[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 根据美国专利法119(e)本申请要求2012年6月7日提交的临时申请61/656,794和2012年7月17日提交的61/672,500的优先权。各前述临时申请以其整体通过参考并入本文。

[0003] 序列表

[0004] 本申请包含序列表，其以ASCII格式经由EFS-Web提交，通过参考以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2013年6月7日，名称为30407-0005WO1_SL.txt，大小为118,885字节。

[0005] 本发明涉及光合性能增强的转基因植物，并更特别地涉及在低光条件下光合能力增强的此类植物。

[0006] 光合植物(photosynthetic plants)依靠光，例如，日光作为其能量来源。在农业种植中公认的是光合作用的光捕获和光反应一般不制约植物的生产性。然而，这种认知源于典型的学术上的温室研究且通常不正确。植物经常遭遇对于生长次优的光条件。比如，黎明和下午晚些时段的特征在于具有较低光强度并相应地较低的光合速率。光合速率的昼夜变化受到光合光子通量密度(photosynthetic photon flux density,PPFD)的影响。植物也经常为日光而竞争。生长高大的植物(taller-growing plants)经常形成树冠(canopy)，树冠吸收光并影响未达到树冠的生长低矮的植物的光合速率和生长速率。被其它叶遮荫的叶子具有低得多的光合速率。当高密度种植耕作物时也观察到遮荫。

[0007] 光合活性还可受到植物不能有效利用全光谱的限制。驱动光合作用的光化反应的光首先被植物叶绿体色素吸收。叶绿素为典型的光合生物的色素。叶绿素a具有最佳效率的两个峰，一个在谱的蓝色部分(约430nm)和一个在谱的红色部分(680nm)。各种“相关色素(associated pigments)”吸收可见光谱的其它部分的光，大部分吸收的能量通过一系列受体直至能量相当于在700nm处吸收的能量。然而，光合作用不会被谱的绿-黄色部分的光，即被具有520-550nm范围波长的光所有效驱动。在密集林分(forestry stands)中到达较低树叶的光非常绿，使得这类光对于驱动光合作用进一步次优。部分光谱因此不能用于驱动光合作用或低效地驱动光合作用。

[0008] 植物光合活性可因此受到光强度的制约，并受到优化植物内源色素以吸收光并驱动光合过程的光波长谱的制约。本发明通过提供具有吸收和发射光的非内源发色团(chromophores)(即，发光团(photophores))的植物，来提供用于改善植物光合活性的方法和组合物。本发明提供改善次优条件下，例如低光条件下植物的生长。

[0009] 本发明涉及用于改善植物生长的组合物和方法。

[0010] 在某些方面，提供光合活性改善的转基因植物，其中植物包含外源发色团，外源发色团吸收在对于光合活性为次优范围内的第一波长的光，并且当吸收该波长的光时，发射在对于植物的光合活性有效的范围内的波长下的光。

[0011] 在某些方面，提供光合活性改善的转基因植物，其中植物包含发色团的链(a chain of chromophores)，所述链吸收对于光合活性为次优的范围中的波长的光，然后使能量通过该链直至发色团发射对于植物光合活性有效的范围内的波长下的光。比如，转基因植物可包含第二外源发色团，其吸收对于植物光合活性为次优范围内的波长的光，并且当吸收所述波长的光时发射对于光合活性为次优范围内的第一波长的光，并且该波长的光被第一外源发色团吸收，然后发射对于植物光合活性有效的波长的光。在某些实施方案中，第二外源发色团具有等于或接近于第一发色团最大吸收波长的最大发射波长。

[0012] 在某些方面，上述外源发色团位于植物的叶绿体，优选位于植物的类囊体膜。

[0013] 在某些方面，提供共栽培植物的方法，其中使光合性能改善的转基因植物与另外的植物在使转基因植物遮荫的条件下共栽培。

[0014] 在某些方面，提供增加土壤氮含量的方法，所述方法包括在土壤中生长转基因固氮植物，例如，表达外源发色团的豆类(legume)。附图说明

[0015] 图1为发色团链(chromophore chain)的示意性代表图，所述发色团链可用于捕获野生型植物利用不良的绿色波长谱中的光，并通过级联能量转移，将光转化为被野生型植物中的捕光机制(light harvesting mechanisms)有效利用的红色波长谱中的光。

[0016] 图2为野生型和mCherry转基因桉属(eucalyptus)叶的一组荧光立体图像(激发滤片BP530-550，阻挡滤片BA575IF)。mCherry转基因桉属叶显示比野生型桉属叶明显更大的荧光强度。

[0017] 图3为野生型和mCherry(系11)转基因桉属植物在生长36天后的一组照片。

[0018] 图4为显示在生长36天后，野生型和转基因mCherry植物(系9和11)从树干底部至顶部的平均高度的图表。所示数据为至少37个复现检验的平均值±1.96标准差(*,p≤0.05；ANOVA之后为邓尼特法(Dunnett’s method))。

[0019] 图5为用于在转基因植物中表达一个发色团的构建体的示意图。

[0020] 图6为用于在转基因植物中表达一个发色团的构建体的示意图。

[0021] 图7为用于在转基因植物中表达一个发色团的构建体的示意图。

[0022] 图8为用于在转基因植物中表达多个发色团的构建体的示意图。

[0023] 图9为用于在转基因植物中表达多个发色团的构建体的示意图。

[0024] 图10为用于在转基因植物中表达多个发色团的构建体的示意图。

[0025] 图11为用于在转基因植物中表达多个发色团的构建体的示意图。

[0026] 图12示出在15s照明间隔和1-1.5分钟遮盖间隔下的10min反应时间之后得到的希尔反应(Hill reaction)斜率。

[0027] 光合植物依靠日光作为其能量来源。因此，它们需要探测该关键环境因素的强度、质量、持续时间和方向，并通过优化其生长和发育来适当地响应。

[0028] 叶绿素a和b富含于绿色植物中。叶绿素具有化学上与血红蛋白和细胞色素中发现的卟啉类基团(porphyrin-like groups)相关的复杂的环结构。类胡萝卜素是具有多个共轭双键的线型分子，其吸收400至500nm区域的光，赋予类胡萝卜素其特征性橙色。大多数色素吸收某些波长的光并反射非吸收的波长，并且起到作为天线复合物的部分的作用，收集光并转移吸收的能量到反应中心复合物中的叶绿素，在此化学氧化和还原反应导致发生长期能量储存。

[0029] 天线系统起到将能量有效地递送到与其关联的反应中心的作用。天线色素的分子结构完全不同，虽然它们全部以某些方式与光合膜相关联。将激发能量由吸收光的叶绿素输送到反应中心的物理机理据认为是共振转移(共振能量转移-RET)。通过该机理经非辐射过程将激发能量从一个分子转移到另一分子。被捕光复合蛋白质中的类胡萝卜素或叶绿素b吸收的光迅速转移到叶绿素a，然后转移到与反应中心密切相关的其它天线色素。

