一种能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物及其制备方法与应用 |
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| 申请号 | CN201710214699.5 | 申请日 | 2017-04-01 | 公开(公告)号 | CN106957322A | 公开(公告)日 | 2017-07-18 |
| 申请人 | 云南中烟工业有限责任公司; | 发明人 | 刘春波; 杨光宇; 申钦鹏; 刘志华; 唐石云; 蒋薇; 王晋; 何沛; 张凤梅; 司晓喜; 尤俊衡; 李振杰; 朱瑞芝; 王昆淼; 苏钟璧; 崔婷惠; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种能改善 卷烟 抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物及其制备方法与应用，属于 植物 化学技术领域。该化合物是从 烟草 中分离得到，化合物命名为：5‑甲 氧 基‑2,2‑二甲基‑7,9‑二氢‑2H‑呋喃[3,4‑h]色烯，英文名为：5‑methoxy‑2,2‑dimethyl‑7,9‑dihydro‑2H‑furo[3,4‑h]chromene，其分子式为C14H16O3，结构式如式（I）所示：，式（I）；其制备方法是以烟草为原料，经浸膏提取、 有机 溶剂 萃取、MCI脱色、 硅 胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得。本发明化合物添加到卷烟滤嘴中，能增加卷烟抽吸喉部舒适性，具有明显的润喉功效。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物，其特征在于，所述异苯并呋喃类化合物是从烟草中分离得到，命名为：5-甲氧基-2,2-二甲基-7,9-二氢-2H-呋喃[3, |
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| 说明书全文 | 一种能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物及其制备方法与应用 技术领域[0001] 本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种从烟草中首次提取得到的异苯并呋喃类化合物及其制备方法与应用。该化合物具有显著改善卷烟抽吸喉部舒适性的效果，可作为卷烟嘴棒添加剂用于改善卷烟抽吸品质。 背景技术[0002] 烟草属草茄科烟草一年生或有限多年生草本植物，其中以烟草N.tabacum L.栽培最广，其成熟的叶片是卷烟工业的重要原料，是一种经济价值较高的作物。烟草除主要用于吸食外，还有其它较为广泛的用途。同时，烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，经过几十年的研究，人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。 [0003] 研究表明，除蛋白质、氨基酸、糖、磷、钙、钾等常规化学成分外，烟草中还含有大量次生代谢产物，化合物类型包括黄酮、香豆素、单宁、呋喃、苯并异呋喃、苯丙素、萜类、生物碱等。这些化合物具有多种生物活性，在抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿、抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等多个方面具有显著效果。呋喃类化合物属于杂环类，在天然植物中也有广泛存在该类化合物的文献报道。除具有广泛的药理作用外，呋喃还是一类重要的香气化合物，天然存在于各种水果和香料植物中,该类化合物现已广泛用于各种饮料、焙烤食品等食用香精的配方中。 [0004] 本发明从烟草中分离得到了一种异苯并呋喃类化合物，该化合物添加到卷烟过滤嘴中，能显著降低卷烟抽吸喉部刺激性，具有明显的润喉功效，可作为烟草添加剂用于改善卷烟抽吸品质用途，目前尚未发现相关报道。 发明内容[0005] 本发明的第一目的在于提供一种异苯并呋喃类化合物；第二目的在于提供所述异苯并呋喃类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述异苯并呋喃类化合物在卷烟滤嘴中的应用，主要用于降低卷烟抽吸喉部刺激性，改善卷烟抽吸品质。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： [0007] 本发明的第一目的是这样实现的，一种能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物，是从烟草中分离得到，其分子式为C14H16O3，其结构式如式(I)所示： [0008] [0009] 该化合物为浅黄色胶状物，化合物命名为：5-甲氧基-2,2-二甲基-7,9-二氢-2H-呋喃[3,4-h]色烯，英文名为：5-methoxy-2,2-dimethyl-7,9-dihydro-2H-furo[3,4-h]chromene。 [0010] 本发明的第二目的是这样实现的，上述能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物的制备方法，以烟草为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MC I脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为： [0011] A、浸膏提取：将烟草粉碎到20～40目，用5～10倍烟草重量的溶剂超声提取2～5次，每次30～60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/4，静置，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a； [0012] B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1～2倍的水，然后用与水等体积的有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b； [0013] C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3～5倍的体积浓度为50～100％甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90％-95％甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c； [0014] D、硅胶柱层析：将浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～200目，用量为浸膏c重量6～10倍量；以体积比为1:0～0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分； [0015] E、高效液相色谱分离：将体积比为7:3的氯仿-丙酮洗脱得到的洗脱液，经高效液相色谱分离纯化，即得所述的苯并异呋喃类化合物。 [0016] 所述A步骤的溶剂为体积浓度为70～100％的丙酮水溶液、体积浓度为90～100％的乙醇水溶液或体积浓度为90～100％的甲醇水溶液。 [0017] 进一步，优选的是，所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯乙醚或石油醚。 [0018] 进一步，优选的是，所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏c 1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。 [0019] 进一步，优选的是，所述D步骤中，梯度洗脱时，所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到T LC点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱。 [0020] 进一步，优选的是，所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以40％的甲醇水溶液为流动相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为280nm，每次进样10～100μL，收集37.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。 [0021] 以上述方法制备得到的异苯并呋喃类化合物的结构通过以下方法进行测定： [0022] 本发明化合物为浅黄色胶状物；HRESI-MS显示其准分子离子峰为255.1004[M+Na]+(计算值255.0997)，结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C14H16O3，不饱和度为7。 [0023] 红外光谱中显示了芳环(1612、1568和1464cm-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、246、282nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。 [0024] 化合物的1H和13C NMR谱(如表1、图1和图2)显示其含有14个碳和16个氢，包括1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-4～C-7、C-4a和C-7a，H-7)，1个谐二甲基色烯环(C-1'～C-5'，H- 1'、H-2'和H6-4',5')，两个氧化的亚甲基(C-1和C-3；H2-1和H2-3)；以及1个甲氧基(δC 61.2；δH 3.85)。进一步分析其HMBC相关信号，根据H2-1和C-3、C-4a、C-7、C-7a；H2-3和C-1、C-4、C-4a、C-7a；以及H-7和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相关(如图3)可推测化合物为异苯并呋喃类。 [0025] 化合物的HMBC谱中可观察到甲氧基氢(δH 3.85)和C-6(δC 156.3)的HM BC相关，可推测甲氧基取代在C-6位；根据H-1'和C-4、C-5、C-6；H-2'和C-5的远程相关，可推测谐二甲基色烯环取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳连接在苯环的C-5位。 [0026] 至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：5-甲氧基-2,2-二甲基-7,9-二氢-2H-呋喃[3,4-h]色烯。 [0027] 化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇)，λmax(logε)282(3.87)、246(3.68)、210(4.15)；IR(溴化钾压片)：νmax3081、2967、1615、1564、1460、1339、1265、1153、1042、879cm-1；1H和13C NMR数据(500和125MHz，CDCl3)，见表1；正离子模式ESIMS m/z 255[M+Na]+；正离子模式HRESIMS m/z 255.1004[M+Na]+(计算值C14H16NaO3，255.0997)。 [0028] 表1 本发明化合物的1H NMR和13C NMR数据(CDCl3) [0029]No. δC δH No. δC δH 1 75.3 5.19 7a 14 3 72.2 5.15 1′ 11 6.60 4 152. 2′ 12 5.74 5 110. 3′ 7 6 156. 4′ 2 1.55s 7 103. 6.22 5′ 2 1.55s 4a 124. -OM 5 3.81s [0030] 本发明的第三目的是这样实现的： [0031] 本发明能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物在改善卷烟抽吸喉部舒适性中的应用。 [0032] 进一步，本发明能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物作为制备卷烟滤嘴添加剂的应用。该滤嘴添加剂可用来改善卷烟抽吸喉部舒适性。 [0034] 本发明与现有技术相比，其有益效果为： [0035] 本发明能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异苯并呋喃类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定为异苯并呋喃类化合物，并表征了其结构。本发明化合物通过三醋酸甘油酯添加到卷烟过滤嘴中，以未添加该化合物的相同卷烟作为对照，进行感官评析。评析结果表明：和对照相比较，添加本发明化合物能降低卷烟抽吸喉部刺激性，具有明显清咽利喉功效。本发明化合物添加到卷烟滤嘴中，工艺上容易实现，不增加生产过程中的额外步骤，可明显提升卷烟抽吸品质，有良好的应用前景。附图说明 [0036] 图1为本发明异苯并呋喃类化合物的核磁共振碳谱(13C NMR)； [0037] 图2为本发明异苯并呋喃类化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)； [0038] 图3为本发明异苯并呋喃类化合物的关键HMBC相关图。 具体实施方式[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。 [0040] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。 [0041] 本发明所述的异苯并呋喃类化合物，是从烟草中分离得到，其分子式为C14H16O3，其结构式如式(I)所示： [0042] [0043] 化合物命名为：5-甲氧基-2,2-二甲基-7,9-二氢-2H-呋喃[3,4-h]色烯，英文名为：5-methoxy-2,2-dimethyl-7,9-dihydro-2H-furo[3,4-h]chromene。 [0044] 本发明所述异苯并呋喃类化合物的制备方法，是以烟草为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为： [0045] A、浸膏提取：将烟草粉碎到20～40目，用5～10倍烟草重量的溶剂超声提取2～5次，每次30～60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/4，静置，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a； [0046] B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1～2倍的水，然后用与水等体积的有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b； [0047] C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3～5倍的体积浓度为50～100％甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90％-95％甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c； [0048] D、硅胶柱层析：将浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～200目，用量为浸膏c重量6～10倍量；以体积比为1:0～0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分； [0049] E、高效液相色谱分离：将体积比为7:3的氯仿-丙酮洗脱得到的洗脱液，经高效液相色谱分离纯化，即得所述的异苯并呋喃类化合物。 [0050] 所述A步骤的溶剂为体积浓度为70～100％的丙酮水溶液、体积浓度为90～100％的乙醇水溶液或体积浓度为90～100％的甲醇水溶液。 [0051] 所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯乙醚或石油醚。 [0052] 所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏c 1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。 [0053] 所述D步骤中，梯度洗脱时，所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱。 [0054] 所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以40％的甲醇水溶液为流动相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为280nm，每次进样10～100μL，收集37.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。 [0055] 本发明化合物添加到卷烟过滤嘴中，具有明显的改善卷烟抽吸喉部舒适性效果；而且和对照相比较，卷烟抽吸的润感有提升、生津作用明显，抽吸的喉部舒适性得到明显改善。 [0056] 实施例1 [0057] 烟草样品来源于云南玉溪，品种为玉溪K326。 [0058] 取干燥的烟草4.4kg，粗粉碎至30目，用10倍烟草重量的70％的丙酮水溶液超声提取4次，每次60分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至原体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩成120g的浸膏a； [0059] 在浸膏a中加入240g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成80g浸膏b； [0060] 在浸膏b中加入240g的甲醇溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用6升体积浓度为90％甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到62g浸膏c； [0061] 在浸膏c中加入93g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶62g拌样，拌样后，用200目硅胶372g装柱；所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱，收集梯度洗脱液、减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品D(7:3)部分12g，再以 40％的甲醇为流动相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为280nm，每次进样50μL，收集37.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述异苯并呋喃类化合物。 [0062] 实施例2 [0063] 烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200。 [0064] 取干燥的烟草10kg，粗粉碎至40目，用5倍烟草重量的的甲醇超声提取5次，每次30分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至原体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩成300g浸膏a； [0065] 在浸膏a中加入350g水，用与水等体积的二氯甲烷萃取3次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成210g浸膏b； [0066] 在浸膏b中加入630g的体积浓度为50％甲醇水溶液溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用10升体积浓度为95％甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到150g浸膏c； [0067] 浸膏c中加入300g的丙酮溶解，然后加入80目硅胶180g拌样，用180目硅胶1500kg装柱，拌样后上柱；所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱，收集梯度洗脱液、减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品D(7:3)部分32g，再以40％的甲醇为流动相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT G F反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为280nm，每次进样80μL，收集37.