1μmol NADH的酶量为1U。通过酶活性检测,以乙醛,丙醛,丁醛,正戊醛为底物计算得到重组醛脱氢酶Fwaldh的Vmax分别为1.8U/mg/min,2.0U/mg/min,5.3U/mg/min,5.2U/mg/min。
[0073] 4.2重组醛脱氢酶Fwaldh的最适pH测定方法如下:
[0074] 经纯化的重组Fwaldh以丁醛为底物在不同的pH值下进行酶促反应以测定其最适pH。重组Fwaldh在不同pH的缓冲液中35℃温度下进行重组Fwadh酶活力测定。结果(图2)表明,重组Fwaldh的最适pH为9.0。
[0075] 4.3重组醛脱氢酶Fwaldh的最适温度及温度稳定性测定方法如下:
[0076] 重组Fwaldh的最适温度的测定为以丁醛为底物在Glycine-NaOH缓冲液(pH9.0)体系及不同温度下进行酶促反应。热稳定性测定为重组Fwaldh在50℃,55℃,60℃下分别处理不同时间,再在35℃下进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果(图3)表明,其最适温度为35℃,该酶在低温下具有较高的活性,20℃具有63%的活性,10℃仍具有30%的活性,该酶在室温放置一周后,仍具有60%的酶活力。酶的热稳定性试验表明,重组Fwaldh为热不稳定性酶,50℃处理1h后,剩余酶活还有10%左右;60℃,70℃处理1h后,酶活基本为0%。
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