植物单花粉高通量收集与PCR检测方法

>斤属技术领域：

本发明属于--种植物单花粉高通量收集与PCR检测方法。 嘴景技术：

单花粉PCR已经在几个物种上成功，但由于单个花粉分离和裂解的困难，单花粉PCR W限于少量（最多达到60粒）花粉粒。这限制了单花粉PCR在植物遗传分析和染色体帝ij 图上的应用。

花粉很小（Pinar and Inceoglu 1999; Su and Saunders 2003; Tel-Zur et al. 2003; Wen and Nowicke 1999)，自然条件下在花粉囊裂解后只能存活几分钟（Fritz and Lukaszewski 1989; Khatun and Flowers 1995; Luna et al. 2001)。因此基于花粉活'性 酌研究，取样和遗传分析的效率显得很重要。PCR方法在单细胞和单花粉的遗传变异(Aziz and Sauve 2003; Li et al. 1990; Matsunaga et al. 1999; Parducci et al. 2005; Petersen et al. 19恥;Zhang et al. 1992)、基因表达（Shoemaker et al. 2005)和基因型（Aziz et al. 2005; Li and Yeung 2002)分析中已经成功。然而，在这些研究中只用到少量的单花 凇粒，只有一例最多达到60粒(Aziz et al. 2005)。花粉是一组具有不同基因型的单倍 体的集合，每一个单花粉只获得了其供体整个核基因组的一部分（C叩enh肌er et al. 2000)。从统计的角度看，大量的花粉分析对于遗传研究至关重要。总体而言，花粉粒很 小且具有厚的花粉壁（Pinar and Inceoglu 1999; Su and Saunders 2003; Tel-Zur et al. 2003; Wen and Nowicke 1999)，得到足够的花粉粒并把其中DNA释放出来而不抑制PCR 及应是单花粉PCR方法的两个瓶颈所在。

单细胞，如人类精细胞可以利用流速细胞计数仪(Li et al. 1990; Zhang et al. 1992)、 显微操纵器（Shoemaker et al. 2005)和毛细管（Li and Yeung 2002)进行分离;单个花粉 粒有用激光分离仪(Matsunaga et al. 1999)、显微操纵器（Aziz and Sauve 2003; Aziz et al. 2005; Haliyo and Regnier 2003)和特制的玻璃微管（Parducci et al. 2005)进行 分离。显微操纵器是当前分离单个花粉的主要仪器，但由于使用的玻璃微管易折断，不能 直接将花粉粒放于PCR管中，因此效率很低，受试的花粉粒个数最高没有超过60 (Azizet al. 2005)。激光分离仪可以高效分离单个花粉粒，但十分昂贵。成熟花粉粒既厚又硬的 壁（Parre and Geit腿n 2005; Santos and Mariath 1999)以及其尺寸大小（0. 005 to 0.25 ram in diameter)非常适宜在显微镜下用精细的镊子直接分离。另一方面，裂解花粉粒释 放核酸比动物细胞困难得多。为此曾尝试了多种方法，包括激光束切割(Matsunaga etal. 1999)、缓冲、液裂解（Matsunaga et al. 1999)、预培养发芽（Aziz and Sauve 2003; Aziz et al, 2005)，或用吸液管压碎(Parducci et al. 2005)等。然而多数实验室没能力购 置昂贵的激光束切割器，培养基预发芽会引入许多抑制PCR反应的化学物质(Aziz and Sauve 2003; Aziz et al. 2005)，吸液管压碎法仅适用于压碎大的花粉粒化石。 一些研 究显示花粉壁可以被某些化学试剂溶解（Loewus et al. 1985; Southworth 1974)。最近， Xin等（2003)报道了一种不影响PCR反应、适用于抽提多种植物DNA的快速方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，该方法能应用于 大批量单花粉收集并进行单花粉PCR的能力，为植物遗传分析和染色体制图提供了一种新的方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，依序包 缩如下步骤：

1) 显微镜分离完整、千净的未开裂花粉以及花粉破囊壁和染色，将染色液小心排净； 留下的花粉粒清洗，最后让花粉粒完全千燥；

2) 用取液器分装适宜^裂解液于适宜个数孔的PCR板中，密封并离心使裂解液沉于 ,底；

3) 在显微镜下用镊子挑选着色的单花粉粒并把着色的单花粉粒放入PCR管底的裂解 潘中;

