op detoxification sponge to act to distinguish

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、有機リン及び有機イオウ化合物に曝された装置及び／又は人を中和し解毒し又は除染するための材料、化合物、キット、及び方法に関する。

【０００２】 発明の背景 有機リン及び有機イオウ化合物（両方をＯＰという）、除草剤、殺虫剤などの化学物質を除染し中和し或いは除去する方法は公知である。 しかし、従来の方法で用いられる組成物は、腐食性、引火性、毒性、製造及び貯蔵の困難性、限られた寿命など、不適切な性質を有している。

【０００３】 例えば、標準的な除染剤であるＤＳ２は、重量比で７０％のジエチレントリアミンと、２８％のエチレングリコールモノメチルエーテルと、２％のＮａＯＨとから成る。 ＤＳ２は効果的であるが、空気に曝すと腐食してしまう。 ＤＳ２とその使用によって生ずる物質は、有害な材料として分類され規制されている。 その使用後、ＤＳ２は、処理した領域を水洗いする前に３０分間、放置しなければならない。 また、ＤＳ２はテラトゲンでもある。

【０００４】 いくつかの除染方法では、腐食性及び毒性があって人間とその眼のような敏感な組織を傷つけるハイポクロライド系を使用している。 他の方法では、汚染された材料を焼却したり、カーボンフィルタを用いて残存化学物質を吸収するようにしている。 更に他の方法では、化学物質を吸収するポリマービーズやマイクロエマルジョンを用いており、これらはすすぎをしなければならない。 これらの方法は、本質的に危険かつ高価であり、有害物を発生する。 更に、これらの組成物や化合物の多くは、水や二酸化炭素に曝されると劣化してしまうので、製造された日に使用しなければならない。

【０００５】 生体内で行われるいくつかの方法では、求核性オキシムの存在下でコリンエステラーゼを用いて、ＯＰ化合物を解毒する。 この酵素による生化学的解毒法は、
小動物や、人間以外の霊長類においては、種々のＯＰ化合物に対して効果的である。 例えば、牛亜科の胎児漿液アセチルコリンエステラーゼ（ＦＢＳ−ＡＣｈＥ
）或いは馬の漿液ブチリルコリンエステラーゼ（Ｅｑ−ＢＣｈＥ）でアカゲザルを前処理すると、毒性の高いＯＰ神経ガスであるソマンの５ＬＤ _５０まで防御できる。 ＯＰ毒物に対し一の前処理薬剤として酵素を用いることは、個々の事象に対しては充分な防御を与えるが、生体内でＯＰ化合物を中和するには、比較的大量（化学式どおり）の酵素を必要とする。 そのため、酵素前処理とオキシム再活性化を組み合わせることにより、ＯＰ／酵素化学量論は増大して、ＯＰで阻害されたＦＢＳ−ＡＣｈＥの触媒活性は速やかに連続して再保存され、ＯＰ化合物は解毒される。

【０００６】 明らかに、ＯＰ化合物に曝された材料や装置、人を中和し解毒し又は除染するための、より良い装置と方法が求められている。

【０００７】 最近、従来の技術ではできなかった、安全で効果的かつ便利な解毒と、毒性の高い化合物の量及び質の測定とを可能にする、ＯＰ解毒物質と装置及び方法が開発された。 以下、これらの環境に優しい化合物と装置及び方法について説明する。

【０００８】 発明の概要本発明は、ＯＰ化合物に曝された装置及び／又は人を中和し解毒し除染し洗浄するための材料、化合物、キット、及び方法を提供する。

【０００９】 １つの実施態様では、本発明は、人間に向けられた物を含むＯＰ化合物の除去、除染及び中和のための、酵素と基質との混合物から成る材料に関する。 用いられる酵素混合物は、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）及び／又はＯＰヒドロラーゼ及び、Ｈ1-6のようなオキシム、２−ＰＡＭのようなモノビスクオタナリオキシム等の、ＯＰ反応化合物のような再活性化物質から成る。

【００１０】 上記の材料は、柔軟又は堅牢な多孔性支持体を備える。 多孔性支持体は、ポリウレタン・マトリクス或いはその等価物で構成できる。

【００１１】 例えば、多孔性支持体は、柔軟なスポンジ状の物質或いはこれと同様な物でよく、ここで酵素が固着される。 用いられるポリウレタン・プレポリマーや基質によって変わる柔軟性と多孔性を持つ多孔性支持体が得られる。 多孔性支持体は、
需要と型の形状に応じて、種々の形状、サイズ及び密度に形成することができる。 例えば、多孔性支持体は、典型的な家庭用スポンジや小タオルの形に形成される。 スポンジの好ましい寸法は、１×２×８（インチ）〜２×４×８（インチ）
である。 小タオルの好ましい寸法は、４×４×0.25（インチ）〜４×４×0.0312
5（インチ）〜14×14×0.0625（インチ）である。 しかしながら、大規模な設計のときは、初めの固定化した酵素製造物の寸法を大きくできる。 例えば、約４×
８フィートのロールを製造し、上記のように適当なサイズにすることができる。

【００１２】 スポンジ状の支持体は、器具、研究室のハードウェア、装置、スキンその他のデリケートな膜などのように、粗く若しくは不規則な表面の除染が望まれるか或いは従来の除染材料が人間の組織には適さない、天然、合成または生物の表面を含む表面上で、使用することが好ましい。 例えば、上記材料は、毒性がなく、固定化した酵素が傷口には浸透しないので、傷口を清浄にして汚れを除くのに使用される。 このため、公共の場でテロリストの攻撃により傷ついた市民を救済するために上記スポンジを使用できるであろう。

【００１３】 中和或いは除染すべき対象及び／又は範囲が、裂け目や割れ目、多孔質又は不均一の表面であるならば、発泡体状の支持体が好適である。 適切なノズルを備えたスプレー式のボトルやスプレー式の缶により、その少量を使用してもよい。 更に、発泡体を感知装置の開口や耳孔のような対象物のオリフィスに分配できるように選択してもよい。 大きな領域が汚染されたときは、大量の発泡体を分配する装置を使用できる。

【００１４】 発泡体状の支持体は、髭剃りクリームのように一定時間後に消散するか、或いは安定した柔軟性のあるスポンジ状の支持体に付けることができる。 消散する発泡体は、生体に用いられる。 付着させる発泡体は、対象の周りに適用して発泡体の中に汚れを取り込むことができる。

【００１５】 必要時には、上記材料は、堅牢な多孔性支持体で構成できる。 この堅牢な材料は、粉砕してパウダーにして、ローション、石鹸その他の液体に加えることができる。 同様に、柔軟な材料がローション、石鹸その他の液体に使用するのに適するように処理できる。

【００１６】 また、上記材料は、大気のような気体を中和し解毒したり除染するフィルタの形に作られる。 また、この材料は、衣類若しくは衣類の裏地として使用するのに適した形にできる。 更に、この材料を水中に置き、次に水中から取り出すことにより、水の汚れを除去することにも使用できる。

