防止或减轻对象的呼吸消化道中烟草相关损伤的烟草和烟草包装材料

发明领域和背景

本发明涉及防止或减少呼吸消化道(aerodigestive tract)的氧化剂应激相关 疾病的发病的方法。更具体地说，本发明涉及利用羟钴胺(维生素B12a， OH-CO)、去铁胺(deferoxamine)(DES)和还原型谷胱甘肽(GSH)来防止或降低 呼吸消化道中烟草诱导的细胞或大分子损伤的方法。

烟草消费的有害作用

烟草滥用的有害作用众所周知。烟草是导致显著发病率和死亡率的全球公 共卫生危害。虽然吸烟对口咽和呼吸道施加大量的氧化剂攻击，但任何烟草消 费相关的氧化剂负担(如下所述)对烟草消费者的整个身体有害。即，烟草消费 对动脉粥样硬化、心血管疾病、慢性阻塞性肺病和各种形式的癌症，包括口癌、 喉癌、食道癌和肺癌有产生和促进作用。

消费烟草主要有两种途径：吸烟和无烟消费(smoke-less consumption)。后 者包括吐烟草(spit tobacco)、咀嚼烟草(chewing tobacco)、咀嚼烟(chew)、嚼 烟(chaw)、浸烟(dip)、板烟条(plug)，有各种形式：鼻烟(snuff)、含烟(snuss) 和咀嚼烟草。鼻烟是细颗粒状烟草，通常装在茶包状小袋中，使用者在其下 嘴唇和牙龈之间“挤压”或“浸湿”它们。咀嚼烟草由撕碎的、扭结的(twisted) 或“块状的(bricked)”烟叶制成，使用者将它们放在他们的颊和牙龈之间。 无论是鼻烟、含烟或咀嚼烟草，使用者通过将烟草置于口中，吸吮烟草汁液， 常吐出积累的唾液来享用它们。这种吸吮和咀嚼使得尼古丁(麻醉性药物)通 过口腔组织吸收到血流中。无烟烟草对口腔具有有害作用并且会因尼古丁和 其他化学物质的口腔吸收而具有全身作用。约5千万美国人吸烟，而不计其 数的其他人作为二手吸烟者而受到烟草烟(TS)的影响。吸烟者的孩子吸入这 种二手烟，会比不吸烟者的孩子具有更多的呼吸问题。

有研究估计TS含有3,000种以上不同的成分，其中许多有毒性、致癌性和 /或产生自由基。自由基是含有未成对电子的原子或分子。氧自由基包括超氧化 物自由基(·O2-)、羟基自由基(·OH)，它们与过氧化氢(H2O2)和单态氧(1O2)统称 为活性氧(reactive oxygen species)(ROS)。由于反应活性高，它们可导致活细 胞成分例如蛋白质、脂质、碳水化合物和核苷酸的化学修饰和损伤。

烟草烟介导的氧化剂损伤与烟雾(smog)诱导的相似，从而增强了对受污 染气氛环境中一手和二手吸烟者的这种毒性刺激。

在所谓的主流TS和侧流TS中已鉴定了TS的大多数成分。前者是在抽烟 期间通过烟草产品的烟嘴吸入的烟体积，而侧流烟是在抽每口烟之间从闷烧的 香烟放出的烟。比较过滤嘴香烟和无过滤嘴香烟时，虽然焦油和尼古丁截留在 香烟的过滤嘴中，但这主要适用于主流烟。在低焦油和超低焦油产量香烟中， 放出的主流烟也显著减少。然而，与无过滤嘴香烟相比，侧流烟中放出的毒性 和致癌性成分并未显著减少。因此，侧流烟是环境烟的主要原因，其影响吸烟 者和他们不吸烟的同伴，所谓的二手吸烟者。

有证据显示雪茄(cigars)以及香烟(cigarettes)具有高度毒性和成瘾性。 烟草吸食者的口腔癌和喉癌的危险性具有类似的升高。有证据表明一支雪茄产 生的致癌性颗粒水平超过三支香烟产生的。对于二手吸烟者，雪茄产生的烟也 有更大的影响。流行病学研究显示，与不吸烟者相比，吸雪茄的人得心脏疾病、 肺气肿和口腔癌症及咽癌症的频率更高。吸雪茄的人可能花整整一小时吸食一 支大雪茄，并且通常将未点燃的雪茄叼在嘴上，从而通过局部吸收而进一步接 触有毒物质。因此，与香烟相比，吸食雪茄可能接触同样或者更高的毒性TS。 最近，雪茄的销售量升高，部分是因为它们在女性中开始流行，和女性联谊“雪 茄吧”的出现。

烟草消费相关的口腔疾病：无论是吸食还是咀嚼的烟草均在口腔中导致常 见的不良作用。烟草烟有两个机会在口中施加其有害作用，即在被吸烟者吸入 及呼出过程中。

每年诊断到30,000例以上新的口腔癌症，占所有新癌症的2-4％。口腔癌 症每年杀死8,000位患者，每年诊断的案例中只有一半能存活5年。这些患者 中大多数是烟草产品使用者。口腔鳞状细胞癌(SCC)是最常见的头颈恶性肿瘤， 每年全球发生300,000以上新病例。该疾病的特征在于发病率和死亡率高(约 50％)，就这方面而言，该疾病类似于恶性黑色素瘤(1-4)。口腔SCC的主要诱因 是接触烟草，据认为该原因导致全球50-90％的病例(5，6)。因此，吸烟者中口 腔SCC的发生率比不吸烟者高4-7倍(7，8)。此外，与不吸烟者相比，发生 该疾病的平均年龄低15岁，证明口腔SCC的TS-相关风险较高(9)。各种恶性 肿瘤尤其与无烟烟草消费相关。这些恶性肿瘤包括口腔癌症和胃肠道癌症，包 括食道癌和膀胱癌。在吸烟者中发现的粘膜白斑(leukoplakia)(烟草在口腔粘 膜上诱导的一种白色斑块)是直接接触有烟或无烟烟草导致的一种局部刺激，其 与烟草滥用的频率和年数有直接关系。虽然粘膜白斑是一种良性口腔损伤，但 其有恶化的可能。

此外，烟草导致了口和牙齿的其它口腔症状或病理学作用。烟草可导致口 臭，可使得味蕾麻木并影响对食物的嗅觉和味觉。其可污染牙齿并导致龋齿。 吸烟者比不吸烟者有更多的牙石(牙结石)。烟草还与破坏性牙周(牙龈)疾病和牙 齿牙丧失有关。急性坏死性溃疡性龈炎(“战壕口炎”)是主要发生在烟草吸 食者中的一种破坏性、疼痛的炎性病症。据称，对TS过敏的个体中鼻粘膜 和鼻窦粘膜的肿胀也有关。

口腔粘膜下纤维变性主要发生在印度，其是一种慢性、渐进性的恶化前疾 病。其病因是长期咀嚼烟草或槟榔或二者。纤维化导致口的张开受约束，并 涉及上颚、扁桃体窝、颊粘膜和下面的肌肉。口咽癌也与该疾病有关，其在 印度发生率高并且70％的病例与咀嚼烟草有关。使用无烟烟草和槟榔在巴基 斯坦、孟加拉国和爪哇以及这些国家和印度在美国和英国的移民中也很普 遍。

烟草烟还不利地影响皮肤。英格兰的Douglas Model博士在研究了116个 病例的图片和合适的不吸烟对照后于1985年将“吸烟者面部”加入医学词典 (10)。与光照损伤(photodamage)相似，具有吸烟者面部的那些人显得更老且有 更多皱纹。

