呼吸道防护设备功效的评估测试方法很多，特别是测定内部密封泄漏率 (欧洲标准EN 13274-1)和呼吸能力(欧洲标准EN13274-3)的方法更是不胜 枚举。
众所周知，还有许多方法也可用来测算过滤材料的去除病毒功效，这些 过滤材料在实验室、制药工业或医疗设备中均用作过滤膜。所述方法均使用 无毒的气雾攻击法和噬菌体。
“折叠式疏水性过滤器作为呼吸系统内结核分支杆菌传播的屏障的效 能”(S.Speigh等人：应用微生物学与研究中心，英国威尔特郡SP40JG索 尔兹伯里波登当)的文章中就曾引用了上述方法的一个示例。
然而，所有这些方法都从未应用于呼吸道防护设备；实际上，迄今为止， 还不能在模拟呼吸的同时直接在个人防护设备上测试细菌和病毒的去除效 能，及其在使用者面部的实际应用。
为了测算个人防护设备(如全面罩、半面罩、过滤面罩等的过滤器)对 诸如细菌和病毒等生物制剂的防护性能，一直以来人们使用的分析方法有粉 尘和/或由非重要基质组成的各种不同化学气溶胶。
但是，所有这些测试方法都既不能反映微生物制剂的特征，也不能反映 其穿过屏障介质—即呼吸道防护设备—的特性。

本发明涉及一种呼吸道个人防护设备(PPE)对生物制剂防护性能的新的 评估测试方法，其特征在于，使用各种不同机器设备通过谢菲尔德头部和自 呼吸器来模拟呼吸以再现个人防护设备(PPE)的用途。
本发明的一个具体实施例是评估个人防护设备(PPE)对生物制剂的防护 特性所使用的整个设备，以及为评估个人防护设备(PPE)对生物制剂的防护特 性而使用的谢菲尔德头部和自呼吸器。
图1概述了所使用的这种装置的示意图。
该装置包括：
a)病毒和/或细菌气溶胶发生器
b)装有谢菲尔德头部的测试箱
c)呼吸器，可模拟呼吸并可调整吸气和呼气频率
d)吸入系统，用来将从不同部位提取的空气试样输送到起泡器以测定病 毒和/或细菌浓度。
这个方法主要是指，通过产生器(a)产生试验微生物的气溶胶并将所述气 溶胶送到试验箱(b)。
在试验箱内，设有一个戴着个人防护设备(PPE)的谢菲尔德头部。
试验箱内的空气由谢菲尔德头部通过自呼吸器(c)吸入。
谢菲尔德头部进行了改动，从而可以通过口-鼻部位吸入空气，并从头的 后部排出后送到自呼吸器内。
由于个人防护设备(PPE)直接置放在谢菲尔德头部，在检查个人防护设备 (PPE)防护功效的测试期间，还考虑了与个人防护设备(PPE)的物理/机械和人 机工程学特性相关的环境特性(这些对于个人防护设备是否适合防护生物制 剂是至关重要的)。
也就是说，由于个人防护设备严重磨损而出现密封泄漏(以及因此而不 能依赖过滤材料本身的过滤性能)，导致污染物可能通过的情况也都可进行 评估。
为了测定个人防护设备(PPE)的病毒或细菌保留情况，对经由吸入系统(d) 提取的并送到某些起泡器的空气进行两种试验分析。
特别是，测算了试验箱内空气中微生物的浓度(白试验(white test)， 即与谢菲尔德(Sheffield’s)头部右眼对应位置提取的空气)，以及流经 个人防护设备(PPE)的空气中微生物的浓度(抽样试验，即从对应于口部的 个人防护设备下方提取的空气)。
白试验和抽样试验可同时进行，即在带有相应成份和适当酸度/碱度(pH) 的溶液内，经由两个独立试管，在特定时间内，对试验箱内生物制剂的分散 体(白试验)和流过个人防护设备(PPE)的空气试样(抽样试验)进行起泡试 验。
两个起泡器以恒定流量连接到吸入系统上。
试验结束时，起泡器内的溶液被输送到相应的无菌容器内，然后对采集 到的微生物进行计数。
个人防护设备(PPE)对微生物的阻塞(blocked)率可按如下公式测定：