[0030] 在次优光条件下，植物通过吸收野生型植物不适于吸收的波长(例如，520-640nm)，与野生型植物相比，能够从增强的光利用谱获益。本文所述的转基因植物由于从对于野生型植物中光合活性为次优的光波长捕获更多光子因而具有增强的光合作用性能。与野生型植物相比，该次优波长的利用允许转基因植物产生能量以增强光合速率，因此增加生物质(biomass)累积和生长。

[0031] 叶绿体中的发色团和能量转移

[0032] 通过吸收野生型植物不适于有效吸收或利用的波长，与野生型植物相比，转基因植物从增强的光利用谱获益。优选的发色团在驱动绿色植物光合作用中低效的绿-黄色光谱(大约520-550nm)中具有激发max。为驱动光合活性，(一个或多个)发色团应当单独或组合产生可被天然捕光复合物捕获和利用的能量。发色团的链可用于从一个到另一个捕获和发射光直至发射波长在被天然捕光复合物有效利用的范围内。

[0033] 不同的色素共同充当天线，收集光并将其能量转移到反应中心。天线系统起到有效递送能量到与其联合的反应中心的作用(van Grondelle等人,Biochem.Biophys.ACTA,1187:1-65,1994；Pullerits和 Ace Chem Res,29:381-389,1996)。天线色素的分子结构完全不同，虽然它们全部与光合膜以某些方式联合。激发能量从吸收光的叶绿素输送到反应中心的物理机理据认为是共振转移(共振能量转移-RET)。通过该机理经非辐射过程将激发能量从一个分子转移到另一分子。

[0034] 光合效率可通过过表达内源发色团或表达外源发色团来增加。内源发色团包括叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素a具有最佳效率的两个峰，一个在谱的蓝色部分(430nm附近)和一个在谱的红色部分(680nm)，存在利用可见光谱几乎每一部分，并使大部分吸收的能量沿受体链通过(当然，沿途损失少量)直至能量相当于在700nm处吸收的能量的“相关色素(associated pigments)”。类胡萝卜素是具有多个共轭双键的线型构象分子。在400至500nm区域的吸收带赋予类胡萝卜素其特征性的橙色。大多数色素用作天线复合物，收集光并转移能量到反应中心复合物，在此发生导致长期能量储存的化学氧化和还原反应。被捕光复合蛋白中的类胡萝卜素或叶绿素b吸收的光迅速转移至叶绿素a，然后转移到与反应中心密切关联的其它天线色素。

[0035] 光合效率还可通过表达外源荧光蛋白来增强，此类外源荧光蛋白吸收在被天然植物系统光合利用差的波长下的光。比如，在绿-黄色谱的光波长(520-590nm)被天然捕光复合物的吸收差。转基因蛋白优选通过共振能量转移(RET)发射在受体生物的天然光合范围内的光，并由此在植物中参与能量转移。RET过程包括激发第一转基因发色团分子，该分子反过来通过在能够被第二发色团吸收的波长下发射，而该第二发色团在第一发色团发射谱下适于吸收能量，从而将其能量转移。从一个发色团向另外发色团的能量转移的过程可经由发射激发或光子转移或者两个发色团或捕光元件之间的能量转移的任何其它手段来进行。

[0036] 可用于增强植物光合活性的外源发色团的实例示于表1中。

[0037] 在表1中给出可用于增强光合活性的发色团的非限定实例。另外的示例性发色团包括mVenus(SEQ ID NO:41)、mFred(SEQ ID NO:42)和mKate 1(SEQ ID NO:43)。

[0038] 表1:荧光蛋白数据

[0039]

[0040] 1David等人,Photochem.Photobiol.Sci.11:358-363,2012.

[0041] 2Sarker等人,J.Biomed.Opt.14:34-37,2009.

[0042] 3Mena等人,Nat.Biotechnol.24:1569-1571,2006.

[0043] 4Zapata-Hommer等人,BMC Biotechnol.3:5,2003.

[0044] 5Han等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.971:627-633,2002.

[0045] 6Nagai等人,Nat.Biotechnol.20:87-90,2002.

[0046] 7Shimozono等人,Methods Cell Biol.85:381-393,2008.

[0047] 8Pletnev等人,J.Biol.Chem.283:28980-28987,2008.

[0048] 优选的发色团鉴定为具有下列性质中的一种以上：(i)植物不有效利用的激发波长范围，(ii)在能够激发能量转移链中的发色团的范围内的发射波长；(iii)高量子产量(发射的光子和吸收的光子之比－0水平的亮度，即，发射强度，定义为：摩尔消光系数×荧光量子产量/1000。

[0049] 光合活性的增强可通过表达单个转基因发色团或具有重叠发射和吸收谱的两个以上发色团来实现。具有重叠发射和激发谱的若干发色团的链可用于克服一个发色团的发射谱和另一发色团和/或受体天然捕光色素和叶绿素的激发谱之间的大的空隙。第二发色团可为转基因发色团或一种或多种天然色素和/或叶绿素例如作为天然捕光复合物一部分的发色团。这些基因可与其它基因串联表达或用于共转化。可将两种或更多种荧光蛋白导入细胞中从而达到最佳光合效率。受体可为但不限于类胡萝卜素或其它四萜类有机色素、叶黄素或叶红素或叶绿素a或b。

[0050] 适合于在发色团链中使用的发色团的对(pair)和链的实例包括TurboYFP(激发max在525nm；538nm的发射max)和mKO1(激发max在548nm；559nm的发射max)。mKO1进而能够激发第三发色团，比如DsRed-Express2(激发max在554nm，发射max在591nm)。DsRed-Express2还可用于将能量转移至mCherry、TurboFP635、TurboFP650并将其激发，反过来它们在能够被植物捕光复合物(包含叶绿素和类胡萝卜素)利用的红色波长(610-650nm)下发射。具有重叠发射和激发谱的一种或多种发色团的共表达可因此用作人工链以捕获绿色-黄色谱中的光，并将其能量转移到植物捕光复合物。上述这些示例性发色团链能够使植物更好地利用在530-590nm之间的绿色-黄色波长谱中的光，由此增强光合作用。

[0051] 图1为发色团链的示意性代表图，其可用于捕获野生型植物利用不良的绿色波长谱中的光，并通过级联能量转移，将光转化为被野生型植物中的捕光机制有效利用的红波长谱中的光。

[0052] 光合细胞类型

[0053] 转基因植物可受益于在有助于植物的光合活性的任何组织或细胞类型中增强的光合活性。高等植物中最活跃的光合组织为叶的叶肉。叶肉细胞具有多拷贝的叶绿体，其包含专门吸收光的绿色色素，叶绿素。

[0054] 外源发色团的定位

[0055] 通过将一种以上的外源发色团在引导外源发色团到叶绿体或叶绿体内的区室(compartment)中的转运肽的控制下在植物的叶绿体中和/或在细胞质中和/或在细胞质中转化并表达来实现光合作用增强。光合作用的类囊体反应发生在叶绿体特定内膜(称作类囊体)中。这些类囊体反应的终产物为高能化合物ATP和NADPH，二者在包括大部分植物(和地球)生物质的固碳反应中用于合成糖。糖的合成发生于叶绿体的基质(stroma)(围绕类囊体的水性区域)中。