【００１７】 他の実施態様では、上記材料は、中和、解毒又は除染する特定の化学物質に従って色で符号化できる。 色又は色の計画は、酵素濃度、活性又は残りの寿命、或いはその範囲を示すように選択できる。

【００１８】 本発明の材料は、その上でＯＰ化合物の汚染を除去するために容器の中に置いてもよい。

【００１９】 他の実施態様は、ＯＰ化合物のような有害物の量や質を測定するために一定の材料を使用する方法も含む。

【００２０】 ここで開示しているように、当業者は、種々の材料とそれらの使用を認識するであろう。 これらの形態の全ては、ＯＰ化合物を更に吸収するためにカーボンと適切に組み合わされる。 カーボンは、上記材料の支持体内に埋め込まれるか又は組み込まれる。 或いは、上記材料と共に使用される層、フィルタその他のものでもよい。 更に、ＨＩ−６のような再活性化化合物を、ドライカプセル、ペレット、リポゾーム等の、ゆっくり放出する形態で、上記材料の支持体内に埋め込むか又は組み込むようにしてもよい。

【００２１】 本発明の好ましい実施態様は、合成する間、多孔性支持体の上又はその中でＡ
ＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥを同時にＯＰハイドロラーゼと固定させる材料から成る。 好ましくは、酵素は共有結合によって固定化される。 酵素は、原核生物又は原生物のものでもよい。 これらの酵素は、組換え体でもよい。 酵素は、細胞内又はセルフリーで含有され得る。 他に、ＯＰ化合物のような有害な化学物質を加水分解できる酵素を用いることもできる。 同様の方法で、農薬の汚染を除去するためにトリエステラーゼのような酵素を用いることができる。 好適な酵素は、再活性化され又はＯＰ化合物を直接加水分解できるものである。

【００２２】 他の実施態様では、本発明は、ＯＰ化合物のような有害な化学物質の除去、除染又は中和するために、多孔性支持体上に固定化された酵素の混合物から成る材料を製造する工程に関する。 この実施態様では、酵素とプレポリマーとの混合物が、バイオタイプ成分の劣化を最小にしながら優しく且つ均一に混合され、それによって得られた固定化酵素が所定量のＯＰ化合物を効果的に除染し中和し又は解毒することができる。 用いた装置は、上記成分を互いに重ねる。 これは、低せん断プロセスである。 従来の方法、例えば混合ドリルで、材料を合成している間、用いた酵素は流体力又はせん断応力を受ける。 上記成分を互いに優しく重ねる装置を使用することにより、これらの流体力又はせん断応力を大幅に減少させ、
ドリルでの混合装置の高いせん断力に敏感な酵素にとって好ましい。 更に、表面活性ポリマー、例えばＰ−６５や、低濃度のグリセノールのような添加剤の使用により、せん断力によって誘発される酵素の変性を防止できる。 この表面活性ポリマーは又、固体の支持体に適切な堅さと吸収性を与える。

【００２３】 上記材料を製造するのに好適な工程では、２室構成の装置が使用される。 第１
のチャンバーは酵素の混合物を収容し、第２のチャンバーはプレポリマーを収容する。 酵素とプレポリマーは、１：１の比で同時に押し出されて混合される。 好ましくは、酵素とプレポリマーは、酵素とプレポリマーを優しく且つ均一に混合する静的な混合ステータに通して、急速且つ均等に押し出される。 好ましい低せん断装置は、２室シリンジで、且つ粘性のあるポリウレタン又はエポキシ樹脂を混合するのに使用される静的な混合ステータである。 この装置のサイズは、要求に応じて変更できる。 兵士が野外で使用するため、ポケットサイズにできる。 或いは、装置を大規模な製造及び／又は大きい対象又は範囲の除染に適するようにしてもよい。 低せん断装置は、高せん断装置で調整した同じ混合物と比較して、
ＡＣｈＥ又はＢＣｈＥ固定化酵素の活性を２倍以上にする。

【００２４】 更に本発明は、材料の酵素活性を再活性化する種々の材料、方法及び装置に関する。 これらの材料、方法及び装置によれば、固定化された酵素の酵素活性を再活性化するためにいくつかの除染材料を必要とする、いくつかの個別の用途及び／又は単一の継続的な用途のために、人が本発明の除染材料を使用することを可能にする。 また、これらの材料、方法及び装置によれば、多孔性支持体に吸収された過度のＯＰ化合物を完全に除染及び／又は中和することができるが、これによって固定化酵素と反応することはない。 これらの方法と再活性化材料は、基質及び／又はオキシムを用いて、ＯＰ阻害固定化酵素の触媒作用を再活性化する。

【００２５】 更に本発明は、裂け目や割れ目のような表面、衣類のような多孔質又は不均一の表面、及びスキンのように有機リン酸や農薬を吸収しやすい生物表面から、有機リン酸を除去、除染する際の助けとなるように上記実施態様に付加される種々の材料及び添加物に関する。 添加物は、スポンジ材料と共に使用され、当該材料の多孔性支持体の中に組み込むことができる。 添加物は、乾燥又は液状でよく、
また、トリアセチンやテトラグリムのような、有機リン酸を溶融する化合物、或いはオキシムでよく、これらは、除染及び再活性化酵素の助けとなる。

【００２６】 本発明のもう１つの態様は、種々のキットに関する。 これらのキットは、有害な有機リン酸及び／又はイオウ化合物の除染に必要な複数の酵素を含むスポンジを備える。 これには、除染プロセスを実行し又はそのために必要な材料も含まれる。 また、発泡体が変成するならば、キットはポリマー材料と酵素、例えば、有機リン酸及び／又は有機イオウ除染発泡体を製造するためのプレポリマー、安定な酵素混合物、及び低せん断装置をも含む。 更に、これらのキットは、ＯＰ化合物の量と質を検出するためのインジケータと、検出結果を中央の収集ポイント、
例えばコンピュータ、アップリンクのサテライト、無線中継所、携帯型の電池駆動計測装置などへ送信するための手段とを備えている。 例えば、携帯型の電池駆動計測装置を用いてコンピュータに接続し、反応速度を計算して中央の収集ポイントに伝送することにより、ＯＰ化合物の量を分析することができる。 このキットには、装置の使用を容易にするアイテム、例えば、指示書、容器、試験管などを備えることができる。

【００２７】 発明の詳細な記述酵素はポリマー合成中にハイポベースのポリウレタンに取りこまれている。 米国特許第４，３４２，８３４号参照。 ハイポプレポリマーはポリエーテル（又はポリエステル）ポリオールを架橋剤の存在下にイソシアネートと反応させることにより合成される。 havens, PL, 他、Ind Eng Chem Res (1992) 32:2254-2258 ; 米国特許第４，１３７，２００号；LeJeune, K.El, 他、Biotechnology and B ioengineering (1999) 20; 62(6):659-665を参照。 合成はこのポリウレタンプレ ポリマー中で存在するイソシアネートに水分子を接触させることにより開始され る。