4) 分装适宜iil矿物油于适宜个数孔的PCR板中，短暂离心；

5) 把步骤4)的适宜个数孔的PCR板于PCR仪上在90-98。C温度下保持16分-18分 30秒;

6) 在步骤5)的每一管中加入适宜pl的TE缓冲液，离心，然后加入PCR反应成分?昆 士液（一般含lxPCR反应缓冲液，适宜量dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP, MgCL，引物，模板 DNA， T叫DNA聚合酶，H20)，调整终体积为20

7) 短暂离心，置于PCR仪上，PCR反应参数为：90-98X:保持3-8分钟进行预变性， 熟循环参数根据计划进行的相应PCR程序设定，本发明的循环数设定为35-40，最后72。C 诞伸5-IO分钟，获得PCR产物，保持于4T温度下；

8) 步骤7)的PCR产物用电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照a

步骤1)所述的显微镜分离完整、干净的未开裂花粉以及花粉破囊壁和染色的步骤是 在显微镜下用镊子分离一个个完整、干净的未开裂花粉囊放入载玻片上，滴染色液并挑破 囊壁使花粉逸出，将载玻片放入带盖的培养皿中于温度为23-30°C下培养20-40分钟，后 取出载玻片用镊子将染色液小心排净；留下的花粉粒用灭菌蔗糖液重复清洗，同时调整萍见 野内密度；最后让花粉粒完全干燥。

上述将载玻片放入带盖的培养皿中在本发明是在优选温度为28X下培养20-40分钟。 步骤1)所用的染色液是由0.7 mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30 mM蔗糖配成。 步骤2)所述的裂解液的制备方法为：：吸取适量灭菌双蒸水，以及适量的1M NaOH 或者1M K0H和适量的20%Tween-20 ，置于2.0ml离心管中，涡旋片刻即制成裂解液， 所述的裂解液体积可依反应个数多少增减，但裂解液中NaOH或者K0H的终浓度为0.1M， Tween-20终浓度为2%;本发明的裂解液的具体制备方法为：吸取1600^1灭菌双蒸水， 200pl 1M NaOH或者lM K0H和200^1 20%Tween-20 ,置于2.0ml离心管中，涡旋片刻即 制成裂解液。

所述的步骤2)中的取液器为12道取液器，采用12道取液器分装lpl裂解液于96孔 PCR板中，用锡箔胶带密封并离心使裂解液沉于管底；所述的步骤4)的96孔PCR板中是 分装有5pl矿物油；所述的步骤6)的在毎一管中是加入1h1 TE缓冲液。

步骤1)所用的镊子的尖端直径小于等于0. Olmm，分离花粉是在63倍的显微镜下完成的。

步骤4)所述的短暂离心是自指在离心力为1479g下离心1分钟。 本发明步骤中所述的PCR板是放在PCR仪中且PCR仪中的优选温度控制为95°C ， PCR裉一般选用96孔PCR板，步骤5)的PCR板于PCR仪上在95"C温度下保持时间优选为17 ^> 30秒；步骤7)短暂离心，置于PCR仪上，在优选温度为95。C保持时间3-8分钟进，f 澦变性。

步骤6)所加入的PCR反应成分混合液一般由lxPCR反应缓冲液，适宜量dATP、 dTTP、 dGrP和dCTP， MgC12，引物，模板DNA， Taq DNA聚合酶和H20组成，具体优选含量可用实 滩例所述的含量。

步骤7)获得的PCR产物用含0. 5吗/ml溴化乙啶的1. 5%琼脂糖进行电泳分离并在成 竭系统上进行扫描拍照。

本发明具有的特点为：本方法应用一种特殊的镊子在显微镜下分离单个花粉，在碱和 表面活性剂溶液中裂解后用TE缓冲溶液中和。裂解混合液直接作为模板在5S核糖体内转 渌间隔区（5S r"似-iT5)、随机扩增多态性DNA (RAPD)和微卫星PCR(SSR-PCR)方法中工作， 并对不用预扩增的PCR反应参数进行了优化。应用这种方法， 一个经过培训的人每天可以 进行288个单花粉PCR反应。该方法以甘蔗单花粉为材料建立，在其它五种可以采集到花 淞的植物即玉米、斑茅、青豆、高粱和番茄上验证，效果良好，该发明方法也可以用于其 它花粉的采集及PCR检测。该方法大批量收集并进行单花粉PCR的能力为植物遗传分折和 染色体制图提供了一种新的方法，并使得遗传分析条件更可控、费用大幅度降低。该方法 对于应用经典遗传分析方法困难的物种具有特殊的意义。