接触TS所导致的分子损伤：烟草烟诱导对脂质、DNA和蛋白质(特别是 通过蛋白质-SH基团)的氧化剂损伤，其原因是含有高水平的自由基以及醛类， 包括乙醛(乙醇)、丙醇和丙烯醛以及其它有害分子。

氧化剂损害：烟草烟分成两相：焦油和气相烟。焦油含有高浓度的自由基。 许多焦油提取物和氧化剂是水溶性的并将氧还原成超氧自由基，后者再经歧化 形成强效的氧化剂H2O2。气相烟中的氧化剂是半衰期极短的以碳和氧为中心的 的反应活性集团。

接触氧化应激的细胞的细胞功能受到严重影响，并损伤膜脂质、蛋白质、 细胞骨架结构和DNA。现已检测到自由基对DNA的破坏是形成单链断裂、双 链断裂和染色体异常。接触电离辐射和TS的细胞也显示胞内DNA破坏增加， 具有突变的前兆以及产生恶性肿瘤。现已证实TS引发血浆(plasma)中的蛋白质 羰基化，与之相反，人血浆与气相烟而不是全TS接触对脂质产生氧化损伤。

氧化还原-活性(redox-active)金属：在有H2O2和TS中发现的其它低反 应活性自由基例如超氧自由基(superoxide radical)存在下，氧化还原活性金属 离子，例如铁和铜离子参与有害的Haber-Weiss和Fenton反应，产生高反应 活性的羟基自由基。

醛类：研究显示，血浆与TS接触将以蛋白质羰基化(11)以及血浆脂质和抗 氧化剂氧化(12)的形式导致蛋白质损伤。发现蛋白质羰基化的积累来源是因为 TS中存在的醛类(13，14)。此外，已证明TS显著影响几种唾液酶，例如淀粉 酶、乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(14，15)，其中认为基于TS的醛类例如丙 烯醛和巴豆醛以及氧自由基是影响上述酶的成因物质(14，15)。

生理抗氧化剂：

谷胱甘肽：谷胱甘肽是一种含硫的三肽(L-γ-谷氨酰基-1-半胱氨酸-甘氨 酸)，其是哺乳动物细胞内最丰富的非蛋白质硫醇(thiol)，被认为是原始 抗氧化剂。还原形式的谷胱甘肽，“GSH”，作为谷胱甘肽-S-转移酶和谷 胱甘肽过氧化物酶的底物，所述酶催化的反应参与异生(xenobiotic)化合 物的解毒和ROS及其他自由基的抗氧化。这种遍在蛋白在维持自由基敏感 性细胞组分的完整性中起着至关重要的作用。在包括营养不良和严重的氧化 应激在内的GSH耗尽的状态下，细胞随后可能因过量的自由基破坏而受损 并死亡。

口腔过氧化物酶：口腔过氧化反应是唾液抗氧化剂系统的关键的酶活性 (16-19)。口腔过氧化物酶活性由两种过氧化物酶：唾液过氧化酶(SPC)和髓过氧 化物酶(MPO)的组合活性构成。唾液过氧化物酶由大唾液腺(主要是腮腺)分泌 (18)，其产生总口腔过氧化物酶(OPO)活性的80％，而MPO由白细胞产生(20)， 其产生剩余的20％OPO活性。口腔过氧化物酶行使两种防止氧化损伤的功能， 其降低细菌和白细胞通过唾液腺分泌入口腔的H2O2水平，并抑制口腔中各种细 菌的代谢和增殖。

口腔过氧化物酶参与破坏TS-相关的H2O2。肝脏将烟草烟-相关的氢氰酸 (HCN)代谢成硫氰酸根离子(SCN-)。腮腺从血浆中特异性螯合这种SCN-，该腺 体将其分泌入口腔。其在不吸烟者的唾液中的浓度范围为0.3-1.5mM，而其在 吸烟者中的浓度范围为1.4-4.0mM(取决于每天抽烟的数量)，t1/2延长为9.5小 时(21)。分泌入唾液后，SCN-在OPO催化的反应中与口腔中的H2O2反应并将 其消除，如图2a所示。然而，现已证明如果OPO被破坏或耗尽，例如与TS 接触所发生的情况，口腔中的H2O2未被消除并维持能与经腮腺唾液分泌的氧化 还原金属离子进一步反应(22，23)。

在OPO催化的SCN-+H2O2→OSCN-+H2O的反应中，H2O2氧化SCN-， 一种主要由腮腺分泌的氰化物解毒产物。在该反应中，SCN-用作供电子组分， 类似于其它生物体系中的GSH(20，24，25)。该反应产生两种强效抗细菌氧 化产物：次硫氰酸(hydrogen hypothiocyanite)(HOSCN)及其共轭的阴离子， OSCN-。HOSCN和OSCN-的抗细菌活性来自它们与对于糖酵解至关重要的 细菌酶例如己糖激酶、醛缩酶和丙酮酸激酶的巯基反应的能力(20，25-28)。

现已有几项研究证明OPO在口腔疾病预防中的重要性。例如，采用动物模 型或Ames检验的研究显示唾液抑制已知的口腔癌症诱导物，例如TS、4NQO 和苯并芘的诱变作用(29，30)。生物化学研究也证明唾液抑制ROS例如来自槟 榔嚼块烟草(betel quid tobacco)(口腔癌症的最强效诱导物)的超氧自由基和 H2O2的产生(31)。在具有口腔扁平苔藓(一种恶化前病损)的患者中观察到唾液 抗氧化能力降低，这进一步支持了这些结论(32)。

现已采用了几种现有技术方法来减少或防止氧化剂损伤导致的口腔疾病发 生。

例如，利用香烟过滤嘴截留TS焦油，但不能截留气相化合物。

一种方法利用提供化学吸附性能的针对TS的过滤嘴来降低TS中的醛浓度 (33)。

另一种方法利用口腔大剂量的抗氧化剂来降低巨噬细胞和嗜中性细胞的吞 噬活性相关“突发性呼吸(respiratory burst)”反应导致的H2O2产生。现已证明 吸烟者的“突发性呼吸”反应高于不吸烟者，这可能与前者中呼吸消化道疾病 的发生率升高有关。

在还有另一方法中，利用具有增加谷胱甘肽水平的药学特性的二肽化合物 (34)。

另一种方法利用谷胱甘肽的甘氨酸羧酸烷基单酯来增加细胞GSH水平 (35)。

还有另一方法提议组合给予谷胱甘肽和硒以防止接触TS导致的氧化剂损 伤(36)。

另一方法提议组合给予谷胱甘肽、抗坏血酸、硒和含硫氨基酸以防止口腔 氧化剂损伤(37)。

还有另一方法提议组合给予以下抗氧化剂中的一些或全部以提供免遭氧化 剂损伤的口内保护作用：L-谷胱甘肽、L-硒代甲硫氨酸、L-硒代半胱氨酸、抗 坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸酯、L-半胱氨酸、N-乙酰基-1-半胱氨酸、生育酚乙 酸酯、生育酚琥珀酸酯、维生素A、锌盐、甲硫氨酸和牛磺酸(38)。

本发明人先前已描述了新型吸烟过滤嘴和口服组合物以减轻呼吸消化道中 与烟草相关的损害(参见美国专利号6,789,546)。这些组合物包含能减轻或防 止呼吸消化道中与烟草相关的过氧化物酶活性丧失的活性剂。