[0056] 因此，比如SEQ ID NO:2或3与融合到任何叶绿体、基质或类囊体信号肽的SEQ ID NO:4-6或SEQ ID NO:5-6一起的共表达。可选地，携带发色团的DNA序列的质体转化载体(plastide transformation vectors)可直接在叶绿体中用于目标基因的叶绿体转化和表达。

[0057] 在一个实施方案中，融合到叶绿体基质信号(SEQ ID NO:7)或更优选融合到类囊体膜信号(SEQ ID NO:8和9)的SEQ ID NO:1-3的独立表达。叶绿体中转基因发色团的表达将使其与天然捕光复合物天线，即类胡萝卜素-叶绿素捕光天线紧密物理接近。在各发色团之间在多至10nm的距离处RET现象的发生最有效。因此，当转基因发色团存在于叶绿体中并优选基质中，最优选类囊体中时，发生转基因发色团和天然捕光复合物之间的最佳能量转移。

[0058] 在SEQ ID NO:8-17中提供可用于引导蛋白质到类囊体膜的信号肽的实例。

[0059] 在SEQ ID NO:7和18-20中提供充当基质定位信号的肽的实例。

[0060] 构建体和载体的表达

[0061] 使用包含编码外源发色团的核酸序列和可操作地连接到编码外源发色团的核酸序列的启动子的DNA构建体或DNA载体可产生转基因植物细胞和转基因植物。在某些实施方案中，DNA构建体或载体可进一步包含一种或多种(例如，两种、三种或四种)另外的调控元件，例如用于增强转录的5’引导子(leader)和/或内含子、3’非翻译区(例如，包含多聚腺苷酸化信号的序列)和编码转运肽或信号肽(例如，叶绿体转运肽或信号肽)的核酸序列。

[0062] 可使用的启动子的选择取决于若干因素，包括，但不限于效率、选择性、诱导性、所需的表达水平和/或优选的细胞或组织表达。对于本领域熟练技术人员而言通过适当选择和布置与序列相关的启动子及其它调节区来调节该序列的表达是常规事项。可使用的启动子的实例在本领域内是已知的。某些适当的启动子仅或主要在某些细胞类型中起始转录。用于鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区的方法包括，例如，在Jordano等人，Plant Cell1:855-866,1989；Bustos等人，Plant Cell 1:839-854,1989；Green等人，EMBO J.7:4035-4044,1988；Meier等人，Plant Cell 3:309-316,1991和Zhang等人，Plant Physiology 110:1069-1079,1996中所述的那些。

[0063] 可使用的启动子包括在植物基因组中存在的那些，以及来自其它来源的启动子。示例性启动子包括在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤-诱导质粒上携带的胭脂碱合酶(NOS)和章鱼肉碱合酶(OCS)启动子以及来自花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的CaMV35S启动子，参见，例如，在美国专利Nos.5,164,316和5,322,938(通过参考并入本文)中所述的启动子。源自植物基因的非限定的示例性启动子描述于美国专利No.5,641,876中(其描述了水稻肌动蛋白启动子)，描述于美国专利No.7,151,204中(其描述了玉米叶绿体醛缩酶启动子和玉米醛缩酶(FDA)启动子)，以及描述于美国专利申请公布No.2003/0131377(其描述了玉米烟酰胺合酶(nicotianamine synthase)启动子)中(通过参考将这些每一件并入本文)。

[0064] 可使用的启动子的另外的实例包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，例如来自美洲落叶松(Larix laricina)的RbcS启动子；松树cab6启动子(Yamamoto等人，Plant Cell Physiol.35:773-778,1994)；来自小麦的cab-1基因启动子(Fejes等人，Plant Mol.Biol.15:921-932,1990)；来自菠菜的cab-1启动子(Lubberstedt等人，Plant Physiol.104:997-1006,1994)；来自水稻的cab1R启动子(Luan等人，Plant Cell4:971-981,1992)；来自玉米的丙酮酸正磷酸酯二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:9586-9590,1993)；烟草Lhcb 1*2启动子(Cerdan等人，+
Plant Mol.Biol.33:245-255,1997)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)SUC2蔗糖-H转运体启动子(Truernit等人，Planta196:564-570,1995)；和来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab和rbcS)。可用于驱动茎、叶和绿色组织中的基因转录的另外的示例性启动子描述于美国专利申请公布No.2007/0006346中，通过参考以其整体并入本文。导致在植物绿色组织中优先表达的另外的启动子包括来自基因例如拟南芥核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基(Fischhoff等人，Plant Mol.Biol.20:81-93,1992)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸酯二激酶(PPDK)(Taniguchi等人，Plant Cell Physiol.41(1):42-48,2000)的那些。

[0065] 在某些实施方案中，启动子可改变以包含一种或多种增强子从而有助于提高基因表达。可用于促进基因表达的增强子的实例在本领域内是已知的。增强子经常发现于5’从而在真核细胞中运行的启动子中起始转录，但是通常能够被插入到编码序列的上游(5’)或下游(3’)。在某些情况中，这些5’增强元件为内含子。增强子的非限定实例包括水稻肌动蛋白1和水稻肌动蛋白2基因的5’内含子(参见，美国专利No.5,641,876)，玉米乙醇脱氢酶基因内含子、玉米热休克蛋白70基因内含子(美国专利No.5,593,874)和玉米皱缩1基因(shrunken 1gene)内含子。

[0066] 在某些实施方案中，DNA构建体或载体还可包含源自病毒的非翻译前导序列。可促进转录的非翻译前导序列的非限定实例包括来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus,MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的那些(参见，例如，Gallie等人，Nucl.Acids Res.15:8693-8711,1987；Skuzeski等人，Plant Mol.Biol.15:65-79,1990)。另外的示例性前导序列包括：小核糖核酸病毒(picomavirus)前导子，比如，EMCV前导子(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6126-6130,1989)；马铃薯Y病毒组前导子(potyvirus leaders)，比如，TEV前导子(烟草蚀刻病毒)；MDMV前导子(玉米矮小花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导子(Macejak等人，Nature 353:90-94,1991；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的未翻译前导子(AMV RNA 4)(Jobling等人，Nature325:622-625,1987)；烟草花叶病毒前导子(TMV)(Gallie等人，Mol.Biol.RNA,第237-256页，1989)；和玉米褪绿斑驳病毒前导子(MCMV)(Lommel等人，Virology 81:382-385,1991)。还参见，Della-Cioppa等人，Plant Physiology84:965-968，1987。

[0067] 在某些实施方案中，DNA构建体或载体还可包含可含多聚腺苷酸化信号和/或位点的3’元件。众所周知的3’元件包括来自根癌土壤杆菌基因的那些，例如，nos 3’、tml3’、tmr 3’、tins 3’、ocs 3’、tr 73’，参见，例如，美国专利No.6,090,627中所述的3’元件，通过参考并入本文。3’元件还可源自植物基因，例如，来自小麦(普通小麦(Triticum aesevitum))热休克蛋白17的3’元件(Hsp 173’)、来自小麦遍在蛋白基因、小麦果糖-1,6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β-微管蛋白基因的
3’元件，这些全部描述于美国专利申请公布No.2002/0192813(通过参考并入本文)，来自豌豆(Pisum sativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs3’)的元件，以及来自宿主植物内的基因的3’元件。在某些实施方案中，3’元件还可包含适当的转录终止子，例如，CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。

