[0001] 本发明属于环境工程技术领域，具体涉及一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法。

[0002] 活性炭由于具有良好的吸附性能，化学性能稳定，可耐强酸及强碱，能经受水浸、高温、比水还轻，是多孔性的疏水性吸附剂，故已广泛用于去除饮用水中的臭味、色度、天然及人工合成有机物。活性炭上附着的以微生物及其胞外多聚物为主体的生物膜是水体中有害物质生物降解的主要部分。因此鉴定分析活性炭表面微生物群落结构和分布对于明确饮用水深度处理中活性炭生物降解机制以及微生物泄露导致的健康风险具有重要意义。

[0003] 传统的微生物检测是建立在微生物的分离培养基础上的，检测周期长， 操作复杂，特异性不强。同时环境中的大量微生物无法实现人工培养，或者在培养过程中由于生存环境的改变而改变原有的群落结构，因此仅靠现有的微生物培养技术不能全面地反映所在环境的微生物多样性。分子生物学技术于是成为了研究生物活性炭微生物群落的主要手段。然而，由于处理饮用水的生物活性炭上的生物量相对少，并且和载体颗粒结合紧密，所以菌体很难直接从活性炭上洗脱下来。另一方面，活性炭上吸附的腐殖酸在自然条件下不易发生生物降解，又表现出极性、氧化还原性、络合与吸附等多重理化性质，在经典的DNA 提取过程中与粘粒及金属离子等相互作用而将微生物裹挟其中，阻止SDS 等变性剂的渗透并抑制溶菌酶及蛋白酶K 等的活性，影响裂解缓冲液对微生物的裂解。同时经碱性裂解液处理后溶出的黄腐酸与棕腐酸既能氧化为醌，又能还原为酚，会导致部分DNA 随氧化的苯酚进入有机相而丧失。

[0004] 即使采用透析、离子交换、密度梯度离心、层析和电泳等不同方法对核酸粗提物进行进一步纯化，仍有一些理化性质与核酸相近的腐殖酸组分与之共存，从而影响到核酸的定量及后续的PCR 扩增等技术过程。然而，传统的DNA提取和市售DNA提取试剂盒都不能有效解决上述问题，因此如何在裂解细胞前采用去除腐植酸的预处理和有效微生物洗脱方法就成为从生物活性炭上获得产量大质量高的DNA的关键。

[0005] 本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法，以获得产量和纯度均达到适用于下游分子生物学操作的DNA片段。

[0006] 一种生物活性炭上微生物DNA提取预处理方法，该方法包括步骤如下：

[0007] （1）生物活性炭的脱腐：将生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比1 : 10 混4
合，旋涡2min 后，在50℃下反应10min，再旋涡2min 后，在转速为1.0×10 rpm下离心
5min；其中脱腐缓冲液为NaOH浓度为200mM、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）浓度为2.0wt%的混合溶液；

[0008] （2）超声洗脱：取上述离心后的活性炭，溶于灭菌的去离子水中，旋涡2min后常温下水浴20min，进行1min超声处理，然后取超声后悬浊液，进行DNA提取纯化。

[0009] 本发明的有益效果为：以浓度为200mM的NaOH和浓度为2.0wt%的PVP作为脱腐缓冲液脱腐能力高，减少了腐殖酸对微生物核酸提取的不利影响；超声洗脱处理活性炭克服了饮用水生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难；本发明克服了传统直接提取DNA方法的缺陷，且操作简单，能够从生物活性炭上获得高产量且高纯度的DNA。附图说明

[0010] 图1为实施例1中9种不同方法提取总DNA电泳图；

[0011] 其中各标号条带分别为：1-λ-Hind III digest DNA Marker，2-4分别为NaOH+PVP混合溶液脱腐并超声处理1、2、5min,5-7分别为NaOH溶液脱腐并超声处理1、2、5min，8-10分别为不脱腐并超声处理1、2、5min。

[0012] 图2为实施例2中9种不同方法提取获得的总的DNA的PCR电泳图；

[0013] 其中各标号条带分别为：1-M100 bp DNA Ladder，2-4分别为NaOH+PVP混合溶液脱腐并超声处理1、2、5min,5-7分别为NaOH溶液脱腐并超声处理1、2、5min，8-10分别为不脱腐并超声处理1、2、5min。