美国专利号5,922,346披露了能减轻烟草产品和环境污染物所诱导的自由 基损害的组合物，所述组合物包含还原型谷胱甘肽和硒源作为活性成分，所述 硒源选自元素硒、硒代甲硫氨酸和硒代半胱氨酸，所述活性成分与合适的载体 和调味剂组合，作为凝胶、锭剂、片剂和口胶剂用于它们的口内给药，其浓度 能减轻烟草产品和其它环境污染物诱导的对用户和二手吸烟者的口腔、咽和上 呼吸道的自由基损害。

美国专利号5,906,811披露了减轻烟草产品和环境污染物所诱导的自由基 损害的方法，包括在合适载体中给予浓度能有效减轻对用户的口咽和上呼吸道 的所述自由基损害的以下组合：0.01-10％(重量)谷胱甘肽、1.0-25％(重量)抗坏 血酸、0.001-10％(重量)硒源和0.001-2.0％(重量)的含硫氨基酸。

上述这些减轻烟草损害的努力用作在烟草消费之后或之前的辅助治疗，而 不是与烟草消费同时的。

美国专利号5,829,449披露了包含在香烟、雪茄或烟斗烟中的一种组合物来 减轻烟草烟对口咽腔、呼吸道和肺的自由基损害，所述组合物包含L-谷胱甘肽 和选自L-硒代甲硫氨酸和L-硒代半胱氨酸的硒源。美国专利号5,829,449明确 描述了该组合物通过烟吸入而提供，而不是通过与呼吸消化道(即，湿组织)直 接接触而提供。

美国专利6,138,683披露了包含在一定量选自咀嚼烟草和鼻烟的无烟烟草 中的组合物用于减轻对使用者的口咽腔的自由基损害，所述组合物包含L-谷胱 甘肽和硒源及上述无烟烟草的组合。

发明概述

本发明提供一种吸烟产品，其包含能减轻或防止对象的呼吸消化道中与烟 草相关的细胞死亡的制剂，该吸烟产品被设计和构建成当对象使用时所述制剂 与所述烟草烟能(发生)理化相互作用。

本发明的一方面提供一种包含烟草和烟草包装材料的制品，所述烟草和/ 或烟草包装材料的至少一部分在使用时与对象的呼吸消化道接触，而所述烟草 和/或烟草包装材料的所述至少一部分包含至少一种能减轻或防止所述呼吸消 化道中与烟草相关的过氧化物酶活性丧失的制剂，所述至少一种制剂选自氰化 物螯合剂和铁螯合剂。

本发明的另一方面提供一种包含烟草包装材料的制品，所述烟草包装材料 的至少一部分在使用时与对象的呼吸消化道接触，其中所述至少一部分包含能 减轻或防止所述呼吸消化道中与烟草相关的过氧化物酶活性丧失的制剂。

根据下述本发明优选实施方式中的其它特征，所述烟草包装材料包括过滤 嘴，所述至少一种制剂浸渍在所述过滤嘴的纸张中并且在使用时与所述对象的 所述呼吸消化道接触。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述烟草是无烟烟草。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述烟草是有烟(smoked)烟 草。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述烟草包装材料选自：卷烟 纸、过滤嘴纸、含烟袋包装(suns bag packaging)、烟卷(cigarette)、烟斗和 锡片(tin sheet)包装。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制品选自：鼻烟、香烟、 含烟(snus)、古塔烟(Gutka)、板烟条(plug)、扭花条烟(twist)、碎烟片(scrap) 和烟草水(tobacco water)。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制剂包含氰化物螯合剂。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制剂是羟钴胺。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制剂能减轻或防止对象的 消化道中与烟草烟相关的细胞死亡。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述细胞是淋巴细胞和/或上皮 细胞。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制剂包含铁螯合剂。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制剂是去铁胺。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制剂包含抗氧化剂。

根据所述优选实施方式中还有的其它特征，所述制剂是谷胱甘肽。

本发明通过提供防止或减轻呼吸消化道中烟草烟相关损伤的方法而成功解 决了当前已知构造的不足之处。

附图简述

本文参考附图描述了本发明，仅是举例。现在将详细地具体参考附图，应 该强调所示细节是举例，其目的仅是示范性地讨论本发明的优选实施方式，出 示这些附图的原因是对本发明的主旨和各概念提供据信是最有用且易于理解的 描述。在这方面，仅仅示出了基本理解本发明所需的本发明结构细节，参考附 图进行的描述使得本领域技术人员能明白如何具体实施本发明的几种形式。

在附图中：

图1是示意图，描述浸渍有本发明制剂的过滤嘴纸(filter paper)的结构。

图2a描述了接触TS-衍生的HCN导致的氰酸盐(cyanate)代谢途径。

图2b是描述在吸烟者和不吸烟者中体内接触(吸烟)TS后还原型OPO活性 的数据图。检测了吸一支香烟之前和之后17位吸烟者和16位不吸烟者的OPO 活性。

图2c是描述在吸烟和不吸烟对象中，唾液与TS体外接触后还原型OPO 活性的数据图。检测了接触一支香烟之前和之后7位吸烟者和11位不吸烟者的 OPO活性。

图3是柱状图，描述在体外接触1支香烟的TS的不吸烟对象的唾液中， KCSN-介导的对TS接触诱导的OPO活性降低的抗性(resistance)。各数值代 表在3个对象的实验中获得的平均值±标准偏差(SD)。

图4a-b是Western免疫印迹分析的照片，描述唾液与1支香烟的TS体内 接触后(吸烟)，代表性的不吸烟对象唾液中蛋白质羰基化水平升高(图4a)。样品 的考马斯蓝染色显示了每份样品分析了等量蛋白质的证据(图4b)。缩写：淀粉 酶(Amy)、富含蛋白的蛋白质(PRP)、溶菌酶(Lys)。泳道1：吸烟前；泳 道2：吸烟后10分钟；泳道3：吸烟后30分钟；泳道4：吸烟后60分钟。

图5a-b是Western免疫印迹分析的照片，描述唾液与1支香烟的TS体外 接触后，代表性的不吸烟对象唾液中蛋白质羰基化水平升高(图5a)。样品的考 马斯蓝染色显示了每份样品分析了等量蛋白质的证据(图5b)。泳道1：接触TS 前；泳道2：接触TS后10分钟；泳道3：接触TS后30分钟；泳道4：接 触TS后60分钟。

图6是数据图，描述在1小时期间体外3次接触TS的唾液中OPO活性的 TS剂量依赖性降低。各数据点代表4个对象的唾液实验结果的平均值±平均 值的标准偏差(SEM)。

图7是数据图，描述浓度渐增的氨苯砜(4-氨基苯基砜)对TS处理的唾液中 OPO活性的影响。缩写：NO.1、NO.2、NO.3、NO4和NO.5对应于5位不同 对象的唾液，血浆对应于市售MPO。

图8是数据图，描述在有或没有150μM氨苯砜存在下，对TS处理的唾液 中OPO活性的影响。相对原始OPO活性标准化唾液样品。有(□)或没有(◆)氨苯 砜存在下与TS接触的OPO，有(▲)或没有(·)氨苯砜存在下与空气接触的对照 唾液。

图9是数据图，描述在TS处理的唾液中GSH、去铁胺(deferoxamine)(DES) 和抗坏血酸(盐)(ascorbate)对OPO活性的影响。处理：只有TS(◇，n＝4)， TS+1mM GSH(■，n＝3)，TS+1mM去铁胺(Δ，n＝3)，TS+1mM抗坏 血酸(盐)(X，n＝3)。数据绘制成平均值±平均OPO活性。