[0068] 在某些实施方案中，DNA构建体或载体包括诱导型启动子。诱导型启动子驱动响应于外界刺激如化学试剂或环境刺激的转录。比如，诱导型启动子可赋予响应于激素如赤霉酸(gibberellic acid)或乙烯的转录，或者响应于光或干旱的转录。诱导型启动子的非限定实例描述于Guo等人，Plant J.34:383-392,2003和Chen等人，Plant J.36:731-40,2003。

[0069] 在某些实施方案中，DNA构建体和载体还可包括编码用于使外源发色团靶向到质体(plastid)如叶绿体的转运肽或信号肽的核酸。比如，使外源发色团靶向到叶绿体可由发现于外源发色团的氨基末端的信号序列来控制，该信号序列在输入叶绿体期间被裂解(例如Comai等人，J.Biol.Chem.263:15104-15109,1988)。示例性信号序列可融合到异源基因产物(例如，外源发色团)以影响异源产物(例如，外源发色团)输入到叶绿体(参见，例如，van den Broeck等人，Nature 313:358-363,1985)。编码适当的信号序列的DNA可从编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白、酶EPSP合酶、GS2蛋白和已知叶绿体定位的许多其它蛋白的cDNAs的5’端分离。参见，比如，美国专利No.5,639,949的实施例37中标题为“叶绿体靶向的表达”的章节(通过参考并入本文)。

[0070] 可使用的转运肽或信号肽的非限定实例包括：菠菜的质体(plastidic)铁氧还+原蛋白：NADP氧化还原酶(FNR)，其描述于Jansen等人，Current Genetics13:517-522，
1988。特别地，可使用在Jansen等人，Current Genetics 13:517-522，1998中在cDNA序列的核苷酸-171至165范围内的序列，其包括5’非翻译区以及编码转运肽的序列。另外的实例为玉米蜡质蛋白(waxy protein)的转运肽，其包括成熟蜡质蛋白的前34个氨基酸残基(Klosgen等人，Mol.Gen.Genet.217:155-161,1989)。还可使用没有成熟蛋白的前34个氨基酸的该转运肽。此外，可使用核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(Wolter 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:846-850,1988；Nawrath 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:12760-12764,1994)、NADP苹果酸脱氢酶(Galiardo等人，Planta197:324-332,1995)、谷胱甘肽还原酶(Creissen等人，Plant J.8:167-175,1995)或R1蛋白(Lorberth等人，Nature Biotechnology 16:473-477,1998)的信号肽。

[0071] 另外的类囊体靶向或基质靶向的信号肽描述于Fan等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.398:438-443,2010；Jarvis 等 人，Curr.Biol.14:R1064-1077,2004；McFadden，J.Eukaryot.Microbiol.46:339-346,1999；Robinson 等 人，Plant Mol.Biol.38:209-221,1998；Brink等人，J.Biol.Chem.270:20808-20815,1995；和Von Heijne等人，Eur.J.Biochem.180:535-545,1989。

[0072] 叶绿体转运肽的另外的实例描述于美国专利No.5,188,642和美国专利No.5,728,925，通过参考并入本文。转运肽的另外实例为拟南芥属(Arabidopsis)EPSPS基因的转运肽，参见，例如，Klee,H.J.等人(MGG 210：437-442，1987)。

[0073] 在某些实施方案中，DNA构建体或载体还可包括选择性标记基因从而允许稳定转化体的选择(参见，例如，本文所述的选择性标记)。在某些实施方案中，作为标记基因可使用发色团来选择稳定的转化体(例如，通过测量由发色团发射的光的特定波长)。

[0074] 可使用的示例性DNA载体为pZS197载体。该载体包含在核糖体RNA操纵子启动子(Prrn)控制下的嵌合aadA基因以及质体psbA基因的3’区(Prrn/aadA/TpsbA)，并且包含用于靶向到叶绿体基因组的大的单拷贝区的质体rbcL和accD基因。可使用的另外的示例性DNA载体为pMON 30125反向重复序列载体，其为pPRV 111A的衍生物。pMON 30125载体包含由PpsbA和TpsbA表达信号驱动的嵌合aadA基因。可用于表达外源发色团的另外的示例性DNA载体和构建体在本领域内是已知的。

[0075] 转化方法

[0076] 植物的转化技术在本领域内是众所周知的，并且包括基于土壤杆菌(Agrobacterium)的技术(参见，例如，美国专利Nos.5,635,055；5,824,877；5,591,616；
5,981,840；和6,384,301)以及不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术涉及通过原生质体或细胞直接吸收外源遗传材料。这可通过聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的吸收(参见，例如，美国专利No.5,384,253)、基因枪法(particle bombardment)介导的递送(参见，例如，美国专利Nos.5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865)、原生质体转化(参见，例如，美国专利No.5,508,184)或显微注射来实现。这些技术的非限定实例由Paszkowski等人，EMBO J.3:2717-2722,1984；Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199:169-177,1985；Reich等人，Biotechnology 4:1001-1004，1986；和Klein等人，Nature 327:70-73,1987中描述。

[0077] 还描述了使用土壤杆菌的转化(参见，例如，WO94/00977和美国专利No.5,591,616，各自通过参考并入本文)。在各情况中，使用本领域内已知的标准技术将转化的细胞再生为整株植物。对于使用根癌土壤杆菌的转化可用许多载体。这些载体典型地携带至少一种T-DNA边界序列，并且包括载体例如pBIN 19(Bevan，Nucl.Acids Res.11:369,1984)。双元载体pCIB 10包含编码用于在植物中选择的卡那霉素抗性的基因和T-DNA左右边界序列，并且并入来自广宿主范围质粒pRK 252的序列，允许其在大肠杆菌和土壤杆菌二者中复制(Rothstein等人，Gene 53:153-161,1987)。通过重组体土壤杆菌的靶标植物物种的转化通常涉及土壤杆菌与来自植物的外植体的共栽培(co-cultivation)，并且随后是本领域内众所周知的操作。在携带在双元质粒T-DNA边界之间存在的抗生素或除草剂抗性标记的选择性培养基上再生转化组织。

[0078] 用基因转化植物细胞的另外的方法涉及将惰性或生物学活性粒子推进于植物组织和细胞。该技术公开于美国专利4,945,050；5,036,006；和5,100,792(各自通过参考并入本文)。通常，该步骤涉及在有效渗透细胞外表面的条件下将惰性或生物学活性粒子推进到细胞。Gordon-Kamm等人，Plant Cell2:603-618,1990；Fromm等人，Biotechnology8：833-839，1990；WO 93/07278；和 Koziel等 人，Biotechnology 11:194-200,1993 描述了粒子轰击以实现植物细胞转化的示例性方法。使用粒子轰击转化质体的示例性方 法 描 述 于Svab 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:913-917,1993；Svab等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:8526-8530,1990；McBride 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:7301-7305,1994；Day等人，Plant Biotech.J.9:540-553,2011。