[0014] 下面将通过具体实施例和附图对本发明做进一步说明。

[0015] 实施例1：比较不同脱腐缓冲液脱腐效果

[0016] 生物活性炭样品取自北京市某自来水厂。脱腐缓冲液分别采用不同浓度单一组分的浓度分别为50mM、100mM、200mM的NaCl溶液，浓度分别为50mM、100mM、200mM的Tris-HCl溶液，浓度分别为50mM、100mM、200mM的NaOH溶液和不同浓度的NaOH+PVP混合溶液，浓度组合分别为：50mM+0.5wt%、100mM+1.0wt%、200mM+2.0wt%对活性炭中腐殖酸进行去除。脱腐效果如表1所示。

[0017] 单一组分的脱腐缓冲液中，如NaCl溶液和Tris-HCl在脱腐处理后上清颜色没有变化，说明二者均不具备明显的脱腐能力，NaOH溶液浓度大于100mM 时上清淡棕色，说明100mM 以上的NaOH溶液表现出一定的脱腐效果；将不同配位剂加以组合其脱腐效果可得到提高，在本实例中组合后的脱腐缓冲液的脱腐能力大大提高，特别是经200mM的NaOH和
2.0%的PVP的脱腐缓冲液处理后上清变为深棕色，说明选择以200mM的NaOH和2.0%的PVP作为脱腐缓冲液可以有效去除腐殖酸。

[0018] 表1不同脱腐缓冲液的脱腐效果

[0019]

[0020] 实施例2：提取DNA的产量与质量

[0021] 生物活性炭样品取自北京市某自来水厂。取生物活性炭样品9份，分别采取以下处理：（1）不脱腐殖酸，直接溶于灭菌的去离子水中，旋涡2min后常温下水浴20min，超声处理时间分别为1min、2min、5min；（2）以浓度为100mM 的NaOH溶液为脱腐缓冲液脱腐，超声处理时间分别为1min、2min、5min；（3）以浓度为200mM 的NaOH、2.0wt%的PVP为脱腐缓冲液脱腐，超声处理时间分别为1min、2min、5min处理，然后提取DNA。各取所获DNA 4ul，用1.0%加入了GoldViwe染色剂的琼脂糖凝胶进行电泳，并以Bio-Rad凝胶成像系统对所得核酸的电泳图像进行分析，如图1所示。经浓度为100mM的NaOH溶液和200mMNaOH、2.0wt%的PVP脱腐缓冲液处理后的样品均得到了长度在20Kb以上的总DNA条带，没有经过脱腐处理的样品则没有检测到相应的总DNA条带，而且经双组份脱腐缓冲液处理后样品的DNA条带明显高于只经NaOH脱腐处理的样品。

[0022] DNA提取结果如表2所示，所获得的总DNA A260/A280值均在1.6以上，说明总DNA中没有蛋白污染，个别样品的在1.8以上说明有部分RNA污染，可加入少许RNA酶去除。经浓度为200mM NaOH、2.0wt%的PVP混合溶液脱腐处理后的样品总DNA的A260/A230值明显高于经NaOH溶液脱腐处理的样品，故NaOH+ PVP的脱腐缓冲液脱腐效果明显好于NaOH溶液。经浓度为200mM的 NaOH、2.0wt%的PVP混合溶液脱腐处理后的样品总DNA量明显高于以100mM的NaOH溶液脱腐，而其中超声1min处理所获DNA量最大。说明使用本发明提供的DNA提取方法可以获得产量大，质量高的DNA。

[0023] 表2 DNA提取量

[0024]

[0025] 实施例3：总DNA的PCR扩增检测

[0026] 将实施例2中各方法所获的DNA的PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图像如图2。可以看出，经NaOH+PVP混合溶液脱腐缓冲液处理后的样品的总DNA 为模板均可以扩增出目标条带，相较以NaOH溶液为脱腐缓冲液得到的PCR 产物最多。说明使用本发明提供的方法所获DNA可以满足下游分子生物学操作。