本发明具有的优点为：

1) 效率高：到目前为止，由于显微操纵器本身烦琐的操作过程限制，单个试验受试 的花粉粒个数最多没有超过60,分离单花粉粒效率很低；而应用本发明的方法， 一个经过 培训的人每天可以进行288个单花粉的分离和PCR反应。而且，制一板花粉粒载玻片可供 多次直接取样使用，省去其它方法花粉发芽培养和保存等步骤；再者，花教、裂解液可直接 作为PCR反应模板使用，不用沉淀分离DNA，进一步提高了效率。

2) 通用性强：本发明方法可应用于多种植物的单花粉PCR分析，包括花^Kt径很小 的番恭；可应用于多种PCR反应程序，如特异引物PCR、随机引物PCR和微卫星PCR分 析。

3) 成本低，且简便易行：不需要昂贵的仪器，所需试剂也皆为常规试剂，样品制备 简单，不需要复杂DNA抽提和预扩增；操作过程简便易行，没有复杂和要求苛刻的分子 生物学实验操作步骤。

4) 稳定性强：根据花粉活性染色鉴定方法保证入选花粉粒均含有DNA模板；花粉粒 分离收集手段可靠；花粉粒裂解释放DNA效果比发芽等其它方法更好。

5) 实用性和可操作性强：按照本发明方法， 一般的实验室都具备开展相关研究的条 件； 一个经过培训的普通人员均可进行试验操作，从而将研究人员从复杂的分子生物学实

验操作中解脱出来，专心于数据分析。

6) 特别适用于生殖遗传统计分析：分子生物学已经步入后基因组时代，由单个基因 克隆进入到多个基因的协同作用研究。而本方法可以高通量收集植物由二倍体经减数分裂 产生的单倍体花粉所获得的亲本基因组遗传信息，通过分析可以获得植物最重要的发育阶 段一生殖遗传规律，为评价亲本优劣和提高育种效率提供指导。

附图说明：图1为本发明的花粉粒和镊子尖端直径尺寸比较图。

图中：（A)甘蔗；（B)玉米；（C)青豆；（D)五节芒；（E)高粱；（F)番茄。测量尺：

采用OLYMPUS Objective Micrometer OB M 1/100 (图中一格代表0. Ol咖）。 图2为本发明的甘蔗单花粉粒PI/PII PCR反应产物的电泳检査图。 泳道定义：U: DNA标准分子量（Catalog能N2050);图中：泳道1-36，优化条科: 下四个甘蔗品种单花粉PCR反应产物比较；泳道37-48，染色(39至43)与未染色(44至 48)单花粉粒PCR反应产物比较。泳道l、 10、 19、 28、 37，负对照（H20);泳道2、 11、 20、 29、 38，正对照（依次为甘蔗品种L03-378、 HoCP03-718、 HoCP02-618、 TCP99-4474、 L03-378的总DNA);泳道3至9， 39至48， L03-378单花粉粒；12至18， HoCP03-718 单花粉粒；21至27， HoCP02-618单花粉粒；30至36, TCP99-4474单花粉粒。 图3为本发明的五个物种单花粉粒PI/PII PCR反应产物的电泳检查图。 泳道定义：La: DNA标准分子量(Catalog甜N2050);图中：泳道1、 3、 7、 11、 15、 19,负对照（H20);泳道2,正对照（L03-378总DNA);泳道4至6,玉米；泳道8至 10,高粱；泳道12至14，五节芒；泳道16至18,青豆；泳道20至22，番茄。

图4为本发明的高通量单花粉PCR方法在RAPD和SSR PCR反应程序中的应用图（以 HoCP02-618的单花粉粒为样本）6

泳道定义：La: D跳标准分子量（Catalog郞N2050);图中：泳道1至16,应用两 条不同RAPD引物的PCR反应；泳道17至32，应用两种不同裂解液的RAPD-PCR反应；泳 道33至44,应用两对不同SSR引物的PCR反应；泳道1、 9、 17、 25、 33、 39,负对照(H20); 泳道2、 10、 18、 26、 34、 40，正对照（HoCP02-618总DNA);泳道1至8和17至32， 引物为0PBE-04的RAPD-PCR;泳道9至16，引物为0PA-17的RAPD-PCR;泳道17至24， 含KOH的裂解液；泳道1至16和25至44，含NaOH的裂解液；泳道33至38,引物为SMC336BS 的SSR PCR;泳道39至44，引物为SMC1604SA的SSR PCR。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明-