[0079] 如上所述，还可使用PEG或电穿孔来转化植物细胞。使用PEG或电穿孔来转化植物细胞的非限定实例描述于EP 0292435、EP 0392225和WO93/07278中。

[0080] 还可将质体转化用于在不需要核基因组转化的情况下产生表达异源发色团的转基因植物。质体转化技术广泛地描述于美国专利Nos.5,451,513；5,545,817；和5,545,818(各自通过参考并入本文)和描述于WO 95/16783(通过参考以其整体并入)；和描述于McBride等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:7301-7305，1994；以及Okumura等人，Transgenic Res.15:637-646，2006。用于叶绿体转化的基本技术涉及例如，使用基因枪法(biolistics)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)将侧翼为选择性标记的、含有靶基因的克隆质体DNA的区域导入适当的靶组织。1至1.5kb的侧翼区(称为靶向序列)有助于与质体基因组的同源重组，并且允许质体DNA特定区域的置换或修饰。最初，利用赋予对大观霉素和/或链霉素的抗性的叶绿体16S rRNA和rps12基因中的点突变作为转化的选择性标记(参见，例如，Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:8526-8530，
1990；Staub等人，Plant Cell4,39-45,1992)。这以大约每100次目标叶的轰击为一次的频率实现稳定的同质转化体(homoplasmic transformants)。在这些标记之间的克隆位点的存在允许产生用于导入外源基因的质体靶向载体(Staub等人，EMBO J.12,601-606,1993)。
通过用显性选择性标记置换隐性rRNA或tau蛋白抗生素抗性基因(编码大观霉素-解毒酶氨基苷-3’-苷腺酰基转移酶的细菌aadA基因)获得转化频率的实质性增大(Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:913-917,1993)。用于质体转化的其它选择性标记在本领域内是已知的。可用于质体(例如叶绿体)转化的载体的另外的实例为载体pPH143(WO97/32011)。质体转化通过同源重组将基因插入在各植物细胞中存在的环形质体基因组的全部数千个拷贝中，利用相对于核表达基因为巨大拷贝数的质体DNA，从而允许可容易地超过总可溶性植物蛋白质的10％的表达水平。

[0081] 瞬时转化也可用于在植物细胞或植物中表达异源发色团。植物组织瞬时转化的非限定实例包括叶渗入、真空渗入、用土壤杆菌感染或用DNA涂布的粒子轰击靶组织。

[0082] 用于测量光合活性的分析

[0083] 在植物细胞或植物中进行的光合作用的量可通过测量由转基因植物或植物细胞产生的淀粉的量来间接测出。在植物细胞培养物或植物的光合作用的量还可使用CO2检测器(例如，CO2的降低或消耗表明光合作用水平增强)或O2检测器(例如，O2水平的升高表明光合作用水平增强)来检出(参见，例如，在Silva等人，Aquatic Biology7:127-141,2009；和Bai等人,Biotechnol.Lett.33:1675-1681,2011中所述的方法)。光
14 14 -
合作用还可使用放射性标志的CO2(例如，CO2和H CO3)来测量(参见，例如，在Silva等人，Acquatic Biology7:127-141,2009以及其中引用的文献中所述的方法)。光合作用还可通过检测叶绿素荧光来测量(例如，Silva等人，Acquatic Biology 7:127-141,2009，以及其中引用的文献)。用于检测植物的光合作用的另外的方法描述于Zhang等人，Mol.Biol.Rep.38:4369-43792011)。

[0084] 植物试剂和实验方法

[0085] 本文所述的产物和工艺可由本领域内已知的试剂和方法来构建或者使用这些试剂和方法来进行。此类试剂和方法包括用于植物基因和蛋白表达系统的那些，包括在细胞质和叶绿体的特定区室中提供表达的系统。植物转化系统在本领域内也是已知的。实例包括利用土壤杆菌和基因枪射弹(ballistic projectiles)的转化。可转化到核或叶绿体，例如叶绿体类囊体或基质，并且转化可为稳定或瞬时转化(例如，使用本文所述的示例性方法)。分析光合活性的方法在本领域内也是已知的。

[0086] 植物

[0087] 在某些实施方案中，转基因植物为单子叶或双子叶植物。单子叶转基因植物的实例包括，例如，早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass,Poa))、饲草(forage grass)(例如，羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium))、温带牧草(temperate grass)(例如剪股颖属(Agrostis))，以及谷类(例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉米)。双子叶转基因植物的实例包括，例如，烟草、豆类(例如，羽扇豆(lupins)、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆)，以及十字花科植物(十字花科(Brassicaceae)家族)(例如，花椰菜和菜籽)。因此，本文提供的转基因植物包括广泛范围的植物，包括，但不限于来自檟如树属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、油棕属(Elaeis)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、莨菪属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、马郁兰属(Majorana)、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pannisetum)、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高梁属(sorghum)、可可树属(Theobromus)、葫芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、蚕豆属(Vicia)、卵萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)。

[0088] 在某些实施方案中，转基因植物为树木或灌木(例如，桉属树木或灌木)。桉属的非限定实例包括，但不限于，以下物种及其杂交物：葡萄桉(E.botryoides)、苹果桉(E.bridgesiana)、赤桉(E.camaldulesis)、灰桉(E.cinerea)、蓝桉(E.globule)、巨桉(E.grandis)、西达桉(E.gunii)、尼克尔桉(E.nicholii)、圆叶桉(E.pulverulenta)、大叶桉(E.robusta)、野桉(E.rudis)、柳叶桉(E.saligna)、细叶桉(E.Tereticornis)、尾叶桉(E.Urophilla)、多枝桉(E.viminalis)、邓恩桉(E.dunnii)，和任意前述物种特别是巨桉和尾叶桉的杂交种。其它实例包括杨属物种(Poplar species)，例如美洲黑杨(P.deltoides)、欧洲山杨(P.tremula)、新疆杨(P.alba)、黑杨(P.nigra)(欧美杨(euramericana))、黑杨(P.nigra)(加拿大杨(canadensis))、欧洲山杨(P.tremula)、毛果杨(P.trichocarpa)、滚边杨(P.rouleauiana)、香脂杨(P.balsamifera)、辽杨(P.maximowiczii)，及其杂交物；和松属物种(属＝松属(Pinus))。

[0089] 在某些实施方案中，转基因植物为观赏植物。

[0090] 使用方法

[0091] 植物通常竞争日光。通过茎和躯干保持直立，叶形成吸收光的树荫并影响在它们下面的光合速率和生长。被其它叶遮荫的叶具有低得多的光合速率。茂密生长的植物例如林木比茂密生长差的植物更需要竞争光。本发明的转基因植物通过能够从之后可被吸收的非利用的光波长捕获更多的光子以产生与野生型植物相比增加的光合速率的能量而具有增强的光合作用，因此增加生物质累积和生长。

[0092] 在一方面，在温室中栽培的植物的光合活性可通过将发色团激发/发射谱与来自温室光的，例如特别是LED或其它能量有效光源的波长发射相匹配来增强。植物可在比如，配备有LEDs或某些其它光源或包括由发射对于植物中表达的特定内源发色团最适合的光的特定的一个范围或多个范围组成的广泛来源的若干光源的温室中生长。