【００２８】 ２段工程がこの時点から生ずる。 イソシアネートが水と反応して不安定なカルボン酸が形成し、次にＣＯ２を生成してアミンに分解する。 ＣＯ２は多孔性支持体を持ち上げそれが起ち上がるのを可能にする。 このアミンは直ちにイソシアネートと反応して尿素結合が生成する。 酵素はイソシアネートと反応しうるアミン類やハイドロキシル類などの多機能基を有しているので、合成中に酵素は多孔性支持体の一部として一体化する。 かなりの量の酵素がポリマー合成の進行を混乱させることなく多孔性支持体に結合できる。 このポリマー合成中に生ずる反応を以下に示す。

【００２９】

【化１】

【００３０】 以下のリストの酵素（これらの酵素は種々のソース、例えば、セルフリー、組み換え、その他）及び化学物質はこの発明においての使用に適するものの例である： アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）； ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）； プソイドコリンエステラーゼ； 有機リン酸ハイドロラーゼ（ＯＰＨ）； 有機リン酸アンハイドロラーゼ（ＯＰＡＡ）； リン酸トリエステラーゼ； プソイドモナスヂミヌタバクテリアＯＰＨ（パラオキソナーゼ）； ラッカーゼ（laccase）； プラリドキシムクロライド（２−ＰＡＭ） ７−（メトキシフォスフィニオキシ）−１−メトキシキノリウムアイオダイド（ＭＥＰＱ）； ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）； アセチルチオコリンアイオダイド（ＡＴＣ）； Ｓ−ブチリルチオコリンアイオダイド（ＢＴＣ）； ５，５'−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイックアシッド）（ＤＴＮＢ）； Ｎ，Ｎ'−トリメチレンビス（ピリジニウム−４‐アルドキシム）ジブロマイド（ＴＭＢ４）；及び １−（２−ヒドロキシイミノメチル−１−（４−カルボキシアミノピリジニウム）−ジメチルエステルハイドロクロライド（ＨＩ−６）。

【００３１】 一般に、ＯＰ化合物に対する最も単純なバイオセンサはプラスチック、ガラス、布，ナイロン、ラバーなどの担体の上にしっかり固定された多孔性支持体の表面又は内部に固定化されたＣｈＥ類を有する物質からなる。 ＯＰ化合物の検出は色により定性測定され得る。 ＯＰ化合物をテストするために、バイオセンサはテストされるべき試料に曝される。 ＯＰ化合物による固定化ＣｈＥの阻害が定性的に溶液形態で観察される阻害と同様であるので、試料への暴露はほんの短時間でよい。

【００３２】 以下の実施例は本発明を説明するものであって制限するものではない。 実施例１ 可能な酵素妨害の測定トリルジイソシアネート（ＴＤＩ）から誘導されたポリエーテルプレポリマーは非常によくこのＣｈＥ類（又は全てのたんぱく質）の表面に存在するリジンやアルギニンのような遊離アリファチックアミンと反応してこの物質の永久架橋部になるので、この物質のコンピュータ企画分子モデルは、各酵素の表面で手に入るアミノ基に的を絞って遂行され、多孔性支持体にこれらの基をカップリングさせることが酵素の機能を妨害するか否か測定された。 これはその結晶構造が既に知られている全ての酵素又はホモロジーによりモデル化され得る酵素について行われ得る。

【００３３】 図１Ａはアセチルコリンエステラーゼ、ブチルコリンエステラーゼ及びフォスフォトリエステラーゼのモデル化表面を説明し、このプレポリマーにカップリングする為に入手できるＣｈＥ類の表面のリジン及びアルギニン残基を示す。 これは、Biosym Technologiesによる分子モデル作成ソフトウエアであるInsight II
により生成された。 この分子モデルに基きこの多孔性支持体にカップルするＦＢ
Ｓ−ＡＣｈＥの表面に少なくとも１個のリジンと２９個のアルギニンの水に影響されやすい残基があり、一方、エキン−ＢＣｈＥには２６個のリジンと２６個のアルギニン残基がモデル化された。 大抵のリジン及びアルギニン残基はこのＣｈ
Ｅ類の後ろ側で発見され、ほんの少しが酵素の触媒作用位置の谷間が位置する側に見出された。 ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥの両方の縁及び触媒作用位置の谷間の開口は必然的にリジンとアルギニンを欠いていると思われた。 従ってこの多孔性支持体にこれらの酵素をカップリングすることは基質、ＯＰ類などの阻害剤、又はモノジスクオタナリオキシムを含むオキシム類などの再活性剤の入り込み、触媒生成物の活性位置へ及びからの放出及び酵素の動的速度に及ぼす影響が最小となるはずである。 同様に、ラッカーゼの表面のモデル（図１Ｂ）はこのプレポリマーに共有結合できる残基を示している。 実施例２ 酵素結合ポリウレタン物質の合成この物質の典型的合成は、１％（最終濃度）の界面活性剤を含むリン酸バッファ中で酵素をプレポリマーと混合することからなる。 トリルジイソシアネート（
ＴＤＩ）から誘導されたポリエーテルプレポリマー、ハイポールプレポリマーＴ
ＤＩ３０００(Hampshire Chemical, Lxington, MA),及びプルロニックＰ−６５
界面活性剤（BASF Specialty Chemicals, Parsippany, NJ）が用いられた。 この２層システムは混合され、適切な型に注がれ、硬化のため放置された。 図２は、
スポンジ状多孔性支持体からなる硬化した物質を示す。 図１２は固定化されたＡ
ＣｈＥを含む小さな物質を示す。

【００３４】 図３は、プレポリマーと酵素の特異反応を説明する図である。 合成はＨ２Ｏ分子がポリウレタンプレポリマー中に存在するイソシアネート基と反応するとき開始する。 イソシアネートは水と反応して不安定なカルボン酸を生成し、これはＣ
Ｏ２を生成しながらアミンに分解する。 このＣＯ２はこのポリマーを膨らませ多孔性にする。 同時に、このアミンは直ちにイソシアネート基と反応して尿素結合を生成する。

【００３５】 ＣｈＥはその表面にアミンを有し、イソシアネートと反応することができるので、合成中にポリウレタン支持体の一部になり一体化できる。 この物質にはシクロデキストリンで見られるような酵素の深刻な罠又は活性化炭素に見られるような酵素の物理的吸着はない。 Pluronic P-65のような界面活性剤を約１％最終濃度で含ませることはこの物質の最終構造及び吸着ポテンシャルを制御する。

【００３６】 多孔性ポリウレタン支持体からなる物質を製造する為に、Ｐ−６５界面活性剤バッファを含みｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファ約３０ｍＬを６００ｍＬのプラスチックビーカに入れた。 精製ＦＢＳ−ＡＣｈＥ（７５００単位）又は精製Ｅｑ−ＢＣｈＥ（５０００単位）の３から５ｍＬを加え、次にハイポ３０００プレポリマー（トリルジイソシアネート）を加えた。 この２層システムは混合され、１０分間膨らむままにされ、容器から押し出された。 この物質はｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファ約５０ｍＬで十分に洗浄され、乾燥され、将来の使用の為にジッパー付きバッグ中に保存された。 実施例３ 合成された物質の特性約２０−９０％の酵素が遊離のアミノ基又は水酸基により多孔性支持体と共有結合していた。 これはこの物質の第１洗浄液及び第２洗浄液中の酵素の惣菜により測定された。