图10是数据图，描述在TS处理的唾液中100μM FeCl3或抗坏血酸(盐)对 OPO活性的影响。数据点代表采用3位对象的唾液样品绘制成平均值±SD 的数据。

图11是描述存在于TS中的纯化醛类对4-5个对象的唾液中OPO活性影响 的数据图。处理：接触空气3小时(◇)，2mM乙醛(■)，20μM巴豆醛(Δ)， 80μM丙烯醛(X)。

图12是柱状图，描述18小时透析对丧失了68％的原始OPO活性水平的 TS-处理唾液中OPO活性的影响。1：透析前[1]和透析后[2]未经TS处理的唾液 中的对照OPO活性，透析前[3]或透析后[4]TS-处理唾液中的OPO活性和未经 透析18小时后的时间对照[5]。

图13是描述透析18小时后KCN处理的唾液中OPO活性恢复的柱状图。 透析前[1]和透析[后]未经TS处理的唾液中的OPO活性，透析前[3]或透析后 [4]KCN处理2分钟后唾液中的OPO活性和未经透析18小时后KCN处理唾液 中的时间对照OPO活性。

图14是描述OH-CO介导的防止TS-处理所致唾液中OPO活性丧失的柱状 图。没有[1]或有[4]1mM OH-CO(n＝4)存在下，未经TS处理的唾液中的OPO 活性，没有(n＝4)[3]或有0.5mM OH-CO(n＝3)[4]、1mM OH-CO(n＝3)[5] 或2mM OH-CO(n＝3)[6]存在下，TS-处理的唾液中的OPO活性。各数值代 表的数据计算成利用3-4位对象的3-4次试验结果的平均值±SD。

图15是描述OH-CO介导的防止KCN处理的唾液中OPO活性丧失的柱状 图。各数值代表的数据计算成利用3位对象的3次试验结果的平均值±SD。

图16是描述有TS和唾液存在下、37℃温育的淋巴细胞死亡的数据图。

图17是Western免疫印迹分析的照片，描述有唾液存在下，TS处理的淋 巴细胞中蛋白质羰基化水平升高。泳道1：只在PBS中温育；泳道2：有唾液 存在下温育；泳道3：在PBS+TS中温育；泳道4：用TS+唾液温育。温 育在37℃进行80分钟。

图18是Western免疫印迹分析的照片，描述唾液和尿酸对淋巴细胞蛋白质 羰基化的影响。泳道1：只在PBS中温育；泳道2：有唾液存在下温育；泳 道3：有10μM尿酸存在下温育；泳道4：有100μM尿酸存在下温育。温 育在37℃进行20分钟。

图19是数据图，描述以下各种抗氧化剂对在37℃、有TS和唾液存在下温 育的淋巴细胞存活的影响：1mM GSH、1mM NAC (N-乙酰基半胱氨酸)和1 mM去铁胺(DES)。Asc：抗坏血酸(盐)。

图20是Western免疫印迹分析的照片，描述几种抗氧化剂对TS和唾液处 理的淋巴细胞中蛋白质羰基化水平的影响。泳道1：在有TS和唾液存在下温育， 泳道2：在有TS、唾液和1mM NAC存在下温育，泳道3：在有TS、唾液和1 mM抗坏血酸(盐)存在下温育，泳道4：在有TS、唾液和1mM GSH存在下温 育，泳道5：在有TS、唾液和1mM去铁胺(DES)存在下温育。温育在37℃进 行20分钟。

图21是Western免疫印迹分析的照片，描述几种挥发性醛类对淋巴细胞羰 基化水平的影响。泳道1：只与PBS温育，泳道2：与80μM丙烯醛一起温育， 泳道3：与20μM巴豆醛温育，泳道4：与2μM乙醛温育，泳道5：与80μM 丙烯醛+1mM GSH温育，泳道6：与20μM巴豆醛+1mM GSH温育，泳 道7：与2μM巴豆醛+1mM GSH温育。温育在37℃进行20分钟。

图22是Western免疫印迹分析的照片，描述唾液和丙烯醛对淋巴细胞蛋白 质羰基化水平的影响。泳道1：只与PBS温育，泳道2：在有唾液存在下温育， 泳道3：与80μM丙烯醛温育，泳道4：与80μM丙烯醛+唾液温育。温育 在37℃进行20分钟。

图23是柱状图，描述在37℃有唾液、各种抗氧化剂和氧化还原-活性铁存 在下温育20分钟的淋巴细胞存活状况。柱1：只与PBS温育，柱2：在有唾液 存在下温育，柱3：在有1mM抗坏血酸(盐)存在下温育，柱4：在有1mM 去铁胺(DES)存在下温育，柱5：在有90μM FeCl3存在下温育，柱6：在有 唾液+1mM抗坏血酸(盐)存在下温育，柱7：在有唾液+1mM抗坏血酸(盐) +1mM去铁胺(DES)存在下温育，柱8：在有90μM FeCl3+1mM抗坏血 酸(盐)存在下温育，柱9：在有90μM FeCl3+1mM抗坏血酸(盐)+1mM去 铁胺存在下温育。

图24是柱状图，描述在37℃有TS、抗坏血酸(盐)和去铁胺(DES)存在下 温育80分钟的淋巴细胞存活状况。柱1：只与PBS温育，柱2：在有TS存在 下温育，柱3：在有1mM抗坏血酸(盐)存在下温育，柱4：在有1mM去铁 胺存在下温育，柱5：在有TS+1mM抗坏血酸(盐)存在下温育，柱6：在 有TS+1mM抗坏血酸(盐)+1mM去铁胺存在下温育。

图25是Western免疫印迹分析的照片，描述GSH和去铁胺(DES)对37℃ 有TS和唾液存在下温育20或80分钟的淋巴细胞中蛋白质羰基化水平的影响。 柱1：在有TS+唾液存在下温育20分钟，柱2：在有TS+唾液存在下温育 80分钟，柱3：在有TS+唾液+1mM GSH存在下温育20分钟，柱4：在 有TS+唾液+1mM GSH存在下温育80分钟，柱5：在有TS+唾液+1mM GSH+1mM去铁胺存在下温育20分钟，柱6：在有TS+唾液+1mM GSH +1mM去铁胺存在下温育80分钟，柱7：在有TS+唾液+1mM GSH+5 mM去铁胺存在下温育20分钟，柱8：在有TS+唾液+1mM GSH+5mM 去铁胺存在下温育80分钟。

图26描述了与TS接触后氰酸盐的代谢机理。

优选实施方式描述

本发明是防止或减轻对象的呼吸消化道中与烟草烟相关的损伤的方法、药 物组合物、口服组合物、过滤嘴和烟草产品。具体地说，本发明可用于防止或 减轻TS-相关氧化应激导致的OPO活性丧失或CN-、氧化还原-活性金属离子- 或醛诱导的细胞死亡，所有这些在现有技术方法中均未能提供。

参考附图和随附的实施例可以更好地理解本发明的原理和操作。

在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应该理解本发明不限于其在 以下说明书所述或实施例所举例的构造细节和组分配置中的应用。本发明可以 有其它实施方式或可以各种方式实施。还应理解本文所用的措辞和术语是出于 描述的目的，不应视作限制性的。

烟草消费，例如吸烟、咀嚼、浸湿或吸鼻烟的形式，与呼吸消化道的许多 疾病的发病有关。

因此，减轻或防止例如TS等刺激导致的呼吸消化道氧化剂损伤的各种现 有技术方法已见诸描述。

本发明人先前描述了用于减轻呼吸消化道中烟草相关损伤的新型吸烟过滤 嘴和口服组合物(参见美国专利号6,789,546)。这些组合物包含能防止或减轻 呼吸消化道中与烟草相关的过氧化物酶活性丧失的活性剂。

