発明の詳細な説明 〔本発明の分野〕
本発明は、気道のための保護具の生物因子に対する防御を評価するための試験方法に関し、異なる機構が保護具の実際の使用を再現するために用いられることを特徴としている。 〔背景技術〕
気道保護具の効果を評価するため、特に、内部の密封の欠落（European Standard EN 13274-1）及び呼吸妨害（European Standard EN 13274-3）を算出するための多くの試験方法が存在する。 製薬産業又は医療目的の装置において、ろ過膜を用いた物質ろ過のウイルス除去効果を、実験室において算出するための方法も多く存在していることが公知である。 このような方法の例として、“Efficacy of a pleated hydrophobic filter as a barrier to Mycobacterium Tuberculosis transmission within breathing systems”（S.Speighら、-Centre for Applied Microbiology & Research -Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK）を引用する。 しかしながら、これらの全ての方法は、気道保護具に適用することができない。 事実、現在まで、呼吸の模倣及びユーザーの顔における実際の使用の間に、個人用保護具において、直接微生物及びウイルスを除去する効果を試験することができなかった。 微生物及びウイルスのような生物因子に対する個人用保護具の防御性能（全面マスク、半面マスク、ろ過面マスク等）を算出するために、ほこり及び／又は非ウイルス基材から作られた異なる種類の化学煙霧剤を用いた分析方法が、よく用いられている。 しかしながら、これらの試験方法の全ては、微生物因子の挙動も、気道の保護具である障壁媒体へのその浸透特性も描写しない。 〔発明の説明〕
本発明は、気道のための個人用保護具（ＰＰＥ）における生物因子に対する防御を評価するための新規な試験方法に関し、ＰＰＥの使用を再現するために、シェフィールドヘッド（Sheffield's head）及び自己呼吸器により呼吸を模倣するという、異なる機構を用いることを特徴としている。 本発明の特定の実施形態は、ＰＰＥの生物因子に対する防御性能を評価するためのシェフィールドヘッド及び自己呼吸器の使用と同様に、ＰＰＥの生物因子に対する防御性能を評価するために用いられる全ての装置である。 図１は、使用する装置の仕組みの概要を説明する。
この装置は、
ａ）ウイルス及び／又は微生物の煙霧剤生成部；
ｂ）シェフィールドヘッドを含む試験槽；
ｃ）呼吸を模倣し、吸気と呼気との頻度を調節する呼吸器；
ｄ）ウイルス及び／又は微生物濃度を決定するために、異なる地点で回収された空気のサンプルを吹き上げ部に運搬する吸引機構；
からなる。 この方法は、主に、生成部（ａ）の手段によって試験微生物の煙霧剤を生成すること、及びこの煙霧剤を試験槽（ｂ）に送ることからなる。 この試験槽の内部には、ＰＰＥが設置されたシェフィールドヘッドがある。 試験槽内の空気は、自己呼吸器を通してシェフィールドヘッドによって吸い込まれる。 シェフィールドヘッドの改良を、口−鼻領域を通した空気の吸い込みと、送られた後側から自己呼吸器への吐き出しとを可能にするために行う。 シェフィールドヘッドに直接設けられたＰＰＥのおかげで、ＰＰＥの防御効果を調べるための試験を実行している間、ＰＰＥの物理的／機械的及び人間工学的な特徴に関連した周辺特性（ＰＰＥにとって生物因子に対する防御用途に適合するために不可欠な特性）もまた考慮される。 