式中：
Nv＝试验箱内气溶胶中试验微生物的浓度(白试验)
Na＝过滤面罩下方试验微生物的浓度(抽样试验)
图2到图6给出了处理流程和其各个部件的详细情况。
气溶胶发生器(图2)由如下部分组成：
-蠕动泵(1)
-雾化器(nebuliser)(2)
-喷雾管路(nebulisation line)(3)
-干燥管(4)
-测流量管(flow tube)(5)
通过蠕动泵(1)将含有已知数量的微生物的悬液输送给雾化器(2)，在这 儿，流过喷雾管路(3)的压缩空气生成一种气溶胶。
这种气溶胶一旦输入到干燥管(4)内便与干的压缩空气相混合，后者由测 流量管(5)单独输入。
进入到干燥管的微生物气溶胶粒子迅速蒸发并以恒定流量进入到试验 箱。
试验箱(图3)主要由如下部分组成：
-封闭地(hermetically)密封的容器(6)
-一个谢菲尔德头部(7)，与管路一起布置在容器内
容器(6)的形状和尺寸应允许谢菲尔德头部得以安装，该容器采用能够实 现气密的材料制成；为此，容器四壁采用垫片密封，其中一个壁可以打开以 便实施该方法所要求的动作。
谢菲尔德头部(7)置放在密封容器(6)内，其带有连接到自呼吸器的管路 和提取试验箱内空气试样和流过个人防护设备(PPE)的空气的管路。
密封容器的形状为平行六面体，与实验室工作台的尺寸相符合，带有可 折叠的打开/关闭壁板，该容器一般采用“莱克桑”(Lexan)(热塑聚碳酸酯) 和类似材料制成。
例如，谢菲尔德头部可以带有一个附件，该附件又带有三个同心管路， 其中两个管路联接到自呼吸器上，而第三个管路则在谢菲尔德头部的口-鼻水 平位置处收集流过个人防护设备(PPE)的空气；还有一个管路—即第四个管 路—位于右眼水平位置，用来提取试验箱内的空气。
呼吸器(图4)由一个泵和一个变换器组成，后者用来调整吸气/呼气速 度；呼吸频率可按正常人的呼吸速率来调节，一般在每分钟20到40次循环 之间，空气容量范围为每个循环1.5到3.5升之间。
吸入系统(图5)主要包括：
-真空泵(8)
-流量调节器(9)
-白试验吸入管(10)
-白试验起泡器(11)
-抽样试验吸入管(12)
-抽样试验起泡器(13)
该系统将微生物的分散体吸入到试验箱内，以便对其进行量化计数。
吸收动作是靠真空泵(8)来进行的，真空泵可以以恒定流量来提取液体， 而恒定流量是由流量调节器(9)来调节和控制的。
白试验和抽样试验通过对适当成分和pH控制的液体内的微生物分散体 进行起泡而经由两个不同管路同步进行。用来收集病毒制剂的分散体一般都 是pH6.8的溶液，而用于细菌制剂的分散体则pH一般为中性。
在与谢菲尔德头部右眼水平位置通过吸入管(10)提取试验箱内的分散 体(白试验)，该分散体起泡后进入到无菌玻璃起泡器(11)内。
流经个人防护设备(PPE)的空气试样(抽样试验)是通过吸入管(12)在谢 菲尔德头部嘴的水平位置处提取的，该空气试样起泡后进入到无菌玻璃起泡 器(13)内。
试验结束时，断开起泡器的连接，将溶液输入到无菌容器内，并对溶液 内的微生物进行计数。
本发明的一个具体实施例是指一种装置，该装置用来检查个人防护设备 (PPE)对生物制剂的防护效能，其特征在于，其包括一个病毒和/或细菌气溶 胶发生器、一个装有谢菲尔德头部的试验箱、一个模拟呼吸并调节吸气和呼 气频率的呼吸器、一个将各处提取的空气试样送到起泡器进行病毒和/或细菌 浓度测定的吸入系统，所述谢菲尔德头部带有接到自呼吸器上的管路，以便 进行经由口-鼻部位吸入和呼出空气，还带有空气提取管路，用来提取试验箱 内空气和流经个人防护设备(PPE)的空气。
