[0001] 本发明涉及水产动物的一种病原的检测技术，具体涉及一种养殖鱼类致病菌海豚链球菌(Streptococcus iniae)的分子诊断试剂盒及检测方法。

[0002] 海豚链球菌(Streptococcus iniae)病是一种重要的鱼类细菌病，常在罗非鱼、鲈鱼等养殖鱼类中引起爆发性鱼病，导致鱼群大量死亡。再者，海豚链球菌还可以通过伤口感染人，已被确立为新型人畜共患病原。尽管如此，海豚链球菌在鉴定上却存在很多问题。首先，海豚链球菌发现较晚，于1976年才得以定种，因此很多商品化的生化鉴定系统并没有将该菌列入其中，如比较著名的生化鉴定系统BioMerieux Vitek、Microscan、Vitek和ATB Expression system等等。而在Roach 2006年的研究中，用Biolog GP生化鉴定系统，仅能准确鉴定出19/25的海豚链球菌菌株(Roach et al，2006，J MicrobiolMethods，27：20-26)。因此仅依靠生化鉴定的方法来鉴定海豚链球菌极不可靠，特别是在人类临床，极有可能被误诊为其他更为常见的人类病原链球菌如S.dysgalactiae subsp.equisim ilis或S.uberis等。而现代分子生物学技术的发展特别是核酸序列测定、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)及其衍生的一些技术为水产动物疾病的诊断带来了革命性的变化。目前，用于特异鉴定海豚链球菌病的一些靶序列包括16S rDNA、ITS序列以及乳酸氧化酶基因。在Mata等的研究中，以16S rDNA为靶序列的特异引物在鉴定过程中，不能将鱼类无乳链球菌和海豚链球菌分开来(Mata et al.，2004，VetMicrobiol，101：
109-116)。这种情况的发生可能与16S rDNA基因的特点有关，它过于保守，而在相近种中序列差异性不大，以致产生以上情况。同样，在我们的研究中发现Mata所用引物在其推荐扩增条件下对不同的中国海豚链球菌菌株进行扩增时，有一些菌株出现多条扩增条带。此外，在我们还发现1998年Berridge等设计的一对引物在用于鉴定我们采集的中国株时，全部呈阴性，即没有扩增条带。而且也不能将它的文章中所描述的标准株扩增出阳性片段。鉴于以上种种问题，我们通过对国外标准株及中国的不同海豚链球菌分离菌株的一段保守序列ITS进行测序比对，重新设计了一对引物，经检测对海豚链球菌不同菌株均具有较高灵敏度及特异性。另外，通过对各种实验条件的优化，使得所设计引物能够直接对感染的鱼体组织进行检测，并将检测步骤规范化，从而达到简单快速特异的特点。

[0003] 本发明的目的在于提供一种鉴定养殖鱼类致病菌海豚链球菌(Streptococcus iniae)的分子诊断试剂盒及检测方法，以实现对海豚链球菌的准确、标准化检测，为健康养殖提供科学依据。

[0004] 本发明的一种鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒及检测方法包括下列部件：

[0005] (1)感染组织裂解buffer A，1管，内装感染组织总DNA提取裂解

[0006] buffer：20mM Tris-HCl，5mM EDTA Na2，400mM NaCl，1％SDS，pH8.0；

[0007] (2)DNA提取B液，1管，内装蛋白酶K(10mg/ml)；

[0008] (3)DNA提取C液，1管，内装酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)；

[0009] (4)DNA提取D液，1管，内装异丙醇；

[0010] (5)阳性模板对照E液，1管，内装海豚链球菌基因组DNA；

[0011] (6)PCR反应液F液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物P1、引物P2和TaqE；

[0012] (7)盒子。

[0013] 上述鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒中所述的一对引物P1和P2是根据海豚链球菌基因组中一段保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：

[0014] P1(5’GAAAATAGGAAAGAGACGCAGTGTC3’)

[0015] P2(5’CCTTATTTCCAGTCTTTCGACCTTC3’)

[0016] 用本发明上述试剂盒检测鱼类病原菌海豚链球菌的方法，按下列步骤进行：

[0017] (1)取0.1～0.2g左右的脑、肝、脾、肾或肌肉组织等组织待检样品，加入200μl裂解BufferA，并于匀浆器中匀浆；

[0018] (2)加入2μl DNA提取B液，50～55℃水浴裂解1小时；

[0019] (3)向裂解组织液中加入200μl DNA提取C液，充分混匀，离心5min(10000g)后取上清液；

[0020] (4)在上清中加入200μl DNA提取D液，冰浴15min，离心5min(10000g)，70％乙醇洗涤沉淀2次，将其沉淀溶于20μl无菌水中作为PCR模板；

[0021] (5)分别取模板和E液，加入到PCR反应中，混匀后短暂离心数秒，置于PCR仪上；

[0022] (6)按下列条件扩增：

[0023] 94℃变性5min；

[0024] 94℃30sec，

[0025] 55℃-60℃30sec，

[0026] 72℃1min，35个循环；

[0027] 72℃延伸5min

[0028] (7)反应结束后取5～10μl样品，与1～2μl的6×Loading Buffer混合，在含0.5～1μg/ml的1～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如样品孔有377bp的核酸条带，说明样品中有海豚链球菌感染，反之则没有。