すなわち、ＰＰＥの着用不良に影響する密封の欠落に起因する（それゆえに、そのろ過材料のろ過特性に依存しない）汚染物質の考えられる経路はもまた、評価される。 ＰＰＥのウイルス又は微生物の保有を算出するために、吸引機構（ｄ）を通して回収され、いくつかの吹き上げ部に送られた空気において、２つの試験分析を行う。 特に、試験槽の内側の空気中（ホワイトテスト（White test）、シェフィールドヘッドの右眼に対応する位置からの回収）及びＰＰＥを介して通過した空気中（サンプルテスト、口に対応する、ＰＰＥの下からの回収）の微生物濃度が算出される。 ２つの別々のチューブを介して吹き上げ部を通して、試験槽（ホワイトテスト）及びＰＰＥを横断する空気サンプル（サンプルテスト）における分散した生物因子について、ホワイトテストとサンプルテストの両方を、特定の期間、適切な構成物及び適当な酸性／アルカリ性（ｐＨ）の両方を有する溶液中において、同時に行う。 ２つの吹き上げ部の両方は、一定の流れで、吸引機構に連結されている。 試験の終わりに、吹き上げ部に収容された溶液を、適切な殺菌した容器に移した後、回収した微生物を計数した。 ＰＰＥによって妨害された微生物の比率を以下のように決定した。
式中、
Ｎｖは試験槽内部の煙霧剤中の試験微生物の濃度であり（ホワイトテスト）、Ｎａはろ過面マスクの下の試験微生物の濃度である（サンプルテスト）。 図２〜６は、処理フロー及びその構成要素の詳細について示す。 煙霧剤生成部（図２）は、
−蠕動ポンプ（１）；
−噴霧器（２）；
−噴霧ライン（３）；
−乾燥チューブ（４）；
−フローチューブ（５）；
から構成される。 微生物の量が判明している懸濁液を、蠕動ポンプ（１）を介して圧縮空気のある噴霧器（２）に入れ、噴霧ライン（３）を介して通過させて増やし、煙霧剤を生成する。 この煙霧剤を、一旦乾燥チューブ（４）に入れ、フローライン（５）から別々に来る乾燥した圧縮空気と混合する。 乾燥チューブに入った微生物煙霧剤の小滴は即座に蒸発し、一定の流れで試験槽に移される。 試験槽（図３）は主に、
−密閉された容器（６）；
−導管ラインを有し、上記容器内に置かれた１つのシェフィールドヘッド（７）；
から組み立てられる。 容器（６）の形及び容積は、シェフィールドヘッドを設置することを許容し、容器は、気密性を保証し得る素材から形成されており、この目的のために、壁はパッキンで密閉され、これらの壁の一つは本方法によって要求される動作が可能なように開かれることができる。 シェフィールドヘッド（７）は密閉された容器（６）内に設置され、自己呼吸器に連結された導管と、試験槽に収容された空気サンプル及びＰＰＥを介して通過する空気を回収のための導管とを備えている。 密閉された容器は、実験机の大きさに一致し、折り畳み開閉壁を有する平行６面体として成形される。 また、この密閉された容器は、典型的には、レキサン（Lexan）（登録商標）又は同様の材料を用いて形成される。 シェフィールドヘッドは、例えば、３つの同心管を有する付属品を備えている。 この同心管のうちの２つは、自動呼吸器に連結されており、３つ目の１つの同心管は、ヘッドの口鼻レベルにおいて、ＰＰＥを介して通過する空気を回収する。 ４つ目のさらに１つの同心管は、右目レベルに位置し、試験槽に収容された空気を回収する。 呼吸器（図４）は、ポンプ、及び吸気／呼気速度を調節する変換器で構成されている。 呼吸頻度は、標準的なヒトの呼吸につき調節することが可能であり、典型的には、１サイクル当たりの空気量の範囲１．５〜３．５リットルにおいて、１分当たり２０〜４０サイクルが包含される。 吸引機構（図５）は、主に、
−吸引ポンプ（８）；
−フロー調節部（９）；
−ホワイトテスト吸入チューブ（１０）；
−ホワイトテスト吹き上げ部（１１）；
