用于生物降解三氯蔗糖和其他氯化碳水化合物的微生物聚生体 |
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| 申请号 | CN200980108810.6 | 申请日 | 2009-02-09 | 公开(公告)号 | CN101981176A | 公开(公告)日 | 2011-02-23 |
| 申请人 | 塔特和莱利技术有限公司; | 发明人 | 刘嘉丽; 特拉维斯·阿龙·马汉; 埃德·法利; | ||||
| 摘要 | 记述了能够降解氯化 碳 水 化合物的分离的 微 生物 聚生体和使微生物在特定 温度 和盐条件下适应于降解氯化碳水化合物的方法。还记述了利用微生物聚生体降解废料流中的氯化碳水化合物的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.分离的能够降解氯化碳水化合物的微生物聚生体，其中所述分离的微生物聚生体在包含氯化碳水化合物的培养基中生长或生存，且其中所述微生物聚生体降解一种或多种所述氯化碳水化合物。 |
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| 说明书全文 | 用于生物降解三氯蔗糖和其他氯化碳水化合物的微生物聚生体 [0001] 发明背景 [0003] [0004] 三氯蔗糖 [0005] 已经开发了许多用于制备三氯蔗糖的不同合成途径，其中位置6处的反应性羟基首先被酰基阻断，从而形成蔗糖-6-酰化物。所述蔗糖-6-酰化物然后氯化，从而取代位置4，1′，6′处的羟基以生成4，1′，6′-三氯-4，1′，6′-三脱氧半乳蔗糖-6-酰化物(三氯蔗糖-6-酰化物)，随后水解以去除酰基取代基并由此生成三氯蔗糖。若干用于配制蔗糖-6-酰化物的合成途径涉及锡介导的酰基化反应，其示范性实例公开在美国专利号4,950,746；5,023,329；5,089,608；5,034,551；和5,470,969中，通过参考将其结合在本文中。 [0006] 可以使用多种氯化试剂来氯化蔗糖-6-酰化物，且最普遍地应该使用Vilsmeier型盐，诸如Arnold试剂。一种合适的氯化方法由Walkup等(美国专利号4,980,463)公开，其中叔酰胺，典型地N，N-二甲基甲酰胺(″DMF″)，用作氯化反应溶剂。在氯化完成后，用碱溶液中和反应混合物，从而在三氯蔗糖-6-酰化物的位置2，3，3′，和4′重新生成羟基，这在水溶液中生成三氯蔗糖-6-酰化物，其伴随着由氯化试剂反应产生的叔酰胺溶剂和盐。三氯蔗糖-6-酰化物然后脱酰基，以生成三氯蔗糖。一种合适的方法由Navia等，美国专利号5,498,709教导，通过参考将其公开内容结合在本文中。 [0007] 多种氯化碳水化合物典型地在合成三氯蔗糖过程中形成。这些化合物可以进行化学脱氯，从而提供容易生物分解的废品。然而，化学脱氯典型地需要高温和使用腐蚀性溶液，这可以对随后生物降解所述废品具有负面作用。需要更具成本效益且对环境友好的方法来降解氯化碳水化合物。 [0008] 发明概述 [0009] 本发明提供能够降解氯化碳水化合物的分离的微生物聚生体，其中所述分离的微生物聚生体在包含氯化碳水化合物的培养基中生长或生存且其中所述微生物聚生体降解氯化碳水化合物. [0010] 本发明还提供分离的微生物聚生体，其中所述微生物聚生体能够降解在生产三氯蔗糖中产生的废料流中的氯化碳水化合物。 [0011] 还提供用于降解氯化碳水化合物的方法，所述方法包括以下步骤：a)用能够降解氯化碳水化合物的分离的微生物聚生体接种包含氯化碳水化合物的培养基；和b)在所述培养基中温育所述微生物聚生体。 [0012] 还提供开发能够降解氯化碳水化合物的微生物聚生体的方法，其包括以下步骤：a)提供包含微生物的环境样品；b)在包含一种或多种有机溶剂的确定成分培养基中温育该样品中的微生物，其中所述温育的温度为约15℃-约55℃且所述培养基的盐酸盐浓度是约4.5％以下；c)选择步骤b)后所述培养基中存在的降解一种或多种所述有机溶剂的微生物聚生体；d)随后用包含所述氯化碳水化合物的培养基替换所选聚生体的培养基；和e)通过针对所述氯化碳水化合物的降解监测培养基来选择降解氯化碳水化合物的聚生体。 [0013] 另外提供生产三氯蔗糖的方法，其包括以下步骤：a)将包含处于水性溶剂中的三氯蔗糖-6-酰化物的溶液维持在足以基本使全部三氯蔗糖-6-酰化物脱酰基的条件下；b)随后重获三氯蔗糖；和c)通过包括以下步骤的方法降解脱酰基作用后存在的氯化碳水化合物：i)用降解氯化碳水化合物的分离的微生物聚生体接种包含氯化碳水化合物的溶液；和ii)在该溶液中温育所述微生物聚生体。 [0015] 图1.使聚生体P-4适应包括45℃和4.5％盐的培养条件的盐和温度斜坡曲线。 [0016] 图2.三氯蔗糖生产过程不同阶段产生的两个废料流中的总氯化碳水化合物的生物降解。 [0017] A.由聚生体P-3和P-4生物降解废料流1中的总氯化碳水化合物。 [0018] B.由聚生体P-5，P-6和P-7生物降解废料流2中的总氯化碳水化合物。 [0019] 图3.由聚生体P-4和P-6生物降解合成培养基中的4-氯-半乳糖。 [0020] 发明详述 [0021] 描述了用于使微生物适应于降解废料流中可能存在的氯化碳水化合物的方法。该方法已经用于生产能够用于降解氯化碳水化合物的微生物聚生体。这些聚生体由Chi-Li Liu博士于2008年1月11日为Tate&Lyle保藏在国家农业利用研究中心(Agricultural Utilization Research)，北部区域研究实验室(Northern Regional Research Laboratories)，Peoria，IL中，其保藏号为NRRL B-50091，NRRL B-50092，NRRL B-50093，NRRL B-50094，NRRL B-50095，NRRL B-50096，NRRL B-50097，和NRRL B-50098，且记述在实施例3中。这些微生物聚生体包括适合共存在这样的环境中的微生物物种组，在所述环境中某些参数，诸如食物成分、温度、盐浓度、或这些参数的组合为生存和生物降解提供选择性压力。通过使用微生物聚生体来生物降解，可以减小或甚至完全避免对氯化碳水化合物进行化学脱氯的需要。 [0022] 在本说明书中，“微生物”包括用显微镜可见的生物体(微生物)(microbes)，微生物(microorganisms))，诸如细菌和单细胞真核生物体。微生物“生长”定义为微生物的生存或任何繁殖。“聚生体”是单培养物中存在的两种以上微生物物种组。“培养物”指单生物反应器，其包含生长培养基和两组或更多组微生物生物体。“废料流”是包含生产过程中产生的化合物的培养基，其中这些化合物不能再循环回到生产过程中或作为有用的产物重获。 [0023] 用于适应的包含微生物的环境样品可以获自可能存在氯化碳水化合物的生产位点，例如，废料溶液，废料沉淀物诸如料泥和沉积物，和邻近生产位点的土壤。包含微生物的环境样品通过在合成培养基中培养而富集并适应于所需性能，所述合成培养基模拟废料流的组成和温度。一般地，这些条件包括基于重量0％-4.5％盐酸盐，更典型地，1％-4.5％的盐酸盐，和15℃-55℃的温度。合成培养基包含微生物的食物源，诸如酵母提取物(氮源、氨基酸和维生素)和糖(碳源)，以及有机盐(例如钙、钠、磷酸盐、硫酸盐等)和对微生物生长很重要的痕量元素(诸如Fe，Mn，Ni，Mo，Co，Se，等)。样品中存在的不同微生物的生存和生长应该取决于最初的食物源、盐酸盐浓度和温度条件。在一个实施方案中，微生物培养物在温度约27℃-约50℃下温育且培养基具有约4.5％以下的最终盐酸盐浓度。含盐量可以由任何盐酸盐或盐酸盐的组合，包括碱金属，碱土金属，和过渡金属，例如NaCl，CaCl2，MgCl2，MnCl2等和氯化铵组成。可以调节培养基的pH以最优化生物降解废料流的条件。 [0024] 实施例1和2描述开发和选择适应于在特定温度和盐浓度下生长的微生物聚生体。