시트형상 소편, 그 소편을 포함하는 발모 촉진용 시트, 및 그 소편을 포함하는 미백 및 주름 개선제

시트형상 소편, 그 소편을 포함하는 발모 촉진용 시트, 및 그 소편을 포함하는 미백 및 주름 개선제

본 발명은 시트형상 소편, 그 소편을 포함하는 발모 촉진용 시트, 및 미백 및 주름 개선제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 소정의 생리 활성 물질을 국소적으로 흡수시켜 상기 생리 활성 물질의 작용을 발휘시키기 위한 시트형상 소편 및 그 소편을 포함하는 발모 촉진용 시트, 및 미백 및 주름 개선제에 관한 것이다.

나이가 들거나 질병 등에 기인하여 백발이 늘어나고, 두발이 가늘어지고, 두발이 빠져서 전체적으로 개수가 줄어든다는 것이 일어난다. 또한, 원형 탈모증을 비롯한 여러 가지의 질병에 의해 모발이 부분적으로 손실되는 경우도 있다. 또한, 두발뿐만 아니라 기미나 주름이라는 피부의 노화가 진행되는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 피부의 노화는 나이가 드는 것뿐만 아니라 햇볕에 타는 것 등 다른 요인에 의해서도 발생할 수 있다.

특히, 모발이 빠진 후에 굵은 털이 자라 나오지 않을 경우에는 모발이 손실되거나 가늘어지거나 해서 그 부분의 맨살갗이 보이게 된다. 특히, 모발의 색이 짙은 경우에는 털이 가늘어지거나 빠지거나 하고 있는 것이 눈에 띄기 쉽다.

이러한 경우, 모발이 빠지기 전과 동일한 굵기의 모발의 발모를 촉진하는 것은 매우 어려워 가발이 사용되어 왔다. 가발은 두부 전체를 덮도록 머리에 쓰는 타입의 반복 사용할 수 있는 가발과, 식모재를 식부한 베이스 시트와, 이 베이스 시트를 두피에 부착하기 위한 점착층을 구비하는 일회용 가발(이하, 「부분 가발」이라고 하는 경우가 있다)로 대별된다(특허문헌 1 참조).

상기 일회용 가발은 사용에 있어서는 외관상 부자연스러운 느낌을 부여하지 않는 것이 중요하며, 이것을 위해서는 두피로의 양호한 피트성이 요구된다. 현재로는 극박 시트로 이루어지는 베이스 시트와, 상기 베이스 시트에 식부된 식모재와, 상기 베이스 시트의 이면에 형성되는 점착층으로 이루어지는 가발이 제안되어 있다(특허문헌 2 참조. 이하, 「종래기술 1」이라고 한다).

또한, 점착층의 점착력을 비교적 낮추면서 재이용 가능한 부분을 일회용의 부분으로부터 분리함으로써 비교적 장기간의 사용에 견딜 수 있는 재제성 일회용 가발이 제안되어 있다(특허문헌 3, 이하 「종래기술 2」라고 한다).

또한, 기미를 눈에 띄지 않게 하는 미백 화장품, 주름을 개선하는 주름 제거 화장품 등도 여러 가지 성분을 포함하는 것이 시판되어 있다(비특허문헌 1 참조. 이하, 「종래기술 3」이라고 한다).

종래기술 1 및 2는 가발을 사용함으로써 현재 얇아져 버려 있는 두발의 상태를 얇아지기 전의 상태와 같이 보일 수 있다는 점에서는 우수한 기술이다.

그러나 종래기술 1 및 2에서 제안되어 있는 일회용 가발을 사용해도 두발이 얇아지기 전의 상태로 되돌아가는 것은 아니기 때문에 두발의 상태의 변화에 맞추면서 계속해서 사용하지 않으면 안된다는 문제가 있었다.

또한, 종래기술 2에서는 종래기술 1에 대해서 개선이 요망되는 사항의 몇 가지가 해소되어 있지만, 여전히 이용자가 스스로 가발을 두부에 장착하는 것이 곤란한 것에는 변함이 없다. 즉, 가발의 베이스 시트가 30㎛ 정도의 극박의 시트이기 때문에 장착할 때 베이스 시트가 불규칙하게 변형되어버려 이용자가 스스로 가발을 두부에 장착하는 것이 실질적으로 불가능했다. 이 때문에 이용자가 가발의 구입점에 내점하여 전문가에 의해 부착 받지 않으면 안 되었다.

그러나 가발의 부착 시에 남의 눈에 노출되어 부끄러움을 느끼기 때문에 이용자는 내점을 싫어하는 경향이 있다. 대머리, 특히 젊은 대머리의 경우, 이용자는 가발을 장착하고 싶은 원망(願望)이 있지만, 내점해서의 장착이 부끄러워 결국 가발의 장착을 단념하는 일이 많다. 이 결과, 이용자가 되어야 할 자의 행동이 소극적으로 되거나, 어두운 성격이 되거나 하는 것이 알려져 있다.

또한, 원래 두발의 색이 짙을 경우에는 두발이 얇아진 것이 눈에 띄기 쉽고, 두발의 상태에 따라서 연령이 높게 판단되기 때문에 젊은 느낌을 부여하기 위해서 두발을 늘리는 것에 대해서 강한 사회적인 요청이 있었다. 또한, 두발을 늘릴 수 있으면 가발을 사용하는 것도 불필요해져 가발의 장착에 요하는 시간 및 비용을 절약할 수 있기 때문에 이러한 면으로부터의 요청도 크다.

또한, 최근 미백 효과를 나타내는 화장품이 주목받아 많은 종류의 화장품이 시판되어 있지만(종래기술 3), 백반 등의 부작용이 발생하여 큰 문제가 되고 있다. 피부 세포 내에서의 멜라닌 합성을 억제하면 미백 효과가 나타난다고 여겨져 있어 티로시나아제의 활성 억제제 등이 화장품에 배합되어 있다.

그러나 미백이나 주름 제거용의 화장품은 도포 후에 얼얼한 등의 불쾌감이 발생하여 단기간밖에 효과를 유지할 수 없다는 문제점이 있었다. 이 때문에 미백이나 주름 제거용의 화장품에 대한 사회적 요청이 증대하고 있다.

본원발명은 상기와 같은 사정을 기초로 완성된 것이며, 사용함으로써 얇아져버린 두발의 상태를 얇아지기 전의 상태로 회복시킬 수 있는 발모 촉진용 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본원발명의 제 1 실시형태는 탄성 재료로 이루어지는 베이스 시트와; 생리 활성 물질을 함유하며, 또한 상기 베이스 시트측과는 반대 방향으로 연장되는 복수의 마이크로 니들이 형성되고, 상기 베이스 시트의 일방측의 표면 상에 형성된 레저버층과; 상기 레저버층의 상기 베이스 시트측과는 반대측의 표면 상에 메시형상으로 형성되는 접착층과; 상기 레저버층이 형성되어 있는 면과 반대측의 상기 베이스 시트의 면 상에 박리 가능하게 형성된 접착 보조층을 구비하고, 상기 마이크로 니들의 선단부는 상기 접착층으로부터 돌출되어 있는 것을 특징으로 하는 시트형상 소편이다.

여기에서 상기 탄성 재료는 투습성을 갖는 두께 0.1㎜ 미만의 반투명 합성 수지로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 레저버층은 수용성 고분자와, 단당류 또는 이당류의 혼합물, 및 상기 생리 활성 물질의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 수용성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 덱스트린, 덱스트란, 프로테오글리칸, 콘드로이틴황산 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스히알루론산, 및 그들의 생리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다. 상기 단당류 또는 이당류는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 및 이들의 2 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.

또한, 상기 생리 활성 물질은 치수 간세포의 배양 상청액 중에 포함되는 것인 것이 바람직하고, 상기 치수 간세포의 배양 상청액은 동결 건조 분말인 것이 바람직하다. 그리고 상기 치수 간세포는 (i) bmi-1, HPV-E6, 및 HPV-E7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자와, (ii) hTERT 또는 pTERT 중 어느 하나의 유전자의 조합을 도입한 불사화 세포인 것이 바람직하다. 또한, 상기 치수 간세포는 인간 또는 돼지 유래인 것이 바람직하다.

