海豚链球菌(Streptococcus iniae)病是一种重要的鱼类细菌病，常 在罗非鱼、鲈鱼等养殖鱼类中引起爆发性鱼病，导致鱼群大量死亡。 再者，海豚链球菌还可以通过伤口感染人，已被确立为新型人畜共患 病原。尽管如此，海豚链球菌在鉴定上却存在很多问题。首先，海豚 链球菌发现较晚，于1976年才得以定种，因此很多商品化的生化鉴 定系统并没有将该菌列入其中，如比较著名的生化鉴定系统 BioMerieux Vitek、Microscan、Vitek和ATB Expression system等等。 而在Roach 2006年的研究中，用Biolog GP生化鉴定系统，仅能准确 鉴定出19/25的海豚链球菌菌株(Roach et al，2006，J Microbiol Methods，27：20-26)。因此仅依靠生化鉴定的方法来鉴定海豚链球菌 极不可靠，特别是在人类临床，极有可能被误诊为其他更为常见的人 类病原链球菌如S.dysgalactiae subsp.equisim ilis或S.uberis等。而 现代分子生物学技术的发展特别是核酸序列测定、聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)及其衍生的一些技术为水产动物疾 病的诊断带来了革命性的变化。目前，用于特异鉴定海豚链球菌病的 一些靶序列包括16S rDNA、ITS序列以及乳酸氧化酶基因。在Mata 等的研究中，以16S rDNA为靶序列的特异引物在鉴定过程中，不能 将鱼类无乳链球菌和海豚链球菌分开来(Mata et al.，2004，Vet Microbiol，101：109-116)。这种情况的发生可能与16S rDNA基因的 特点有关，它过于保守，而在相近种中序列差异性不大，以致产生以 上情况。同样，在我们的研究中发现Mata所用引物在其推荐扩增条 件下对不同的中国海豚链球菌菌株进行扩增时，有一些菌株出现多条 扩增条带。此外，在我们还发现1998年Berridge等设计的一对引物 在用于鉴定我们采集的中国株时，全部呈阴性，即没有扩增条带。而 且也不能将它的文章中所描述的标准株扩增出阳性片段。鉴于以上种 种问题，我们通过对国外标准株及中国的不同海豚链球菌分离菌株的 一段保守序列ITS进行测序比对，重新设计了一对引物，经检测对海 豚链球菌不同菌株均具有较高灵敏度及特异性。另外，通过对各种实 验条件的优化，使得所设计引物能够直接对感染的鱼体组织进行检测， 并将检测步骤规范化，从而达到简单快速特异的特点。

本发明的目的在于提供一种鉴定养殖鱼类致病菌海豚链球菌 (Streptococcus iniae)的分子诊断试剂盒及检测方法，以实现对海豚链 球菌的准确、标准化检测，为健康养殖提供科学依据。
本发明的一种鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒及检测方 法包括下列部件：
(1)感染组织裂解buffer A，1管，内装感染组织总DNA提取裂解 buffer：20mM Tris-HCl，5mM EDTA Na2，400mM NaCl，1％ SDS，pH 8.0；
(2)DNA提取B液，1管，内装蛋白酶K(10mg/ml)；
(3)DNA提取C液，1管，内装酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)；
(4)DNA提取D液，1管，内装异丙醇；
(5)阳性模板对照E液，1管，内装海豚链球菌基因组DNA；
(6)PCR反应液F液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O、 含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物P1、引物P2和TaqE；
(7)盒子。
上述鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒中所述的一对引物 P1和P2是根据海豚链球菌基因组中一段保守区序列设计的，其 DNA序列分别如下：
P1(5’GAAAATAGGAAAGAGACGCAGTGTC3’)
P2(5’CCTTATTTCCAGTCTTTCGACCTTC3’)
用本发明上述试剂盒检测鱼类病原菌海豚链球菌的方法，按下 列步骤进行：
(1)取0.1～0.2g左右的脑、肝、脾、肾或肌肉组织等组织待检样品， 加入200μl裂解Buffer A，并于匀浆器中匀浆；
(2)加入2μl DNA提取B液，50～55℃水浴裂解1小时；
(3)向裂解组织液中加入200μl DNA提取C液，充分混匀，离心5min (10000g)后取上清液；
(4)在上清中加入200μl DNA提取D液，冰浴15min，离心5min (10000g)，70％乙醇洗涤沉淀2次，将其沉淀溶于20μl无菌 水中作为PCR模板；
(5)分别取模板和E液，加入到PCR反应中，混匀后短暂离心数秒， 置于PCR仪上；
(6)按下列条件扩增：
94℃变性5min；
94℃30sec，
55℃-60℃30sec，
72℃1min，35个循环；
72℃延伸5min
(7)反应结束后取5～10μl样品，与1～2μl的6×Loading Buffer混合， 在含0.5～1μg/ml的1～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯 下观察，如样品孔有377bp的核酸条带，说明样品中有海豚链球菌感染， 反之则没有。
本发明具有如下有益效果：
1)、用本发明的试剂盒及检测方法进一步提高了检测的灵敏度， 即细菌个数为9个时，仍可扩增出阳性结果。2)、采用本发明鉴定海 豚链球菌，可以对停乳链球菌、无乳链球菌、杀鱼巴氏杆菌、鰤鱼诺 卡氏菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、乳酸球菌、金黄色葡萄 球菌等多种水产常见病原细菌及其他常见细菌进行较好的区别。3)、 本发明可直接对感染鱼体组织直接进行检测，可以免除细菌培养过 程，5～8小时即可得知检测结果，而其他方法至少需要1天或一星期以 上。