本发明的具体实施方式如下：

(一）材料与方法

1)仪器和试剂

本研究使用的仪器包括--台Narishige公司生产的显微操纵器(Model MN-153) (East Meadow, NY, USA)、用布朗微管拉制器（Sutter Instr咖ent Co卿any， Novato, CA， USA) 制作的玻璃微管、Zeiss显微镜（Carl Zeiss Microimaging, Inc., Thor画od, NY， USA)、 镊子（DUMONT No. 11254-20) (Fine Science Tools USA, Inc., Foster City, CA, USA) 以及O. 5-10 pi 12道取液器（Thermo Electron Corporation, Milford, MA， USA)。

配制的下列化学溶液所用试剂购自Sigma-Aldrich公司（Kansas, M0， USA): 1 M NaOH; 1 M KOH; 20% Tween-20 (吐温-20) ; TE缓冲液（0. 1 M Tris-HC1, 2 raM EDTA); 1% (W/V)牛血清白蛋白（BSA) ; 10%圃PVP-40 (聚乙烯吡烙烷酮40);染色液(0.7mM 苯胺磷酸氢二铵蓝，30 mM蔗糖）；30 mM蔗糖溶液。系列裂解液（0.025 M， 0.05 M， 0.1 M, 0. 15 M, 0. 20 M NaOH或0. 025 M, 0. 05 M， 0.1 M, 0. 15 M, 0. 20 M KOH, 2% TVeen-20 (吐温-20)用前现配。此外，矿物油(mineral oil) 、 10 mM dNTPs (脱氧核糖核苷酸)混合物和琼脂糖也购自Sigma-Aldrich公司。DNA标准分子量购自Bionexus公司 (Oakland, CA， USA); Taq DNA聚合酶，10倍PCR buffer (PCR反应缓冲液一般含 10-50咖ol/L Tri.s-Cl (20。C下pH8. 3-8.8)， 50,1/L KC1和适当浓度的Mg2+,另夕卜，反 应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100^ig/tnl的牛血清白蛋白（BSA))和25 mM氯 化镁溶液购自Roche诊断试剂公司（Indianapolis, IN, USA)。

2) 植物和花粉材料

所用花穗分别采自四个优良的甘蔗品种（即L03-378， HoCP03-718， HoCP02-618禾口 TCP99-4474)、夏威夷超甜玉米10号（Zea mays L.)、 M 81-E号高粱（Sorghum bicolor L.)、 Derby (德贝）绿豆(/%35"eo/i/s n/Jgar/s厶)以及Florida 91号番茄(Lycopersicon esculentum L.)。按照Pan等（2000)的方法从四个甘蔗品种的叶中提取的DNA作为PCR反 应的阳性对照。

3) 花粉裂解和单花粉PCR

单个花粉粒放置于装有1 ^裂解液的单个PCR管或96孔PCR板中，花粉沉淀后加入 5 ^矿物油。设置两套副对照， 一套管加1 pi裂解液，不加花粉粒；另一套加1 pi 和一个花粉粒。样品短暂离心（1479 g l分钟）后分别在95。C保温15、 17.5和20分,中 以裂解花粉粒。之后，加入等摩尔量的TE buffer (TE缓冲液，TE缓冲液组成一般为0. 1 M Tris-HC1， 2 mM EDTA)中和，短暂离心。