상기 접착층은 의료용 실리콘계 접착제로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 접착 보조층은 스펀지형상 부재로 구성되어 있는 것이 바람직하고, 상기 스펀지형상 부재는 우레탄, 실리콘, 펄프지, 스티로폼, 비닐, 및 천으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 소재로 구성되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 상기 레저버층이 형성되어 있는 면과 반대측의 상기 접착층의 면 상에 박리 가능하게 배치되어 프레임형 형상을 갖는 유지 부재를 더 구비하고, 상기 유지 부재는 상기 접착층으로부터 돌출되어 있는 마이크로 니들의 선단부의 높이보다 긴 두께를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 여기에서 상기 유지 부재를 플라스틱제 또는 금속제 시트형상 부재로 하는 것이 바람직하다. 상기 금속제 시트형상 부재로서는 알루미늄제 부재를 채용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태는 발모 촉진용 시트에 있어서 본 발명의 시트형상 소편을 구비하는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 시트이다. 여기에서 상기 시트형상 소편이 구비하는 베이스 시트에 소정의 밀도로 심어진 인공 모발을 더 구비하도록 할 수 있다. 여기에서 상기 인공 모발이 자외선 경화성의 수지에 의해 상기 베이스 시트에 고정되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 베이스 시트의 밑넓이가 손가락 끝의 표면적과 동등한 면적으로 되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 상기 인공 모발이 상기 접착 보조층을 관통하여 상기 베이스 시트에 심어져 있는 것이 바람직하다. 여기에서 상기 인공 모발은 상기 베이스 시트를 관통하여 상기 베이스 시트의 상기 레저버층측에서 상기 베이스 시트에 고정되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 발모 촉진용 시트에서는 상기 시트형상 소편을 유지하고, 상기 시트형상 소편에 있어서의 접착층으로부터 돌출되어 있는 마이크로 니들의 선단부의 높이보다 긴 두께를 갖는 프레임형 형상의 유지 부재를 더 구비하는 것이 바람직하다. 이러한 유지 부재로서는 플라스틱제 또는 금속제 시트형상 부재인 것이 바람직하다. 여기에서 상기 금속제 시트형상 부재는 알루미늄제인 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 레저버층이 동결 건조 배양 상청액을 함유하는 상기 시트형상 소편을 포함하는 미백 및 주름 개선제이다. 시트형상 소편을 유지하기 위한 유지 부재를 더 구비하는 것이 바람직하고, 상기 유지 부재는 플라스틱제 또는 금속제 시트형상 부재인 것이 바람직하다. 여기에서 상기 금속제 시트형상 부재는 알루미늄제인 것이 바람직하다.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면 여러 가지의 크기로 가공할 수 있기 때문에 두부, 안면 등의 다양한 부위에 적절한 크기로 부착할 수 있고, 생리 활성 물질을 효율 좋게 도입할 수 있는 시트형상 소편을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 두발이 거의 없어져 있거나 또는 얇아지고 있는 부분에 부착함으로써 상기 부분에 있어서의 발모를 촉진할 수 있는 발모 촉진용 시트를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면 기미가 있는 부분이나 주름이 깊은 부분에 부착함으로써 기미나 주름을 옅게 한다는 미백 효과나 주름의 개선 효과를 발휘하는 미백 및 주름 개선제를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 시트형상 소편의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2는 마이크로 니들의 형상을 나타내는 모식도이다. 도 2(A)는 단면도, 도 2(B)는 사시도이다.
도 3은 도 1의 시트형상 소편의 제작 공정을 설명하는 도(그 1)이다.
도 4는 도 1의 시트형상 소편의 제작 공정을 설명하는 도(그 2)이다.
도 5는 본원발명의 발모 촉진용 시트의 제작에서 사용하는 배양 상청액을 생산하는 불사화 간세포의 개체 배가 횟수의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 상기 불사화 간세포에 있어서의 STRO-1의 발현이 개체 배가 횟수(PD)의 증가에 따라 감소하는지의 여부를 확인했을 때의 그래프이다.
도 7은 상기 불사화 간세포의 골형성능이 개체 배가 횟수(PD)의 증가에 따라 감소하는지의 여부를 확인했을 때의 헤마톡실린-에오진 염색의 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 상기 불사화 간세포의 개체 배가수와 상기 배양 상청액의 신생골의 골량 산생능의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 일회용 가발의 기능도 갖는 본 발명의 발모 촉진용 시트의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 10은 도 9의 발모 촉진용 시트의 단면도이다.
도 11은 도 9의 시트형상 소편의 제작 공정을 설명하는 도(그 1)이다.
도 12는 도 9의 시트형상 소편의 제작 공정을 설명하는 도(그 2)이다.
도 13은 인공 모발을 베이스 시트에 식부하는 모양을 나타내는 도(A) 및 (A)에 있어서의 B부의 확대도(B)이다. 인공 모발의 이식을 설명하기 위한 도면이다.
도 14는 도 9의 시트형상 소편의 제작 공정을 설명하는 도(그 3)이다.
도 15는 본 발명의 발모 촉진용 시트를 두부에 부착했을 때의 사진이다.
도 16은 본 발명의 발모 촉진용 시트를 부착 전의 두피의 상태(A), 장착 3일 후의 두피의 상태(B), 장착 7일 후의 두피의 발모 상태(C)를 각각 나타내는 확대 사진이다.
도 17은 본 발명의 발모 촉진용 시트의 두부로의 부착 전후의 변화를 나타내는 사진이다. 도 17(A)는 두정부, 도 17(B)는 귀 뒤의 원형 탈모증 부분에 각각 부착했을 때의 변화를 나타낸다.
도 18은 본 발명의 미백 및 주름 개선제의 형상의 베리에이션을 나타내는 모식도이다. 도 중 (A)는 기미 제거용, (B)는 눈 주위의 주름 개선용, (C)는 팔자주름의 개선용, (D)는 이마의 주름 개선용의 미백 및 주름 개선제를 나타내는 모식도이다.

이하에 본원발명을 더 상세하게 설명한다. 또한, 이하의 설명 또는 도면에 있어서는 동일 또는 동등한 요소에는 동일한 부호를 붙여 중복하는 설명을 생략한다.

도 1에 나타내어지는 바와 같이 본원발명에 의한 시트형상 소편(1)은 (a) 탄성 재료로 이루어지는 베이스 시트(2)와; (b) 생리 활성 물질을 함유하며, 또한 베이스 시트(2)측과는 반대 방향(-Z 방향)으로 연장되는 복수의 마이크로 니들(4n)이 형성되고, 베이스 시트의 일방측(-Z 방향측)의 표면 상에 형성된 레저버층(4)과; (c) 레저버층(4)의 베이스 시트측과는 반대측(-Z 방향측)의 표면 상에 메시형상으로 형성되는 접착층(5)과; (d) 레저버층이 형성되어 있는 면과 반대측(+Z 방향측)의 베이스 시트(2)의 면 상에 박리 가능하게 형성된 접착 보조층(12)을 구비하고 있다. 여기에서 마이크로 니들(4n)의 선단부는 접착층(5)으로부터 돌출하고 있다.

또한, 시트형상 소편(1)은 (e) 레저버층(4)이 형성되어 있는 면과 반대측(-Z 방향측)의 접착층(5)의 면 상에 박리 가능하게 배치되어 프레임형 형상을 갖는 유지 부재(H)를 더 구비하고 있다. 여기에서 유지 부재(H)는 접착층(5)으로부터 돌출되어 있는 마이크로 니들(4n)의 선단부의 높이보다 긴 두께를 갖고 있다.

또한, 복수의 시트형상 소편(1)이 금속성의 판형상 부재 또는 플라스틱제의 판형상 부재 상에 재치된다. 여기에서 상기 판형상 부재에는 시트형상 소편(1)의 유지 부재(H)의 -Z 방향측면이 접착제에 의해 강고하게 접착된다. 이렇게 판형상 부재에 재치된 시트형상 소편(1)은 판형상 부재 상에 유지 부재를 남긴 상태로 판형상 부재로부터 박리되도록 되어 있다.

유지 부재(H)는 상기 시트형상 소편(1)에 형성되어 있는 마이크로 니들(4n)을 보호하기 위해서 시트형상 소편과 일치한 형상의 환형상 부재를 구비하는 플라스틱제 또는 금속제 시트형상 부재인 것이 제품의 중량 및 비용의 면으로부터 바람직하다. 상기 유지 부재가 금속제 시트형상 부재인 경우에는 알루미늄제인 것이 가공하기 쉬움 등의 점으로부터 바람직하다.

상기 베이스 시트(2)를 구성하는 탄성 재료는 투습성을 갖고, 두께가 0.1㎜ 미만인 반투명의 합성 수지라는 3개의 특징을 구비하는 것이 바람직하다. 이것은 이하의 3개의 이유에 의한다.

제 1로 투습성이 없으면 피부에 접착했을 경우에는 후에 땀에 포함되는 수분이 증발하지 않고 차있게 되어버려 불쾌할 뿐만 아니라 피부에도 악영향을 줄 수 있다. 제 2로 두께가 0.1㎜ 이상에서는 피부를 자연스럽게 따라서 접착할 수 없고, 예를 들면 발모 촉진용 시트를 두피에 접착했을 경우나, 미백 및 주름 개선제를 피부에 부착했을 경우에 외관상 상기 발모 촉진용 시트를 사용하고 있는 것이 시인할 수 있는 부자연스러움이 남는다. 제 3으로 반투명의 소재로서 두면, 피부의 어떠한 위치에 부착했을 경우에도 상기 발모 촉진용 시트를 사용하고 있는 것이 눈에 띄지 않는다.

이러한 탄성 소재로서는, 예를 들면 폴리우레탄 수지, 실리콘 수지, 나일론 수지 등을 들 수 있고, 실리콘 소재인 것을 적합하게 사용할 수 있다. 투습성을 갖는 반투명 합성 수지의 두께는 약 20~약 60㎛이면 피부에 대한 피트성이 좋고, 또한 부착하고 있는 것이 눈에 띄지 않기 때문이다. 또한, 이러한 소재를 본 발명의 미백 및 주름 개선제에 사용했을 경우에는, 예를 들면 얼굴에 부착한 후, 그 위로부터 화장을 하는 것도 가능하다.

상기 레저버층(4)은 도 2에 나타내어지는 바와 같이 -Z 방향으로 연장되는 복수의 마이크로 니들(4n)이 형성되어 있다. 마이크로 니들(4n)을 형성하기 위한 오목부는 상부 직경(o1)이 약 0.1~0.3㎜, 저부 직경(o2)이 약 0.03~0.05㎜, 깊이(t2)가 약 0.6~1.0㎜인 원뿔형상을 하고 있고, 격자형상으로 배열되어 있는 것이 바람직하다. 이 오목부는 약 50~100개/㎠인 것이 바람직하다.

레저버층(4)은 수용성 고분자와, 단당류 또는 이당류의 혼합물, 및 상기 생리 활성 물질의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 수용성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 덱스트린, 덱스트란, 프로테오글리칸, 콘드로이틴황산 나트륨, 카르복시메틸렐룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스히알루론산, 및 그들의 생리학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 것이 바람직하다.

이들 성분에 의해 적당한 크기의 마이크로 니들(4n)을 형성시킬 수 있고, 형성된 마이크로 니들(4n)에 의해 후술하는 생리 활성 물질이 효율 좋게 피부에 도입되기 때문이다. 이들 중에서도 히알루론산을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 단당류 또는 이당류는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 및 이들의 2 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 비용 및 자극성의 점으로부터 글루코오스를 사용하는 것이 바람직하다.

상술한 수용성 고분자와, 단당류 또는 이당류의 조성물 중의 상기 단당류 또는 이당류의 함유량은 0.2~4중량%로 하는 것이 마이크로 니들(4n)의 피부 내에 있어서의 용해 시간 및 기계적 강도의 점으로부터 바람직하다. 단당류 또는 이당류의 함유량이 5%를 초과하면 마이크로 니들의 피부 내에서의 용해 시간이 30분 이내로 지나치게 짧아지기 때문에 이들의 함유량을 0.2~4중량%로 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 접착층(5)은 의료용 실리콘계 접착제로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 부착한 후에 염증이 생기거나, 벗긴 후에 피부가 벌게진다는 문제가 발생하지 않기 때문이다. 또한, 상기 접착층(5)의 메시로부터 적절한 크기의 마이크로 니들(4n)이 돌출되어 있는 것이 상기 생리 활성 물질을 효율 좋게 피부에 도입할 수 있기 때문에 바람직하다.