−サンプルテスト吸入チューブ（１２）；
−サンプルテスト吹き上げ部（１３）
により構成される。 この機構は、微生物を定量するために、分散した微生物を試験槽に吸引する。 吸引は吸引ポンプ（８）を介して生じさせ、フロー調節部（９）を介して調節及び制御される一定の流れにおける回収を可能にする。 ２つの異なるラインを通して、ｐＨが制御された適切な溶液中に分散した微生物を吹き上げることによって、ホワイトテスト及びサンプルテストの両方を同時に行う。 ウイルス因子を回収するために用いた分散溶液は、典型的には、ｐＨ６．８の溶液である一方で、微生物因子のための溶液のｐＨは、典型的には、中性である。 試験槽内の分散溶液（ホワイトテスト）は、シェフィールドヘッドの右眼レベルにおいて、吸入チューブ（１０）を通って回収され、消毒したガラスの吹き上げ部（１１）中に吹き上げられる。 ＰＰＥを通過する空気サンプル（サンプルテスト）は、シェフィールドヘッドの口レベルにおいて、吸入チューブ（１２）を通って回収され、消毒したガラスの吹き上げ部（１３）中に吹き上げられる。 試験の最後に、吹き上げ部の接続が断たれ、溶液が殺菌した容器中に運ばれ、溶液中の微生物の計測が終了する。 本発明の特定の実施形態は、生物因子に対するＰＰＥの防御効果を調査するために用いられる装置であり、ウイルス及び／又は微生物煙霧剤生成部、シェフィールドヘッドを備えた試験槽、吸気と呼気との頻度を調節する呼吸器、並びにウイルス及び／又は微生物濃度を決定するために、異なる地点で回収された空気のサンプルを吹き上げ部に運搬する吸引機構を備え、シェフィールドヘッドには、口−鼻領域を通って空気を吸い込む及び吐き出すことを可能にするための、自己呼吸器に連結された導管と、試験槽に収容された空気及びＰＰＥを通過する空気の両方を回収するための導管とが備え付けられていることを特徴としている。 本発明の好ましい実施形態は、ＰＰＥの生物因子に対する防御効果を放火する装置であり、レキサンにより形成された試験槽内に設置されたシェフィールドヘッドには、３つの同心管を有する付属品が備え付けられている。 この同心管のうちの２つは、自動呼吸器に連結されており、３つ目の１つの同心管は、ヘッドの口鼻レベルにおいて、ＰＰＥを介して通過する空気を回収する。 この付属品は、さらにもう１つの導管である４つ目の導管を有しており、４つ目の導管は、右目レベルに位置し、試験槽に収容された空気を回収する。 この装置において、呼吸器は、ピストンポンプ、及び吸気／呼気速度を調節する変換器により構成されている。 本発明のさらに特定の実施形態はまた、上述したように修飾したシェフィールドヘッドの使用、及びＰＰＥの生物因子に対する防御効果を評価するために導管を通るように形成された自己呼吸器の使用である。 この方法は、特に微生物及びウイルスのような生物因子に対する防御を決定するために用いることができる。 試験に用いる懸濁液の準備及び微生物の計測は、これらの使用のために知られている何れの工程によっても行うことが可能であり、この工程は、典型的にはウイルス及びバクテリアによって異なる。 この発明の最良の形態を説明するために、ウイルス及び微生物因子をそれぞれ用いた方法の２つの実施例を以下に示す。 〔実施例１：ウイルス因子方法〕