然而当对象使用无烟烟草，特别是咀嚼烟、鼻烟和含烟时，这些烟草组合 物和烟草包装工具无一设计成用于减轻相关的损伤。

因此，公认需要能防止或减轻呼吸消化道中任何烟草相关氧化剂损伤而没 有上述局限性的组合物和工具，这也将是极其有益的。

虽然限制了本发明的实施，但本发明人发现以前描述的制剂(参见美国专利 号6,789,546)可用于与呼吸消化道(例如，唾液)直接接触的任何烟草和烟草相关 产品中，因此可在使用烟草(例如，咀嚼)的同时改善其损害。

因此，本发明一方面提供包含烟草和烟草包装材料的制品，所述烟草和/ 或烟草包装材料的至少一部分在其使用时与对象的呼吸消化道接触，而所述烟 草和/或烟草包装材料的所述至少一部分包含能减轻或防止呼吸消化道中与烟 草相关的过氧化物酶活性丧失的制剂。

本发明另一方面提供包含烟草包装材料的制品，所述烟草包装材料的至少 一部分在其使用时与对象的呼吸消化道接触，而所述至少一部分包含能减轻或 防止呼吸消化道中与烟草相关的过氧化物酶活性丧失的制剂。

本文所用的术语“烟草”指符合人类使用的任何烟草种类(例如，天然物质 (crude)或提取物)。

除烟草外，本发明也想到本发明制剂与符合人类使用的其它抽吸、浸渍、 咀嚼、鼻用(snuff)或含用(snused)的草本植物一起使用(符合上述诸方面)， 这些草本植物因使得过氧化物酶活性丧失而破坏呼吸消化道。

本文所用的短语“烟草包装材料”指包装烟草或有助于其消费的任何辅助 工具(means)(载体)。例子包括但不限于卷烟纸、含烟袋(snus bag)、过滤嘴纸 (filter paper)、锡片等。

因此，例如，可将该制剂浸在将与呼吸消化道直接接触的过滤嘴纸中(附着 到所述过滤嘴纸、吸附至所述过滤嘴纸中、以所述过滤嘴纸包被)。

图1描述本发明烟草烟(TS)过滤嘴的香烟过滤嘴构造，下文称为香烟过滤 嘴10。香烟过滤嘴10由纸衬里12和过滤嘴核心14构成，所述核心由玻璃纤 维构成并且位置与烟草填料16毗邻。为能有效递送，可将本发明制剂浸渍在过 滤嘴衬里12中。这种过滤嘴在专利文件(39，40)中已有描述，所述文件的教导 通过引用纳入本文。

或者，可用所述制剂处理卷烟纸，从而能将所述制剂局限在所述纸中将与 呼吸消化道接触的区域(比方说约1cm的边缘)。

本文所用的“呼吸消化道”指衬有唾液的(saliva-lined)组织，例如唇、 口、口腔、舌、口咽(oropharynx)、咽门(throat)、喉(larynx)、食道、上 消化道、唾液腺、唾液以及呼吸道的类似衬有粘液的(mucous-lined)组织，例 如呼吸道粘膜、肺泡(alveoli)、气管和肺。

以下提供了可用于本发明的制剂的非限制性例子。

例如，如以下实施例部分的实施例1所述，抗氧化剂，例如CN-螯合剂可 用于治疗TS-相关的OPO活性丧失。下文给出了CN-螯合剂例如OH-CO和本 发明该方面可用的其它抗氧化剂的例子。

CN-螯合剂(例如，OH-CO)的给予方式优选能在体液例如唾液中形成0.5-2 mM的浓度，优选1mM。

可有效地利用CN-螯合剂来防止或减轻呼吸消化道中TS-相关的损伤，因 为它们起到螯合OPO伤害性的CN-的作用。OH-CO也称为非-CN--结合形式的 氰钴维生素、羟钴胺或维生素B12a，与防止TS-介导的呼吸消化道中氧化剂损 伤的现有技术方法相比，OH-CO防止TS-诱导的OPO活性丧失的这种能力代 表了显著的改善，因为利用其它抗氧化剂例如GSH、抗坏血酸(盐)或去铁胺的 现有技术方法从未证明或暗示过这种保护作用，如以下实施例部分的实施例1 所示。

如以下实施例部分的实施例2所述，可利用具有氧化还原-活性金属离子螯 合剂功能的抗氧化剂来治疗TS-相关的细胞如淋巴细胞的死亡。

氧化还原-活性金属离子螯合剂，例如去铁胺和生理抗氧化剂，例如GSH 是适用于本发明该方面的抗氧化剂的例子，下文给出了其它例子。

氧化还原-活性金属离子螯合剂的使用方式应能在体液(例如，唾液)中形成 约1mM的浓度。去铁胺的给予方式优选能在体液中形成约1mM，更优选约5 mM的浓度。更优选以约1∶1，优选5∶1的比例使用去铁胺和GSH的混合物。 联用时，去铁胺和GSH的体液浓度优选各自为约1mM，虽然浓度为5mM的 去铁胺和浓度为1mM的GSH也是治疗有效的。与防止或减轻TS-介导的呼吸 消化道氧化剂损伤的现有技术方法相比，使用、优选联用抗氧化剂，例如GSH 和氧化还原-活性金属螯合剂(例如去铁胺)代表了显著的改善。

适用于本发明的CN-螯合剂的例子包括，例如依布硒啉(epselen)、维生素 A、C和E、硒化合物、OH-CO、类黄酮(flavenoids)、醌类(例如，Q10、 Q9)、类维生素A(retinoids)和类胡萝卜素。

适用于本发明的氧化还原-活性金属离子螯合剂的例子包括，例如依布硒 啉、去铁胺(desferoxamine)、锌-去铁敏(zinc-desferioxamine)、多胺螯合剂、 乙二胺、二亚乙基三胺(diethylenetriamine)、三亚乙基四胺 (triethylenetetramine)、三亚乙基二胺(triethylenediamine)、四亚乙基五胺 (tetraethylenepentamine)、氨基乙基乙醇胺(aminoethylethanolamine)、氨基乙 基哌嗪、五亚乙基六胺(pentaethylenehexamine)、三亚乙基四胺盐酸盐 (triethylenetetramine-hydrochloride)、四亚乙基五胺盐酸盐 (tetraethylenepentamine-hydrochloride)、五亚乙基六胺盐酸盐 (pentaethylenehexamine-hydrochloride)、四乙基五胺(tetraethylpentamine)、卡 托普利(captopril)、青霉胺(penicilamine)、N，N′-二(3-氨基丙基)-1，3-丙二胺、 N，N，二(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺、1，7-二氧杂-4，10-二氮杂环十二烷、1，4，8，11- 四氮杂环十四烷-5，7-二酮、1，4，7-三氮杂环壬烷三盐酸盐、1-氧杂-4，7，10-三 氮杂环十二烷、1，4，8，12-四氮杂环十五烷和1，4，7，10-四氮杂环十二烷。

铁螯合剂去铁胺(deferoxamine)也称为DES、甲碘酸去铁铵(desferal)和去铁 敏(desferioxamine)。

本发明的制品还可包含至少一种调味剂，例如冬青油、牛至油(oregano oil)、桂叶油(bay leafoil)、薄荷油(peppermint oil)、留兰香油(spearmint oil)、 丁香油、鼠尾草油、黄樟油、柠檬油、橙油、茴香油、苯甲醛(benzaldehyde)、 苦杏仁油、樟脑、雪松叶油、马郁兰油、香茅油、薰衣草油、芥子油、松油、 松针油、迷迭香油、百里香油和肉桂叶油。