또한, 상기 접착 보조층(12)은 스펀지형상 부재로 구성되어 있는 것이 바람직하며, 취급이 편하고, 안전하며 저비용인 점에서 우레탄, 실리콘, 펄프지, 스티로폼, 비닐, 및 천으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 소재인 것이 바람직하다.

상술한 시트형상 소편(1)은 이하와 같이 해서 제작할 수 있다. 우선, 도 3(A)에 나타내어지는 바와 같이 베이스 시트(2), 레저버층(4), 접착 보조층(12), 유지 부재(H), 및 각종 접착제를 준비한다.

이어서, 베이스 시트(2)의 +Z 방향측 표면에 하나의 접착제를 사용하여 접착 보조층(12)을 박리 가능하게 접착하고, 도 3(B)에 나타내어지는 적층체(1a)를 형성한다. 이렇게 해서 접착 보조층(12)을 형성하는 것이 이후의 레저버층(4) 등을 형성함에 있어서 작업을 효율적으로 행할 수 있는 점으로부터 바람직하다.

이어서, 베이스 시트(2)의 -Z 방향측 표면에 다른 접착제를 사용하여 레저버층(4)을 강고하게 접착하여 도 3(C)에 나타내어지는 적층체(1b)를 형성한다. 계속해서 레저버층의 -Z 방향측면에 있어서의 마이크로 니들(4n)이 형성되어 있지 않은 부분에 메시형상으로 점착제를 도포해서 접착층(5)을 형성하고, 도 4(A)에 나타내어지는 바와 같이 적층체(1c)를 형성한다.

이어서, 적층체(1c)를 소망의 크기로 컷팅한 후, 접착층(5)의 -Z 방향측 표면에 유지 부재(H)를 접착한다. 이 결과, 도 4(B)에 나타내어지는 바와 같이 시트형상 소편(1)이 제작된다.

이렇게 해서 제작된 시트형상 소편(1)을 소망의 두께를 갖는 소망의 크기의 금속성의 판형상 부재 또는 플라스틱제의 판형상 부재 상에 형성된 링형상의 시트 홀더 상에 재치하여 제품으로 한다.

또한, 레저버층(4)에 포함되는 생리 활성 물질은 이하와 같이 해서 얻을 수 있다.

우선, 상기 생리 활성 물질을 포함하는 배양 상청액의 생산에 사용하는 치수 간세포를 준비한다. 이러한 간세포는 (i) bmi-1, HPV-E6, 및 HPV-E7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자와, (ii) hTERT 또는 pTERT 중 어느하나의 유전자의 조합을 도입한 것이다. 이들 유전자의 조합을 도입하면 치수 간세포를 100대 이상 계대할 수 있기 때문이다.

상기 치수 간세포의 제작에 있어서는, 우선 포유류의 치수 세포를 이하와 같이 해서 단리한다. 여기에서 「치수 간세포」란, 재생능을 갖는 치아의 신경에 포함되는 간세포의 일종을 말한다. 치아라는 경질의 재료에 보호되어 있기 때문에 자외선이나 방사선을 통과시키지 않고, 유전자도 손상되기 어렵다는 특성을 갖는다.

상기 유전자 중, hTERT는 인간 텔로미어 수복 효소를, 또한 pTERT는 돼지의 텔로미어 수복 효소를 각각 코딩하는 유전자이다. bmi-1은 Bmi-1(폴리콤 복합체를 구성하는 단백질 중 1개)을 생산하는 유전자이다. Bmi-1은 조혈 간세포의 유지에 필요하며, 활성 증강에 의해 조혈 간세포를 늘릴 수 있다. 또한, HPV-E6 및 E7은 HPV-16 또는 HPV-18의 초기 유전자이며, 이들의 인간 파필로마 바이러스가 자기 복제를 위해 사용하는 초기 유전자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 중에 존재하는 유전자이다.

이하에 인간의 탈락 유치로부터 치수 세포를 사용한 불사화 간세포를 제작하는 경우를 예로 들어서 설명한다.

우선, 상기 탈락 유치를, 예를 들면 클로로헥시딘으로 소독하고, 치관부를 분할하여 치과용 리머로 치수 조직을 회수한다. 이어서, 채취한 치수 조직을 기본 배지, 예를 들면 5~15%의 소 혈청(calf serum, 이하 「CS」라고 하는 경우가 있다) 및 50~150유닛/mL의 항생 물질을 함유하는 둘베코 변법 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 이하 「DMEM」이라고 한다)에 현탁한다.

이어서, 1~5㎎/mL의 콜라게나아제 및 1~5㎎/mL의 디스파제를 사용하여 37℃에서 0.5~2시간 처리한다. 효소 처리 후, 3~10분간의 원심 조작(3,000~7,000회전/분)을 행하여 치수 세포를 회수한다. 필요에 따라 셀 스트레이너를 사용하여 세포의 선별을 행한다. 선별된 세포를, 예를 들면 3~6mL의 상기 기본 배지에서 재현탁하고, 직경 4~8㎝의 부착성 세포 배양용 디시에 파종한다.

계속해서 배양액, 예를 들면 10% FCS를 함유하는 DMEM을 첨가한 후, 5% CO ₂ 인큐베이터에서 37℃에서 2주간 정도 배양한다. 상기 배양액을 제거한 후, PBS 등으로 세포를 1~수회 세정한다. 배양액의 제거 및 세포의 세정 대신에 콜로니를 형성한 접착성의 치수 간세포를 회수할 수도 있다. 접착성의 치수 간세포는, 예를 들면 0.025~0.1%의 트립신과 0.3~1mM의 EDTA로 수분간 37℃에서 처리하여 디시로부터 박리시키고, 이어서 세포를 회수한다.

효소 처리 후에 3~10분간의 원심 조작(3,000~7,000회전/분)을 행하고, 치수 세포를 회수한다. 필요에 따라 셀 스트레이너를 사용하여 세포의 선별을 행한다. 선별된 세포를, 예를 들면 3~6mL의 상기 기본 배지에서 재현탁하고, 직경 4~8㎝의 부착성 세포 배양용 디시에 파종한다.

이어서 배양액, 예를 들면 10% FCS를 함유하는 DMEM을 첨가한 후, 5% CO ₂ 인큐베이터에서 37℃에서 2주간 정도 배양한다. 상기 배양액을 제거한 후, PBS 등으로 세포를 1~수회 세정한다. 배양액의 제거 및 세포의 세정 대신에 콜로니를 형성한 접착성의 치수 간세포를 회수할 수도 있다. 접착성의 치수 간세포는, 예를 들면 0.025~0.1%의 트립신과 0.3~1mM의 EDTA로 수분간 37℃에서 처리하여 디시로부터 박리시키고, 이어서 세포를 회수한다.

이어서, 상기와 같이 선별된 접착성 세포를 배양한다. 예를 들면, 상기와 같이 해서 얻은 치수 간세포를 부착성 세포 배양용 디시에 파종하고, 5% CO ₂ , 37℃의 조건으로 인큐베이터에서 배양한다. 이상과 같이 하여 인간 탈락 유치 간세포의 초대 배양 세포(SHED-P)를 얻을 수 있다.

계대 배양은, 예를 들면 육안으로 관찰해서 서브 컨플루언트 또는 컨플루언트에 도달했을 때에 상기와 같이 트립신과 EDTA를 사용하여 세포를 배양 용기로부터 박리시켜서 회수하고, 다시 배양액을 넣은 배양 용기에 파종한다.

여기에서 서브 컨플루언트란, 배양 용기 중의 세포 부착면의 약 70%에 세포가 부착된 상태를 말한다. 예를 들면, 계대 배양을 1~8회 행하여 선별된 세포를 필요한 세포 수, 예를 들면 약 1×10 ⁷ 개/mL 까지 증식시킨다. 이상과 같이 배양한 후에 세포를 회수해서 액체 질소 중에서 보존한다. 여러 가지 도너로부터 회수한 세포를 치수 간세포 뱅크의 형태로 보존하는 것으로 해도 좋다.

(i) bmi-1, HPV-E6, 및 HPV-E7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자와, (ii) hTERT 또는 pTERT 중 어느 하나의 유전자의 조합은 이하와 같이 해서 도입할 수 있다. 우선, 상기 유전자의 조합을 장착하기 위한 플라스미드를 조제하고, 이것을 셔틀 벡터, 예를 들면 pShuttle 2에 장착하여 클로닝을 행한다. 그 후, pShuttle 2에서 대장균을 형질 전환하고, 카나마이신을 마커로서 카나마이신 내성 형질 전환체(이하, 「Kn+」라고 한다)를 선택한다. 이 Kn+의 DNA를 정제하고, 제한 효소 부위를 해석하여 생성된 재조합을 동정한다.

이어서, 예를 들면 PI-Sce I 및 I-Cue I를 사용해서 발현 카세트를 상기 셔틀 벡터로부터 잘라내고, 이 발현 카세트를, 예를 들면 아데노 바이러스 벡터의 DNA에 라이게이션하여 Adeno-X viral DNA를 얻는다. 얻어진 라이게이션 산물(Adeno-X viral DNA)을, 예를 들면 Swa I로 절단하고, 절단 산물을 사용하여 대장균을 트랜스포메이션해서 형질 전환체를 얻는다.

얻어진 형질 전환체 중으로부터, 예를 들면 암피실린을 사용하여 암피실린 내성이질 전환체(이하, 「Amp+」라고 한다)를 선택해서 정제하고, 제한 효소 부위를 해석해서 재조합체를 동정한다. 이어서, 예를 들면 Pac I에서 재조합 아데노 바이러스를 소화하고, 얻어진 단편을 HEK293 세포에 트랜스펙트해서 증식시키고, 이것을 모아서 상기 바이러스의 역가를 측정한다. 상법에 따라서 상기 바이러스를 정제하고, 표적 세포인 SHED-P에 감염시킨다.