【００３７】 これらの酵素は多くのいちで結合され得るので、架橋したポリマー支持体の一部となっている。 この架橋したポリマー支持体は結合酵素に対して大きな安定性を与える。 大量の酵素が小さなポリウレタン支持体中に取り込まれているので、
架橋ポリマー支持体はＯＰ化合物の検出のための高安定且つ高感度物質になっている。

【００３８】 Ａ． 酵素活性 １から４０ｍｇの重量範囲のＦＢＳ‐ＡＣｈＥを含む物質の５つの試料とＥｑ
−ＢＣｈＥを含む物質の５つの試料がｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファ２．
８ｍＬ中に懸濁され、エルマン法で分析された。 Ellman,GL他（1961）Biochm
Phamacol.7:88-95参照。 ＦＢＳ‐ＡＣｈＥの固定化及びＥｑ−ＢＣｈＥの固定化の両方において、スポンジの重量と酵素活性の間には直線関係が見出された。 図１６ＡおよびＢ参照。 スポンジの重量と酵素活性の間には直線関係は、物質全体に渡って均一なＦＢＳ‐ＡＣｈＥ又はＥｑ−ＢＣｈＥの固定化を示す。

【００３９】 この物質は５０ｍＭリン酸バッファ、蒸留水，又は基質の加水分解に影響を与えない１０ｍＭアンモニウムビカーボネートで洗浄された。 従って、プレポリマー、界面活性剤及び酵素をそのままで２２°Ｃで混合することで溶液ＣｈＥの初期活性の約５０％を保持する有用な効果のある物質が得られた。

【００４０】 Ｂ． 蛋白質積込み許容量この物質はＡＣｈＥ又はＢＣｈＥなどのＣｈＥ類のためのかなり高い積込み許容量を有する。 この物質に固定化されたＢＣｈＥの最終活性は合成中の酵素の量をより高くすることにより増大されうる。 図４参照。 非特異性蛋白質（うし血清アルブミン、ＢＳＡ）に精製ＡＣｈＥを一定量加えたが、ＣｈＥ活性は減少しなかった。 図５参照。 このように、より高い効果のある物質を蛋白質、酵素類、他のＣｈＥ類を追加して合成することができる。 加えて、多種の酵素又は複数の酵素の組合せにより、多種類のＯＰ化合物の組合せを検出するのに効果のある物質を速やかに合成できる。

【００４１】 Ｃ． 酵素の安定性図６で示されるように固定化ＣｈＥ及びＯＰハイドロラーゼは４°Ｃで３年より長い間、２５°Ｃ及び４５°Ｃでそれぞれ１２ヶ月より長い間、酵素安定性を維持した。 この物質が液体窒素で凍結されたなら、殆どの初期活性を保持する。
ＴＤＩは固定化ＣｈＥに顕著な安定性を与える。 即ち、固定化ＡＣｈＥｎｏ初期活性の約５０％及び固定化ＢＣｈＥの活性の２０％が、溶液酵素では活性が示されない８０°Ｃで１６時間後にも維持された。 このＣｈＥ物質は２２°Ｃで徹底的に真空乾燥されることができ、その後、再水和されても酵素活性の損失がない。 ＡＣｈＥ又はＢＣｈＥ物質が徹底的に洗浄され、活性の分析が行われたとき、
洗浄、分析サイクルは３日にわたって２０回より多く繰りかえらせたが、活性の減少は生じなかった。 図７参照。 これはこの物質が繰返し使用され得ることを示している。

【００４２】 これらの結果はＣｈＥ類が多孔性支持体中に共有架橋結合し手いること及びＣ
ｈＥ類が皮膚、水又は装置にしみ出てこないことを示している。 従って、固定化された酵素がＯＰ化合物と結合すると、そのＯＰ化合物をその表面から除去するには脱不純物処理を必要とする。

【００４３】 Ｄ． 運動常数

【００４４】

【表１】

【００４５】 この物質は、固定化酵素はしみ出ず、ＯＰ化合物は固定化酵素と不可逆的に結合しているので、妨害を引き起こす化合物や組成物を除去する為に洗浄され、絞られ、又は他の方法で綺麗にされても良い。 基質がこの多孔性支持体の上又は中に埋め込まれ、又は試料に曝された後にこの物質にあてがわれても良い。 この物質においてその基質は溶液のままであり、可動性を維持している。 適切なバッファがこの物質にあてがわれても良い。 物質の色又は発色の変化はＯＰ化合物の存在を示す。

【００４６】 これらのバイオセンサは１回の使用後に処分され又は再使用されてもよい。 このバイオセンサを再使用することにより、この物質はそのＯＰ化合物を蓄積し、
それにより、定義された時間を超えてＯＰ化合物の集積量を示す。 このバイオセンサは、このＯＰ化合物を取り除く試薬、例えばフルオライド塩を使用して再生されても良い。 このバイオセンサの精度は使用に先立って再度キャリブレートされるならば確かめられる。

【００４７】 ＯＰ化合物の存在の為のこれらの定性テストは外部のエネルギー源又は他の装置を必要としない。 しかし、このバイオセンサは、Ｈ２Ｏ２により表示されるようなコリンエステラーゼ活性を測定することによりＯＰ化合物の検出の為の炭素電極を具備する。 この実施態様において、ＣｈＥがその表面又は内部に固定化される物質は炭素電極にしっかり固定される。 本発明において、このバイオセンサは極端な温度で長期間保存されて良い。 また、何度も繰返し使用されても良い。

【００４８】 バイオセンサの幾つかのれいはテストストリップ、バッジ及びパッチを含む。

【００４９】 固定化又は溶液ＣｈＥ類はいずれも活性位置の数が有機リン化合物ＭＥＰＱ，
７−（メチルエトキシフォスフィニルオキシ）−１−メチルキノリニウムアイオダイドを用いた滴定により測定された。 このＡＣｈＥ物質及びＢＣｈＥ物質とそれぞれの溶液酵素の２５°ＣにおけるＭＥＰＱによる阻害の２分子速度常数は溶液酵素と共有結合した酵素の間には大きな差が無いことを示した。 表１参照。 これらの結果はＣｈＥ類の固定化形態と溶液形態は同じようにＯＰ化合物と相互作用することを示している。 従って、通常入手し得る業界公知の酵素活性分析法が用いられうる。

