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一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法与应用
申请号	CN201710972166.3	申请日	2017-10-18	公开(公告)号	CN107510098A	公开(公告)日	2017-12-26
申请人	厦门诺康得生物科技有限公司;			发明人	闫旭; 李柱; 韩绪春; 郭岗; 黄国锋; 吴进; 许元基;
摘要	一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法与应用，涉及电子烟。其原料组成按质量百分比为：65％～80％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含脐带间充质干细胞外泌体，脐带间充质干细胞外泌体的含量为1mg/g。将丙二醇、香料、甘油和水混合，再加入脐带间充质干细胞外泌体，即得。含有干细胞外泌体的电子烟烟液中的干细胞外泌体通过电子烟雾化后被吸收入体内。间充质干细胞来源于脐带，从脐带中分离提取出间充质干细胞，再通过原代培养和传代培养获得。含有干细胞外泌体的电子烟烟液的应用。含有干细胞外泌体的电子烟烟液内的干细胞外泌体可通过雾化方式直接进入肺组织，改善肺部功能。
权利要求	1.一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于其原料组成按质量百分比为： 65％～80％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含脐带间充质干细胞外泌体，所述脐带间充质干细胞外泌体的含量为1mg/g。 2.如权利要求1所述一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的原料组成按质量百分比为：63％～70％丙二醇、1％～2％香料、 15％～20％甘油、5％～15％水；所述水可采用蒸馏水。 3.如权利要求1所述一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：将P3代脐带间充质干细胞种植于T175细胞培养瓶中，当细胞融合后清洗，然后更换无血清培养基继续培养，收集细胞上清用于外泌体分离制备；然后根据CapturemTMExosome Isolation Kit的使用说明进行外泌体的分离制备。 4.如权利要求3所述一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于所述当细胞融合后清洗，当细胞融合达到80％后用PBS清洗；所述继续培养的时间为48～72h。 5.如权利要求3所述一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于所述脐带间充质干细胞的具体制备方法为：取新鲜健康脐带冲洗干净后，剔去血管，剥出华氏胶组织，将所得华氏胶组织剪碎；在细胞培养皿中加入培养液培养，有部分细胞从华氏胶组织块周围爬出，细胞开始增殖，形成细胞集落，待细胞长满后传代。 6.如权利要求5所述一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于所述冲洗干净采用PBS冲洗，所述剔去血管采用剪刀镊子剔去血管；所述将所得华氏胶组织剪碎可剪碎至 1mm3大小。 7.如权利要求5所述一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于所述培养液采用α-MEM培养液，所述培养液中含10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml 链霉素。 8.如权利要求5所述一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液，其特征在于所述在细胞培养皿中加入培养液培养，是培养液刚好覆盖华氏胶组织块；所述培养的条件可置于37℃， 5％的CO2培养箱培养5～7天；所述有部分细胞从华氏胶组织块周围爬出的细胞形态呈细小的梭形；所述细胞开始增殖的条件可为：1周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。 9.如权利要求1～8中任意一项所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将丙二醇、香料、甘油和水混合，再加入脐带间充质干细胞外泌体，即得含有干细胞外泌体的电子烟烟液；所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液中的干细胞外泌体可通过电子烟雾化后被吸收入体内；间充质干细胞可来源于脐带，从脐带中分离提取出间充质干细胞，再通过原代培养和传代培养获得。 10.如权利要求1～8中任意一项所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的应用；所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液内的干细胞外泌体可通过雾化方式直接进入肺组织，改善肺部功能。
