仿刺参体壁总RNA提取方法
| 热词 | 刺参 rna 离心 沉淀 min 提取 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 撤回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 撤回 |
| 申请号 | CN201010223407.2 | 申请日 | 2010-07-12 |
| 公开(公告)号 | CN101864414A | 公开(公告)日 | 2010-10-20 |
| 申请人 | 大连海洋大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 李霞; 秦艳杰; 王雪; 陈秋实; 郑柯; | 第一发明人 | 李霞 |
| 权利人 | 大连海洋大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 大连海洋大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：辽宁省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：辽宁省大连市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：辽宁省大连市沙河口区黑石礁街52号 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 |
| 专利引用数量 | 2 | 专利被引用数量 | 11 |
| 专利权利要求数量 | 1 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 大连非凡专利事务所 | 专利代理人 | 闪红霞; |
| 摘要 | 本 发明 公开一种提取纯度高、完整性好、得率高的仿刺参体壁总RNA的方法，具体方法是取仿刺参体壁组织至液氮中速冻；将速冻的组织 研磨 后置入裂解液中匀浆、离心，取上清；向上清中加入氯仿，再离心取上清至另一离心管中；再加入高盐溶液及异丙醇，所得沉淀用 乙醇 洗涤；用DEPC处理 水 溶解沉淀并定容；向所得溶解液中依次加入无RNA酶的DNA酶缓冲液、无RNA酶的DNA酶及RNA酶 抑制剂 混匀，37℃水浴得DNA裂解液；向DNA裂解液中加入酚∶氯仿(5∶1)混匀，离心取上清；向上清液中加入糖原溶液、 醋酸 钾 溶液及预冷的无水乙醇，混匀过夜后离心弃上清，沉淀用乙醇洗涤、干燥；用DEPC处理水溶解最终沉淀物并定容至20μL，-80℃保存。 | ||
| 权利要求 | 1.一种仿刺参体壁总RNA提取方法，其特征是依次按如下步骤进行： |
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| 说明书全文 | 仿刺参体壁总RNA提取方法技术领域： [0002] 从组织细胞中提取纯度高、完整性好的RNA是进行分子生物学研究的必要前提和关键，因不同物种的组织成分和结构具有差异性，所以对不同细胞来源的RNA的提取必须选择相应的制备方法。 [0003] 仿刺参体壁结缔组织层较厚，由分布比较疏松的胶原纤维构成，体壁化学成分主要为粘多糖、胶原蛋白和色素，这使得提取仿刺参体壁总RNA时样品很难匀浆，采用常规的RNA提取方法所获得的提取物中常含有粘多糖等胶状不溶物和大量黑褐色色素，总RNA纯度低、质量差，这些杂质不但严重影响了之后的RT-PCR等酶促反应，而且也难以满足某些实验(如DDRT-PCR、分子克隆等)对模板纯度的要求。发明内容： [0004] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可避免仿刺参体壁中粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，提取纯度高、完整性好、得率高的仿刺参体壁总RNA的方法。 [0005] 本发明的技术解决方案是：一种仿刺参体壁RNA提取方法，其特征是按如下步骤进行： [0008] c.向离心管B中加入200μL氯仿，摇动14～16s，室温静置2～3min，4℃，12000rpm/min离心，取上清至离心管C中； [0009] d.向离心管C中加250μL高盐溶液(0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L氯化钠的混合液)及250μL异丙醇，室温放置10min，4℃，12000rpm/min离心，弃上清，沉淀用75％乙醇漩涡振荡洗涤，4℃，7500rpm/min离心，吸掉酒精，干燥沉淀物5min～10min； [0010] e.