【００５０】 改良エルマン分析を用いた初期速度法は固定化及び溶液ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥ
のパラメータＫｍ、ｋｃａｔ，及びｋｃａｔ／Ｋｍを決定する為に用いられた。
結合又は溶液ＣｈＥ類の活性位置の数はＭＥＰＱでの滴定により測定された。 表１２及びＡＣｈＥのための図８に示すように、固定化ＣｈＥ類のＫｍ値は対応する溶液酵素より約１０倍であった。 ｋｃａｔ値は劇的に影響されより低くかった。 基質の親和性とｋcatの組み合わされた効果はアセチル化（ｋｃａｔ／Ｋｍ）
における約２０から５０倍の減少をもたらした。 興味深いことに、溶液ＢＣｈＥ
は基質阻害を欠いたが、固定化ＢＣｈＥは基質阻害を生じた。 これらの結果はＣ
ｈＥ類の表面の残基の多孔性支持体への共有結合が結合酵素の活性位置領域の何らかの性質を直接的又は間接的に変えたことを示唆する。

【００５１】

【表２】

【００５２】 固定化及び溶液コリンオキシダーゼのＫm決定：コリンオキシダーゼの溶液形態及び固定化形態（スポンジ）のＫmは図Ｂに示されるように基質カーブに殆どシフトがないことから同じであると観察された。
この基質カーブはこの酵素が固定化に非常に適しているばかりでなく、コリンエステラーゼとの共固定化に非常に適していることご示している。 溶液及びスポンジの観察されたＫmはそれぞれ２．５ｍＭ及び６．７ｍＭである。 図１９Ｂ参照。

【００５３】 Ｅ． 溶液及び固定化酵素のｐＨ固定化および溶液ＡＣｈＥのｐＨ曲線は同一であり、これらの酵素は広いｐＨ
範囲７−８．５で活性を示す。 溶液コリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ，
及びＯＰハイドロラーゼのｐＨ曲線がこの同じｐＨ範囲で至適活性を有するので、多孔性支持体の表面又は内部に固定化されたこれら多種類の酵素の複数個を用いてこの物質を至適化及び多様化することができる。

【００５４】 更に支持する証拠としての溶液及び固定化酵素のｐＨ図１９Ａ：溶液及び固定化コリンオキシダーゼのｐＨ曲線。 図９の溶液及び固定化アセチルコリンエステラーゼのｐＨ曲線と比較してください。 Ｆ． 溶液コリンエステラーゼとセンサ（固定化）コリンエステラーゼの温度依存 活性固定化ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥを含むセンサは、それらの溶液相補体と比較して殆ど同一の温度依存活性を示した。 しかし、図６に示すように、固定化酵素は長時間、高温での変性条件に更に耐性があるが、溶液酵素は耐性がない。 固定化酵素は液体窒素中での凍結にも耐性がある。 これらのグラフは低温において、このセンサが反応速度を増す為に体温又は外部の熱源により暖められうることを示す。 実施例４ 多種類の酵素の複数個の固定化 ＣｈＥ類がバクテリアルＯＰハイドラーゼ（ＯＰＨＢ）及び／又は兎血清ハイドロラーゼ（ＯＰＨＲ）と一緒に共固定化された。 独自に固定化された各酵素の酵素活性と比較して、ＯＰＨと共固定化されたＡＣｈＥ又はＢＣｈＥの酵素活性に低下は無かった。 図１０参照。 更に、共固定化されたＯＰＨの酵素活性においても低下はなかった。 従って、複数個の酵素であって、それらが種々のＯＰ化合物と異なって反応する酵素を選択して広い範囲のＯＰ化合物に対して効果的な不純物除去物質を生成するために１つの物質中に利用することもできる。 最後に、相互検出図解（図１３Ａ）に必要な多種類酵素の例も又図１０に示される。 コリンオキシダーゼのＡＣｈＥ又はＢＣｈＥとの共固定化は独自に固定化された酵素と比較して固定化プロセス又は酵素の活性を変更しない。 実施例５ 高速混合合成接着剤工業（ＣＰＡ，Greenville, RI02828から改良された合成方法を用いることにより、酵素活性を低下させるせん断力が減少される。図１１参照。個の方法において、酵素は幾つかの固定化技術において要求されるような有機バッファ中にはない。これは空気誘導せん断の減少をもたらし、酵素活性が維持される。
この方法は操作が簡単で，素早く且つ再現性もある。 この低せん断混合装置は結果として生ずる固定化ＡＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥの酵素活性を、混合ドリルなどの高せん断装置で調製された同一混合物と比較して２倍以上にする。 表３参照。

【００５５】

【表３】

【００５６】

【表４】

【００５７】

【表５】

【００５８】

【表６】

【００５９】

【表７】

【００６０】

【表８】

【００６１】

【表９】

【００６２】

【表１０】

【００６３】

【表１１】

【００６４】 実施例６ 酵素活性の測定図１３は本発明のバイオセンサと用いられる色々な検出方法を説明している。
ＯＰ化合物の定性検出は、目に見える発色及び／又は化学蛍光発色を用いて視覚的に遂行される。 定量検出は手に持てる装置を用いて行うことができ、蛍光、化学蛍光又は発色の値を測定する。 加えて、使い捨て炭素マイクロ電極からなる電子バイオセンサはＨ２Ｏ２生成からの電気化学信号を検出するために用いることができる。

【００６５】 この物質のＣｈＥ活性は改良エルマン法を用いて、ＡＣｈＥの為には基質としてアセチルチオコリンを含有する、ＢＣｈＥの為には基質としてブチリルチオコリンを含有する水性リン酸バッファ環境中で評価された。 黄色を生成するこれらの反応は分光光度分析で４１２nmで監視された。 エルマン分析の最終反応性生物はＣｈＥを欠く物質に吸着しなかった。 生成された生成物は時間と共に線状であった。 それにより反応性生物の水性環境中への放出は速度制限が無いことを示している。 ＯＰハイドロラーゼ活性の測定のために、用いられた基質はｐ−ニトロヘニルフォスフェートであり、反応は５００nmで監視された。

【００６６】 このエルマン分析とＯＰハイドロラーゼ分析は、その酵素が阻害されないなら、黄色色素を生成する。 酵素が阻害するなら無色である。 又、コリンエステラーゼのためには、２，６−ジクロロインドフェニルアセテート（赤色）、ＣｈＥにより加水分解で青（２，６‐ジクロロインドフェニレート）に変わる。 再度、青色の存在しないことはＯＰによるＣｈＥ阻害を示す。

【００６７】 ＣｈＥ阻害の蛍光検出の為に、基質は１−メチル−７−アセトキシキノリニウムアイオダイド、又は蛍光マレイミド、n-（４−（７−ジメチルアミノ−コウマリン−３−イル）フェニル）−マレイミドでよい。 １−メチル−７−アセトキシキノリニウムアイオダイドは、加水分解で高い蛍光物質である１−メチル−７−
ハイドロキシ生成する。 蛍光マレイミド、n-（４−（７−ジメチルアミノ−コウマリン−３−イル）フェニル）−マレイミドはＣｈＥ類によるでアセチル又はブチリルチオコリンの加水分解で形成されるチオールと縮合する。 即ち、３９０nm
/ex ４７３nm発光。