ここに記載の例において、試験に用いられる微生物は、バクテリオファージＭＳ−２（National Collection of Industrial Bacteria:NCIMB10108）であり、多角性のウイルスの大きさが０．０２μｍである。 試験に用いる懸濁液中の活性ＭＳ−２バクテリオファージの数、及び処理後に保存される活性ＭＳ−２バクテリオファージの数は、寒天層における分散方法を満たすように決定される。 計測方法は、約０．５ｍｌの成長が止まった（インキュベーションから４〜６時間）大腸菌ＮＣＩＭＢ９４８１（約１０ ８ ＣＦＵ／ｍｌ）を含む２．５ｍｌのトリプトン大豆寒天と共に、ＭＳ−２バクテリオファージ及びその混合物を含む、ｐＨ６．８の“緩衝液相（Buffer Phase）”の０．１ｍｌ又は１ｍｌの範囲での等分を引くことからなる。 第２の事例においては、約１．０ｍｌの成長が止まった（インキュベーションから４〜６時間）大腸菌ＮＣＩＭＢ９４８１（約１０ ８ ＣＦＵ／ｍｌ）を含む５ｍｌのトリプトン大豆寒天が含まれる。 寒天化した柔らかい土台は、それゆえに、即座にトリプトン大豆寒天プレート上に流し込まれ、２重の層が形成される。 ３７℃で２４時間のインキュベーションの後、バクテリオファージの目に見える溶菌斑を測定した。 目に見える溶解した溶菌斑を示すプレート（ｐｆｕ：溶菌斑形成ユニット（plaque forming unit））を選択し、対応する希釈液で増加させた。 このようにして決定したｐｆｕを、緩衝溶液中におけるＭＳ−２バクテリオファージの数によって評価する。 緩衝液相内の当所の懸濁液を希釈することによって、調査に用いる適定量が判明した懸濁液を最初に用意する。 その後希釈液を準備し、“二重層”方法を行って濃度を調べる。 計測が終了してすぐに、密集溶解示す、最も濃度の高い希釈液のプレートが選択されるべきである。 緩衝液相の比率を、殺菌したスパチュラを用いてこれらのプレートに加え、寒天を壊し、緩衝液と混合する。 殺菌した容器の中に、寒天を含む緩衝液を静かに移して保管し、寒天が壊れるまで力強く振動させる。 結果物を回転させると、寒天の残余物が沈殿を構成する。 浮遊物を取り出した後、膜を用いてろ過し、等分した部分を４℃で保管した。 このようにして準備した適定量が判明している懸濁液の定義された量を、煙霧剤生成部に導入する。 ウイルス懸濁液を、ポンプ（１）によって生成された流れを通して、噴霧器（２）に押し込む。 次に煙霧剤生成部は、煙霧剤スプレー（３）の圧力及びライン（５）の乾燥の両方を作動する。 試験槽が均等に充填されるのを待った後、槽が充填してすぐに、呼吸器及び吸引機構の吸引ポンプを作動させる。 緩衝相に吹き出す分散物を回収する間、ホワイトテスト及びサンプルテストの両方を２つの分離した導管を通して同時に行う。 試験の最後に、両方の吹き上げ部の接続を断ち、溶液を殺菌した適切な容器に移し、この溶液を即座に４℃で保管して、いずれの微生物の成長も抑制する。 吹き上げ試料採取部を通して収集した、生きたＭＳ−２バクテリオファージを、上述した二重層方法を用いて計測した。 〔実施例２：微生物因子方法〕
微生物因子に対する防御効果を、ウイルス因子に対するものと同様の手順を行って決定したが、試験する微生物は、ｐＨ７．０の希釈液における吹き上げによって収集した。 試験に用いた微生物は、ブレバンジモナス ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）（ＡＴＣＣ １９１４６）であり、微生物の大きさは０．３μｍである。 微生物懸濁液を以下のように準備した。 培養中のいくつかを、トリプトンＳｏｉａ寒天プレート上に絡ませることによって、ストック培地から準備し、３０〜３５℃で１８〜２４時間保管した。 その後、さらに培養中のものを最初のものから得て準備し、同様に３０〜３５℃で１８〜２４時間保管した。 第２の培養中のものを作業培地とする。 作業培地を回収し、ｂｅｕｔｅのｐＨ７．０の希釈液中においた。 ｂｅｕｔｅを機械の撹拌器を用いて撹拌し、懸濁液を取り出して試験チューブに入れた。 懸濁液中の細胞数は、希釈液を用いて１×１０ ７ ＣＦＵ／ｍｌから１×１０ １０ ＣＦＵ／ｍｌの間に到達させ、ユニット量をＭｃＦａｒｌａｎｄインデックスにより予測する必要がある。 その後、