바이러스 감염 후의 HEK293의 세포군을 상법에 따라서 FITC로 염색하고, 플로 사이토미터를 사용하여 STRO-1 양성 세포를 검출한다. 여기에서 STRO-1은 골수에 있어서의 다분화능을 갖는 간엽계 간세포의 마커 중 1개로서 여겨지고 있고, 세포의 불사화의 지표가 된다. 이상의 순서에 의해 치수 유래의 불사화 간세포를 얻을 수 있다.

이어서, 얻어진 불사화 간세포를 상술한 기본 배지, 예를 들면 10% FBS를 첨가한 DMEM을 사용하여 5% CO ₂ , 37℃의 조건하에 24~48시간 배양하여 배양 상청액을 얻는다. 배양 상청액의 회수는, 예를 들면 코마고메 피펫 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 불사화 간세포는 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1), 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β), 및 간세포 증식 인자인 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2 이상의 성장 인자를 배양 상청액 중에 분비한다. 여기에서 「성장 인자」란, 세포 분열을 촉진시키거나 형태의 변화나 비대를 초래하거나 하는 폴리펩티드의 총칭이다. 성장 인자를 생산하는 세포의 종류에 따라 인자는 상이하고, 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 신경 성장 인자(NGF), 종양 증식 인자(TGF) 등으로 대별된다.

또한, 각 세포의 세포막에 있는 수용체는 티로신 키나아제 활성을 갖고, 성장 인자가 결합하면 단백질의 티로신 잔기가 인산화되어 세포의 증식이나 분화를 야기한다. 성장 인자가 개체 발생에 있어서 중배엽 유도 물질로 되어 있는 예가 몇 가지 알려져 있다. 또한, 면역계를 조절하는 림포카인 개체 발생에 있어서 중배엽 유도 물질로 되어 있는 예가 몇 가지 알려져 있다. 이러한 성장 인자는 공지의 ELISA법, 마이크로 어레이법 등으로 정량할 수 있다.

상기 IGF-1은 인슐린과 배열이 고도로 유사한 폴리펩티드이며, 세포 배양에서 인슐린과 마찬가지로 유사 분열 유발 등의 반응을 야기한다. 신경 세포의 성장에도 영향을 주는 것이 알려져 있다. 또한, 상기 VEGF는 배(胚)의 형성기에 혈관이 없는 곳에 새로운 혈관을 형성하는 맥관 형성 및 기존의 혈관으로부터 분지 신장하여 혈관을 형성하는 혈관 신생에 관여하는 일군의 당단백질이다.

상기 TGF-β는 또한 많은 세포에 대한 강력한 증식 억제 인자가 되고, 세포의 분화·유주·접착에도 밀접하게 관여하여 개체 발생이나 조직 재구축, 창상 치유, 염증·면역, 암의 침윤·전이 등의 폭넓은 영역에 중요한 역할을 담당하고 있다. 또한, HGF는 간세포뿐만 아니라 여러 가지 세포에 대해서 세포 증식 촉진, 세포 운동 촉진, 항아포토시스(세포사), 형태 형성 유도, 혈관 신생 그밖의 조직·장기의 재생과 보호를 담당하는 다재한 생리 활성을 갖고 있다.

상술한 각종 간세포를, 예를 들면 15% FCS를 첨가한 DMEM 중에서 37℃에서 소정의 기간 배양함으로써 상기 성장 인자를 포함하는 배양 상청액을 얻을 수 있다. 또한, 상기 간세포의 배양 상청액에는 IGF-1, VEGF, TGF-β, 및 HGF 이외에도 약 70종류의 단백질이 포함된다.

얻어진 배양 상청액 중 15mL를 Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(Millipore Corporation제)에 넣고, 4,000xg에서 약 60분간 원심하여 약 200㎕까지 농축한다. 이어서, 이 튜브에 배양 상청액과 동량의 멸균 PBS를 투입하고, 다시 4,000xg에서 약 60분간 원심하여 용매를 PBS로 치환한다. 얻어진 200㎕의 용액을 마이크로 테스트 튜브에 회수하여 농축 간세포 배양 상청액으로 한다.

상기 Amicon을 사용하는 방법 대신에 에탄올 침전법으로 농축할 수도 있다. 예를 들면, 5mL의 배양 상청액에 대해서 45mL의 100% 에탄올을 첨가해서 혼화하고, -20℃에서 60분간 방치한다. 그 후, 15,000xg에서 15분간 4℃에서 원심하여 상청액을 제거한다.

이어서, 예를 들면 10mL의 90% 에탄올을 첨가해서 잘 교반하고, 다시 15,000xg에서 5분간, 4℃에서 원심한다. 상청액을 제거하고, 얻어진 펠릿을, 예를 들면 500㎕의 멸균수에 용해할 수 있다. 용해 후, 전량을 마이크로 테스트 튜브에 회수하여 농축 간세포 배양 상청액으로 한다.

이상과 같이 해서 얻어진 배양 상청액을 상법에 따라서 동결 건조하고, 용 시 조정의 조성물로 할 수 있다. 얻어진 조성물은 본 발명의 시트형상 소편(1)으로 사용하는 레저버층(4)의 형성에 사용할 수 있다.

구체적으로는 상기 수용성 고분자와, 단당류 또는 이당류를 소정의 비율로 혼합하고, 여기에 동결 건조한 상기 배양 상청액 분말을 혼합하여 레저버층 형성 용 재료를 조제한다. 예를 들면, 히알루론산, 폴리비닐알코올 등의 수용성 고분자에 약 0.2~4중량%의 글루코오스 또는 덱스트란을 혼합하고, 여기에 소망량의 상기 배양 상청액의 동결 건조 분말을 혼합하여 레저버층 형성용 재료로 한다.

이어서, 감광성 수지로 시트를 형성시킨 후에 포토리소그래피법을 사용해서 도 2(A)에 나타내는 바와 같은 형상의 마이크로 니들 패턴을 제작한다. 그 후, 전기 주조 가공에 의해 이 패턴을 전사하여 마이크로 니들 형성용의 주형을 제조한다. 이 주형은 한 변을 약 8~20㎝로 하는 것이 작업 효율의 점으로부터 바람직하다. 또한, 마이크로 니들(4n)을 형성하기 위한 오목부는 상부 직경(o1)이 약 0.1~0.3㎜, 저부 직경(o2)이 약 0.03~0.05㎜, 깊이(t2)가 약 0.6~1.0㎜인 원뿔형상을 이루고 있으며, 격자형상으로 배열되어 있는 것이 바람직하다. 이 오목부는 약 50~100개/㎠인 것이 바람직하다(도 2(B) 참조).

상기 레저버층 형성용 재료에 물을 첨가하고, 약 5~20%의 고형분을 포함하는 수용액을 조제하여 실온에서 상기 주형에 흘려 넣고, 수분을 증발시켜서 건조시켜 그 후에 주형으로부터 박리시키면 마이크로 니들(4n)이 형성된 레저버층(4)을 얻을 수 있다.

또한, 이상과 같이 해서 제작된 시트형상 소편(1)은 사용하는 상기 생리 활성 물질의 양을 조절함으로써 발모 촉진용 시트 또는 미백 및 주름 개선제의 일실시형태로서 사용할 수 있다. 그래서 이하의 설명에서는 시트형상 소편(1)을 적당히 「발모 촉진용 시트 1」 또는 「미백 및 주름 개선제 1」이라고도 기록한다.

이어서, 발모 촉진용 시트의 다른 실시형태에 대해서 설명한다. 도 9에는 발모 촉진용 시트의 다른 실시형태인 발모 촉진용 시트(10)의 구성이 나타내어져 있다. 도 9에 나타내어지는 바와 같이 발모 촉진용 시트(10)는 상술한 시트형상 소편(1)과; 복수의 인공 모발(6)을 구비하고 있다.

상기 인공 모발(6)은 도 10에 나타내어지는 바와 같이 베이스 시트(2)에 소정의 밀도로 심어져 있다. 이 도 10에 나타내어지는 바와 같이 인공 모발(6)은 베이스 시트(2) 및 접착 보조층(12)을 관통하고 있어 베이스 시트(2)의 -Z 방향측 표면에 있어서 베이스 시트(2)에 고정되어 있다.

상기 발모 촉진용 시트(10)는 전체를 두피에 접착시켜서 사용하는 것이 전제로 되기 때문에 스킨 베이스를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 발모 촉진용 시트(10)의 두께는 20~60㎛인 것이 접착성의 양호함과 착탈 시의 견고함의 밸런스의 면에서 바람직하고, 30~40㎛인 것이 더욱 바람직하다.

여기에서 소정의 밀도는 발모 촉진용 시트(10)를 부착하는 부위의 발모 상태에 의존해서 적당히 결정된다. 일반적으로는 일본인의 전체 머리카락 수는 약 10만개라고 하며, 머리카락 밀도(1㎠당 개수)는 머리 두정부에서 133~249개(평균 199개), 전두부에서 114~250개(평균 183개), 후두부에서 137~235개(평균 172개), 측두부 106~217개(평균 130개)라는 측정값이 공표되어 있다. 이러한 숫자를 참고로 해서 적당히 선택하면 좋다.

또한, 인공 모발(6)은 폴리에스테르 섬유, 염화비닐 섬유, 아크릴 섬유, 난연 폴리에스테르 섬유 등 가발의 제작에 일반적으로 사용되어 있는 섬유를 사용할 수 있고, 폴리에스테르 섬유를 사용하는 것이 비용면으로부터 바람직하다.

또한, 인공 모발(6)은 자외선 경화성의 수지에 의해 베이스 시트(2)에 고정되는 것이 바람직하다. 이렇게 해서 자외선 경화성을 사용함으로써 인공 모발(6)의 빠짐을 방지하면서 효율 좋게 식모한 인공 모발(6)을 고정할 수 있기 때문이다.

상기한 발모 촉진용 시트(10)는 이하와 같이 해서 제작할 수 있다. 우선, 도 11(A)에 나타내어지는 바와 같이 베이스 시트(2), 레저버층(4), 접착 보조층(12), 유지 부재(H), 복수의 인공 모발(6), 및 각종 접착제를 준비한다.