一般地，包含具有降解氯化碳水化合物潜力的微生物的环境样品在处于合成培养基中的生物反应器中培养，所述合成培养基包含作为氯化碳水化合物源的废料流中通常存在的有机成分、溶剂和酸。例如，在一个实施方案中，氯化碳水化合物源是来自三氯蔗糖生产过程的废料流，其还包含甲醇、乙醇、磷酸、二甲胺HCl(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、和二甲基乙酰胺(DMAc)中的一种或多种。培养基的温度和盐浓度以逐步的方式逐渐升高。一般地，微生物首先适应特殊温度，然后在以所需温度下保持时适应特殊盐浓度。在温度或盐增加的每一步监测培养基的有机成分降解。当培养物能够在给定温度或盐浓度下降解培养基中的全部有机成分时，进一步增加温度或盐。重复该过程，直至达到最终所需的温度和盐浓度。适应过程的长度应该取决于温度、盐浓度、和能够降解培养基中的有机化合物的微生物浓度。 [0025] 然后将能够降解合成培养基中全部有机成分的培养物引入包含氯化碳水化合物的培养基，例如，废料流中，并监测降解氯化碳水化合物的能力，如实施例3中所述。包含氯化碳水化合物的培养基可以直接加入或与合成培养基混合，并以渐增的浓度逐渐引入。对于每种培养物，保持所选的温度和盐浓度。每种能够在特定温度和盐条件下降解一种或多种氯化碳水化合物的培养物形成聚生体。聚生体中存在的微生物的精确鉴定是任选的。利用实施例1-3中所述的方法，选择了8种能够降解氯化碳水化合物的微生物聚生体并将其保藏在NRRL。每种聚生体的保藏号和温度和盐条件列举在表1中。 [0026] [0027] 表1.在NRRL保藏的聚生体的特征 [0028] 为了生物降解氯化碳水化合物，包含这些化合物的培养基(例如废料流)用能够在该培养基中存在的温度和盐条件下消化氯化碳水化合物的微生物聚生体来接种。氯化碳水化合物可以包括，但不仅限于，氯化单糖、二糖、三糖、多糖或寡糖。所用聚生体可以针对其降解的氯化碳水化合物的类型来选择，或为了最优化特定温度或盐条件下的生物降解来选择。可以选择温育条件，以最优化特殊类型培养基中氯化碳水化合物的降解。 [0029] 微生物聚生体降解氯化碳水化合物，且优选适应于降解一种或多种氯化碳水化合物。优选地，微生物聚生体降解三氯蔗糖和/或至少一种或至少两种除三氯蔗糖以外的氯化碳水化合物。除三氯蔗糖以外的氯化碳水化合物包括二氯化二糖(优选选自4，1′-二氯半乳蔗糖；4，1′-二氯-3′，6′-脱水半乳蔗糖；4，6′-二氯半乳蔗糖；1′，6′-二氯蔗糖；和6，6′-二氯蔗糖))；三-氯化二糖(优选选自4，1′，6′-三氯蔗糖；4，6，6′-三氯半乳蔗糖；和6，1′，6′-三氯蔗糖)，和四-氯化二糖(优选选自4，1′，4′，6′-四氯塔格半乳蔗糖(tetrachlorotagatogalactosucrose)和4，6，1′，6′-四氯半乳蔗糖)。 [0030] 实施例 [0031] 1.选择在确定的盐和温度条件下生长的微生物聚生体 [0032] 桶式生物反应器由7.5加仑 塑料刻度量筒构建。空气通过水族气泡石递送至培养基。空气流(L/min)通过旋转流量计来控制。生物反应器用预热200瓦特IC钛水族加热器来加热，所述加热器受到温度控制器的数字控制。培养基pH由相连的用于直接控制酸泵的Mettler pH2100e控制器，使用H2SO4维持在7.0。培养基渗透使用固定在生物反应器每侧上的2个L形不锈钢管来获得，其中一个用于液体培养基进入且一个用于生物量返回。生物量通过含有XM-50或PM-100膜且与泵相连的空纤维盒，由渗透分离。 [0034] 最初的环境样品取自来自阿拉巴马州McIntosh的三氯蔗糖生产废水处理机构的池沉积物。该样品在由乙酸钠(7.05g/L)、甲酸钠(3.16g/L)、蔗糖(7.6g/L)、酵母提取物(0.01g/L)、二甲胺-HCl(0.272g/L)、二甲基甲酰胺、99％(0.25ml/L)、二甲基乙酰胺、99％(0.125g/L)、甲醇、99％(0.165ml/L)、乙醇、99％(0.04ml/L)、磷酸、85％(0.165ml/L)、和氢氧化铵、29％(0.225ml/L)组成的合成培养基中温育。