附图说明
图1海豚链球菌分子诊断试剂盒对海豚链球菌和其他细菌的检 测结果。其M：DNA分子量标准；S1，S2分别为海豚链球菌的 ATCC29178标准株和中国分离代表株，1-10分别为无乳链球菌、停 乳链球菌、杀鱼巴氏杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、乳酸球菌、金黄色葡萄球 菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌。
图2海豚链球菌分子诊断试剂盒对感染海豚链球菌的鱼组织和 未感染海豚链球菌的鱼组织PCR的检测结果。M：DNA分子量标准； S：为阳性对照DNA，1、3、5、7、9分别为感染海豚链球菌的鱼的 脑、肝、脾、肾、肌肉组织样品2、4、6、8、10分别为未感染海豚 链球菌的鱼的脑、肝、脾、肾、肌肉组织样品。

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒
该试剂盒由下列部分构成(10样份)
(1)感染组织裂解buffer A，1管，2ml/管，内装感染组织总DNA 提取裂解buffer：20mM Tris-HCl，5mM EDTA Na2，400mM NaCl，1％SDS，pH 8.0；
(2)DNA提取B液，1管，20μl/管，内装蛋白酶K(10mg/ml)
(3)DNA提取C液，1管，2ml/管，内装酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶ 1)；
(4)DNA提取D液，1管，2ml/管，内装异丙醇；
(5)阳性模板对照E液，1管，10μl/管，内装海豚链球菌基因组DNA；
(6)PCR反应液F液，1管，250μl/管，内装PCR扩增反应液，包 括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物P1、引物P2和 TaqE；
(7)盒子；
该分子诊断试剂盒中所述的一对引物P1和P2的DNA序列分 别如下：
P1(5’GAAAATAGGAAAGAGACGCAGTGTC3’)
P2(5’CCTTATTTCCAGTCTTTCGACCTTC3’)
PCR扩增反应液体系(25μl体系)如下：
ddH2O                  17.5μl
10×buffer(含Mg2+)     2.5μl
dNTP(10mM)             1μl
引物P1(10μM)          1μl
引物P2(10μM)          1μl
Taq酶(1U/μl)          1μl
实施例2：鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒特异性检测 使用实例1中的试剂盒，按以下步骤进行：
(1)取海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、杀鱼巴氏杆菌、鰤 鱼诺卡氏菌、乳酸球菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、 嗜水气单胞菌、霍乱弧菌单菌落加入200μl裂解Buffer A混匀；
(2)加入2μl DNA提取B液，50～55℃水浴裂解1小时；
(3)向裂解液中加入200μl DNA提取C液，充分混匀，离心5min (10000g)后取上清液；
(4)在上清中加入200μl DNA提取D液，冰浴15min，离心5min (10000g)，70％乙醇洗涤沉淀2次，将其沉淀溶于20μl无菌 水中作为PCR模板；
(5)分别取模板和E液，加入到PCR反应中，混匀后短暂离心数秒， 置于PCR仪上；
(6)按下列条件扩增：
94℃变性5min；
94℃30sec，
55℃-60℃30sec，
72℃1min，35个循环；
72℃延伸5min
(7)反应结束后取5～10μl样品，与1～2μl的6×Loading Buffer混合， 在含0.5～1μg/ml的1～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯 下观察，只有海豚链球菌标准株ATCC29178和中国分离株出现377bp 的目的条带，而其他细菌均无扩增条带(见图1)。
实施例3：海豚链球菌分子诊断试剂盒对感染海豚链球菌的鱼 组织和未感染海豚链球菌鱼的检测
使用实例1中的试剂盒，按以下步骤进行：
(1)取0.1～0.2g左右的感染海豚链球菌的鱼和未感染海豚链球菌鱼 脑、肝、脾、肾或肌肉等组织待检样品，加入200μl裂解Buffer A，并于匀浆器中匀浆；
(2)加入2μl DNA提取B液，50～55℃水浴裂解1小时；
(3)向裂解组织液中加入200μl DNA提取C液，充分混匀，离心5min (10000g)后取上清液；
(4)在上清中加入200μl DNA提取D液，冰浴15min，离心5min (10000g)，70％乙醇洗涤沉淀2次，将其沉淀溶于20μl无菌 水中作为PCR模板；
(5)分别取模板和E液，加入到PCR反应中，混匀后短暂离心数秒， 置于PCR仪上；
(6)按下列条件扩增：
94℃变性5min；
94℃30sec，
55℃-60℃30sec，
72℃1min，35个循环；
72℃延伸5min
(7)反应结束后取5～10μl样品，与1～2μl的6×Loading Buffer混合， 在含0.5～1μg/ml的1～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯 下观察，发现只有阳性对照和感染海豚链球菌鱼的各个组织可见 377bp的核酸条带，而未感染鱼的各个组织没有出现扩增条带(见图 2)。