利用五种DNA引物进行PCR反应。引物碱基序列（5' to 3')如下：5S rZWJ-775 (ribosomal intergenic spacer)引物 PI [TGGGAAGTCCT (C/T)GTGTTGCA] and PI I [(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA] (Cox等1992);两个RAPD (randomly amplified polymorphic DNA)引物OPBE-04 (CCCAAGCGAA)和0PA-17 (GACCGCTTGT);以及两对甘蔗 微卫星引物（SSR) SMC336BS (上游 ATTCTAGTGCCAATCCATCTCA 和下游 CATGCCMCTTCCAAACAGAC ) 和 SMC1604SA (上游AGGGAMAGGTAGCCTTGG和下游 TTCCAACAGACTTGGGTGG)。其中PI/PII PCR反应体积为20 pi ,含1 pi裂解液、单个花 粉粒、等摩尔的TE缓冲液、50raMKCl、 10 mM Tris. HC1 (pH 8. 3) 、 3. 0慮MgCl2、 0. 2 mM 的dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP (四种脱氧核糖核苷酸)、0.25 引物、0.1% (W/Y) BSA (牛血清白蛋白）和1个单位的r邻DNA聚合酶。PI/PII-PCR反应程序为95°C5分钟（在 优化试验中延长至10分钟、15分钟），热循环参数为93t55秒、6(TC10秒、72。C40秒， 30个循环(在优化试验中延长至40或50个循环），最后72'C延伸10分钟。RAPD-PCR 反应体积为20pl ，除dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP浓度为0. 25mM、引物为0.5pM夕卜，其 它成分同PI/PII-PCR; RAPD-PCR程序为95。C保持5分钟，热循环参数为93XM0秒、40 。C30秒、72。C60秒，40个循环，最后72。C延伸5分钟。SSR-PCR反应体积也为20 pl ， 除MgCh为2. 75 mM、 dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP浓度为0. 25mM、引物为0.21 -外,其 它成分同PI/PII-PCR; SSR-PCR反应程序为95。C保持5分钟，热循环参数为94°C30秒.、 58"30秒、72。C30秒，40个循环，最后72匸延伸10分钟。

PCR扩增仪为GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems， Inc. ， Foster City CA, USA). PCR产物用含0. 5叫/ml溴化乙啶的1. 5°/。琼脂糖进行电泳分离并在GEL Logic 200 Imaging System (New Haven, CT， USA)上进行拍照。 (二）结果与讨论1) 载玻片制备与单花粉收集

用75%的酒精擦拭镊子、不锈钢针和载玻片（75x25 mm, Clay Adams™)，装有裂解液 的50 rnl灭菌烧杯和消毒纸用于分离花粉后清洗和擦拭镊子。在载玻片上滴一滴染色液， 在63倍显微镜下用镊子分离一个完好无损、外壁无花粉粒沾染的未开裂花粉囊放入染色 液中，挑破囊壁使花粉逸出。将载玻片放入带盖的培养皿中于28T培养20-40分钟，后取 出载玻片用镊子将染色液小心排净。留下的花粉粒用15滴灭菌蔗糖液重复清洗，同时调 整«1野内花粉粒密度，最后让花粉粒完全千燥。

使用的显微操纵器是三维可调装置，拉制的玻璃微管在分离单花粉粒并放入PCR管 的过程中易折断，应用这种装置，分离困难且速度低。相反，D固0NTNo.11254-20型滠子 尖端直径达0.01 mm，可直接分离直径大于0.01 ram的多个物种单花粉粒（图1)。在放大 63倍显微镜下，收集者可以清楚看到载玻片上的单个花粉粒，分离迅速而且可靠，通过开 合镊子2-3次，花粉粒很容易进入到PCR管底的裂解液中，在取下一个花粉粒前在显微牵竟 下检査镊子尖以确保每一个PCR管中有一个花粉粒。 一般情况下，每人每小时平均可以收 集60个花粉粒。

用这种滠子分离花粉粒有一个无法比拟的优点，就是可以感知花粉粒的一些物理特性 如硬度和饱满程度，而这些特性与花粉活力密切相关，对花粉PCR的成功很重要（见下文）。 当花粉粒直径接近或小于镊子尖端直径时，分离速度会降低，如番茄的花粉粒(见图1F). 此外，花粉粒应当完全干燥，否则，尽管镊子尖有一定的柔软度，花粉粒还会变形。

2) 裂解液浓度优化

PCR在所有受试的NaOH和K0H裂解液中（0. 025 M, 0. 05 M， 0,1 M, 0,15 M, 0. 20 M) 均能工作。然而，在NaOH和K0H浓度为0. 1 M和0. 15 M时，PCR条带清楚且无干扰条 带，这与Xin等(2003)的研究结果一致。为验证这个结果，取含0. 1 M NaOH的裂解、液 对所有四个受试甘蔗品种的单花粉粒进行了测试。经过17分30秒的加热预处理，运，亍 PI/PII-PCR程序，所有受试花粉粒PCR均产生了目的条带(见图2, l至36泳道）。而以 lnl水作为裂解液的对照则没有产生任何PCR条带（图片未显示），含lpl裂解液而无花 粉粒的对照也没有产生任何PCR条带（见图2，泳道l， 10， 19, 28,和37;图3，泳道 1, 3, 7， 11， 15和19)。显然，这种裂解液对于花粉粒裂解具有重要作用，并且裂解不 是品种特异性的。含K0H的裂解液则为类似的PCR反应提供了新的选择。