说明书全文	一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法与应用技术领域 [0001] 本发明涉及电子烟，尤其是涉及添加脐带间充质干细胞外泌体的电子烟在改善肺功能中应用的一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法与应用。背景技术 [0002] 电子烟，又称电雾化卷烟，是一种通过电子加热手段向呼吸系统传送电子烟烟液的电子装置。电子烟主要由烟杆(包括发光二极管、电池、控制电路、气动开关和雾化器等元器件)和烟弹(包括储液腔和吸嘴)组成。在抽吸电子烟时，气动感应开关在抽吸的负压作用下触发，通过电磁感应作用使集成控制电路接通，指示灯亮起，在电加热丝加热烟弹中烟液的同时雾化器发出超声波使贮液腔里的烟液雾化，雾化烟液随着气流进入人体口腔，从而达到模拟烟液的效果。虽然和卷烟相比，电子烟少了许多有害成分，但烟液的主要成分是尼古丁和丙二醇，丙二醇在短时间内刺激呼吸道，长期、反复吸入丙二醇会对人体产生哪些不良影响尚不清楚，而长期吸入尼古丁会对吸食者肺部造成一定伤害。 [0003] 干细胞外泌体(exosomes)是干细胞释放到细胞外基质中的膜分泌体系，不仅含有干细胞的活性物质，而且具有选择性组装、靶向性投递、高效修复受损组织、安全性高、化学性质稳定易于保存等特点，是干细胞领域具有重要研究价值的新兴热点。外泌体作为细胞在特定环境下分泌的膜包裹的递质，在细胞间信息传导过程中起到重要作用。干细胞外泌体包含有大量的生物信息传播介质，如mRNA、miRNA的遗传信息，核糖核蛋白体等蛋白质、脂质、膜受体以及其他一些具有生物活性的物质。 [0004] 有研究结果显示，干细胞外泌体能抑制全身炎症反应，减少肺组织氧化应激损伤，改善肺毛细血管通透性，减轻肺损伤的严重程度。有研究结果显示，MAPK 信号通路在机械通气肺损伤中活性增加，对机械通气肺损伤具有保护作用。在实验中，注射干细胞外泌体的实验组和模型组大鼠肺组织建模后p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白水平较注射生理盐水的对照组增高，实验组大鼠肺组织p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白水平较模型组降低。因此，MSC外泌体可能通过抑制内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织中p-JNK、p-P38、p-ERK蛋白表达来发挥对肺组织的保护作用。发明内容 [0005] 本发明的目的在于针对目前干细胞外泌体通过注射的方式经过血液循环进入肺部改善肺功能、注射干细胞外泌体的方式门槛高、生物安全性不够等问题，提供将干细胞外泌体通过电子烟雾化的方式被人体吸收，避免上述各种缺点的一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法。 [0006] 本发明的另一目的在于提供所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的应用。 [0007] 所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的原料组成按质量百分比为：65％～80％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含脐带间充质干细胞外泌体，所述脐带间充质干细胞外泌体的含量为1mg/g。 [0008] 所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的原料组成按质量百分比优选：63％～70％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含脐带间充质干细胞外泌体，所述脐带间充质干细胞外泌体的含量为1mg/g。 [0009] 所述水可采用蒸馏水。所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法可为：将P3代脐带间充质干细胞种植于T175细胞培养瓶中，当细胞融合后清洗，然后更换无血清培养基继续培养，收集细胞上清用于外泌体分离制备；然后根据CapturemTMExosome Isolation Kit(Cell Culture)的使用说明进行外泌体的分离制备；所述当细胞融合后清洗，可当细胞融合达到80％左右后用PBS清洗；所述继续培养的时间可为48～72h。 [0010] 所述脐带间充质干细胞的具体制备方法可为：取新鲜健康脐带冲洗干净后，剔去血管，剥出华氏胶组织，将所得华氏胶组织剪碎；在细胞培养皿中加入培养液培养，有部分细胞从华氏胶组织块周围爬出，细胞开始增殖，形成细胞集落，待细胞长满后传代。 [0011] 所述冲洗干净可采用PBS冲洗，所述剔去血管可采用剪刀镊子剔去血管；所述将所得华氏胶组织剪碎可剪碎至1mm3大小；所述培养液可采用α-MEM培养液，所述培养液中含10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml 链霉素；所述在细胞培养皿中加入培养液培养，最好培养液刚好覆盖华氏胶组织块；所述培养的条件可置于37℃，5％的CO2培养箱培养5～7天；所述有部分细胞从华氏胶组织块周围爬出的细胞形态呈细小的梭形；所述细胞开始增殖的条件可为：1周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。 [0012] 所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的制备方法包括以下步骤： [0013] 将丙二醇、香料、甘油和水混合，再加入脐带间充质干细胞外泌体，即得含有干细胞外泌体的电子烟烟液。 [0014] 所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液中的干细胞外泌体通过电子烟雾化后被吸收入体内。 [0015] 间充质干细胞来源于脐带，从脐带中分离提取出间充质干细胞，再通过原代培养和传代培养获得。 [0016] 所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液的应用；所述含有干细胞外泌体的电子烟烟液内的干细胞外泌体可通过雾化方式直接进入肺组织，改善肺部功能。 [0017] 本发明针对目前干细胞外泌体都是通过注射的方式经过血液循环进入肺部改善肺功能，但注射干细胞外泌体的方式门槛高、具有生物安全性等问题，提供一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法，所述电子烟烟液其重量组成：65％～80％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％蒸馏水，另外包含脐带间充质干细胞外泌体(添加含量为1mg/g)。患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的烟民在吸了添加干细胞外泌体的电子烟后，可明显改善肺部功能。附图说明 [0018] 图1为本发明实施例用Western blot检测α-SMA、Fibronectin的表达。在图1中，A为空白对照，B为TGF-β1，C为TGF-β1+Ex。 [0019] 图2为本发明实施例干细胞外泌体治疗组在小鼠气管内给予50ul浓度为10μg/ml的干细胞外泌体，观察记录小鼠的存活率。在图2中，a为PBS，b为BLM+MSC-Ex，c为BLM。具体实施方式 [0020] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。 [0021] 1.细胞实验 [0022] 转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-Beta 1,TGF-β1)的刺激可以导致正常人肺成纤维细胞中α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin)等纤维化标记物的表达量明显提高，间充质干细胞外泌体可以显著抑制TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达。 [0023] 实验方法：分离培养正常人肺成纤维细胞，将P3代细胞以适当密度种植于6孔板，待细胞融合达70％，饥饿细胞12h，空白组不加入任何药品，对照组加入TGF-β15ng/ml，干细胞外泌体治疗组加入TGF-β15ng/ml和10μg干细胞外泌体，分别作用48h后，收集细胞，提取蛋白，用Western blot检测α-SMA、Fibronectin的表达，结果如图1所示。 [0024] 实验结果：由图1可知，TGF-β1刺激可导致正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达明显升高，干细胞外泌体可较明显抑制TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达。 [0025] 实验证明：干细胞外泌体可抑制肺纤维化患者肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达。 [0026] 2.动物实验 [0027] 博来霉素(BLM)会伤害肺部、造成肺纤维化或严重的间质性肺病，已经成为当今经典的动物肺纤维化模型的诱导剂。本发明选用BLM作为诱导剂，经气管内给药诱导小鼠肺纤维化，分析小鼠成活率和肺组织病理学评分。实验结果表明，采用干细胞外泌体治疗小鼠肺纤维化，可明显提高小鼠存活率，减轻肺纤维化的肺部病变，明显降低小鼠肺组织病理学评分。 [0028] (1)BLM诱导肺纤维化小鼠模型的建立 [0029] 取6周龄SPF级BALB/C小鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，喉镜直视下利用小动物气道给药，高压枪将药物导管插入气管内，空白对照组按3mg/kg的剂量注入PBS，实验对照组和治疗组按3mg/kg的剂量注入BLM，注药后将动物直立并旋转，使药物在肺内均匀分布。 [0030] (2)肺纤维化小鼠气管内给予干细胞外泌体 [0031] 在给予BLM后第2天，干细胞外泌体治疗组在小鼠气管内给予50μl浓度为10μg/ml的干细胞外泌体，观察记录小鼠的存活率，结果如图2所示，干细胞外泌体治疗组小鼠的存活率明显高于实验对照组的小鼠存活率(P＜0.05)。 [0032] 结论：气管内给予干细胞外泌体可降低BLM诱导的肺纤维化的死亡率，减轻肺部病变。 [0033] 3.临床试验 [0034] 慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)确诊需要肺功能检查，使用支气管扩张剂后FEV1/FVC＜0.7可以确认存在不可逆的气流受阻。根据FEV1占预计值的百分比进行功能分级。COPD肺功能分级如表1所示。 [0035] 表1 [0036] [0037] 实验方法： [0038] 选择30名患有COPD的烟民作为受试者，其中Ⅰ级10人，Ⅱ级10人，Ⅲ级10人，随机分成A、B两组，每组包含Ⅰ级5人，Ⅱ级5人，Ⅲ级5人。A组在试验期30天内抽不含干细胞外泌体的普通电子烟，B组在试验期30天内抽含有1mg/g干细胞外泌体的电子烟，试验前和试验30天后分别对30名受试者进行肺功能检查。检查结果的FEV1平均值如表2所示。 [0039] 表2 [0040] [0041] 实验结果表明： [0042] B组添加干细胞外泌体的电子烟对COPD患者的肺功能有显著提高。 [0043] 综上：患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的烟民在吸了添加间充质干细胞外泌体的电子烟后，可明显改善肺部功能。

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