[0093] 还提供增加土壤的氮含量的方法，所述方法包括种植(栽培)表达本文所述的至少一种发色团的转基因固氮植物。在某些实施方案中，转基因固氮植物可在不同植物(例如，本文所述的非转基因植物或不同的转基因植物)附近(例如，每隔一排或每隔两、三、四、五、六、七、八、九或十排)栽培。在某些实施方案中，所述方法可包括将转基因固氮植物耕作(耕种)到土壤中并允许转基因固氮植物组织在土壤中分解的步骤。在某些实施方案中，常年进行若干生长周期。

[0094] 固氮植物的实例包括豆类。固氮植物的其它实例包括山豆麻属(Parasponia)、放线菌根植物(Actinorhizal)(例如，赤杨和杨梅)、蔷薇科(葫芦目、山毛榉目和蔷薇目)的有限数量的物种。优选的固氮生物体为豆类。豆类的实例包括，而不限于大豆属(大豆)、菜豆属(菜豆)、莲属和豇豆属的热带豆类以及温带豆类，豌豆属(豌豆)、苜蓿属(紫苜蓿)、三叶草属(三叶草)和蚕豆属(巢菜(vetch))。

[0095] 实施例

[0096] 实施例1：构建体制备和植物转化

[0097] 将包括单独或共同吸收光并发射可被用于驱动光合作用的光的发色团的一种或多种构建体构建并转化到植物中，并分离此类转化体。

[0098] 实施例2:转基因植物叶中荧光的表征

[0099] 使用荧光显微术测量重组蛋白质的荧光吸收和发射。使用组合的荧光显微镜，即Zeiss III-RS或Zeiss Axiovert 100S(Zeiss)，在一个或多个适当的光激发波长，即，待研究的一种或多种试验转基因发色团的激发最大值下，研究来自实施例1中所述的转化的植物和未转化的对照的鲜叶。电子记录或在膜上记录图像。

[0100] 实施例3：转基因植物的光合活性

[0101] 叶绿素荧光测量

[0102] 使用脉幅调制荧光计(PAM-101；H.Waltz，Effeltrich，Germany(MONOTORING-PAM叶绿素荧光计)进行来自叶上表面的经调整的叶绿素荧光发射的测量。通过蓝色电源LED(blue power LED)，各探头产生调整的荧光激发光，连续的光化性光(actinic light)和饱和光闪(saturation flashes)。使光源和信号检测以及饱和光(saturating light)保持距离叶上表面5mm。光纤用于引导来自电源和控制单元的光到样品，并指导光从样品返-2 -1回。经调整的红光的测量强度为～0.1μmol·m s 。在测量荧光诱导之前使叶在零光环境中暗适应10分钟。将测量光束[激发光束]用于诱导最低荧光(F0)。提供饱和光闪以完全降低PSII受体位点QA并测量最大荧光产量(Fm)。用于测量Fm的饱和光闪(1s)的强度为-2 -1
3000μmol·m s 。将可变的荧光(Fv)计算为Fm-F0。Fv:Fm之比反映PSII的光化反应的潜在产量(Krause和Weis,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42:313-349,1991)。

[0103] 气体交换

[0104] 使用GFS-3000便携式气体交换荧光系统(Walz，http://www.walz.com)进行气体交换测量。使用差示红外气体分析仪(differential infrared gas analyzer)(IRGA)测-1量比色杯进口和出口处的水和CO2浓度。将比色杯流量调节为750μmol s ，并且其面积为
2 -1
3cm。在1000和400μmol mol CO2(Ca)的饱和PFD下使植物叶光适应，并在九个不同的-2 -1
光强度(0-1000μmol m s )下通过以逐步方式降低施加的PFD来记录光反应曲线。通过依赖于比色杯中改变CO2浓度测量净光合速率来获得CO2反应曲线。叶被调节至750μmol -2 -1 -1
m s PFD和400μmol mol CO2。在叶显示恒定的光合速率后开始测量。将CO2浓度逐步降-1 -1
低至50μmol mol CO2的Ca，随后400μmol mol CO2，以恢复初始CO2同化率。随后将Ca-1
逐步增加至1000μmol mol 。

[0105] 实施例4：核酮糖和叶绿素含量以及形态特征的测定

[0106] 如Uehlein等人(Plant Cell 20:648-657,2008)所述，通过从叶样品提取可溶性蛋白质并使用Rubisco-LSU抗体(Agrisera,www.agrisera.com)进行蛋白质印迹分析测定核酮糖含量。用Quantity (Bio-Rad，http://www.Bio-rad.com)定量蛋白含量。如使用丙酮作为溶剂所述，从叶样品提取叶绿素并测定(Porra等人，Biochimica et Biophysica Acta,975:384-394,1989)。研究6周大的植物的叶解剖参数。计数叶的数量并在每株植物的三个不同点测量茎直径。在用IMAGEJ扫描后测定叶面积。通过用透明指甲油制作叶背轴侧的印记来评价气孔长度和密度。在20℃下温育3–5分钟后，拍摄光显微镜图片并用IMAGEJ分析。

[0107] 实施例5:植物生长

[0108] 表达外源发色团的转基因植物和对照植物在以下条件下生长：

[0109] (i)在绿色LEDs(530nm)和黄色LEDs(580nm)下的生长室中；

[0110] (ii)在不同遮荫率(20％-70％)下的网棚中；

[0111] (iii)在规定种植密度(3×3米)和高密度(3×1米)条件下的田地中。

[0112] 根据标准技术测量和比较转基因和对照植物的生物质累积。

[0113] 实施例6.用外源发色团转化的桉属表明生长增加

[0114] 使用桉属进行试验以证实用发色团转化植物将导致光合作用和植物生长的增加。在这些试验中，使用XbaI和SacI限制性位点，将合成基因mCherry，SEQ ID NO:16(GenBank:AAV 52164.1，具有G230S突变)克隆到在CaMV 35S启动子控制下的并具有NOS终止子的质粒pBI 121(GenBank:AF 485783.1)。电转化土壤杆菌EAH 105，在卡那霉素平板上(100μg/ml)筛选48小时，并用于植物转化。使用基本上如Prakash等人，在In Vitro Cell Dev Biol.-plant45:429-434,2009中所述的操作转化桉属。简而言之，将桉属枝条在体外繁殖于由3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂组成的Murashige和Skoog(MS)基本培养基(basal salt medium)上。通过标准操作使用卡那霉素并通过在选择平板中检测整株单个枝条中的mCherry荧光来进行转基因植物选择。使用具有SZX2-FRFP1荧光滤片装置(激发滤片BP530-550阻挡滤片BA575IF)的Olympus SZX2-ZB16变焦荧光立体镜检测红色荧光。通过标准操作使阳性植物生根并繁殖，随后检验荧光强度。在荧光立体镜下检验来自各转基因枝条中间的一片离体叶片(0.5cm大小)的荧光强度。目视观察到荧光分数在1-5评分内的任意单位(图2)。