이어서, 베이스 시트(2)의 +Z 방향측 표면에 하나의 접착제를 사용하여 접착 보조층(12)을 박리 가능하게 접착하고, 도 11(B)에 나타내어지는 적층체(1a)를 형성한다. 계속해서 적층체(1a)의 접착 보조층(12) 및 베이스 시트(2)를 관통하도록 복수의 인공 모발(6)을 소정의 밀도로 심고, 도 12(A)에 나타내어지는 중간재(10a)를 제작한다.

이러한 적층체(1a)로의 인공 모발(6)의 이식에는, 예를 들면 V형 식모법에 의해 행해진다. 이러한 V형 식모법에 의한 식모에 있어서는 도 13에 나타내어지는 바와 같이 일정 길이로 절단된 인공 모발(6)을 베이스 시트(2)의 -Z 방향측에 있어서 Z축 방향으로 이동 가능한 1쌍의 안내 바늘(15)에 록킹시킨다. 그 상태로 인공 모발(6)을 록킹한 채, 안내 바늘(15)을 +Z 방향으로 이동시킨다. 이 결과, 안내 바늘(15)은 인공 모발(6)의 근부(6a)를 베이스 시트(2)의 -Z 방향측에 남기면서 +Z 방향으로 이동하여 뽑힌다. 이후 베이스 시트(2)의 -Z 방향측에 남은 근부(6a)에 자외선 경화 접착제를 도포하고, 자외선을 조사해서 경화시킨다. 이렇게 해서 적층체(1a)로의 인공 모발(6)의 이식이 행해진다.

도 12로 되돌아와, 중간재(10a)가 제작되면 중간재(10a)의 베이스 시트(2)의 -Z 방향측 표면에 접착제를 사용하여 레저버층(4)을 강고하게 접착하고, 도 12(B)에 나타내어지는 중간재(10b)를 제작한다. 이때, 상기 베이스 시트(2)의 이면 전체 면에 상술한 마이크로 니들(4n)을 구비하는 두께가 균일한 층을 겹쳐서 레저버층(4)을 형성하는 것이 접착성의 향상과 자연스러운 외관을 확보함에 있어서 바람직하다. 또한, 상기 두께는 베이스 시트(2)의 두께의 1.5~2배 정도(약 45~80㎛)로 하는 것이 본 발명의 발모 촉진용 시트의 인장 강도를 유지하는 것 및 상기 인공 모발 (「헤어재」라고 하는 것이 있다)(6)을 안정시킬 수 있는 점에서 바람직하다.

계속해서, 중간재(10b)의 레저버층(4)의 -Z 방향측면에 있어서의 마이크로 니들(4n)이 형성되어 있지 않은 부분에 메시형상으로 점착제를 도포해서 접착층(5)을 형성하여 도 14(A)에 나타내어지는 중간재(10c)를 제작한다.

이어서, 중간재(10c)를 소망의 크기로 컷팅한 후, 중간재(10c)의 접착층(5)의 -Z 방향측 표면에 유지 부재(H)를 접착한다. 이 결과, 도 14(B)에 나타내어지는 바와 같이 발모 촉진용 시트(10)가 제작된다.

이렇게 해서 제작된 발모 촉진용 시트(10)를 소망의 두께를 갖는 소망의 크기의 금속성의 판형상 부재, 또는 플라스틱제의 판형상 부재 상에 형성된 링형상의 시트 홀더 상에 재치하여 제품으로 한다.

본 발명의 발모 촉진용 시트(10)는 접착층(5)이 격자형상으로 형성되어 있기 때문에 피부로부터 드러난 모발이 자라는 것을 필요 이상으로 억제할 일이 없다. 그 결과, 신속한 발모를 실현할 수 있다.

또한, 상기 발모 촉진용 시트(10)의 제작의 공정으로부터 상기 베이스 시트(2)에 인공 모발(6)을 심는 공정을 생략하고, 사용하는 상기 생리 활성 물질의 양을 조절함으로써 본 발명의 미백 및 주름 개선제를 제작할 수 있다. 제작된 미백 및 주름 개선제는 도 18(A)~도 18(D)에 나타내는 바와 같이 용도에 따라 여러 가지 크기로 컷팅할 수 있고, 시트형상 소편(1)의 경우와 마찬가지로 유지 부재(H) 상에 얹어 제품으로 할 수 있다.

실시예 1

(불사화 SHED의 작출(作出) 및 배양 방법)

(1) 바이러스 도입용 벡터의 제작

(1-1) 플라스미드 추출용 시약

카나마이신(Kan), 암피실린(Amp), LB 액체 배양지 및 LB 한천 배지, 글리코겐, 아가로오스, 멸균수, 아세트산 암모늄, 아세트산 나트륨, 도데실황산 나트륨, 및 RNase A를 사용했다. 50㎎/mL의 카나마이신(Kan) 및 암피실린(Amp)을 조제하고, 스톡 용액으로서 -20℃에서 보존했다. 글리코겐은 20㎎/mL로 조제했다. 10㎎/mL의 RNase A를 조제해서 -20℃에서 보존했다. 10M(포화) 아세트산 암모늄(NH ₄ OAc), 3M의 아세트산 나트륨(NaOAc; pH5.2)을 조제했다.

(1-2) 제한 효소 등

대장균 컴피턴트 셀(Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells, 제품 코드 636756), Swa I(제품 코드 1111A, Smi I이 동등품), Xho I(제품 코드 1094A), T4 DNA Ligase(제품 코드 2011A), NucleoBond Xtra Midi(제품 코드 740410.10/.50/.100), NucleoSpin Plasmid(제품 코드 74058810/50/250)는 모두 Takara Bio Inc.로부터 구입했다. Pac I은 New England Biolabs로부터 구입했다.

(1-3) 버퍼 등

1×TE Buffer(1mM의 EDTA를 포함하는 10mM Tris-HCI[pH 8.0]), 100mM Tris-HCI(pH 8.0)로 포화한 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1, 이하 「PCI 혼합액」이라고 한다)을 조제했다. 에탄올은 100% 및 70%로 사용했다. 미니 스케일로의 재조합에서 사용하는 pAdeno-X 플라스미드 DNA의 정제용에 이하의 버퍼 1~4를 조제했다.

버퍼 1: 10mM EDTA 및 50mM 글루코오스를 포함하는 25mM Tris-HCI(pH 8.0)(오토클레이브 후, 4℃에서 보존)

버퍼 2: 1% SDS를 포함하는 0.2M NaOH(사용 직전에 용시 조제, 밀봉하고, 실온 보존)

버퍼 3: 5M KOAc(오토클레이브 후, 4℃에서 보존)

버퍼 4: 1mM EDTA, 20㎍/mL RNase를 포함하는 10mM Tris-HCI(pH 8.0)

(사용 직전에 RNase를 첨가한다. -20℃에서 보존)

(2) 아데노 바이러스 정제 및 β-gal 분석용 시약

인간 5형 아데노 바이러스로 형질 전환한 인간 HEK293 세포(ATCC #CRL1573)를 사용했다. HEK293 세포는 완전 배지에서 배양했다. 완전 배지의 조성은 100unit/mL의 페니실린G나트륨과 100㎍/mL의 스트렙토마이신, 4mML의 글루타민, 및 10% FBS를 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 기본 배지)으로 했다. 페니실린G나트륨 용액은 10,000units/mL, 황산 스트렙토마이신 용액은 10,000㎍/mL로 조제하고, 스톡 용액으로서 보존했다. 배양에는 60㎜ 플레이트, 100㎜ 플레이트, 6-웰 플레이트, T75 및 T175 플라스크를 사용했다.

트립신-EDTA(제품 코드 CC-5012)는 Takara Bio Inc.로부터 구입했다. 인산 완충 생리 식염수(PBS, Ca ^{2 +} 및 Mg ^{2 +} 불포함) 및 Dulbecco's 인산 완충 생리 식염수(DPBS, Ca ^{2 +} 및 Mg ^{2 +} 함유)를 조제했다. 또한, 0.33%의 뉴트럴 레드 염색액, 0.4% 트리판 블루 염색액을 사용했다. β-gal 어세이에는 X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(25㎎/mL)) 디메틸포름아미드(DMF) 용액은 -20℃에서 차광 보존했다. Luminescent β-gal Detection Kit II(제품 코드 631712, Takara Bio Inc.제)를 사용했다.

(3) 예비 시험

(3-1) lacZ를 포함하는 재조합 아데노 바이러스(pAdeno-X-lacZ)의 구축

10mL의 상술한 완전 배지에 해동 후, DMSO를 제거한 HEK293 세포를 재현탁하고, 전량을 직경 100㎜의 배양 플레이트에 옮겼다. HEK293 세포가 부착된 후에 배양액을 제거하고, 세포를 멸균 PBS로 한번 세정하고, 1mL의 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 약 2분간 처리했다. 이어서, 10mL의 완전 배지를 추가하여 트립신의 반응을 멈추고 온화하게 현탁했다. 바이어블 카운트를 행하고, 배양액 10mL를 넣은 직경 100㎜의 플레이트에 10 ⁵ 개의 세포를 옮기고 균일하게 펼쳤다.

pShuttle2-lacZ(Adeno-X Expression System 1에 포함되어 있는 양성 대조 벡터)와 키트에 포함되어 있는 Adeno-X Viral DNA(PI-Sce I 및 I-Ceu I digested)를 사용하고, 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 lacZ를 포함하는 재조합 아데노 바이러스를 구축했다. 표적 세포인 SHED에 감염시켜 β-갈락토시다아제의 발현을 분석하여 벡터가 구축되어 있는 것을 확인했다.

(3-2) 재조합 pShuttle 2 플라스미드의 구축

재조합 pShuttle 2 Vector(이하, 「rpShuttle 2 Vector」라고 한다)의 구축 전에 키트에 포함되어 있는 pShuttle 2 Vector 및 pShuttle 2-lacZ Vector로 DH5α 대장균을 형질 전환했다. 50㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트(이하, 「LB/Kan」이라고 한다) 상에서 형질 전환체를 선택하고, 단일 콜로니로부터 취한 균체를 새로운 LB/Kan로 획선하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트했다.