微生物懸濁液の計測を行った。 懸濁液を１日間、２〜８℃において冷蔵庫内に保管する必要がある。 下流において試験及び収集された微生物懸濁液の計測を、以下のように行った。 各希釈液のサンプル対を混合して取り出し、サンプルをペトリプレートに運んだ。 液体としてのＴＳＡの決まった量を添加して４５℃で二重釜内に保存し、プレートをゆっくり振動させた。 プレートを３０〜３５℃で２４時間インキュベートする。 各プレートのユニット数を計測した後、プレートをさらに２４時間インキュベートする。 よく分離したもの以外の、各プレート成長したユニット数を再び計測する。 各サンプルの最も多いユニット数を決定した。 試験懸濁液のＣＦＵ／ｍｌの数を算出した。 上述した方法の例は、本発明をよりよい説明の目的のみ有し、いずれの限定も意図しない。 例えば、同様の大きさ及び微生物特性の微生物を、同様に使用することが可能であり、さらに代替の試験懸濁液調整物、異なる時間、並びに収集方法及び異なる計測方法も使用することが可能である。 本発明の方法は、例えば、全面マスク、ろ過面マスク、使い捨てのカップ型マスク、又は平たく折り畳まれるろ過面マスク、フィルターのような、気道のための全てのＰＰＥにおける、生物因子に対する効果を評価するために用いることができる。 例えば、実施例１の手順は、ＷＯ２００５／０７７２１４Ａ１特許に記載されたような、平たく折り畳まれるろ過面マスクを計測するために用いられている。 ＷＯ２００５／０７７２１４Ａ１特許は、酢酸ビニール樹脂によって互いに結合したホウケイ酸塩マイクロガラス繊維を備えたろ過層、強いセルロースを基礎とする基材によって支持された繊維マトリックス、及びシリコンを基礎とするコーティングによって処置された構造に特徴を有している。 結果を以下に示す。
本発明の方法の目的は、湯量実験室規範（ＧＬＰ）ヘッドラインに従って正当であると確認されている。 〔方法の有効性〕
本方法の有効性試験をは、試験機構の効率（微生物懸濁液の緩衝液中への分配の均一性、試験実行中の微生物の有効性、全ての方法の精確さ）、及び微生物因子計測の分析効率（再現性、中間体の精度、精密さ）の両方を考慮した。 有効性試験を、ＭＳ−２バクテリオファージを用いたウイルス因子方法及びブレバンジモナス ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）を用いた微生物因子方法の両方を考慮して行っている。 微生物懸濁液計測の効率を最初に調べた。 微生物懸濁液の濃度を、適切な計算方法によって計測した。 各希釈液の適定量を何度も調査し、試験を数回繰り返している。 結果物を、分析結果の再現性、すなわち精度を計測するために用いており、同質のサンプル懸濁液の計測を繰り返し調べている。 各希釈液の選択のために、平均及び標準偏差を計測した。 その後、変化率パーセンテージ（ＣＶ％）を計測し、測定結果の標準偏差と平均との間のパーセンテージ率から得た。 ＣＶ％＝シグマ／Ｙ＊１００
ここでシグマは標準偏差であり、Ｙは評価平均である。 異なる希釈液から得られたＣＶ値は、ウイルス及び微生物の両方の実験において１５％以下であり、正しい計測再現性を示した。 上述した６つの試験で得られた結果を用いて、方法の精度を調査している。 すなわち、実験で得られた値が理論上知られている粗いからどのように異なるかを調査している。 評価の基準は、実験により得られたデータ及び理論上知られたデータである再現％に基づいている。 再現％＝Ｎｓ／Ｎ＊１００