3) 单花粉PCR的添加成分及其影响

为避免加热过程中裂解液体积的损失，在每个PCR管中加入l.O pl裂解液和单花粉 粒后再加入5.0 pl矿物油，对照则不加矿物油。运行PI/PI1-PCR程序，反应混合物用电 泳分离。结果，加矿物油的PCR反应条带清晰且稳定（见图2，泳道1至36)，无矿物油 的PCR反应要么条带模糊，要么没有条带（图片未显示）。有一些物质如NaOH、 Tween-20 以及从花粉壁中释放的物质会抑制PCR反应。在DNA模板纯度不高时，BSA常作为7"a?酶 的稳定剂使用（A1-Soud and R油tr6ffl 2000; Xin et al. 2003)。另--种聚合物PVP，根 据报道可在粗制的DNA样品中消除复杂化合物对7k?酶的干扰（Xin等2003)。本试验在 PCR反应混合物中加入0. 1% BSA和1% PVP,但PCR结果与未加这些物质的对照差别不明 显。考虑到裂解花粉壁的混合物中含多种化学物质，建议在进行花粉PCR反应时加入BSA。

4) PCR预变性和加热裂解时间以及循环数对PCR反应的影响在PI/PI1- PCR反应程序中对儿种不同预变性时间长度进行了测试，结果显示：5分 钟在单花粉PCR反应中效果最好，PCR反应条带丰度更高，这对于有多个条带的PCR反应 如RAPD-PCR很重要。5分钟预变性时间与Xin等（2003)的PCR程序不同。7^<7酶活'性随 95°C保温时间而下降，Roche公司7ag酶的半衰期只有40分钟（Roche Applied Science 2005/2006)。显然，单花粉PCR对95。C保温时间很敏感，因为单花粉PCR扩增需要更多的 循环和更长的时间。

单花粉是具有厚壁的单倍体，因此加热裂解的时间长短和PCR循环数对PCR反应具有 重要作用。利用PI/PII-PCR程序，最好的PCR反应结果出现于加热裂解时间为17分30 秒和PCR循环数为40时（见图2，泳道1至36)。这些泳道都呈现出清晰的条带，尽管 它们来自不同甘蔗品种的单花粉粒。以上结果说明这些单花粉粒在加热裂解时间为17分、 30秒时已经被成功裂解，单花粉粒裂解后释放的DNA模板在40个PCR循环后已被扩增到 一个合适水平。加热裂解时间与PCR循环数的其它组合均未产生理想效果。

5) 花粉粒活性对PCR反应的影响

--些花粉粒染色后显示蓝色，而其它的则不能染色仍显黄色。既然有活力的花粉能吸 收染色液，而无活力的花粉不能（Pline et al. 2002)，我们就专门挑选了一些蓝色的 花粉粒，这些花粉粒通常是圆形的；相反，黄色的花粉粒看起来象三角形并且在用镊子夹 取时容易变成薄片。用PI/PII-PCR程序扩增，蓝色的花粉粒产生了稳定的PCR条带（见 图2，泳道1至36)，而黄色的花粉粒则差异很大（见图2，泳道44至48)。以上结果 用分子方法清楚地显示有活力的花粉粒包含有咖A,并且花粉活力对于PCR的成功至关重 要。为防止花粉发芽，选择了高浓度的苯胺蓝（0.7 niM)以达到快速染色的目的。