本发明的一个优选实施例是指一种装置，该装置可评估个人防护设备 (PPE)试验箱内，所述箱内装有一个附件，该附件带有三个同心管，其中两个 管路联接到自呼吸器上，而第三个管路则在谢菲尔德头部的口-鼻水平位置收 集流过个人防护设备(PPE)的空气；还有一个管路—即第四个管路—位于右 眼水平位置，用来提取试验箱内的空气，所述呼吸器是由活塞泵和变换器组 成，后者用来调节吸入/呼出速度。
本发明的另一个具体实施例还是使用谢菲尔德头部，所述头部进行了如 上所述改动，同时还包括使用自呼吸器，后者包括一个泵，用来评估个人防 护设备(PPE)对生物制剂的防护效能。
这个方法可以用来测定对生物制剂的防护性，特别是对细菌和病毒。
试验悬浮液的制备和微生物的计数可以采用这些用途的任何已知处理方 法来进行，对于病毒和细菌来讲，这些处理方法一般都是不同的。
为了更详细的说明本发明，下面介绍所述方法的两种示例，分别为病毒 制剂和细菌制剂的方法。
示例1：病毒制剂方法
此处所介绍的这个示例中，所使用的试验微生物是噬菌体MS-2(国立工 业细菌收藏所：NCIMB 10108)，这是一种0.02μm大小的多角体病毒。在攻 击悬浮液经处理后存放的活性MS-2噬菌体的数量的测定是通过在琼脂培养 基层上采用分散体方法来进行的。
计数方法是指，提取0.1ml或1ml含有MS-2噬菌体的pH6.8“缓冲液 噬菌体”的试样量，并且在一种情况下，将这些试样量与含有大约0.5ml静 止生长(注入后4-6小时)的大肠杆菌NCIMB 9481(大约108CFU/ml)的2.5ml 胰蛋白胨大豆琼脂相混合，在第二种情况下，是将这些试样量与含有大约 1.0ml静止生长(注入后4-6小时)的大肠杆菌NCIMB 9481(大约108CFU/ml) 的5ml胰蛋白胨大豆琼脂相混合。
这样，就可以将琼脂化的软床倒入胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptone soyaagar)平板内，以便形成一个双层。在37°C下经过24小时孵育后，对 噬菌体的可见噬斑进行计数。选择表示可见裂解噬斑的平板(酶：噬菌斑形 成单位(pfu.plaque forming units))并采用相应稀释剂进行增殖。如此而 测定的酶(Pfu)将相当于缓冲液噬菌体内的MS-2噬菌体。
首先，在缓冲液噬菌体内稀释原始悬液，按试验已知滴定率来制备悬浮 液。然后，制备稀释物，并采用“双层”方法来检查浓度。一旦计数结束， 必须选择出反映一种融合溶菌的最高稀释的平板。在这些平板上添加一定比 例的缓冲液噬菌体，并使用无菌刮勺将琼脂裂开并使其与缓冲液相混合。
在无菌容器中，存放含有琼脂的缓冲液并对其进行倾析，然后，用力摇 动直到琼脂裂开。结果是自旋的(spun)；琼脂残余物将形成沉淀。采集漂浮 物并用一个膜进行过滤，在4℃温度下存放等分试样量。按已知滴定率如此 制备的悬浮液被置入到具有一定体积的气溶胶产生器内。
病毒悬液通过泵(1)而产生流动从而被输送到雾化器(2)内。
然后，气溶胶产生器在气溶胶雾化器(3)的压力下开始工作，气溶胶经由 管路(5)干燥流动。
在等候试验箱均匀充气之后，一旦试验箱充气完毕，呼吸器和吸入系统 的真空泵便启动。白试验和抽样试验便可同时通过两个独立管子进行，与此 同时，在缓冲液噬菌体内对所提取的分散体进行起泡。在试验结束时，断开 两个起泡器的连接，将溶液送入到相应的无菌容器内，所述容器立即在4℃ 下储存，目的是抑制任何微生物的生长。
通过起泡采样器采集的活性MS-2噬菌体可以采用上述双层方法进行计 算。
示例2：细菌制剂方法