ここでＮはウイルス懸濁液の理論上知られたデータ（ｐｆｕ／ｍｌ）であり、Ｎｓはウイルス懸濁液の実験により得られたデータ（ｐｆｕ／ｍｌ）である。 １２の試験において得られた再現値％の全てから、ウイルス及び微生物の両方の場合において、７０〜１３０％の範囲の再現値％を含んでいることが判明した。 ウイルスを用いて行った試験及び微生物を用いた試験の両方において、再現％の平均値は、８０〜１２０％の範囲であった。 最後に、再現性を計測するための試験を、２つの異なる工程によって２日の異なる日に行った。 それゆえに、分析結果の中間体の精度を同様に計測し、日及び異なる人々に依存する精度として得ることができる。 ２日の異なる日に２つの異なる工程によって異なる希釈液から得られたＣＶ値は、ウイルス及び微生物の両方の場合において１５％以下だった。 この結果は、よい中間体精度を示している。 試験機構の効率もまた調べた。 作業培地を、方法の説明においてすでに示したように準備し、定義された量の微生物懸濁液と共に噴霧器に与えた。 煙霧剤生成部を作動し、試験槽を均一に満たすように、時間をおいた。 その後、吸引機構の吸引ポンプを作動し、吸引ポンプ及び煙霧剤生成部の両方を停止させた。 両方の吹き上げ部と回路との接続を断ち、溶液を４℃に保たれた殺菌された容器中に移し、いずれの微生物の成長も抑制した。 いくつかの計測試験を、微生物の種類に適した方法を用いて、緩衝溶液において要求される希釈液と共に行った。 試験を、２日の異なる作業日において、何度も行った。 ２つの吹き上げ部（ホワイトテスト及びサンプルテスト）中における微生物懸濁液の分散の均一さを、槽内の１つの回収地点において同様に計測した。 各試験のために、２つの吹き上げ部において収集した微生物の比率間の相違を、以下の式を用いて算出した。
ここで、Ｎｖは、吹き上げ部１１において計測された微生物数（ｐｆｕ／ｍｌ）であり、Ｎａは、吹き上げ部１３において計測された微生物数（ｐｆｕ／ｍｌ）である。 ウイルス及び微生物の両方の場合において、５％の範囲外に分散値の差はなかった。 それゆえに、ことなる地点における微生物の分散は適合することが判明した。 方法の全ての精度を、分析結果の再現性に関して評価している。 両方の吹き上げ部からのこれらの以前の試験結果のデータを用いて、ＣＶ％を以下の式によって算出した。 ＣＶ％＝シグマ／Ｙ＊１００
ここで、シグマは標準偏差を示しており、Ｙはｎ個のサンプルの平均値を示している。 ２日間に得られたＣＶ％は、ウイルス及び微生物の両方の場合において２５％よりも大きく、このことは、分析結果の適合した再現性を示しており、それゆえに方法の全ての精度の適合を示している。 最後に、試験実行中の微生物の生存可能性、すなわち、少なくとも３０分間生存し得る微生物の可能性を決定した。 この可能性は、ＰＰＥの防御効率の分析の観点の下、概要をまとめるのに十分な濃度に、試験槽内を維持することを可能にするものである。 判明した適定量を有する１×１０ ７ 〜１×１０ ８の間の微生物懸濁液の測定を、その準備の後すぐに行った（Ｔ ０ ）。 同じ懸濁液の計測を、準備後１５分、３０分、及び４５分で行った（Ｔ １５ 、Ｔ ３０ 、Ｔ ４５ ）。 その後、Ｔ １５ 、Ｔ ３０及びＴ ４５で得られた計測値を、Ｔ ０のものと比較した。 試験を３回繰り返した。 ウイルス及び微生物の両方の場合において、Ｔ１５、Ｔ３０及びＴ４５において減少した適定量は、Ｔ ０におけるウイルス適定量と比較して、２対数よりも小さかった。 それゆえに、微生物は調査中常に生存可能である。 本発明の特定の実施形態を、前述の記載において説明しているが、いずれの単純な変更及び再設計も、請求項で定義した本発明のもたらす概念及び本質から外れるものではないことが、当業者によって理解されるだろう。 |