[0029] 本发明具有如下有益效果：

[0030] 1)、用本发明的试剂盒及检测方法进一步提高了检测的灵敏度，即细菌个数为9个时，仍可扩增出阳性结果。2)、采用本发明鉴定海豚链球菌，可以对停乳链球菌、无乳链球菌、杀鱼巴氏杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、乳酸球菌、金黄色葡萄球菌等多种水产常见病原细菌及其他常见细菌进行较好的区别。3)、本发明可直接对感染鱼体组织直接进行检测，可以免除细菌培养过程，5～8小时即可得知检测结果，而其他方法至少需要1天或一星期以上。附图说明

[0031] 图1海豚链球菌分子诊断试剂盒对海豚链球菌和其他细菌的检测结果。其M：DNA分子量标准；S1，S2分别为海豚链球菌的ATCC29178标准株和中国分离代表株，1-10分别为无乳链球菌、停乳链球菌、杀鱼巴氏杆菌、脚鱼诺卡氏菌、乳酸球菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、 嗜水气单胞菌、霍乱弧菌。

[0032] 图2海豚链球菌分子诊断试剂盒对感染海豚链球菌的鱼组织和未感染海豚链球菌的鱼组织PCR的检测结果。M：DNA分子量标准；S：为阳性对照DNA，1、3、5、7、9分别为感染海豚链球菌的鱼的脑、肝、脾、肾、肌肉组织样品；2、4、6、8、10分别为未感染海豚链球菌的鱼的脑、肝、脾、肾、肌肉组织样品。

[0033] 以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。

[0034] 实施例1：鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒

[0035] 该试剂盒由下列部分构成(10样份)

[0036] (1)感染组织裂解buffer A，1管，2ml/管，内装感染组织总DNA提取裂解buffer：20mM Tris-HCl，5mM EDTA Na2，400mMNaCl，1％SDS，pH8.0；

[0037] (2)DNA提取B液，1管，20μl/管，内装蛋白酶K(10mg/ml)；

[0038] (3)DNA提取C液，1管，2ml/管，内装酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)；

[0039] (4)DNA提取D液，1管，2ml/管，内装异丙醇；

[0040] (5)阳性模板对照E液，1管，10μl/管，内装海豚链球菌基因组DNA；

[0041] (6)PCR反应液F液，1管，250μl/管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物P1、引物P2和TaqE；

[0042] (7)盒子；

[0043] 该分子诊断试剂盒中所述的一对引物P1和P2的DNA序列分别如下：

[0044] P1(5’GAAAATAGGAAAGAGACGCAGTGTC3’)

[0045] P2(5’CCTTATTTCCAGTCTTTCGACCTTC3’)

[0046] PCR扩增反应液体系(25μl体系)如下：

[0047] ddH2O 17.5μl

[0048] 10×buffer(含Mg2+) 2.5μl

[0049] dNTP(10mM) 1μl

[0050] 引物P1(10μM) 1μl

[0051] 引物P2(10μM) 1μl

[0052] Taq酶(1U/μl) 1μl

[0053] 实施例2：鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒特异性检测

[0054] 使用实例1中的试剂盒，按以下步骤进行：

[0055] (1)取海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、杀鱼巴氏杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、乳酸球菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌单菌落加入200μl裂解Buffer A混匀；

[0056] (2)加入2μl DNA提取B液，50～55℃水浴裂解1小时；

[0057] (3)向裂解液中加入200μl DNA提取C液，充分混匀，离心5min(10000g)后取上清液；

[0058] (4)在上清中加入200μl DNA提取D液，冰浴15min，离心5min(10000g)，70％乙醇洗涤沉淀2次，将其沉淀溶于20μl无菌水中作为PCR模板；

[0059] (5)分别取模板和E液，加入到PCR反应中，混匀后短暂离心数秒，置于PCR仪上；

[0060] (6)按下列条件扩增：

[0061] 94℃变性5min；

[0062] 94℃30sec，

[0063] 55℃-60℃30sec，

[0064] 72℃1min，35个循环；

[0065] 72℃延伸5min

[0066] (7)反应结束后取5～10μl样品，与1～2μl的6×Loading Buffer混合，在含0.5～1μg/ml的1～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，只有海豚链球菌标准株ATCC29178和中国分离株出现377bp的目的条带，而其他细菌均无扩增条带(见图1)。

[0067] 实施例3：海豚链球菌分子诊断试剂盒对感染海豚链球菌的鱼组织和未感染海豚链球菌鱼的检测

[0068] 使用实例1中的试剂盒，按以下步骤进行：

[0069] (1)取0.1～0.2g左右的感染海豚链球菌的鱼和未感染海豚链球菌鱼脑、肝、脾、肾或肌肉等组织待检样品，加入200μl裂解BufferA，并于匀浆器中匀浆；

[0070] (2)加入2μl DNA提取B液，50～55℃水浴裂解1小时；

[0071] (3)向裂解组织液中加入200μl DNA提取C液，充分混匀，离心5min(10000g)后取上清液；

[0072] (4)在上清中加入200μl DNA提取D液，冰浴15min，离心5min(10000g)，70％乙醇洗涤沉淀2次，将其沉淀溶于20μl无菌水中作为PCR模板；

[0073] (5)分别取模板和E液，加入到PCR反应中，混匀后短暂离心数秒，置于PCR仪上；

[0074] (6)按下列条件扩增：

[0075] 94℃变性5min；

[0076] 94℃30sec，

[0077] 55℃-60℃30sec，

[0078] 72℃1min，35个循环；

[0079] 72℃延伸5min

[0080] (7)反应结束后取5～10μl样品，与1～2μl的6×Loading Buffer混合，在含0.5～1μg/ml的1～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，发现只有阳性对照和感染海豚链球菌鱼的各个组织可见377bp的核酸条带，而未感染鱼的各个组织没有出现扩增条带(见图2)。