이어서, hTERT, bmi-1, HPV-E6, HPV-E7을 pShuttle 2에 이하의 순서로 클로닝했다. 이들의 유전자에 적합한 제한 효소로 pShuttle 2 Vector를 절단했다. 이어서, 상기 키트에 첨부되어 있는 pShuttle 2 Vector Information Packet(PT3416-5)을 참조하고, 삽입하는 DNA에 합치하는 멀티 클로닝 사이트를 결정했다. 제한 효소 처리가 완료된 상기 플라스미드를 알칼리 포스파타제로 처리해서 정제했다.

상법에 따라 표적 DNA 단편을 조제하여 정제했다. 상기 제한 효소로 소화한 벡터와 상기 유전자 단편을 라이게이션하고, DH5α 세포(컴피턴트 세포)를 라이게이션 산물로 형질 전환했다. 상기 컴피턴트 세포의 일부를 취하여 키트에 포함되어 있는 대조 벡터 pShuttle2-lacZ Vector로 형질 전환해서 양성 대조로 했다.

형질 전환한 대장균을 포함하는 혼합액을 LB/Kan 한천 플레이트에 접종하고, 카나마이신 내성(Kanr)의 형질 전환체(콜로니)를 선택했다. 5~10개의 Kan 내성 클론을 선택하고, 소량의 액체 배지에 접종해서 증폭했다. 이들의 클론이 rpShuttle 2 Vector를 갖고 있는 것을 확인한 후에 하룻밤 인큐베이트했다. 그 후, 시판의 실리카 흡착 컬럼을 사용하여 상법에 따라 구축된 플라스미드 DNA를 정제했다.

이 플라스미드 DNA를 제한 효소로 처리하고, 1% 아가로오스겔 전기 영동을 행하여 소망의 재조합 플라스미드를 동정했다. 시퀀싱에 의해 삽입한 단편의 방향과 삽입 부위를 확인하여 포지티브 클론을 동정했다. 재조합 pShuttle 2 플라스미드 DNA(이하, 「rpShuttle 2 플라스미드 DNA」라고 한다)를 타겟 세포에 직접적으로 트랜스펙트하고, 웨스턴블롯을 행하여 목적 단백질의 발현을 예비적으로 체크했다.

(3-3) rpShuttle 2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I 이중 소화

상기와 같이 해서 제작한 rpShuttle 2 플라스미드 DNA로부터 도입한 유전자의 발현 카세트를 PI-Sce I 및 I-Ceu I로 잘라냈다. 키트에 첨부된 프로토콜에 기재된 in vitro 라이게이션법에 따라서 잘라낸 발현 카세트를 Adeno-X Viral DNA에 장착했다. rpShuttle 2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I 이중 소화액을 30㎕ 조제하고, 하기 표 1에 기재한 시약을 1.5mL의 멸균 후 마이크로 원심 튜브에 넣어서 혼합했다.

이어서, 충분히 혼화한 후에 마이크로 원심 튜브에 넣어서 가볍게 원심하고, 그 후, 37℃에서 3시간 인큐베이트했다. 1kb 러더(DNA 사이즈 마커)와 함께 상기 이중 소화 후의 반응액(5㎕)을 1% 아가로오스/EtBr겔로 영동했다.

(3-4) 페놀:클로로포름:이소아밀알코올 추출

원심 튜브에 상술한 이중 소화액의 나머지(25㎕)에 70㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가하고, 보텍스로 충분히 교반했다. 이어서, 미량 원심기를 사용하여 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5mL의 마이크로 원심 튜브에 옮겼다. 여기에 400㎕의 95% 에탄올, 25㎕의 10M 아세트산 암모늄, 및 1㎕의 글리코겐(20㎎/mL)을 첨가하고, 보텍스로 충분히 교반했다.

이어서, 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 상청액을 흡인해서 제거하여 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 300㎕의 70% 에탄올을 첨가해서 실온에서 14,000rpm으로 2분간 원심했다. 상청액을 주의 깊게 흡인해서 제거하고, 펠릿을 실온에서 대략 15분간 풍건했다.

펠릿이 건조된 후에 이것을 10㎕의 멸균한 1×TE Buffer(pH 8.0)에 용해하고, 사용할 때까지 -20℃에서 보존했다.

(4) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 구축

(4-1) Adeno-X 바이러스 게놈으로의 발현 카세트의 서브 클로닝

하기 표 2에 나타내는 시약을 순서대로 1.5mL의 멸균 후 마이크로 원심 튜브에 넣어 온화하게 혼화하고, 가볍게 원심한 후에 16℃에서 하룻밤 인큐베이트했다.

각 샘플에 90㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가해서 보텍스로 온화하게 교반했다. 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5mL의 마이크로 원심 튜브에 옮기고, 여기에 400㎕의 95% 에탄올, 25㎕의 10M 아세트산 암모늄, 및 1㎕의 글리코겐(20㎎/mL)을 첨가하고, 보텍스로 온화하게 교반했다.

4℃에서 5분간 14,000rpm으로 원심하고, 상청액을 흡인에 의해 제거하여 펠릿을 얻었다. 이하의 에탄올 침전 조작은 상기(3-4)와 마찬가지로 행했다. 펠릿이 건조된 후에 이것을 15㎕의 멸균 탈이온수에 용해했다.

(4-2) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 Swa I 소화

하기 표 3에 나타내는 소화액을 조제하고, 원심 튜브에 넣은 각 샘플에 첨가하여 2시간, 25℃에서 인큐베이트했다.

각 샘플에 80㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가해서 보텍스로 온화하게 교반했다. 마이크로 원심 튜브, 4℃에서 5분간 14,000rpm으로 원심했다. 이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (3-4)와 마찬가지로 행하고, 펠릿의 용해액은 사용할 때까지 -20℃에서 보존했다.

(4-3) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA에 의한 대장균의 형질 전환의 확인

일렉트로포레이션용 컴피턴트 셀(대장균)을 Supercharge EZ10 Electrocompetent Cell(제품 코드 636756)을 사용하여 상기 (4-2)에서 얻은 Swa I 소화 산물로 형질 전환했다. 형질 전환 혼합액을 LB 배지에 암피실린(마지막 농도 100㎍/mL)을 첨가한 한천 플레이트(이하, 「LB/Amp 한천 플레이트」라고 한다)에 접종하여 37℃에서 하룻밤 인큐베이트했다. 암피실린 내성(Ampr) 형질 전환체로서 약 10 ⁶ 개의 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를 제품에 부속된 Adeno-X System PCR Screening Primer Set로 체크했다.

5mL의 신선한 LB/Amp 액체 배지에 단일의 콜로니로부터의 균체를 접종하고, 하룻밤 배양했다. 다음날 후술하는 미니 스케일법에 따라 Adeno-X 플라스미드 DNA를 정제했다.

(4-4) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 미니 스케일 조제

대수 증식에 있는 배양액 5mL를 14,000rpm으로 30초간 원심하고, 상청액을 제거했다. 펠릿을 다시 10,000rpm으로 1분간 원심하고, 마이크로 피펫을 사용하여 상청액을 제거했다. 여기에 150㎕의 상기 버퍼 1을 첨가해서 온화하게 피펫팅하고, 재현탁했다. 이 세포 현탁액에 150㎕의 버퍼 2를 첨가하고, 온화하게 전도 혼화하여 빙상에 5분간 방치했다. 냉각한 세포 현탁액에 150㎕의 버퍼 3을 첨가하고, 다시 전도 혼화하여 빙상에 5분간 방치했다.

이 세포 현탁액을 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 투명한 상청액을 청정한 1.5mL의 원심 튜브에 옮겼다. 이 상청액에 450㎕의 PCI 혼합액을 첨가하고, 전도 혼화해서 교반했다. 그 후, 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5mL의 마이크로 원심 튜브에 옮겼다.

이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (4-1)와 마찬가지로 조작을 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다. 목적의 rDNA는 후술하는 제한 효소에 의한 해석 및 PCR에 의해 동정했다.

(5) 얻어진 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 제한 효소 부위 해석

PI-Sce I 및 I-Ceu I를 사용하여 해석을 행했다. 하기 표 4에 나타내는 시약을 1.5mL의 멸균이 완료된 마이크로 원심 튜브에 넣어 30㎕의 PI-Sce I/I-Ceu I 이중 소화 반응액을 첨가하여 충분히 교반하고, 가볍게 회전시켜서 내용물을 모았다.

37℃에서 3시간 인큐베이트하고, 제한 효소 처리를 행했다. 이 처리 후의 반응액을 1% 아가로오스/EtBr겔로 영동했다.

(6) 재조합 아데노 바이러스의 생산

(6-1) HEK293 세포트랜스펙트용 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 조제

하기 표 5에 나타내는 시약 등을 1.5mL의 멸균이 완료된 원심 튜브에 넣어서 혼합하고, 미량 원심기에서 가볍게 원심했다. 그 후, 37℃에서 2시간, 인큐베이트하고, rAdeno-X 플라스미드 DNA의 Pac I 제한 효소 처리를 행했다.

60㎕의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100㎕의 PCI 혼합액을 첨가하고, 보텍스로 온화하게 교반하고, 미량 원심기로 4℃에서 5분간 14,000rpm으로 원심했다. 수층을 청정한 1.5mL의 멸균이 완료된 원심 튜브에 주의 깊게 옮겼다.

이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (3-4)와 마찬가지로 조작을 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다.

(6-2) Pac I 소화 Adeno-X 플라스미드 DNA의 HEK293 세포로의 트랜스펙션

상기 플라스미드 DNA의 트랜스펙션의 24시간 전에 직경 60㎜의 배양 플레이트당 세포 수가 1~2×10 ⁶ (대략 100cells/㎟)이 되도록 HEK293 세포를 접종하고, 37℃, 5% CO ₂ 존재하에서 인큐베이트했다.