可将活性成分引入上述制品(例如鼻烟)，例如以干粉的形式，作为抗氧化 剂化合物的混合物，或作为在保护性脂质体、纳米球或其它可接受的递送运载 体中的复合物。该粉末可在最后的制造过程中加入，还可含有该行业常用的合 适调味品或芳香剂。

本领域普通技术人员鉴于以下非限制性的实施例可以明白本发明的其它目 的、优点和新特征。此外，上文所述和下文权利要求部分所述的本发明各实施 方式和各方面在以下实施例中可以得到实验支持。

实施例

现参考以下实施例，这些实施例和以上描述一起非限制性地描述本发明。

实施例1

羟钴胺提供针对烟草烟诱导的呼吸消化道抗氧化(antioxidant)防御丧失 的保护作用

许多常见的和高度衰弱性口腔疾病，例如癌症、牙周炎和龈炎是消费烟草 产品例如吸烟所致或因其而加重。例如，口腔癌是一种频发的致死性和高度衰 弱性疾病，全球50-90％的病例是由烟草消费所致。导致癌症进程加速的一种公 认机理是经由氧化损伤，例如接触自由基导致的蛋白质破坏。

因此，本发明人分析了TS对呼吸消化道抗氧化防御的影响，并发明了防 止这种影响的手段(means)，如下所述。

接触烟草烟导致口腔过氧化物酶减少和蛋白质破坏增加

口腔过氧化物酶是抵御例如疾病(如上消化道恶性肿瘤、牙周炎和龈炎) 进展相关的大分子破坏所致上消化道氧化剂损伤的关键性唾液酶防御手段。图 2a图示了OPO介导的免遭接触TS HCN所致抗氧化损伤的机理。

因此，如下所述，本发明人分析了TS对OPO活性和唾液蛋白质羰基化(接 触氧化应激和/或TS所诱导的蛋白质破坏的公认指标)的影响(11、12、42)。

方法和材料：

唾液收集：按照以前所述(43)，在非刺激条件下收集至少10年每天至少吸 20支烟的健康吸烟者和不吸烟者的全唾液。

烟草烟的产生：烟草烟得自含有14mg焦油和0.9mg尼古丁的常见市售烟 (以色列特拉维夫市杜白克有限公司的“时代”牌香烟(“Time”cigarettes，Dubek Ltd.))

唾液与TS的体内接触：检测吸1支香烟之前和之后吸烟者和不吸烟者的2 ml唾液样品中的OPO活性。实验前1小时，对象不接触TS。

唾液与TS的体外接触：按照以前所述(11、12、14、15)，联用香烟和真空 系统进行唾液样品与TS的体外接触。简言之，将4-5ml唾液样品置于具有侧 臂的50ml真空烧瓶中，所述侧臂和香烟相连。对烧瓶抽真空，1支香烟的烟以 4-5次“抽吸(puffs)”吸入烧瓶中。在与TS接触前即刻抽取用于分析OPO 活性的唾液样品，并在完成样品与TS接触(约10分钟)后0、30和60分钟抽取 用于分析OPO活性的唾液样品。烧瓶在37℃温育在代谢摇床(metabolic shaker) 中。收集后，立即在4℃将样品以800xg离心10分钟以除去鳞状细胞和细胞 碎片。随后分析得到的上清液的OPO活性和唾液蛋白质羰基化。

分析OPO活性：如以前所述(20)，根据2-硝基苯甲酸-硫氰酸酯(NBS-SCN) 试验检测OPO活性。简言之，pH5.6时，通过加入β-巯基乙醇将DTNB还原 成NBS，通过检测412nm的吸光度以分光光度法监测与OSCN-(OPO的产物) 反应导致的NBS浓度降低(18)。一单位的酶活性定义为利用12,800的摩尔消 光系数、在22℃断裂1μmol NBS/分钟所需的活性(20)。

蛋白质羰基化的Western免疫印迹分析：如以前所述(14)，利用10％的凝 胶通过SDS-PAGE分离唾液蛋白质并电印迹到硝基纤维素膜上。联用英特金公 司的Oxyblot试剂盒(Intergen Co，Purchase NY)与抗-二硝基苯基肼(DNPH) 抗体来标记羰基化的蛋白质。然后通过将标记的印迹与第二HRP-偶连的抗- 家兔抗体反应，随后通过第二标记抗体的ECL检测来显示蛋白质羰基化水 平，如以前所述(14)。

结果的统计学分析：从体内和体外研究的吸烟者和不吸烟者实验亚组获得 的结果计算范围、平均值和SD及SEM。利用P＜0.05作为标准建立统计学显 著差异，通过用于平均值差异的2-样品T-检验进行统计学分析来比较各亚组的 结果。

结果：

吸入烟草烟导致体内口腔过氧化物酶活性受损：至少1小时不接触TS后， 在体内和体外研究所采用的对象中，发现吸烟对象的唾液样品中OPO活性水平 分别是不吸烟对象的82％和85％，然而，统计学分析显示这些差异不是统计学 显著的，因此结论认为吸烟者和不吸烟者的基线OPO活性水平是相似的(表1)。

表1.在体外和体内研究所采用的不吸烟对象和吸烟对象的基础口腔过氧 化物酶水平相似

吸1支香烟后，在吸烟和不吸烟对象中均立即观察到OPO活性急剧降低， 不吸烟者中水平的降低(吸烟前水平的42.5％，p＜0.01)还要高于吸烟者(吸烟前 水平的58.5％，p＜0.01)(图2b)。随后不接触TS，吸烟后30分钟时两组中OPO 活性水平均回复到初始吸烟前水平的90-100％。

体外接触烟草烟导致口腔过氧化物酶活性降低：体外研究利用与体内研究 所用那些不同的一组不吸烟和吸烟对象。与上述体内实验得到的结果相似，两 个研究组中接触1支香烟TS后在时间0时OPO活性水平显著降低，其中不吸 烟者唾液中OPO活性丧失高于吸烟者唾液(图2c)。

有文献报道不吸烟者唾液含有0.3-1.5mM SCN-，而严重吸烟者的唾液含有 1.4-4.0mM SCN-，据推测严重吸烟者中SCN-含量较高提供了抵御TS-诱导的 OPO活性降低的保护作用。因此，为确定为何与不吸烟者相比，吸烟者中OPO 活性略高以及更耐受TS，分析了以硫氰酸钾形式(KSCN)外源性添加SCN-对接 触TS的不吸烟者唾液的影响。在体外系统中将0.5-5.0mM KSCN加入3位不 吸烟对象的唾液并检测吸1支香烟前后的OPO活性，证实了加入SCN-确实提 供了抵御OPO活性丧失的显著保护作用(图3)。

唾液与TS的体内接触导致显著的唾液蛋白质羰基化：通过Western免疫印 迹分析评估，发现通过吸1支香烟使得唾液与TS体内接触导致唾液蛋白质羰 基化水平显著增加(图4a)。在吸烟后10分钟观察到最高水平的蛋白质羰基化 (图4a，泳道2)。发现主要的唾液蛋白，例如淀粉酶、富含酸性脯氨酸的蛋白 和溶菌酶是被TS羰基化程度最大的(most carbonylated)。

唾液与TS的体外接触导致显著的唾液蛋白质羰基化：与上述体内研究相 似，通过Western免疫印迹分析评估发现，唾液与1支香烟的TS体外接触显著 增加主要唾液蛋白质的羰基化水平(图5a)。体外研究中未发现蛋白质羰基化水 平的恢复，因为不可能提供新的唾液。

