| 热词 | dna 活性炭 生物 naoh 活性 核酸 提取 pvp 洗脱 微生物 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 撤回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 撤回 |
| 申请号 | CN201210187547.8 | 申请日 | 2012-06-07 |
| 公开(公告)号 | CN102719425A | 公开(公告)日 | 2012-10-10 |
| 申请人 | 清华大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 刘文君; 张明露; 王占朝; 余祎; | 第一发明人 | 刘文君 |
| 权利人 | 清华大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 清华大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：北京市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：北京市海淀区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：北京市海淀区100084信箱82分箱清华大学专利办公室 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 |
| 专利引用数量 | 2 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 3 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京鸿元知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 邸更岩; |
| 摘要 | 一种饮用 水 处理 中 活性炭 生物 膜 的核酸提取方法，涉及 环境工程 饮用水 深度处理生物活性炭工艺单元中 微生物 学技术领域。该方法首先采用脱腐缓冲液对活性炭颗粒进行脱腐处理，再进行水浴和超声洗脱。具体方法为采用NaOH溶液或NaOH与聚乙烯吡咯烷 酮 混合溶液作为脱腐缓冲液对活性炭进行脱腐处理， 超 声波 洗脱和化学裂解后提取生物活性炭上的微生物核酸。所获总DNA长度在20Kb以上，完全满足PCR分析的要求。解决了生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难问题，减少了 腐殖酸 对微生物核酸提取的不利影响，微生物细胞充分裂解。该方法操作简便，DNA产量大，纯度高。 | ||
| 权利要求 | 1.一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法技术领域背景技术[0002] 活性炭由于具有良好的吸附性能和化学性能稳定，可耐强酸及强碱，能经受水浸和高温，比水轻，是多孔的疏水性吸附剂，故已广泛用于去除饮用水中的臭味、色度、天然及人工合成有机物。活性炭上附着的以微生物及其胞外多聚物为主体的生物膜是水体中有害物质生物降解的主要部分。因此鉴定分析活性炭表面微生物群落结构和分布对于明确饮用水深度处理中活性炭生物降解机制以及微生物泄露导致的健康风险具有重要意义。 [0003] 传统的微生物检测是建立在微生物分离培养基础上的，检测周期长，操作复杂，特异性不强。同时环境中的大量微生物无法实现人工培养，或者在培养过程中群落结构由于生存环境的改变而改变，因此仅靠现有的微生物培养技术不能全面地反映所在环境的微生物多样性。分子生物学技术于是成为了研究生物活性炭微生物群落的主要手段。 [0004] 利用十六烷基三甲基溴化铵（Cetyilrt methyl ammonium bromide，CTAB）在一定盐度下与核酸形成沉淀提取DNA是常用的方法。CTAB是一种阳离子去污剂，能够与核酸形成复合物。该复合物在高盐（>0.7mol/L）浓度下可溶，并稳定存在，当盐浓度降低到0.1～0.15mol/L时，CTAB-核酸复合物溶解度降低形成沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。然后通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀使核酸分离出来，最后洗脱掉CTAB即可。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）是一种阴离子表面活性剂，可以和生物膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用而破坏膜结构，同时还会破坏酶的空间结构，影响酶的催化活性。提取DNA时，常利用高浓度的SDS（0.5%以上）在较高温度下（55～65℃）裂解细胞并钝化核酸酶以减小DNA的降解。 [0005] 然而，由于处理饮用水的生物活性炭上的生物量相对少，并且和载体颗粒结合紧密，所以菌体很难直接从活性炭上洗脱下来。另一方面，活性炭上吸附的腐殖酸在自然条件下不易发生生物降解，又表现出极性、氧化还原性、络合与吸附等多重理化性质，在经典的DNA提取过程中与粘粒及金属离子等相互作用而将微生物裹挟其中，阻止SDS等变性剂的渗透并抑制溶菌酶及蛋白酶K等的活性，影响裂解缓冲液对微生物的裂解。同时经碱性裂解液处理后溶出的黄腐酸与棕腐酸既能氧化为醌，又能还原为酚，会导致部分DNA随氧化的苯酚进入有机相而丧失。即使采用透析、离子交换、密度梯度离心、层析和电泳等不同方法对核酸粗提物进行进一步纯化，仍有一些理化性质与核酸相近的腐殖酸组分与之共存，从而影响到核酸的定量及后续的PCR扩增等技术过程。传统的DNA提取方法和市售DNA提取试剂盒都不能有效解决上述问题，因此如何在裂解细胞前采用去除腐植酸的预处理和有效微生物洗脱方法就成为从生物活性炭上获得高产量且高纯度的DNA的关键。 发明内容[0006] 本发明目的在于解决现有技术中由于生物活性炭上生物量少且与载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难问题，减少腐殖酸对微生物核酸提取不利影响，通过脱腐处理和超声波洗脱方法，提供一种有效提取生物活性炭上微生物核酸的方法，以获得产量和纯度均达到适用于下游分子生物学操作的DNA片段。 [0007] 本发明的技术方案如下： [0008] 一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤： [0009] 1）生物活性炭的脱腐处理：将生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比为1∶8～1∶15混合，脱腐缓冲液采用NaOH溶液，或采用NaOH与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液，混合后旋涡振荡，再离心处理，得到脱腐后的生物活性炭； [0010] 2）生物活性炭的超声洗脱处理：将脱腐后的活性炭溶于去离子水中，旋涡振荡及常温水浴后进行超声洗脱处理； [0011] 3）将步骤2）中超声后的悬浊液离心弃上清液进行纯化提取，即获得DNA； [0012] 上述技术方案中，步骤1）中脱腐缓冲液NaOH的摩尔浓度为50mmol/L～200mmol/L，所述混合溶液中聚乙烯吡咯烷酮与NaOH质量比为5∶1至10∶1；步骤1）中离心速度为1000rpm以上，离心时间至少为5min；步骤2）中超声洗脱时间为1min～5min，超声频率为45～100kHz。 [0013] 本发明的具有以下优点及突出性效果： [0014] ①脱腐缓冲液脱腐能力高，减少了腐殖酸对微生物核酸提取的不利影响。②超声处理活性炭克服了饮用水生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难。 [0016] 图1为6个实施例中提取总DNA电泳图。电泳带1为λ-Hind III digest DNA Marker，电泳带2~7分别为1~6个实施例提取获得总DNA。 [0017] 图2为6个实施例中提取总的DNA的PCR电泳图。电泳条带1为M100bp DNA Ladder，电泳条带2~7分别为1～6个实施例提取获得总DNA的PCR扩增。 具体实施方式[0018] 为更好地理解本发明，下面通过具体实施例来做进一步说明。 [0019] 本发明所述的饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法具体步骤如下： [0020] 1）生物活性炭的脱腐处理：将生物活性炭与脱腐缓冲液按不同质量/体积比混合，一般生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比为1∶8～1∶15混合；脱腐缓冲液采用NaOH溶液，或采用NaOH与PVP的混合溶液，混合后旋涡振荡，再离心处理，得到脱腐后的生物活性炭；离心速度为1000rpm以上，离心时间至少为5min；脱腐缓冲液NaOH的摩尔浓度为50mmol/L～200mmol/L，混合溶液中PVP与NaOH质量比范围为为5∶1至10∶1。 [0021] 2）生物活性炭的超声洗脱处理：将脱腐后的生物活性炭溶于去离子水中，旋涡振荡及常温水浴后进行超声洗脱处理；超声频率一般为45～100kHz，超声洗脱时间为1min～5min。 [0022] 3）将步骤2）中超声后的悬浊液离心弃上清液，进行核酸纯化提取。纯化提取采4 用市售试剂盒提取，也可采用以下经典方法：具体为取5ml超声后悬浊液，1.3×10rpm离心5min，弃掉上清液，加入500μl TE缓冲液重悬菌体并转入一个1.5ml的离心管中，加入 30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。加入100μl 5mol/L NaCl充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀后于65℃温育10min。加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻振荡混匀。离心4~5min，将上清液转移到一个新离心管中，加入0.6体积异 4 丙醇，混匀后室温静置60min。1.3×10rpm离心20min，弃去上清液，沉淀用1ml的70%乙醇洗涤两次，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20μl TE缓冲液中置于低温冰箱中备用，即获得高质量的DNA。 [0023] 实施例 [0024] 生物活性炭样品取自北京市某自来水厂，实施例1～3采用NaOH溶液（50~200mmol/L）作为脱腐缓冲液，超声洗脱时间分别为1min、2min和5min，提取DNA；实施例4～6采用NaOH（50~200mmol/L）+PVP（PVP∶NaOH 5∶2，w/w）混合溶液作为脱腐缓冲液，超声洗脱时间分别为1min、2min和5min，提取DNA。 [0025] DNA提取结果如表一所示，所获得的总DNA A260/A280值均在1.6以上，说明总DNA中没有蛋白污染，一些样品在1.8以上说明有部分RNA污染，可加入少许RNA酶去除。采用NaOH溶液（100mmol/L）作为脱腐缓冲液，超声时间由1min增至5min所获DNA提取量增大。采用NaOH（200mmol/L）+PVP（PVP∶NaOH 5∶2，w/w）混合溶液作为脱腐缓冲液，超声时间较短（1min）时所获DNA提取量最大。经NaOH（50~200mmol/L）+PVP（PVP∶NaOH5∶2，w/w）混合溶液脱腐处理后的样品提取总DNA量高于以NaOH溶液（50~200mmol/L）溶液脱腐。使用本发明提供的DNA提取方法可以获得产量大，质量高的DNA。 [0026] 表一：提取总DNA的方法与效果比较 [0027] [0028] 将所获DNA4ul，用1.0%加入了GoldViwe染色剂的琼脂糖凝胶进行电泳，并以Bio-Rad凝胶成像系统对所得核酸的电泳图像进行分析，如图1所示。6种方式均获得长度在20Kb以上的总DNA条带，而且经双组份脱腐缓冲液NaOH（50~200mmol/L）+PVP（PVP∶NaOH 5∶2，w/w）处理后样品的DNA条带高于只经NaOH溶液（100mmol/L）脱腐处理的样品。 [0029] 将所获DNA的PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图像如图2。可以看出，6个实施例均扩增出目标条带，经NaOH+PVP脱腐缓冲液处理后的样品的总DNA为模板均可相较以NaOH溶液（100mmol/L）为脱腐缓冲液得到的PCR产物最多。说明使用本发明提供的方法所获DNA可以满足下游分子生物学操作。 |
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