각 배양 플레이트에 Pac I 소화한 10㎕의 Adeno-X 플라스미드 DNA를 트랜스펙트하고, 표준적인 트랜스펙션법(CalPhos Ma㎜alian Transfection Kit 제품 코드 631312, Takara Bio Inc.제)에 따라 HEK293 세포에 Adeno-X DNA를 도입했다. 트랜스펙션의 다음날로부터 CPE(세포 변성 효과)가 일어나 있는지의 여부를 확인했다. 1주일 후에 배양 플레이트의 저면이나 측면에 부착하고 있는 세포를 온화하게 교반해서 유리시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 15mL의 멸균이 완료된 원뿔 원심 튜브에 옮기고 실온에서 5분간 1,500×g으로 원심했다.

얻어진 침전을 500㎕의 멸균 PBS에 현탁했다. 드라이 아이스/에탄올 중에서 동결시켜 37℃의 항온조에서 융해시킨다는 동결 융해 조작을 3회 반복하여 세포를 충분히 융해시킨 라이세트를 얻었다. 이어서, 가볍게 원심해서 부유물을 제거하고, 상청액을 멸균한 다른 튜브에 옮겨 바로 사용했다. 바로 사용하지 않는 분은 -20℃에서 보존했다. 60㎜ 플레이트의 배양 세포에 250㎕의 상기 라이세트를 첨가해서 배양을 계속했다. 또한, Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드 631028, Takara Bio Inc.제)에 포함되는 항Hexon 항체를 사용하여 이 키트의 취급 설명서(PT3651-1)에 따라 아데노 바이러스의 역가를 측정했다.

(6-3) 고역가 바이러스 조제를 위한 바이러스의 증폭

이 역가 측정을 시작하는 약 24시간 전에 HEK293 세포를 T75 플라스크에 접종하고, 37℃, 5% CO ₂ 존재하에서 하룻밤 배양하고, 50~70% 컨플루언트가 되어 있는 것을 확인했다.

다음날, 바이러스를 포함하는 새로운 배지와 교환하고, MOI=10으로 감염시켰다. 37℃, 5% CO ₂ 존재하에서 90분간 배양한 후에 플라스크를 인출하고, 10mL의 배지를 추가했다.

37℃, 5% CO ₂ 존재하에서 3~4일간 배양하고, CPE를 확인했다. 50%의 세포가 박리된 결과, 상기와 마찬가지로 해서 유리 세포 현탁액으로 하고, 15mL의 멸균이 완료된 원뿔 원심 튜브에 옮겼다. 상기와 마찬가지의 동결 융해 조작을 행하여 세포를 융해시켰다. Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드 631028)를 사용하고, 10 ⁷ PFU/mL의 역가를 얻었다. 웨스턴 블로팅을 행하고, 패키징된 아데노 바이러스 게놈이 목적 유전자에 특이적인 전사 단위의 카피를 기능하는 형태로 갖고 있는지를 확인했다.

(7) 표적 세포로의 아데노 바이러스 감염

(7-1) 표적 세포로의 감염

감염의 24시간 전에 6-웰 플레이트에 1×10 ⁶ 개의 SHED를 접종했다. 접종의 다음날에 배지를 제거하고, 바이러스를 포함하는 1.0mL의 배지를 각 플레이트의 중심에 첨가했다. 이 용액을 SHED가 형성한 단층 전체에 균일하게 펼쳤다.

37℃, 5％ CO ₂ 존재하에서 4시간 배양하고, 바이러스를 SHED에 감염시켰다. 이어서, 신선한 배지를 첨가하고, 37℃, 5% CO ₂ 존재하에서 더 배양했다. 감염 24시간 후~48시간 후에 걸쳐서 도입 유전자의 발현을 경시적으로 해석했다.

(7-2) 감염 세포의 β--갈락토시다아제 발현의 해석

Adeno-X-lacZ를 감염시킨 접착성 세포에 있어서의 β--갈락토시다아제의 발현은 Luminescent β-galDetection Kit II(제품 코드 631712, Clontech Laboratories, Inc.제)를 사용해서 분석했다.

실시예 2

(1) SHED의 제작

10세의 건상 남아로부터 얻어진 탈락 유치를 사용했다. 이 탈락 유치를 이소딘 용액으로 소독한 후, 치과용 다이아몬드 포인트를 사용하여 치관을 수평 방향으로 절단하고, 치과용 리머를 사용하여 치수 조직을 회수했다. 얻어진 치수 조직을 3㎎/mL의 Ｉ형 콜라게나아제 및 4㎎/mL의 디스파제의 용액 중에서 37℃에서 1시간 소화했다. 이어서, 이 용액을 70㎜의 세포 스트레이너(Falcon Corporation제)를 사용하여 여과했다.

여과 분별한 세포를 4mL의 상기 배지에 재현탁하고, 직경 60㎜의 부착성 세포 배양용 디시에 파종했다. 10% FCS를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이 디시에 첨가하고, 5% CO ₂ , 37℃에 조정한 인큐베이터에서 2주간 정도 배양했다. 콜로니를 형성한 접착성 세포(치수 간세포)를 0.05% 트립신·0.2mM EDTA에서 5분간, 37℃에서 처리하고, 디시로부터 박리한 세포를 회수했다.

이어서, 상기와 같이 해서 선발한 접착성 세포를 부착성 세포 배양용 디시(콜라겐 코트 디시)에 파종하고, 5% CO ₂ , 37℃로 조정한 인큐베이터 중에서 1차 배양하여 초대 배양 세포로 했다. 육안 관찰로 서브 컨플루언트(배양 용기의 표면의 약 70%를 세포가 차지하는 상태) 또는 컨플루언트가 되었을 때에 0.05% 트립신·0.2mM EDTA로 5분간 37℃에서 처리해서 세포를 배양 용기로부터 박리해서 회수했다. 이렇게 해서 얻어진 세포를 다시 상기 배지를 넣은 디시에 파종하고, 계대 배양을 수회 행하여 약 1×10 ⁷ 개/mL까지 증식시켰다. 얻어진 세포를 액체 질소 중에서 보존했다.

그 후, 1차 배양 세포를 상기 배지를 사용하여 약 1×10 ⁴ 세포/㎠ 농도로 계대 배양했다. 1~3회 계대한 세포를 실험에 사용했다. 인간 BMMSC(골수 간옆계 간세포, Bone Marrow Mesenchymal stem cells)는 Lonza Corporation으로부터 구입하고, 메이커의 취급 설명서에 따라서 배양했다. 이상과 같이 하여 인간 탈락 유치 치수 간세포(SHED)를 얻었다. 얻어진 SHED를 FACSTARPLUS(Becton·Dickinson and Company제)를 사용하여 각 시료에 대해서 약 1×10 ⁶ 개의 STRO-1 양성 세포를 이하와 같이 해서 소트했다.

브로모데옥시우리딘 BrdU 염색 키트의 메이커(Invitrogen Corporation제)의 취급 설명서에 따라 BrdU를 12시간 도입시켜 SHED의 증식 속도를 평가했다(각 군에 대해서 n=3). 실험은 5회 반복했다. 1원 배치 분산 분석 후에 Tukey-Kramer 검정을 행하고, 통계적 유의차를 평가했다.

STRO-1을 면역 형광으로 검출하기 위해서 SHED를 3% 파라포름알데하이드로 고정하고, 그 후 PBS에서 2회 린싱하고, 100mM의 글리신으로 20분간 처리했다. 이어서, 이들의 세포를 0.2%의 Triton-X(Sigma-Aldrich Japan제)로 30분간 투과 처리하고, 그 후, 5%의 당나귀 혈청 및 0.5%의 소 혈청 알부민의 혼합물 중에서 20분간 인큐베이트했다.

이어서, 세포를 1차 항체의 마우스 항 인간 STRO-1 항체(1:100, R&D Co.,Ltd.제)와 함께 1시간 인큐베이트하고, 2차 항체의 염소항 마우스 면역 글로블린 M-FITC 항체(1:500, Southern Biotechnology Associates Inc.제)와 함께 30분간 인큐베이트하고, 벡터 실드 DAPI(Vector Laboratories Inc.제)를 사용하여 마운트했다. 그 후, 15% FBS를 첨가한 α-MEM을 6웰 플레이트에 넣어 소트한 세포를 클론 제작용에 파종했다. 증식한 세포의 중으로부터 약 300 콜로니를 시험용에 풀했다.

(2) 유전자의 도입

상술한 바와 같이 bmi-1, E6, E7, 및 hTERT의 4개의 유전자를 아데노 바이러스 벡터에 장착하고, 이들 유전자 산물을 발현하는 바이러스 벡터를 제작했다. 대조로서 이들의 유전자를 장착하지 않은 대조 벡터를 제작했다.

SHED를 직경 100㎜의 콜라겐 코트 디시에 1×10 ⁶ 개를 파종하고, 10% FBS를 첨가한 DMEM을 첨가해서 서브 컨플루언트까지 배양했다. 이 배지를 흡인 제거해서 상기 배지에서 희석한 바이러스 용액 500㎕를 첨가하고(MOI=10), 37℃에서 5% CO ₂ 인큐베이터 중에서 1시간 배양하여 상기 바이러스 벡터를 감염시켰다. 감염 48시간 후, 감염 세포를 퓨로마이신(1pg/mL)을 첨가한 상기 배지 중에서 10일간 배양해서 선택하고, 500~600개의 내성 클론을 풀했다. 3~4일마다 약 0.5×10 ⁵ 개의 SHED를 직경 100㎜의 배양 샬레에 파종하여 계대했다. 유전자가 도입된 SHED를 SHED-T, 유전자가 도입되지 않는 SHED를 SHED-C로 했다.

실시예 3

(1) SHED-C 및 SHED-T의 성장 속도의 측정

SHED-T(유전자 도입을 한 SHED)의 개체수의 배가 상태를 도 5에 나타냈다. 도면 중, 세로축은 개체수 배가 횟수(세포 분열 횟수, 회), 가로축은 시간(배양 일수)이다. 또한, 배양 중의 SHED가 1개월간 분열되지 않는 상태를 세포의 노화의 판단 기준으로 했다. SHED-C는 30회 정도에서 증식이 정지하고, 노화 또는 증식 정지 단계에 들어갔다. 이에 대하여 SHED-T는 250PD를 초과하여 800일 경과 후에도 증식했다.