培养基的pH用NaOH调节至7.0。对于10L生物反应器，5L该合成培养基用4L H2O来稀释，并将1L环境样品(池沉积物和池水)加入至生物反应器中。最初，生物反应器保持在27℃的温度。 [0035] 每24h监测培养基中有机盐、溶剂和蔗糖的降解。当连续三天所有培养基成分在约24h内消耗(降解)时，认为微生物是适应的。在该时间后，以逐步方式，经过一段时间，将温度从27℃升高至32℃，至37℃，至45℃，至50℃。在每一步，使微生物再次适应于在新温度下在24h内降解全部培养基成分。该过程持续直至达到所需温度。对于高于45℃的温度，需要甚至更逐渐地引入温度升高，在温度升高之间容许6周以上，从而维持生物降解。 [0036] 当使聚生体适应于所需温度时，合成培养基的浓度以10％的增量逐渐由50％增加至100％。盐(盐酸盐)浓度随着增加合成培养基的浓度而增加，100％合成培养基包含约4.5％盐酸盐。测量每批培养基中的盐酸盐水平，并用NaCl调节，以生产包含1，2，3，或4.5％盐酸盐的培养基。该培养基中有机成分的降解如下监测，并容许微生物适应于每种新的盐酸盐和合成培养基浓度。聚生体P-4的盐和温度斜坡曲线的实例显示在图1中。 [0037] 聚生体对最终所需温度和盐浓度的完全适应需要约1(低温或低盐)至约6(高温和高盐)个月。 [0038] 2.选择降解培养基中有机物的微生物聚生体 [0039] 贯穿实施例1中所述的过程，针对培养基中有机成分的降解，一般通过液相色谱法或气相色谱法来监测生物反应器培养物。选择能够在7-10天内以所需温度和盐浓度始终降解合成培养基中的全部有机成分的生物反应器培养物，以适应于三氯蔗糖废料流。 [0040] 3.选择降解氯化碳水化合物的微生物聚生体 [0041] 由实施例2中所述的过程选择的生物反应器首先暴露于三氯蔗糖废料流，其中氯化碳水化合物已经化学脱氯，尽管这步对适应程序不是必须的。脱氯由用NaOH将废料流样品pH升高至12，煮沸该溶液1h，然后用HCl将pH降低至7.5-8.0组成。将包含脱氯碳水化合物的溶液以10％的增量逐渐引入至合成培养基中，并容许微生物适应每次增加。当微生物展示完全降解培养基中的所有有机成分的能力时，增加脱氯碳水化合物培养基的百分比。 [0042] 在100％脱氯碳水化合物溶液中稳定7-10天后，对聚生体供应包含氯化碳水化合物的粗三氯蔗糖废料流。加入废料流成分以获得约1500ppm处于脱氯碳水化合物溶液中的氯化碳水化合物。对培养物提供源自三氯蔗糖生产过程中不同步骤的2个废料流之一。生物反应器培养基中存在的氯化碳水化合物，在提供三氯蔗糖废料流(时间零)之前(基线)和之后，在增加用微生物聚生体温育三氯蔗糖废料流的时间的条件下，通过HPLC分析来测量。包含氯化碳水化合物的三氯蔗糖废料流成分仅向每个生物反应器溶液添加一次。每日测量生物反应器溶液中存在的氯化碳水化合物水平。 [0043] 选择8种展示氯化碳水化合物生物降解的生物反应器培养物作为在NRRL保藏的聚生体。这些微生物聚生体可以保持在废料流培养基中，或可以保存在包含15％甘油的-80℃残余培养基中。这8种聚生体的温度和盐酸盐参数显示在表1中。图2示范由聚生体P-3和P-4(图2A)和聚生体P-5，P-6，和P-7(图2B)生物降解两个废料流中的总氯化碳水化合物的进程。 [0044] 4.使用聚生体降解三氯蔗糖生产废料流中的氯化碳水化合物 [0045] 聚生体培养物中的氯化碳水化合物在暴露于废料流后之前(基线)和之后增加时间时的组成显示在表2和3中。对于聚生体P3和P4，废料流1中约82％氯化碳水化合物和废料流2中约47-53％氯化碳水化合物经过7天降解。 [0046] 表2和3中的二-氯化二糖包括，但不仅限于，4，1’-二氯半乳蔗糖；4，1’-二氯-3′，6′-脱水半乳蔗糖，4，6′-二氯半乳蔗糖；1’，6′-二氯蔗糖；和6，6′-二氯蔗糖。