用0.1％DEPC处理水溶解所得沉淀物并定容至20μl； [0011] f.向e步骤所得溶解液中依次加入3μL无RNA酶的DNA酶缓冲液、6μL无RNA酶的DNA酶(1U/μL)及1μL RNA酶抑制剂混匀，37℃水浴1h，得DNA裂解液； [0012] g.取30μLDNA裂解液，加入酚∶氯仿(5∶1)30μL，混匀，4℃，12000rpm/min离心，取上清； [0013] h.向上清液中加入4μL 10mg/mL糖原溶液、6μL 2.5mol/L的醋酸钾溶液及120μL预冷的无水乙醇，混匀后-20℃过夜，4℃，10000rpm/min离心，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤两次、干燥； [0014] i.用0.1％DEPC处理水溶解所得沉淀物并定容至20μL，-80℃保存。 [0015] 本发明与现有技术相比，具有如下优点： [0017] ②研磨后移到加有1mL TRIzol的匀浆器中匀浆，能够更好的裂解细胞使RNA充分释放出来。 [0018] ③粗提时用高盐溶液和异丙醇等体积沉淀，纯化过程中沉淀时使用醋酸钾，都能够更有效的去除多糖和色素的污染。 [0019] ④用DNase消化粗提的样品，并将消化时间延长到1h，可以更有效的去除基因组DNA的污染。 [0020] ⑤纯化时加入适量糖原(10mg/mL)与RNA共沉淀，可以提高RNA的产率(糖原浓度在不高于4mg/mL时不会影响RT-PCR反应的进行)。 [0023] 图2是本发明实施例提取并纯化出的仿刺参体壁总RNA反转录后，仿刺参β-actin基因的PCR扩增琼脂糖电泳图。具体实施方式： [0024] a.用0.45μm滤膜过滤的海水清洗暂养的仿刺参，用手术刀取50mg～100mg仿刺参体壁组织迅速投入液氮中速冻； [0025] b.将冻存的组织研磨成粉末，用药勺迅速将粉末置入加有1mL TRIzol裂解液(主要成分是苯酚，还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等，Invitrogen公司产品)的匀浆器中匀浆，将匀浆液移至离心管A中，室温静置5min，4℃，12000rpm/min离心10min，取上清至离心管B中； [0026] c.向离心管B中加入200μL氯仿，摇动14～16s，室温静置2～3min，4℃，12000rpm/min离心15min，取上清至离心管C中； [0027] d.向离心管C中加250μL高盐溶液(0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L氯化钠的混合液)及250μL异丙醇，室温放置10min，4℃，12000rpm/min离心，弃上清，沉淀用75％乙醇漩涡振荡洗涤，4℃，7500rpm/min离心10min，吸掉酒精，超净工作台干燥沉淀物5min～10min； [0029] f.向e步骤所得溶 解液中依次加 入3μL无RNA酶的DNA酶缓冲 液(10×RNase-Free DNase Buffer，TaKaRa公 司 产 品)、6μL 无RNA酶 的DNA酶 (1U/μL，RNase-Free DNase，TaKaRa公司产品)及1μL RNA酶抑制剂(RNasinPlus RNase Inhibitor，Promega公司产品)混匀，37℃水浴1h，得DNA裂解液； [0030] g.取30μLDNA裂解液，加入酚∶氯仿(5∶1)30μL，混匀，4℃，12000rpm/min离心15min，取上清； [0031] h.向上清液中加入4μL 10mg/mL糖原溶液、6μL 2.5mol/L的醋酸钾溶液及120μL预冷的无水乙醇，混匀后-20℃过夜，4℃，10000rpm/min离心15min，弃上清，沉淀用 75％乙醇洗涤两次、在超净台干燥； [0032] i.用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯B.B.I公司产品)处理水溶解所得沉淀物并定容至20μL，-80℃保存。 [0033] 本发明提取并纯化出的仿刺参体壁总RNA的琼脂糖电泳如图1所示：28s带亮度和宽度皆为18s带的二倍，说明此总RNA纯度和完整性好、质量高。 [0034] 本发明提取后的仿刺参体壁总RNA经反转录后，对β-actin基因进行PCR扩增，扩增产物琼脂糖电泳图如图2所示：带型清晰、稳定，说明此总RNA完全能够满足后续Northern印迹、基因表达分析、分子克隆等实验的要求。 |
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