【００６８】 化学発光検出は、ＣｈＥと基質（ＡＣｈ又はベンゾイルクロライン）を追加して、コリンオキシダーゼとパーオキシダーゼがルミノールの含む混合物に追加される。 この化学発色方法に於いて、光源は必要でない。 従って、より小型のよりエネルギー効率の高い検出器にすることができる。 更に、化学発光は暗さに慣れた目での検出をできるようにする。 Amplex Red(Molecular Probes,Inc.)とＨ２
Ｏ２の反応生成物であるこのインジケータレゾルフィンは、感度を増大できる蛍光 と可視赤色色素の両方であるという利点を有する。 （図１３参照）。

【００６９】 代表的エルマン比色分析のために、標準装置によるＯＰ化合物の検出の下限は凡そＯＰの３５フェムトグラムである。 この限界はＣｈＥが固定化された物質の１cm2で得ることができる。 この量はこの物質の合成中に大きくすることも小さくすることもできる。 このように、この物質に共有結合するＯＰ神経剤の最大累積量は約１００pgである。

【００７０】 マイクロ電極はＣｈＥ活性を検出するのに用いることができる。 このように、
前記共有結合設計は、例えば、ＣｈＥ類、コリンオキシダーゼ、及びパーオキシダーゼの多酵素で用いられ得る。 この混合物は炭素電極の周りにスポットされ、
硬化される。 図１４参照。 この酵素−炭素電極は酵素の損失なしに水のような流れる液体を連続的に分析するために用いることができる。

【００７１】 光学分析及びＵＶ−可視分光光度計、蛍光計、及び電気化学検出器などの通常の研究室の装置は定量的バイオセンサに発展させるのために用いることができる。

【００７２】 同様に、上記基質及びインジケータは小さなパケット、リポゾームなどのに入れられいてもよく、多孔性支持体に詰め込まれ、取込まれていても良い。 その物質が圧搾され、押さ付けられ、他の方法で操作されるとき、基質とインジケータは放出され、結果として生ずる色の変化でＯＰ化合物の存在を示す。

【００７３】 酵素活性の測定固定化コリンオキシダーゼと固定化ＡＣｈＥを含むスポンジ１０mgが基質（アセチルコリン）、インジケータ（Molecular Probes,Inc.のAmplex Red）及び西洋わさびパーオキシダーゼを含むバッファ２．５mLの入ったキュベット中でインキュベートされた。 １つのスポンジは２５°Ｃで５分間ＭＥＰＱに曝され、水ですすがれ、次いで同じバッファの第２キュベット中に入れられた。 別のキュベットは上記と同じバッファだけが入れられ、バイオセンサスポンジは入れられなかった。

【００７４】 ２５°Ｃで５分間インキュベート後、試料が５６０nmにおいて視覚的に分光光度計で観察された。 蛍光分析では560nm励起、５８０nm発光である。 白紙に対する可視鑑定で、左の試料（ラベルＡ）はセンサがアクティブで基質と反応するとき、強い色（赤）を示す。 中央の試料（ラベルＢ）はＯＰ ＭＥＰＱに曝された後のセンサの状態を示す。 これは毒されもはや発色しない。 実に、右の試料、ラベルＣではバッファのみでセンサを含まないものは、識別できない。

【００７５】 同じ試料は蛍光計で監視され、又は手で持てる分光光度計で可視範囲で監視され得る。 蛍光分析の利点は可視スペクトルでの分析にわたって感度が非常に強化されることである。 実験室の分光光度計を用ると、蛍光測定されたときキュべット中で信号及び感度が４０００倍強化された。

【００７６】 ＡＣｈＥとコリンオキシダーゼのセンサは、エネルギー源のない完全な暗闇中で有機リン酸塩の不存在及び存在の基で表示するために用いることができる。 Ａ
ＣｈＥ／コリンオキシダーゼ固定化センサは基質（アセチルコリン）、ルミノール（５−アミノ−２，３‐ジヒドロ−１，４−フターラジンジオン）、１０ug/m
Lの西洋わさびパーオキシダーゼを含むバッファ２．５mL中でインキュベートされた。 蛍光は蛍光計で定量された。 励起もなく（光源がない）、放出も０のオーダーでなっかった（毒されていないセンサの反応により生成する光を測定するための広い開口）。 ＡＣｈＥは基質を加水分解し、コリンオキシダーゼは生成物（
図１３の図解参照）に作用する。 その結果は、化学蛍光である。 化学蛍光は、暗さに慣れた人の目のしきい値以上で４分間以上観察された（水平な点線で示されている）。 実施例７ ＤＦＰでの固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの阻害固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの試料１００mgが色々な濃度のＤＦＰで、ｐＨ８．０
の５０ｍＭリン酸バッファ２ｍＬ中で２５°Ｃで１時間インキュベートされた。
試料中の残留ＤＦＰが、新しい１Ｕ/mL溶液の０．５mLへ反応混合物の０．５mL
づつを加えて１時間インキュベートし、エルマン分析で用いる１０μｌを分析することにより、測定された。 この結果は図１７に示されている。

【００７７】 ＤＦＰでの固定化ＦＢＳ―ＡＣｈＥの阻害はバッファ中に懸濁された発泡体へ加えられたＤＦＰ理論量と比例した。 実施例８ ＤＦＰでの固定化Ｅｑ―ＢＣｈＥの阻害固定化Ｅｑ―ＢＣｈＥの試料５０mgが色々な濃度のＤＦＰで、ｐＨ８．０の５
０ｍＭリン酸バッファ２ｍＬ中で２５°Ｃで１８時間インキュベートされた。 試料中の残留ＤＦＰが、新しい１Ｕ/mLＥｑ―ＢＣｈＥ溶液の０．５mLへ反応混合物の０．５mLづつを加えて１時間インキュベートし、エルマン分析で用いる１０
μｌを分析することにより、測定された。 この結果は図１８に示されている。 実施例９ 多固定化酵素からなる区別バイオセンサコリンエステラーゼ、ＯＰハイドロラーゼ、及びＯＰ以外を加水分解する酵素類からなる物質は多孔性支持体の表面又は内部に共有結合で固定化されると，区別バイオセンサを生成することができる。 区別バイオセンサは、多孔性支持体の表面又は内部に固定された種々のＣｈＥ類、ＯＰハイドロラーゼ類、及び／又はラッカーゼ類から作ることができ、各ＣｈＥ類、ＯＰハイドロラーゼ類、及び／
又はラッカーゼ類は、プラスチック片のような担体上に独自に且つ別々に固定されている。 例えば、ラビットからの血清ＯＰハイドロラーゼは、サリンに高い活性を示すが、ソーマンには示さない。 従って、固定化ＯＰＨｒを有する物質とラッビットの血清以外のソースからのＯＰハイドロラーゼを有する物質を１枚のプラスチック片に固定するとサリンとソマンを識別するバイオセンサとして作用できる。