对细菌制剂的防护效能的测定也是通过一个类似于病毒制剂的程序方法 进行，但是，试验微生物的采集是通过在pH7.0稀释剂中起泡来进行的。试 验用的微生物是缺陷短波单胞菌(Brevundiminuta(ATCC 19146)，即一种 0.3μm大小的细菌。细菌悬浮液按如下方式制备：一些次培养基 (under-cultures)是从一种储用培养基中制备的，通过在胰蛋白胨大豆琼脂 平板上进行蠕动而成，并在30-35℃下存放18-24小时。而后，再制备另一 个次培养基，该次培养基是按相同方法从第一个次培养基中采集的，同样在 30-35℃下存放18-24小时。第二个次培养基就是工作培养基。
提取工作培养基，并将其置入Beute的pH7.0的稀释剂中。
用机械搅拌器对制剂(Beute)进行搅拌，而后，采集悬浮液，并放入到 试管内。
使用稀释方法和估算单位数量，通过麦氏比浊(McFarland)指数，使悬 液中小细胞的数量必须达到一个值，即1x107CFU/ml和1x1010CFU/ml之 间的一个值。
然后，进行细菌悬浮液计数
试样当天，悬浮液必须置放在电冰箱内，温度在2-8℃之间。
在下游试验并采集的细菌悬液的计数按如下说明进行：
使用稀释剂制备需要计数的悬浮液的连续稀释方法。每种稀释的双试样 进行混合并提取，并在陪替氏(Petri)平板中取样。以液体形式添加一定数量 的胰酪胨大豆琼脂(TSA)，置放在蒸锅内，温度保持在45℃，轻轻摇动平板。 对平板进行孵育，温度30-35℃，时间24小时。在每个平板的单位数计数 之后，对平板再孵育24小时。每个平板上生长的单位数再次计数，但不计算 那些并未完全分离的单位数。
测定每个试样的最大单位数。
计算试样悬浮液的CFU/ml的数。
上面所述方法示例的唯一目的是，更好地说明本发明，但并不说明本发 明仅限于这些示例。例如，也可以使用大小和微生物学特性相似的微生物， 而且，也可以使用不同的试验悬液准备方法，采用不同时间和不同采集方法 以及不同的计数方式。
所述方法可以用来评估所有呼吸道个人防护设备对生物制剂的防护效 能，例如，全面罩、过滤面罩、一次性杯状或折叠平面过滤面罩，过滤器等。
例如，示例1中所示工艺方法曾用来计算可折叠平面过滤面罩的效能， 诸如WO 2005/077214 A1专利中所介绍的面罩，其特征在于，过滤层由硼硅 超细玻璃纤维，采用醋酸乙烯酯树脂粘结在一起，纤维基体由坚硬的纤维素 基来支撑，该结构采用硅基涂层进行了表面处理。
试验结果如下：
  进入攻击 的病毒 (x109) 试验箱内的病毒 白试验(Nv) (x105) 过滤面罩后发现的病毒 抽样试验(Na) (x103) 截留病毒％ 100-(Na/Nvx100) 4.6 3.4 1.7 99.5000 4.6 7.5 1.3 99.8267 4.6 4.9 1.0 99.7959 3.1 4.5 1.2 99.7333 3.1 6.4 2.1 99.6719 3.1 4.6 1.4 99.6957
本发明的所述方法已经按照良好实验室规范(GLP)进行了有效性验证。 方法的有效性
所述方法的有效性试验考虑到了试验系统效能(微生物悬液在缓冲液内 的均匀分布、试验实施期间微生物的生命力、整个方法的精度)和微生物制 剂计数的分析效能(重复性、中间精密度、精确性)。
有效性试验的进行既涉及到使用MS-2噬菌体的病毒制剂方法，也涉及到 使用缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)的细菌制剂方法。
首先检查微生物悬浮液计数的功效。
采用相应计数方法计算微生物悬浮液的浓度。对于每种稀释方法来讲， 滴定率需要多次检查，而且试验需要重复多次。