因此，这些结果鉴定了TS接触所致的OPO活性丧失和伴随的大分子破坏， 例如唾液蛋白质羰基化。

氢氰酸(HCN)介导与烟草烟相关的口腔过氧化物酶活性丧失：

为阐明TS导致OPO活性丧失的机理，分析了各种氧化剂和抗氧化剂对体 外接触TS的唾液中OPO活性的影响，如下所述。

材料与方法

烟草烟的产生：烟草烟得自含有14mg焦油和0.9mg尼古丁的常见市售烟 (以色列特拉维夫市杜白克有限公司的“时代”牌香烟)。

唾液与TS的体外接触：如上所述进行唾液样品与TS的体外接触，改变之 处在于相同的唾液样品以20分钟为间隔多次与1支香烟的TS接触。

分析OPO活性：如上所述分析TS处理的唾液样品中的OPO活性。

有氧化剂、抗氧化剂和抑制剂存在下用TS处理唾液：在用TS处理前，将 指定浓度的各种试剂和材料加入唾液。除非另有指定，所有化学品购自美国密 苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO， USA)。

统计学分析：如上文体外研究所述进行结果的编辑(compilation)和统计 学分析。

结果：

唾液接触3支香烟的TS导致OPO活性以TS剂量依赖性地降低至TS-接触 前水平的22％(图6)。

氨苯砜(Dapsone)a已显示在酸性pH下能特异性抑制SPO，但不抑制 MPO(44)。因此，为确定OPO活性的MPO或SPO活性组分中哪一种因接触 TS而丧失，在有50-150μM浓度渐增的氨苯砜存在下检测TS-处理的唾液中的 OPO活性。发现有150μM氨苯砜存在下接触TS导致的OPO活性丧失为 60-85％，而对照MPO活性未受影响(图7)，在含有约40％MPO的唾液中，有 或没有150μM氨苯砜存在下的OPO活性丧失相似(图8)，从而表明TS以相似 程度影响SPO和MPO活性。

在有或没有1mM抗坏血酸(盐)(ascorbate)或抗氧化剂GSH或去铁胺 存在下，发现TS-处理的唾液中OPO活性丧失相似(图9)，唾液与1mM抗 坏血酸(盐)或氧化剂100μM FeCl3接触2小时未抑制OPO活性(图10)。

在有2mM、80μM丙烯醛和20μM巴豆醛(TS中存在的几种主要醛类) 存在下，TS-处理的唾液中OPO活性未受影响(图11)。

随后经透析处理18小时后，丧失初始OPO活性约68％的TS-处理唾液中 的OPO活性水平恢复到初始水平的94％(图12)。因此，估计可以通过除去低 分子量分子来治疗TS-处理唾液中的OPO活性丧失。

氰化物(Cyanide)是血红素过氧化物酶的已知抑制剂，现已发现各种牌子 香烟的气相TS含有2-233μg KCN(45)。因此，为测试透析处理能通过除去 KCN而恢复TS-处理唾液中的OPO活性这一假说，用150μM KCN处理唾 液样品并分析OPO活性。仅仅温育2分钟后便观察到该浓度的KCN导致 OPO活性丧失约65％，通过透析显著逆转了这种丧失(图13)，从而表明KCN 实际上能抑制OPO活性。

羟钴胺保护与烟草烟相关的唾液过氧化物酶丧失：由于发现CN-离子参与 TS-相关的OPO活性丧失，本发明人试图提供利用CN-螯合剂来防止这种OPO 活性丧失的手段。

加入用量渐增的OH-CO(一种已知的CN-螯合剂)显示能显著防止TS处理 后40分钟唾液中的OPO活性丧失(图14)。类似地，向用1mM KCN处理2分 钟的唾液中加入1mM OH-CN足以完全防止KCN-相关的40-60％的OPO活性 丧失(图15)。此外，将唾液与OH-CO预温育能防止TS-和KCN-相关的OPO活 性丧失，从而表明氰化物实际上介导TS-相关的OPO活性丧失。

因此，这些结果表明，根据本发明，OH-CO可用于有效减轻或防止与接触 TS相关的疾病，例如呼吸消化道恶性肿瘤、牙周炎和龈炎(gingivitis)等的发 生。

实施例2

抗氧化剂去铁胺和谷胱甘肽防止与接触烟草烟相关的上呼吸消化道淋巴细 胞死亡

呼吸消化道的许多疾病与消费烟草产品或咀嚼槟榔有关。例如，口腔SCC 是最常见的头颈恶性肿瘤，发病率和死亡率高。在多达90％的病例中，该癌症 由口腔上皮细胞与烟草产物例如TS或咀嚼的槟榔接触所诱导。这种接触总是 在有唾液存在下发生，大概由自由基诱导。因此，检测了有唾液存在下TS对 细胞的影响，如下所述。

材料与方法

TS诱导口腔粘膜细胞突变在有唾液存在下发生(22、23)。因此，为研究细 胞上TS与唾液之间的相互作用，将完整细胞单独或在有唾液存在下接触TS。 淋巴细胞因其对氧化剂损伤高度敏感而被采用。

唾液收集：无刺激条件下，早上(早8点到中午)在安静的房间中收集21-47 岁健康对象(3男3女)的唾液。如以前所述(43)，在进食后至少1小时通过吐在 容器中来收集唾液10分钟。收集后，立即将唾液在4℃以800xg离心10分钟 以除去细胞和细胞碎片，得到的上清液用于生物化学分析。

淋巴细胞分离：将18-55岁、知情、健康的10位不吸烟对象的血液抽取入 含有EDTA的细胞准备管(vacutainers)。按照生产商的使用说明，通过 Ficoll-Hypaque(西格玛公司(Sigma))梯度离心分离淋巴细胞，将淋巴细胞以 107细胞/ml悬浮在PBS(以色列，BH工业公司(Beit-Ha’emek Industries，Israel)) 中，并立即用于实验。

烟草烟的产生：烟草烟得自含有14mg焦油和0.9mg尼古丁的常见市售烟 (以色列特拉维夫市杜白克有限公司的“时代”牌香烟)。

在有唾液存在下用TS处理淋巴细胞：如以前所述(14、15)，将除去过滤嘴 末端的时代牌香烟(能除去直径＞0.1mm的颗粒)与剑桥(Cambridge)过滤嘴相 连，剑桥过滤嘴与真空系统组合以将气相TS抽入含有悬浮在12-15ml PBS中 的淋巴细胞的密封250ml烧瓶中，从而使得淋巴细胞与TS接触。在该烧瓶中 产生可再现的抽真空，抽真空5秒后，80-100ml点燃的香烟的TS抽入该烧瓶。 加入所示浓度的化学添加剂GSH、NAC、去铁胺、抗坏血酸(盐)(Asc)、尿酸或 FeCl3(西格玛公司)。将这些淋巴细胞悬浮在补加了30％(v/v)唾液的PBS中 以进行淋巴细胞的唾液处理。用0.5支香烟的TS处理后，37℃，在代谢摇 床中温育烧瓶20分钟，再用TS处理4次，如上所述。

检测淋巴细胞存活：通过台盼蓝排除试验(Trypan Blue exclusion assay)评 估淋巴细胞活力。

淋巴细胞蛋白质羰基化的Western免疫印迹分析：2,000rpm离心2分钟以 除去唾液和温育介质的其它组分后，用PBS洗涤淋巴细胞两次。然后以14,000 rpm离心淋巴细胞1分钟，在含有20mM Tris pH 7.4、1mM EGTA、1mM PMSF、50μM NaVO4和50mM NaF的裂解缓冲液中超声处理10秒以裂解细 胞。14,000rpm离心裂解液1分钟，收集上清液作分析。如上所述进行羰基化 分析。