【００７８】 更に、幾つかの種類の好ハロゲンバクテリア及びアルテロモナスバクテリアからの酵素は、有機リン化合物に対する酵素活性に大きな違いを有しているので、
これらの酵素が多孔性支持体の表面又は内部に共有結合で固定化されている複数の物質は区別作用バイオセンサとして用いるために１つの担体に別々に固定することができる。 例えば、A.undiからのＯＰＨはサリンやタバンに対してよりもソマンに対して高い酵素活性を示すので、A.undiからのＯＰＨと他のソースからのＯＰＨとで、サリンやタバンを越えてソマンを区別して検出するバイオセンサとして作用できる。 更に，種々のＯＰハイドロラーゼ、ＣｈＥ類、ラッカーゼ、ラッカーゼのメディエイタ、及びそれらの変異物は、複数のＯＰ化合物に対して異なる特性及び／又は活性を示すようにスクリーニングしたり、発展させたりすることができる。

【００７９】 表４は幾つかの酵素の概略を示し、与えられたＯＰ化合物の速やかな定量および定性同定に用いられる。

【００８０】 担体は各ＯＰに対して異なる特性を示す異なる固定化酵素のスポットを含む幾つかの区分に分けられ得る。 例えば、１つのＯＰ薬がテストされる試料に存在するなら、ＡＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥ阻害があるだろう。 即ちＡＣｈＥ及び／又はＢＣｈＥ中で色の変化がない。 もしＯＰ薬がサリンなら、ラビットＯＰハイドロラーゼはサリンを加水分解して、その結果ラビットＯＰハイドロラーゼの区分で色が変化するはずである。 更に，A.undinaを含む区分は、サリンは基質のほんの一部であるので与えられた基質を控えめに阻害するだけなので、控えめな色の変化があるだろう。 ＶＸが存在するなら、ラッカーゼを含む区分の色はラッカーゼがＶＸを加水分解するので変化するだろう。

【００８１】

【表１２】

【００８２】 このように、表５に示すような固定化酵素からなる物質は独自に担体に固定されうる。 これらの物質を具備する担体がテストされる試料に曝されて後、特定のＯＰ薬の存在は適切な基質の存在で与えられた物質の色の変化を観察することにより測定され得る。

【００８３】

【表１３】

【００８４】

【表１４】

【００８５】 実施例１１ ＯＰ化合物の遠隔定量及び定性分析 ＯＰ被阻害酵素は、直ぐには元に戻らず控訴は固定化されているので、この物質は、テストの場所から、与えられたＯＰ化合物の存在及び量を分析する別の場所へ移送されてもよい。 更に、この物質は所定の時間ＯＰ化合物を監視する場所において置かれても良い。 このＯＰ被阻害酵素は直ぐには元に戻らないので、阻害化合物及び組成物はテストの場所，又は、異なる場所でこの物質から除去されてもよい。 更に，この分析は、サンプリング後、直ちに又は間もなく行われる必要はない。

【００８６】 Ａ． フッ素化合物で誘導されるＯＰの放出高濃度のＦ−はこの物質に固定され且つ阻害されたＣｈＥに結合したＯＰ化合物の放出を引き起こす。 図１５参照。 これにより可溶性のフォスフォフルオリデートが生成し、これは存在するＯＰ化合物に特異的である。 このフォスフォフルオリデートはガスクロマトグラフィーで同定及び定量され得る。 更に，元のＯＰ
化合物を決定する為にマススペクとロメトリーで確認できる。 特に、阻害されたＣｈＥを含むが洗浄された有毒物質を含まない物質をｐＨ４まで酸性にし、２Ｍ
弗化カリウムでインキュベートした。 この溶液は、次にC18SipPak(Waters Assoc
iates, Milford, Mass.)で抽出される。 このＯＰ化合物は遊離され、ガスクロマトグラフィー及びマススペクとロメトリーで同定される。 関心のある殆どのＯＰ
試薬が同定できる。 ＯＰ除草剤からも識別される。 この実施例において、この物質は機械的ストレス、厳しい化学的条件、及び極端な及び変化する温度に非常に抵抗性があるので、後日ＯＰ化合物をテストするために、試料を凍結する必要はない。

【００８７】 Ｂ． 酵素の消化他の工程として、ＯＰ化合物の暴露後の同定の為に酵素の消化が用いられても良い。 このＯＰ化合物は多孔性支持体かに固定された酵素から放出され、ｐＨ１
０の１Ｍトリスバッファとアルカリ性フォスファタ−ゼで消化されても良い。 その後、高分子生成物が濃縮され、ピリジンととトリメチルシリル化試薬の溶液に溶かされる。 このサンプルは次にガスクロマトグラフィー及びマススペクとロメトリーで分析される。

【００８８】

【表１５】

【００８９】 実施例１２ 実施例１３ フェイルスポジティブに対する抵抗性このセンサはフェイルスポジティブに対する抵抗性を有することが好ましい。
この定義においてＯＰのフェイルスポジティブは酵素を変成させる全ての化合物である。 有機化合物は溶液状態の多くの蛋白質及び項をを阻害し変成させることが知られているので、このＡＣｈＥセンサを標準ガソリン（図２１Ａ）及びジーゼル排気ガス（図２１Ｂ）に曝して活性を評価した。 連続して２−３時間曝した後にも初期活性の８０％以上を保持していた。 ポリマーマトリックスも破壊されていなかった。 これらの結果は、このマトリックスが固定化されたアセチルコリンエステラーゼを有機燃料の蒸気などの変成条件に対して安定化し、フェイルスポジティブ応答を減少させたことを示している。 実施例１４ 実施例１５ 水性環境での有機リン酸塩に対する長期感度固定化酵素の最大の利点はそれらがポリウレタンマトリックスのな化で永久的に共有結合で固定されていることである。 このことは以下の溶液状態の酵素又は紙、チケット、又は指示Ｓとリップに共有結合ではなく付与される酵素にはない特性をセンサに与える。

【００９０】 Ａ． 異なるｐＨで２５°Ｃで連続インキュベートごの活性保存能力 ２５°ＣでｐＨ４．０から１０．５のバッファ中で２ヶ月後の固定化ＡＣｈＥ
とＢＣｈＥ酵素の活性が図２１Ａと２１Ｂにそれぞれ示される。

【００９１】 Ｂ． 自然水源において環境温度２５°Ｃで連続インキュベートごの活性保存能 力環境中で長期間計か語にもＡＣｈＥセンサが活性を保っている更なる証拠が図２１Ｃ及び図２１Ｄに観察されている。