[0115] 将在不同荧光强度下进行的选定的植物转移到温室(24℃，14小时天然日光)。将转基因植物生长于温室中36天并测量高度(从茎底部至顶部)。具有mCherry显著表达的转基因植物与野生型对照植物相比显示出增加的生长(参见，图3和4)。这些数据表明表达发色团的转基因植物具有增加的光合作用，其导致增加的植物生长。

[0116] 实施例7：发色团表达构建体

[0117] 使用以下元件制作构建体：

[0118] 发色团

[0119] mCherry(SEQ ID NO:1和44)；TurboYFP(SEQ ID NO:4和45)、mKO1(SEQ ID NO:5和46)、DSRed-express2(SEQ ID NO:6和47)和Turbo-FP650(SEQ ID NO:3和48)。

[0120] 启动子

[0121] 将以下启动子用于实现组成型、高表达的发色团；

[0122] 花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S(SEQ ID NO:49)。

[0123] SuperP(SEQ ID NO:50)，源自根癌土壤杆菌章鱼肉碱合酶(OCS)和甘露碱合酶(MAS)的调控元件的合成的组成型启动子。启动子为OCS活化子序列以及融合到MAS启动子的MAS活化子元件的三倍重复的组合体。Ni等人，Plant J,1995,7:661-676。

[0124] 草莓镶脉病毒(SvBv)启动子(SEQ ID NO:51)。

[0125] 转运肽/信号肽

[0126] 通过将发色团融合到叶绿体基质信号肽(SEQ ID NO:7)或类囊体信号肽(SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)来实现发色团向叶绿体基质或类囊体膜的定向。用于发色团定向定位的肽还包括来自拟南芥核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基的RBC转运肽(叶绿体基质信号肽)(SEQ ID NO:52)(Fischhoff等人，Plant Mol.Biol.,1992,20:81-93)；源自拟南芥氧进化增强子蛋白3的类囊体靶向信号肽,Thy 1(SEQ ID NO:53)；和源自拟南芥光系统Ⅱ亚基Q的类囊体靶向信号肽，Thy 2(SEQ ID NO:54)。

[0127] 图5-11中示意性示出构建的七个发色团表达构建体。

[0128] 根据以下通用方案构建发色团表达构建体：

[0129] 由化学合成的编码TurboYFP、mKO1、ds-red express2和TurboFP 650的基因，上游启动子和信号肽以及下游终止子构建分别表达TurboYFP、mKO1、ds-red express2和TurboFP 650的具有或不具有类囊体转运肽的四重发色团构建体6和7(图10和11)。通过用限制酶XmaI+SacI二次消化质粒随后连接，将包括相应上游启动子和下游终止子的四个发色团基因克隆到pBI 121双元载体。

[0130] 通过用AscI分别消化构建体6和7，随后连接，来获得表达TurboFP 650构建体的具有或不具有类囊体转运肽的双重发色团表达构建体4和5(图8和9)。

[0131] 由化学合成的mCherry构建表达mCherry的，具有或不具有转运肽的构建体1、2和3(图5、6和7)，并通过用限制酶XmaI+SacI二次消化质粒随后连接，将它们克隆到pBI121双元载体。

[0132] 插入到载体pBI 121以形成构建体1-7的单独的元件如下：

[0133] 构建体1元件(SEQ ID NO:55)

[0134] CaMV35S启动子：核苷酸1-371

[0135] RBC信号肽：核苷酸465-635

[0136] mCherry编码序列：核苷酸639-1346

[0137] NOS终止子：核苷酸1378-1630

[0138] 构建体2元件(SEQ ID NO:56)

[0139] CaMV35S启动子：碱基1至371的核苷酸

[0140] 类囊体1(Thy1)信号肽：核苷酸456-686

[0141] mCherry编码序列：核苷酸690-1397

[0142] NOS终止子：核苷酸1429-1681

[0143] 构建体3元件(SEQ ID NO:57)

[0144] CaMV35S启动子：核苷酸1至371

[0145] 类囊体2(Thy2)信号肽：核苷酸456-707

[0146] mCherry编码序列：核苷酸711-1418

[0147] NOS终止子：核苷酸1450-1702

[0148] 构建体4元件(SEQ ID NO:58)

[0149] CaMV35S启动子：核苷酸1至835

[0150] 编码mKO1的序列：核苷酸926-1582

[0151] MAS2终止子：核苷酸1583-1982

[0152] CaMV35S启动子：核苷酸1991-2416

[0153] TurboFP650编码序列：核苷酸2490-3194

[0154] NOS终止子：核苷酸3211-3463

[0155] 构建体5元件(SEQ ID NO:59)

[0156] CaMV35S启动子：核苷酸1至835

[0157] Thy1信号肽：核苷酸926-1156

[0158] 编码mKO1的序列：核苷酸1157-1810

[0159] MAS2终止子：核苷酸1811-2210

[0160] CaMV35S启动子：核苷酸2219-2644

[0161] Thy1信号肽：核苷酸2718-2948

[0162] TurboFP650编码序列：核苷酸2949-3650

[0163] NOS终止子：核苷酸3667-3919

[0164] 构建体6元件(SEQ ID NO:60)

[0165] CaMV35S启动子：核苷酸1至835

[0166] mKO1编码序列：核苷酸926-1582

[0167] MAS2终止子：核苷酸1583-1982

[0168] SVBV启动子：核苷酸6306-6677

[0169] TurboYFP编码序列：核苷酸6684-7415

[0170] AGS终止子：核苷酸7416-7686

[0171] Super启动子：核苷酸7699-8810

[0172] DS-RED express2编码序列：核苷酸8817-9494

[0173] OCS终止子：核苷酸9495-9895

[0174] CaMV35S启动子:：核苷酸9904-10329

[0175] TurboFP650编码序列：核苷酸10403-11107

[0176] NOS终止子：核苷酸11124-11376

[0177] 构建体7元件(SEQ ID NO:61)

[0178] CaMV35S启动子：核苷酸1至835

[0179] Thy1信号肽：核苷酸926-1156

[0180] mKO1编码序列：核苷酸1157-1810

[0181] MAS2终止子：核苷酸1811-2210

[0182] SVBV启动子：核苷酸2223-2594

[0183] Thy2信号肽：核苷酸2601-2852.