试验结果用来测算分析结果的重复性，也就是说精密度，在均匀试样中 重复检查悬液计数情况。
对于所选择的每种稀释来讲，应计数平均值和标准偏差。
然后，计算变化率百分比(CV％)，该百分比是从标准偏差和所做测量的平 均值之间的百分率中获得的。
CV％＝∑(sigma)/Y*100
式中：
∑(sigma)＝标准偏差
Y＝平均值
在病毒和细菌特性方面，不同稀释方法所得出的CV值均低于15％，反 映了计数重复性正确。
使用上面所述6个试验中获得的结果，检查所述方法的精确性，也就是 说，试验值是如何不同于已知理论数据。
评估标准是基于恢复值％，其为实验数据和已知理论数据之比。
恢复值％＝Ns/N*100
式中：
N＝病毒悬浮液已知理论数据(pfu/ml)
Ns＝获得的病毒悬浮液试验数据(pfu/ml)
可以看出，不论是病毒还是细菌，12项试样中获得的恢复值都是在 70-130％的范围内。
在使用病毒和使用细菌进行的试验中，平均恢复值％都是在80-120％的 范围内。
最后，由两名不同的操作手在两天内进行重复性的计算测试。因此，也 可以计算分析结果的中间精确度，从而来将所述中间精确度作为根据天数和 不同操作手的精确度。
不论是病毒还是细菌，由两名操作手在两天内获得的不同稀释方法的CV 值均低于15％。
这个结果表明，中间精确度良好。
另外，还要检查测试系统功效。
工作培养基可以按照所述方法进行制备，该培养基输送到气溶胶装置， 后者带有一定体积的微生物悬液。启动气溶胶产生器一直等到试验箱均匀充 满。然后，吸入系统的真空泵启动，最后再将真空泵和气溶胶产生器关闭。
将两个起泡器从电路上断开，将溶液注入到无菌容器内，在4℃下存 放，目的是抑制微生物的生长。
然后，使用适合这种微生物的方法来在缓冲溶液上按所要求的稀释方法 进行一些计数试验。
在两个不同工作日内，进行多次试验。
在试验箱内的两个不同提取位置，计算进入到两个起泡器内的微生物悬 液的均匀分布情况(白试验和抽样试验)。
对于每种试验来讲，使用如下公式来计算两个起泡器内采集到的微生物 百分比之间的差：

式中：
Nv＝在起泡器11内进行的微生物计数(pfu/ml)
Na＝在起泡器13内进行的微生物计数(pfu/ml)
不论是病毒还是细菌，分布差值均未超出±5％的范围。因此，可以看出， 不同部位微生物的分布是合适的。
然后，就分析结果的重复性，进行整个方法精密度的评估。
通过使用两个起泡器的如上测试所获得的数据结果，按如下公式计算 CV％值。
CV％＝∑/Y*100
式中：
∑＝标准偏差
Y＝n个试样的平均值
在病毒和细菌中，两天内获得的CV％值都>25％，这说明分析结果的重复 性合适，因此，整个方法精密度是合适的。
最后，测定实施试验期间微生物的生命力，即，微生物至少生存30分钟 的能力，试验箱保持充分的浓度，目的是从分析角度全面评估个人防护设备 的防护性能。
在悬液制备(To)后，立即进行1 x 107和1 x 108之间的具有已知滴定 率的微生物悬液的计数。同一悬液的计数在其制备15，30和45分钟后(T15， T30，T45)进行。
然后，将所获得的T15，T30，T45时的计数与制备时的To进行比较。
这个试验重复进行三次。
就病毒和细菌来讲，与在制备To时病毒滴定率相比，在T15，T30，T45时 的滴定率下降量小于2个对数。
因此，在试验期间，微生物始终是有生存能力的。
虽然前面已经介绍了本发明的一些具体实施例，但所属领域的技术人员 都了解，任何简单改动和重新布置都将没有脱离所附权利要求定义的本发明 的精神或主要属性。