6) 高通量单花粉PCR方法在其它物种和PCR程序中的应用

为了测试这种高通量单花粉PCR方法的通用性，我们应用PI/PII-PCR程序对其它五 种可以采集到花粉的植物即玉米、五节芒、青豆、高粱和番茄进行了单花粉PCR扩增，PCR 扩增条件同以上所述的甘蔗品种PCR扩增条件。来自所有这些物种的单花粉均被成功地裂 解并得到了特异扩增目的条带(见图3)。以甘蔗品种HoCP02-618的单花粉粒为模板，用 RAPD- PCR和SSR-PCR程序迸行PCR反应，除热循环参数根据计划进行的相应PCR程序设 定外，其它扩增条件同以上所述的甘蔗品种PCR扩增条件，效果同样良好(见图4) 。RAPD-PCR 揭示了来源于该供体的花粉具有广泛的遗传多样性。据研究者所知，这是首次运用 RAPD-PCR方法证明来源于同一供体的花粉粒遗传不同的RAPD分子标记，而且某些花粉粒 携带有相同的RAPD分子标记(见图4，泳道7和21;泳道13和14)。这也揭示了该方法在 测定来源于同一供体花粉粒的不同基因型的组成比例方面的潜力。我们同时也测试了含 NaOH和K0H裂解液对RAPD-PCR的影响，结果发现没有差别（见图4，泳道17至32〉。

总而言之，我们建立的单花粉高通量PCR检测方法在所有受试的物种包括甘蔗在内都 应用良好，这主要应归功于该方法在单花粉分离效率以及花粉的裂解和PCR稳定性方面的 独特优点，并且也省去了对含痕量DNA的花粉粒进行预扩增的步骤。能够应用多种分子标 记方法对花粉粒基因组的遗传变异进行高通量分析，且费用大幅度降低。如果某一研究需 要对同一批花粉粒的遗传变异进行多种分子标记分析，在单花粉PCR前可以应用全基因组 复制的方法将花粉粒的痕量DNA扩增至400-500倍（Blanco et al. 1989; Esteban et al, 1993; Zhang et al. 1992)。(三）高通量单花粉PCR检测方法的归纳 花粉与植物其它器官相比，在尺寸、结构和活力等许多方面都存在显著不同。所以--个高效的花粉PCR方法应该进行多因素优化，包括花粉染色、裂解溶液、PCR反应成分、

花粉裂解时间和模板变性时间等。

综上所述，本发明研究建立的高通量PCR检测方法具体可以归纳如下：

1、 在显微镜下（63倍）用镊子分离一个完整、千净的未开裂花粉囊放入载玻片上-一 滴染色液（0.7 mM苯胺磷酸氢二铵蓝，30 mM蔗糖）中并挑破囊壁使花粉逸出，将载玻 片放入带盖的培养皿中于28°C培养20-40分钟，后取出载玻片用镊子将染色液小心排净。 留下的花粉粒用15滴灭菌蔗糖液重复清洗，同时调整视野内密度。最后让花粉粒完全干 燥；

2、 吸取1600^1灭菌双蒸水，200^1 1M NaOH (或者1M K0H)和200pl Tween-20 ， 置于2.0 ml离心管中，涡旋片刻即制成裂解液，裂解液体积可依反应个数多少增减，f旦 裂解液中NaOH或者KOH的终浓度为0. 1M， Tween-20终浓度为2%;

3、 用12道取液器分装1^1裂解液于96孔PCR板中，用锡箔胶带密封并离心使裂解 液沉于管底；

4、 在显微镜（63倍）下用镊子(DUMONT No. 11254-20)挑选着色的单花粉粒放入PCR 管底的裂解液中，开合镊子2-3次；

5、 将镊子放回显微镜下检査是否有单花粉附着，随后将镊子尖部浸入装有干净裂解 液的50ml烧杯中摇动清洗，然后再分离另一个单花粉粒；

6、 单花粉粒分离完成后，分装5pl矿物油于96孔PCR板中，短暂离心（1479 g离心 1分钟）;

7、 置96孔PCR板于PCR仪上在9S。C保持17分30秒；

8、 在每一管中加入lplTE缓冲液，离心，然后加入PCR反应成分混合液，调整终体 积为20

9、 短暂离心，置于PCR仪上，PCR反应参数为：95'C保持5分钟进行预变性，热循 环参数根据计划进行的相应PCR程序设定，PCR循环数设定为40，最后72"C延伸10分钟， 保持于4-C;

10、 PCR产物用含0. 5 pg/ml溴化乙啶的1. 5%琼脂糖进行电泳分离并在成像系统上进 行扫描拍照。

按照该操作程序， 一般情况下，每人使用一台PCR仪8小时工作日内可完成三个96 孔PCR板即288个单花粉粒的收集并进行PCR扩增反应。