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得异苯并呋喃类化合物。 [0068] 实施例3 [0069] 烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200。 [0070] 取干燥的烟草15kg，粗粉碎至20目，用8倍烟草重量的90％的甲醇水溶液超声提取2次，每次45分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至原体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩成460g浸膏a； [0071] 在浸膏a中加入460g水，用与水等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成300g浸膏b； [0072] 在浸膏b中加入1500g的体积浓度为85％甲醇水溶液溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用15升体积浓度为93％甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到150g浸膏c； [0073] 浸膏c中加入450g的甲醇溶解，然后加入100目硅胶120g拌样，用160目硅胶1.2kg装柱，拌样后上柱；所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱，收集梯度洗脱液、减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品D(7:3)部分32g，再以40％的甲醇为流动相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT G F反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为280nm，每次进样80μL，收集37.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得异苯并呋喃类化合物。 [0074] 实施例4 [0075] 实施例4与实施例3的区别在于，超声提取时，所用溶剂为95％乙醇水溶液。萃取时，采用的有机溶剂为乙醚。 [0076] 实施例5 [0077] 实施例5与实施例3的区别在于，超声提取时，所用溶剂为90％丙酮水溶液。萃取时，采用的有机溶剂为石油醚。 [0078] 实施例6 [0079] 实施例1制备制备得到的异苯并呋喃类化合物的结构通过以下方法进行测定；本发明化合物为浅黄色胶状物；HRESI-MS显示其准分子离子峰为255.1004[M+Na]+(计算值255.0997),结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C14H16O3，不饱和度为7。红外光谱中显示了芳环(1612、1568和1464cm-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、246、282nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。化合物的1H和13C NMR谱(表1)显示其含有14个碳和16个氢，包括1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-4～C-7、C-4a和C-7a，H-7)，1个谐二甲基色烯环(C- 1'～C-5'，H-1'、H-2'和H6-4',5')，两个氧化的亚甲基(C-1和C-3；H2-1和H2-3)；以及1个甲氧基(δC 61.2；δH 3.85)。进一步分析其HMBC相关信号，根据H2-1和C-3、C-4a、C-7、C-7a；H2- 3和C-1、C-4、C-4a、C-7a；以及H-7和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相关(图3)可推测化合物为异苯并呋喃类结构。化合物的HMBC谱中可观察到甲氧基氢(δH 3.85)和C-6(δC 156.3)的HMBC相关，可推测甲氧基取代在C-6位；根据H-1'和C-4、C-5、C-6；H-2'和C-5的远程相关，可推测谐二甲基色烯环取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳连接在苯环的C-5位；。至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：5-甲氧基-2,2-二甲基-7,9-二氢-2H-呋喃[3, 4-h]色烯。 [0080] 实施例5 [0081] 取实施例2-5制备的化合物，为浅黄色胶状物。测定与实施例6相同，确认实施2-5制备的化合物为所述苯并异呋喃类化合物——5-甲氧基-2,2-二甲基-7,9-二氢-2H-呋喃[3,4-h]色烯。 [0082] 实施例7 [0083] 取实施例1-5中任一制备的异苯并呋喃类化合物进行卷烟滤嘴的添加效果试验，试验情况如下： [0084] 供添加用卷烟为红云红河集团的卷烟“紫云，”用三醋酸甘油酯将上述异苯并呋喃化合物用配成0.1mg/mL的溶液。按滤嘴丝束重量的8％均匀的喷洒到滤嘴丝束上，制成滤棒，然后将该滤棒通过常规的卷烟卷接制成卷烟，进行感官评析，并以未添加该化合物的相同卷烟作为对照。评析结果表明：和对照相比较，添加本发明化合物的卷烟抽吸的润感有提升、生津作用明显，抽吸的喉部舒适性得到明显改善(表2)。 [0085] 实施例7 [0086] 取实施例1-5中任一制备的异苯并呋喃类化合物进行卷烟滤嘴的添加效果试验，试验情况如下： [0087] 供添加用卷烟为红云红河集团的卷烟“紫云，”用三醋酸甘油酯将上述异苯并呋喃类化合物用配成0.2mg/mL的溶液。按滤嘴丝束重量的5％均匀的喷洒到滤嘴丝束上，制成滤棒，然后将该滤棒通过常规的卷烟卷接制成卷烟，进行感官评析，并以未添加该化合物的相同卷烟作为对照。评析结果表明：添加本发明化合物的卷烟抽吸的润感有提升、生津作用明显，抽吸的喉部舒适性得到明显改善(表2)。 [0088] 表2 卷烟感官舒适度评价 [0089] [0090] 注：分数越高，产品感官质量越好。 [0091] 本发明化合物应用方法不限于此，还可添加至内衬纸上等。 [0092] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。 |
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