(2) 플로 사이토메트리 분석

단일 세포의 현탁액을 얻기 위해서 접착성의 단층 세포를 트립신/EDTA로 소화했다. 2x10 ⁵ 개의 세포에 항STRO-1 모노클로널 항체(1:100)를 첨가해서 방치하고, FACSCalibur 플로 사이토미터(Becton Dickinson and Company제)를 사용해서 분석했다. 대응하는 아이소타입이 동일 대조 항체와 비교해서 99% 이상의 비율로 형광 레벨이 높을 경우에 발현이 양성으로 했다. SHED-T 및 SHED-C 모두 초기 및 후기의 계대 세포를 고정하고, FITC 결합 STRO-1 항체로 염색했다. 그 후, 플로 사이토메트리로 분석했다. 시험은 각각 2회 행했다. SHED-C에서는 STRO-1 양성 세포의 비율이 PD20에서 27%이며, PD30에서는 15%까지 감소했다(도 8(A) 및 도 8(B)). SHED-T에서는 STRO-1 양성 세포의 비율이 각각 PD20에서 46%, PD40에서 41%이었다(도 6(C) 및 도 6(D)).

(3) 분화능의 검토

PD0, PD10, 및 PD20에 있어서의 SHED-C 및 SHED-T의 분화능을 신생골량의 형성능 및 조직 염색으로 조사했다. 우선, 2.0x10 ⁶ 개의 SHED-C 또는 SHED-T를 40㎎의 히드록시아파타이트/3칼슘 인산(HA/TCP) 세라믹 분말(Olympus Corporation제)에 혼합하고, 10주령의 면역 무방비 상태 마우스(NIH-bgnu-xid, 암컷, Harlan Sprague Dawley Inc.제)의 배측 표면의 피하에 이식했다.

이식 8주간 후에 이식물을 회수하고, 4% 포르말린으로 고정해서 탈회한 후, 파라핀 포매하기 위해서 10% EDTA를 포함하는 PBS 용액으로 버퍼링했다. 일부는 플라스틱 포매하기 위해서 70% 에탄올 용액 중에 보존했다.

파라핀 절편을 탈파라핀화하고, 이것을 수화한 후, 헤마톡실린 및 에오진(이하, 「H&E」라고 한다)으로 염색했다. 도 7(A)~도 7(C)는 SHED-T(불사화 간세포)의 PD0~PD20의 염색상을 나타내고, 동(D)~(F)는 SHED-C(정상 세포)의 PD0~PD20의 염색상을 나타낸다. 생체 내에서의 새로운 뼈의 형성을 정량하기 위해서 특정 영역을 선택하고, SHED-T 이식 후에 형성된 이식물 또는SHED-C 이식 후에 형성된 이식물 각각에 대해서 신생골 면적과 시야 면적을 산출하고, 이들의 수치로부터 신생골량을 구했다.

신생골량=신생골 면적/시야 면적×100

도 8에 각 개체수 배가 횟수(배가 시간)에 있어서의 SHED-T와 SHED-C의 신생골량의 변화를 나타냈다. 도면 중, **은 p<0.05, ***은 p<0.01을 나타낸다. 또한, 신생골량은 이하의 산출식으로 구했다.

도 8에 나타내어지는 바와 같이 SHED-C에서는 개체수 배가 횟수가 늘어남에 대해서 신생골량이 감소하고, PD20에서는 PD0의 약1/5까지 저하되었다. 이에 대해서 SHED-T에서는 PD20까지 신생골량은 거의 변동이 없고, PD20에서는 SHED-T는 SHED-C의 5배 이상의 뼈를 형성한 것이 나타났다.

(4) 암화 활성의 평가

SHED-C 및 SHED-T 세포를 면역 무방비 상태 마우스의 피하 조직에 1×10 ⁶ 개를 이식했다. 이식 후, 30일 이상 관찰을 행했지만, 이 기간 중 상기 세포를 이식한 어느 마우스에 있어서도 종양은 형성되지 않았다. 또한, SHED-T 세포에서는 40~200PD의 배양 세포의 모든 클론의 형태에 변화는 없었다. 이상으로부터 SHED-T에는 암화 활성은 없는 것이 나타내어졌다.

(5) 평가

SHED-T는 260PD를 초과해도 분화 능력을 유지한 채 증식하는 능력을 갖고 있는 것이 나타내어졌지만, SHED-C는 분화 능력을 갖지만 30PD 이하에서 노화했다.

이상으로부터 SHED-T는 불사화 세포가 되어 있어 활성이 높은 SHED 배양 상청액의 대량 생산에 적합한 것이 나타내어졌다.

실시예 4

(1) 시트형상 소편의 작성

유리 용기 중에서 히알루론산에 약 0.2~4중량%의 덱스트란을 혼합하고, 여기에 소망량의 상기 배양 상청액의 동결 건조 분말을 혼합하고, 레저버층 형성용 재료로 했다.

이어서, 시판의 감광성 수지로 시트를 형성시켜 포토리소그래픽법을 사용하여 도 2(A)에 나타내는 바와 같은 형상의 마이크로 니들 패턴을 제작했다. 그 후, 전기 주조 가공에 의해 이 패턴을 전사하고, 마이크로 니들 형성용의 주형을 제조했다. 이 주형은 한 변을 약 10㎝×10㎝의 정방형으로 하거나, 7㎝×15㎝의 직사각형으로 했다.

또한, 마이크로 니들을 형성하기 위한 오목부는 상부 직경이 약 0.2㎜, 저부 직경이 약 0.04㎜, 깊이가 약 0.8㎜인 원뿔형상을 이루도록 하고, 격자형상으로 배열되도록 했다. 이 오목부는 약 75개/㎠이었다.

상기 레저버층 형성용 재료에 물을 첨가하고, 약 10%의 고형분을 포함하는 수용액을 조제하여 실온에서 상기 주형에 흘려 넣고, 수분을 증발시켜서 건조시키고, 그 후에 주형으로부터 박리시켜서 마이크로 니들이 형성된 레저버층을 얻었다.

계속해서 도 3(C)~도 4(B)와 마찬가지로 해서 시트형상 소편을 작성했다. 즉, 베이스 시트(2)의 편면에 접착 보조층(12)을 접착제를 사용해서 접착시켜 접착 보조층(12)을 형성하지 않은 베이스 시트(2)의 면 상에 레저버층(4)을 접착시켰다. 이어서, 마이크로 니들(4n)이 형성되어 있지 않은 부분에 메시형상으로 접착층(5)을 형성시켜 극박 시트를 제작했다. 이 극박 시트 상에 유지 부재(H)인 고정용 우레탄을 겹쳐 도 1에 나타내는 바와 같은 시트형상 소편으로 했다.

도 18(A)~도 18(D)에 나타내는 바와 같은 소망의 크기로 컷팅해서 본 발명의 시트형상 소편을 제작했다. 그 후, 이 시트형상 소편을 소망의 두께를 갖는 소망의 크기의 금속성의 판형상 부재 또는 플라스틱제의 판형상 부재 상에 형성된 시트 홀더에 재치하고, 차광성의 필름에 밀봉하여 제품으로 했다. 이들 제품은 사용 시까지 냉장 보존했다. 이 시트 홀더는 상기 시트형상 소편의 주변부를 약 1㎜ 폭으로 덮는 것 같은 구조로 되어 있어 마이크로 니들의 구조를 유지하기 위한 것이다.

(2) 발모 촉진용 시트의 부착

이상과 같이 해서 제작되는 발모 촉진용 시트 1을 도 3(A)~도 4(B)에 나타낸 순서로 제작했다.

이상과 같이 해서 조제한 발모 촉진용 시트 1을 도 15에 나타내는 바와 같이 남성의 두부에 부착했다. 상기 발모 촉진용 시트 1을 부착해서 두피에 밀착시킨 후에 접착 보조층을 베이스 시트로부터 박리했다. 본 실시예에서는 본 발명의 발모 촉진용 시트의 부착 상태를 보기 쉽게 하기 위해서 헤어재를 심지 않은 베이스를 사용하고, 디지털 카메라로 촬영을 행한 결과를 도 16(A)~도 16(C)에 나타낸다.

부착 전의 두발의 상태를 도 16(A)의 1~3에, 부착 3~7일 후의 두발의 상태를 도 16(B)의 1~3 및 도 16(C)의 1~3에 나타낸다. 부착 전후의 두발의 상태로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 발모 촉진용 시트를 부착하면 3일 후에 발모가 관찰되어 그 후, 경시적으로 발모량이 늘어나 있는 것이 명백해졌다(도 16(B) 1~3의 흰 원 내를 참조 요망). 특히, 7일 후의 사진에서는 1개소로부터 복수의 두발이 자라고 있는 것이 관찰되었다(도 16(C) 3을 참조 요망).

또한, 백발이 되어 간 부분에 본 발명의 발모 촉진용 시트를 부착했을 때의 상태의 변화를 도 17(A)에 나타낸다. 도 17(A)의 좌측의 사진은 부착 개시 전, 우측의 사진은 5회의 부착을 행한 약 2개월 남짓 후의 사진이다. 탈모되어 있던 부분에는 부착 이전에는 백발뿐이었지만, 발모량의 증가와 검은 머리카락이 돋아나 있는 것이 확인되었다.

탈모된 부분에 본 발명의 발모 촉진용 시트를 부착했을 때의 상태의 변화를 도 17(B)에 나타낸다. 도 17(B)의 좌측의 사진은 부착 전, 도 17(B)의 우측의 사진은 5회의 부착을 행한 약 2개월 남짓 후의 사진이다. 탈모되어 있던 부분에는 부착 이전에는 하얀 머리카락이 약간 남아있었지만, 발모량이 명백하게 늘어나 있고, 또한 검은 머리카락이 돋아나 있는 것이 확인되었다.

이상에서 본 발명의 발모 촉진용 시트를 부착한 부위에서는 두발의 정상적인 성장이 촉진되는 것이 확인되었다.

(산업상 이용가능성)

본 발명은 미용의 영역에 있어서 극히 유용하다.

1: 시트형상 소편 2: 베이스 시트
4: 레저버층 5: 접착층
6: 인공 모발(헤어재) 6a: 근부(이식부)
6b: 자유단부 8: 고정부
10: 발모 촉진용 시트 12: 접착 보조층
15: 안내 바늘 H: 유지 부재