统计学分析：从对照亚组(PBS中的淋巴细胞)和各种处理亚组中获得统计 学分析的结果。计算平均值、SD和SEM，采用邦氏多重比较检验模型(Bonferroni Multiple-Comparison Test Model)(47)，通过偏差的单路分析(one-way analysis-of-variance)(46)来分析和比较亚组之间的结果以确定所计算的平均值 之间的显著差异。通过配对差异的T-检验(T-test For Paired Differences)来分析 各对平均值之间的平均值，通过平均值差异的双样品T-检验(Two Sample T-test For Differences in Means)来比较各两个亚组之间的平均值(48)。

结果：

淋巴细胞在单纯的PBS或补加了30％(v/v)唾液的PBS中的80分钟温育期 间，细胞死亡或蛋白质羰基化均未发生(分别见图16和17)。没有唾液存在下， 用TS处理淋巴细胞导致细胞死亡和蛋白质羰基化水平随时间而增加，80分钟 后达到的峰值死亡率为44％(p＜0.01)。在TS处理期间将唾液加入淋巴细胞悬 浮液协同增强了TS的致死作用，这由86.2％(p＜0.01)的死亡率和蛋白质羰基化 水平大大升高所证明(分别见图16和17)。

将唾液加入只在PBS中温育了80分钟的淋巴细胞轻微减少了蛋白质羰基 化水平(图17)。这显示是因为尿酸这一唾液中主要的非酶抗氧化剂(18、28、49)， 因为将尿酸替代唾液加入悬浮介质降低了羰基化水平(图18)。

在悬浮介质中补充1mM抗坏血酸(盐)或1mM NAC未改变接触TS和唾 液的淋巴细胞死亡率，而加入1mM GSH部分防止了这种淋巴细胞丧失。TS 和唾液处理后20和80分钟时，淋巴细胞存活率分别降低至57.1％和13.8％， 而有GSH存在下这些存活率分别为93.4％(p＝0.0001)和24.3％(p＝0.0037)(图 19)。

类似于GSH处理，加入1mM去铁胺显著防止了80分钟时的淋巴细胞死 亡，存活率是23.7％(p＝0.005)(图19)。

与检测的所有其它抗氧化剂缺乏保护作用相比，通过评估淋巴细胞蛋白质 羰基化水平也证实了20分钟时GSH提供的独特保护作用(图20)。

醛类的作用：证明GSH对TS+唾液-诱导的淋巴细胞死亡有保护作用导致 了一种假设，即该(致死)影响是由TS相关的醛类介导。实际上，将已知存在于 TS中的各种外源性醛类加入悬浮在PBS中的淋巴细胞类似地导致细胞死亡。 即，有80μM丙烯醛、20μM巴豆醛或2mM乙醛存在下，20分钟后的存活 率分别是63.3％、80.3％和93.6％，80分钟时这些死亡率分别是57.3％、75.3％ 和92.7％。类似于有TS和唾液存在下GSH介导的活力恢复，通过加入GSH 而介导的针对细胞死亡的保护作用进一步支持了这种通过外源性醛类模拟 TS+唾液诱导的致死性。有这些醛类存在下加入GSH导致20分钟时的淋 巴细胞存活率分别是93.3％、82.3％和93.3％，80分钟时这些存活率分别是 87.4％、81.3％和93.6％。由于对照淋巴细胞的存活率是95.7％，可以得出结 论：乙醛不起作用，而丙烯醛和巴豆醛(程度略轻些)是导致细胞死亡的醛类。

这些醛类诱导的损伤和GSH提供的保护作用的模式在伴随的蛋白质羰基 化水平中相似(图21)。然而，与用唾液和TS处理所显示的复杂协同作用形成对 比的是，用丙烯醛(已证实的最强效硫醇)与唾液处理并未显著改变存活率(分别 是57.9％和66.4％)，也未提高羰基化水平(图22)。这便排除了基于TS-唾 液的协同作用涉及基于TS的醛类的可能性。

过渡金属离子的作用：外源性醛类对淋巴细胞存活相对缓和的影响和以前 注意到缺乏相关的醛-唾液协同作用得出这样一种可能性，即可能有另一种机理 介导TS对淋巴细胞存活的伤害性作用。去铁胺具有与GSH相似的保护作用这 一事实指出氧化还原-活性铁离子可能的作用。为测试该假设，通过以下试验分 析了氧化还原-活性铁的作用，该试验采用检测氧化还原-活性铁介导的对抗坏 血酸(盐)促氧化剂活性的增强作用。也利用去铁胺(一种非常强效的铁螯合剂) 分析了氧化还原-活性铁离子的作用。

将抗坏血酸(盐)加入未接触TS的含唾液介质中导致淋巴细胞存活率降低至 78％(p＜0.01；图23，柱6)。将抗坏血酸(盐)加入含铁例如FeCl3但不含唾 液的PBS中进一步证明了氧化还原-活性铁的调节作用。这产生了与将抗坏 血酸(盐)加入唾液所得相似的结果。证明淋巴细胞存活率降低至77％(图23， 柱8)，有去铁胺存在时完全防止了这种降低(图23，柱9)。

没有唾液存在时，抗坏血酸(盐)或去铁胺均未发现对于TS对淋巴细胞的直 接中等致死作用有任何调节作用(61％存活率)(图24)。这证明氧化还原-活性铁 离子不是源自TS而是源自唾液，如所述的。

GSH和去铁胺针对TS-唾液介导的淋巴细胞死亡的保护作用：由于以上鉴 定的淋巴细胞丧失的两种主要潜在机理是基于氧化还原-活性铁介导的醛类和 高反应活性自由基的作用，进行了目的为同时保护淋巴细胞免遭两种伤害性机 理作用的以下实验。

在有1mM GSH或同时有1mM GSH和低(1mM)或高(5mM)浓度的去铁胺 存在下，将淋巴细胞与TS和唾液接触。检测20和80分钟后的存活率和羰基 化水平。在TS处理淋巴细胞前将1mM GSH和5mM去铁胺加入含唾液的介 质对TS的致死性作用有非常显著的保护作用。而20和80分钟时未受保护的 淋巴细胞的存活率分别是57.2％和14.4％，这些存活率分别上升到90.8％(p＝ 0.0001)和61.6％(表2)。此外，与这种存活率的非常显著的改进相伴的是蛋 白质羰基化水平降低至接近0(图25，泳道7、8)。

表2.单用GSH和与1mM去铁胺联用对TS+唾液处理的淋巴细胞的存 活率％的影响

提示了TS诱导疾病的综合机理，其中新作用归因于唾液丧失其抗氧化能 力并在TS存在下变成强效的促氧化环境(图26)。该机理基于当前研究所得的结 果以及口腔癌症最多发生在有唾液存在下与烟草产物(TS或嚼槟榔)接触的口腔 上皮细胞中这一公知的观察结果。

因此，根据本发明，这些结果表明GSH和去铁胺可有效地用于防止或减轻 与烟草消费所致细胞死亡相关的呼吸消化道疾病。

虽然结合具体的实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应明白有许多 改变、改进和变化。因此，所有这种改变、改进和变化应落在随附的权利要求 的构思和范围中。如同各份出版物、专利或专利申请专门且单独表明通过引用 纳入本文的程度一样，本说明书中述及的所有出版物、专利和专利申请通过引 用全文纳入本说明书。此外，本说明书中引用或辨明任何参考文献不应理解为 承认该参考文献可用作本发明的现有技术。

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