【００９２】 Ｃ． 上記Ａ及びＢでＭ２７２チケットの比較 Ｍ２７２チケットは水溶液中で有機リン酸塩に感度があるものとして最近出まわっている。 このチケットは非共有結合したEelコリンエステラーゼを含む。 固定化したＡＣｈＥ及びＢＣｈＥセンサが１−２ヶ月後にも活性を保持しているのに対し、Ｍ２７２チケットは、湾の水中で（図２１Ｅ）及びバッファ中で（図２
１Ｆ）５分後に、８０％以上の活性を失った。 実施例１６ この物質の形成に先立つ酵素カップリングこれらの酵素は当業界で知られている手段でこの物質を形成するに先だってカップリングさせ、架橋結合した酵素錯体を形成することができる。 Hashida, S.,
Imagawa, M,. Inoue, S., Ruan, K.-h, 及びIshikawa, E（1984）J.Applied Bio
chem 6, 56-63及びSamaoszuk,M>K>, Petersen,A., Lo-Hsueh, M., 及びRietveld
, C.(1989)(A peroxide-generating immunocongugate directed to eosinophil
peroxidase is cytotooxic to Hodgkin's disease cells in vitro.).Antibody
Immunocon..Radiopharm.2(1), 37-46を参照。

【００９３】 例えば、ACｈEは公知の方法で架橋剤を用いてコリンオキシダーゼと結合させることができる。 従って、ＡＣｈＥとコリンオキシダーゼは近接して存在し、Ａ
ＣｈＥの加水分解物であるコリンは次にコリンオキシダーゼによりＨ２Ｏ２ｗｏ
生成する。 このタイプの酵素のカスケードは更に効果的な酵素のカップリングを提供し、より速いより感度のよいものを提供する。 加えて、コリンオキシダーゼの近接により、コリンオキシダーゼのＡＣｈＥに対する割合を減少できる。 2種以上の異なった酵素が用いられてよい。 実施例１７ 農薬（ジクロロフォス）及び有機リン酸（ソマン，ＧＤ）に対する溶液且つ固 定化マンマリアンＡＣｈＥの感度 ＡＣｈＥセンサと溶液ＡＣｈＥを、50ｍＬのフォスフォレートバッファに2.5
ｍＬのジクロロフォス希釈液に５分間曝した後、溶液状の酵素と固定化したセンサの活性を測定した。 図２３Ａに示すように、溶液状の酵素と固定化したセンサの感度は非常に近いＥＣ _５０の値を示したが、スポンジに関する傾斜は、溶液酵素よりも約２０％緩かった。 これらの結果は、農薬の阻害に対して、ＡＣｈＥスポンジは溶液状のマンマリアン酵素よりも少し感度が低いことを示している。

【００９４】 ＡＣｈＥセンサ（酵素を固定）とアセチルコリンエステラーゼ溶液の阻害についても、同様な結果が観察された。 図２３Ｂは、酵素をソマンに５分間曝して酵素の阻害を測定した時、ソマンへの曝しによる酵素活性の喪失を表わす曲線が意味のある程変化していないことを示している。 ソマンなしでは、色発展と酵素活性（１００％レベル）があるのに対し、30ｐｇのソマンでは、殆ど色反応がなく、活性は制御レベルの２０％低い。 表５における参考文献

【００９５】

【表１６】

【００９６】

【表１７】

【００９７】

【表１８】

【００９８】 以上、本発明について説明したが、上述の刊行物及び特許文献は、本発明の理解と開示に必要な限り、この明細書の開示に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ及び有機リン酸トリエステラーゼのモデル化した表面を示す図。

【図１Ｂ】 ラッカーゼのモデル化した表面を示す図。

【図２】 硬化した材料を示す図。

【図３】 酵素とプレポリマーの特別反応を概略的に示す図。

【図４】 材料の合成中に付加されたＢＣｈＥの量と最終材料におけるＢＣｈＥの量との間の直線関係を示す図。

【図５】 合成中に一定量のＡＣｈＥ及びＴＤＩポリマーに付加されたＢＳＡの増加量を示す図。

【図６】 図６Ａ及び図６Ｂは本発明による材料が、25℃及び45℃で12ヶ月以上、及び４
℃で３年以上、酵素の安定を維持したことを示す図。

【図７】 本発明による材料が洗浄後に酵素の活性を維持したことを示す図。

【図８】 可溶性のポリウレタン結合ＡＣｈＥの基質濃度依存曲線を示す図。

【図９】 可溶性の固定化ＡＣｈＥのｐＨの範囲を示す図。

【図１０】 共に固定化されたＣｈＥとＯＰＨの相対的活性を示す図。

【図１１】 図１１Ａ及びＢは、手動式の混合ガン及び処分可能な混合ステータの外観図。

【図１２】 ＣｈＥ活性を検出するための変更可能な手順を示す図。

【図１３】 図１３Ａは、固定化されたＦＢＳ−ＡＣｈＥの酵素活性を示し、図１３Ｂは、
固定化されたＥｑ−ＢＣｈＥの酵素活性を示す。

【図１４】 発泡体で固定化されたＦＢＳ−ＡＣｈＥのＤＦＰによる阻害とＨ１−６による再活性化を示す図。

【図１５】 発泡体で固定化されたＥｑ−ＢＣｈＥのＤＦＰによる阻害とＴＭＢ４による再活性化を示す図。

【図１６】 有機リン酸の比が非常に高いところ（1000重合モル過剰）でのみ拘束、再活性化及び解毒が完了していないことを示す図。 しかしながら、新しいＨＩ−６により再度当初の活性が殆ど回復できる。

【図１７】 図１７Ａは、テトラグリムを添加したスポンジによって与えられた保護を示し、図１７Ｂは、ＨＩ−６を添加したスポンジによって与えられた保護を示し、図１７Ｃは、２−ＰＡＭを添加したスポンジによって与えられた保護を示す。

【図１８】 生成されたカーボンスポンジがメチレンブルー（活性炭に対する色計測インジケータ）を結合する能力を示す図。

【図１９】 オキシムの比活性

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドクトル，ブペンドラ，ピー アメリカ合衆国，メリーランド州 20854， ポトマック，10613 グレート アーバー ドライブ (72)発明者 サクスナ，アシマ アメリカ合衆国，ヴァージニア州 22030， フェアファックス，4220 トローブリッジ ストリート (72)発明者 フェアスター，ショーン，アール アメリカ合衆国，メリーランド州 20872， ダマスカス，10530 トラリー テラス (72)発明者 マックスウェル，ドナルド アメリカ合衆国，メリーランド州，ボルチ モア (72)発明者 ロス，ミッシェル アメリカ合衆国，メリーランド州，エッジ ウッド (72)発明者 レンツ，デヴィッド アメリカ合衆国，メリーランド州，ベル エアー (72)発明者 ルジュヌ，キース，イー アメリカ合衆国，ペンシルバニア州 15212−5848，ピッツバーグ，100 アンダ ーソン ストリート (72)発明者 ラッセル，アラン，ジェイ アメリカ合衆国，ペンシルバニア州 15090−7100，ウェックスフォード，113 フォックスウッドドライブ Ｆターム(参考） 2E191 BA11 BD20 4B033 NA02 NA23 NA26 NB34 NB68 NC01 ND04 NE01 NE02 4J034 BA03 DA01 DA03 DB01 DC50 DG01 HA01 HA07 HC12 HC22 HC46 HC52 HC61 HC71 JA42 NA03 QB16 QB17 QC01 RA02