[0184] TurboYFP编码序列：核苷酸2373-3104

[0185] AGS终止子：核苷酸3582-3852

[0186] Super启动子：核苷酸3865-4976

[0187] Thy2信号肽：核苷酸4983-5234

[0188] DS-RED express2编码序列：核苷酸5235-5909

[0189] OCS终止子：核苷酸5910-6310

[0190] CaMV35S启动子：核苷酸6319-6744

[0191] Thy1信号肽：核苷酸6818-7048

[0192] TurboFP650编码序列：核苷酸7049-7750

[0193] NOS终止子：核苷酸7767-8019

[0194] 实施例8:烟草和桉属中发色团的转化和表达

[0195] 一般方法

[0196] 从单独的转基因植物中提取基因组DNA并通过PCR分析mCherry、turbo-YFP、mKO1、DsRed和turbo-FP 650的存在。使用卡那霉素在选择平板中选择卡那霉素抗性再生组织并通过检测整株单个枝条中mCherry、DsRed express2、TurboFP 650和/或turbo-YFP荧光来进行转基因植物选择。使用具有用于红色荧光的RFP荧光滤片装置(SZX2-FRFP1-激发滤片530-550nm阻挡滤片BA575IF)和用于绿色荧光的GFPA荧光滤片装置(SZX2-FGFPA-激发滤片460-495，阻挡滤片Em510-550)的变焦荧光立体镜(Olympus SZX2-ZB16)来检测红色和绿色荧光。使用标准操作使阳性植物生根并繁殖，随后检验荧光强度。在荧光立体镜下检验来自各转基因枝条中间区域的一片离体叶片(0.5cm大小)的荧光强度。通过PCR确认全部基因的表达。

[0197] 表达融合到叶绿体基质转运肽的mCherry的转基因烟草和桉属

[0198] 使用构建体1获得过表达融合到叶绿体基质信号肽的mCherry的转基因烟草和桉属植物。在各操作中，用构建体1转化烟草和桉属叶组织，随后在含卡那霉素的平板上再生。从再生的单个枝条取出叶样品，并在变焦荧光立体镜下检验以检测红色荧光。发荧光的叶为荧光团(fluorophore)表达阳性。野生型(未转化的植物)不发荧光。与表达mCherry而没有转运肽的细胞(其起初在细胞质中发荧光)相比，如在所述细胞中由红色荧光斑点所显示，在转基因烟草和桉属植物两者的叶绿体中mCherry荧光明显。

[0199] 表达融合到叶绿体类囊体转运肽的mCherry的转基因烟草和桉属

[0200] 在各操作中，分别用构建体2或构建体3(其分别过表达融合到Thy1和Thy2类囊体信号肽的mCherry)转化烟草和桉属叶组织。在转化后，在含卡那霉素平板上再生植物。从再生单个枝条取出叶样品并在用于红色荧光检测的变焦荧光立体镜下检验。与非转基因植物中观察的荧光缺乏相比，通过观察转基因植物中的荧光，表明转基因烟草和桉属植物两者在类囊体中的mCherry表达为阳性。当与没有类囊体信号肽的表达(其起初定位于细胞质中)相比时，类囊体定位的mCherry荧光在细胞中显像为红色斑点。

[0201] 表达mKO1和TurboFP650而没有转运肽的转基因烟草和桉属

[0202] 在各操作中，分别用构建体4转化烟草和桉属叶组织，构建体4过表达合成的mKO1和TurboFP650荧光基团，两者没有信号肽，因此保留于细胞质中。随后，在含卡那霉素的平板上再生植物。从再生的单个枝条取出叶样品，并在变焦荧光下检验以检测红色荧光。将与根本不发荧光的野生型相比显示TurboFP650荧光的叶视为阳性植物。与未转化的野生型植物中观察的荧光缺乏相比，通过转基因植物中观察的荧光，mKO1和TurboFP650荧光团在细胞中的阳性表达明显。

[0203] 表达TurboYFP、mKO1、DSRED-express2和TurboFP650而没有转运肽的转基因烟草和桉属

[0204] 在各操作中，用构建体6转化烟草和桉属叶组织，构建体6过表达四个荧光团，TurboYFP、mKO1、DSRED-express2和TurboFP650，全部没有信号肽，因此保留于细胞质中。随后，在含卡那霉素的平板上再生植物。从再生的单个枝条取出叶样品并在变焦荧光立体镜下检验以便检测红色荧光和检测绿色荧光。与不发荧光的对照、未转化的野生型植物相比，确认到显示红色和绿色荧光的叶为阳性。绿色和红色荧光的检测确认到TurboYFP以及DS-red express2或TurboFP650之一或两者表达。

[0205] 实施例9:转基因植物的光合作用

[0206] 使用希尔反应(Hill Reaction)测量光合作用的光反应，其中使用电子受体2,6-二氯苯酚吲哚酚(DCPIP)来测定放氧速率(oxygen evolution rate)(源自光系统Ⅱ中水分子的裂解)以及进而分离的叶绿体的类囊体的光合速率。Hill,R.,Oxygen Evolved by Isolated Chloroplasts,Nature,1937,139:881-882。

[0207] 用剪刀将去叶脉的烟草叶片(De-veined tobacco leaves)(5g)切为小片并用12.5mL研磨介质(100mM，三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)NaOH.pH 7.8，400mM山梨醇，
5mM MgCl2)使用均化器浸渍。研磨的叶经2层纱布(cheese cloth)过滤到冰冷的100ml烧杯中。滤液(含完整叶绿体)经8层纱布过滤到另外的100ml冰冷烧杯中。为分离叶绿体，在1000×g下4℃离心提取物5min。沉淀包含富含叶绿体的组分。

[0208] 用2mL破碎介质(breaking medium)(20mM三(羟甲基)甲基甘氨酸NaOH，pH7.8，5mM MgCl2)重悬富含叶绿体的组分。用10ml冷破碎介质稀释沉淀并在1900×g下离心5min。丢弃上清液并在0.75mL重悬介质(50mM，三(羟甲基)甲基甘氨酸NaOH，pH 7.8，
100mM山梨醇，5mM MgCl2)中重悬含有富含类囊体的组分的沉淀。将重悬类囊体残留物混合物用于希尔反应。

[0209] 为进行希尔反应，将50μl类囊体残留物添加到5mL反应混合物(50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.8，100mM山梨醇，5mM MgCl2，0.05mM DCPIP)。将三等分转移到Elisa平板并在580nm下测量吸光度，从而获得“暗读数(dark reading)”(照射前)。这被认为是基准水平。然后使用不同光源以15秒间隔照射平板：正常光(白色)、525nm最大(绿色)或580nm最大(黄色)。光强度为约90μE/m2/sec。

[0210] 通过在15s照射间隔后(各照射间隙之后是遮掩间隔(1-1.5分钟之间)，其中使用铝箔来遮掩反应性组织以便在遮掩间隔期间中断暴露于另外的光)在10分钟期间获得吸光度读数来测量反应速率。吸光度随时间的下降反映希尔反应的速率。

[0211] 选择用构建体3(融合到Thy2类囊体信号肽的mCherry)转化并且使用SZX2-FRFP1滤片检测发荧光的三株烟草系用于使用希尔反应的光合作用测量。从三株转基因烟草植物和一株野生型植物的每一株的两片叶中提取类囊体组分。使用不同光源(光，绿色、黄色和没有光-黑暗)照射反应混合物。结果(由希尔反应的斜率表示；图12)显示三株转基因系(转基因系26-36)之一显示在不同光条件下光合速率增加。

[0212] 已描述了发明的若干实施方案。虽然如此，但将理解的是在不违背发明的精神和范围的情况下可进行各种改良。因此，其它实施方案在以下权利要求范围内。本发明的其它特征、目的和优点由说明书和附图以及由权利要求书将显而易见。

[0213] 通过参考以其整体将本文引用的各专利和非专利文献并入于此。