三-氯化二糖包括，但不仅限于，4，1’，6′-三氯蔗糖；4，1′，6′-三氯半乳蔗糖；4，6，6′-三氯半乳蔗糖；和6，1’，6′-三氯蔗糖。四-氯化二糖包括，但不仅限于，4，1′， 4′，6′-四氯塔格半乳蔗糖和4，6，1’，6′-四氯半乳蔗糖。还相信五-氯化碳水化合物被降解。第二废料流含有也被聚生体降解的另外的化合物。这些化合物尚未确定且可以包括另外的氯化碳水化合物(数据未显示)。 [0047] 如图3中所示，微生物聚生体还降解添加至合成培养基中的4-氯半乳糖，这证明它们也能够降解一-氯化单糖。 [0048] 表2.废料流1中氯化碳水化合物的生物降解。数值代表每类氯化碳水化合物的总量(ppm)。 [0049] 样品名称 二-氯化碳 三-氯化碳 四-氯化碳 总共 [0050] 水化合物 水化合物 水化合物 [0051] P-3 基线 20 340 0 361 [0052] P-3 时间0 918 446 270 1634 [0053] P-3 第1天 832 434 264 1530 [0054] P-3 第2天 702 397 257 1356 [0055] P-3 第3天 686 380 272 1337 [0056] P-3 第4天 536 279 232 1048 [0057] P-3 第5天 468 235 191 894 [0058] P-3 第6天 401 160 195 757 [0059] P-3 第7天 89 29 181 299 [0060] P-4 基线 39 0 0 39 [0061] P-4 时间0 977 194 294 1466 [0062] P-4 第1天 693 143 295 1131 [0063] P-4 第2天 497 118 288 903 [0064] P-4 第3天 365 79 274 718 [0065] P-4 第4天 294 59 281 634 [0066] P-4 第5天 204 41 230 475 [0067] P-4 第6天 151 33 233 417 [0068] P-4 第7天 43 36 191 270 [0069] 表3.废料流2中氯化碳水化合物的生物降解。数值代表每类氯化碳水化合物的总量(ppm)。 [0070] 样品名称 二-氯化碳 三-氯化碳 四-氯化碳 总共 [0071] 水化合物 水化合物 水化合物 [0072] P-3 基线 9 0 119 128 [0073] P-3 时间0 133 1020 100 1254 [0074] P-3 第1天 109 1020 100 1230 [0075] P-3 第2天 96 921 91 1108 [0076] P-3 第3天 65 809 88 963 [0077] P-3 第4天 53 721 89 862 [0078] P-3 第5天 41 658 83 781 [0079] P-3 第6天 26 551 87 664 [0080] P-4 基线 31 0 116 147 [0081] P-4 时间0 154 1127 102 1383 [0082] P-4 第1天 114 1096 81 1291 [0083] P-4 第2天 82 955 89 1125 [0084] P-4 第3天 35 888 81 1004 [0085] P-4 第4天 18 768 79 865 [0086] P-4 第5天 14 658 64 736 [0087] P-4 第6天 5 566 74 645 [0088] 尽管本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是应该理解所述实施方案仅作为举例提供。在不偏离本发明精神的条件下，本领域中技术人员应该想到许多变化、改变和替换。因此，意指所附权利要求包括全部这些变化作为属于本发明的精神和范围。 |
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