[0001] 本申请是申请日为2012年1月24日，申请号为201280014801.2，发明名称为“用于药物的经皮递送和全身性递送的纳米粒子”的申请的分案申请。发明领域

[0002] 最概括地说，本发明涉及用于治疗化合物的经皮或全身性递送的基于聚合物的纳米粒子。

[0003] 发明背景

[0004] 经皮治疗由于不能绕开皮肤并递送足够量的亲水的或亲脂的治疗化合物至深皮肤层而仍然是一项挑战。吸收差的活性成分的渗透和透过可通过向制剂中添加特定的促进剂、通过使用胶体递送系统尤其是纳米粒子而被改善。最近在一些科学领域中已显示纳米粒子在此类应用中的益处，但是关于纳米粒子穿过不同皮肤层的潜在渗透了解很少。纳米粒子仅仅凭借他们的尺寸(100nm或更少)便可发挥生物效应。

[0005] 使用纳米粒子系统的包封在药物靶向和递送中是一种日益被实施的策略。此类系统已被提出用于局部施用以促进经皮运送进入并穿过皮肤屏障。然而，此粒子制剂通过哪种机制促进皮肤运送仍然不明确。这些纳米级的系统呈现大的表面积，该特性使得他们成为很有希望的用于经皮递送和透皮递送的递送系统。他们小的粒径确保了与角质层的紧密接触及控制粒子粒径的能力可调节皮肤部位的深层定位[1]。

[0006] 在最近的研究中，使用共聚焦激光扫描显微术(CLSM)以可视化不可生物降解的、荧光的、聚苯乙烯纳米粒子(直径20和200nm)穿过猪皮肤的分布。表面图像显示(i)聚苯乙烯纳米粒子优先积聚在毛囊开口中，(ii)这种分布以依赖于时间的方式增加，和(iii)较小的粒径有利于毛囊定位。除了毛囊吸收，从表面图像明显看到纳米粒子定位在皮肤“褶皱”中。然而，横截面图像显示这些非毛囊结构没有提供用于聚合物载体的可选的渗透途径，其运送明显地被角质层阻碍[2]。

[0007] 最近，脂质纳米粒子已显示作为用于活性物质的局部施用的载体的巨大潜力，主要由于可能的靶向作用和在不同皮肤层的控释。使用高温高压匀质化与超声波处理技术制备了装载酪洛芬和萘普生的脂质纳米粒子，并通过光子相关光谱法和差示扫描量热法表征。纳米粒子对人皮肤的反应被体外评价以确定药物经皮吸收(Franz池法)并被体内评价以确立主动定位(胶带剥离技术)和控释能力(UVB诱导红斑模型)。结果证明粒子能够减少药物渗透同时增加在角质层的渗透和积累。在相对于药物溶液的装载药物的纳米粒子的情形中观察到延长的抗炎作用。直接的和间接的证据证实了早期关于脂质纳米粒子作为用于局部施用载体的有用性的报道，促进了该领域中新的和更深入的研究[3]。

[0008] 聚合物纳米囊也已被提出作为用于局部施用的活性剂的载体。在此类递送系统的许多优点之中是实现有效成分的缓释并增加敏感性化合物的聚合物壳的能力，因此导致皮肤病学制剂的改善的治疗效果。目前，一些商业上可用的化妆产品已包含用于维生素A、玫瑰提取物和小麦胚芽油的包封的纳米粒子[4]。

[0009] 由Wu等人[5]发表的另外一篇最近的文章显示在6小时的局部施用之后，聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)纳米粒子不能够通过皮肤的最表层，即角质层；即使小至30nm的聚苯乙烯纳米粒子也不能够渗透通过角质层。另一方面，包封在纳米粒子内部的疏水性化合物被释放并能够扩散穿过皮肤的较深层。

[0010] 纳米粒子在皮肤表面被阻碍的事实可能是优势，由于有效成分可长期缓慢地释放并扩散穿过皮肤屏障，同时纳米粒子本身将不会全身性地转移。因此，作者[5]表明纳米粒子穿过完整皮肤的渗透似乎不可能引起全身性效应。

[0011] 然而，卫生当局非常关注在局部施用之后通过皮肤内和穿过皮肤的不可生物降解的纳米粒子可引起的潜在的负面作用。事实上，从2009年11月开始，欧盟成员国已采用用于化妆产品的单一法规：这事实上是包含涉及纳米材料在任何化妆产品中的使用的规则的第一个国家立法[6]。根据这个法规，任何人希望分销包含新的纳米材料的产品将被要求在进入市场之前向欧洲委员会分发安全信息。应该强调的是这些关注是指不可生物降解的纳米粒子的使用，但是，在皮肤里跨越合理的时间段将被降解的纳米粒子的使用预计不会引起任何不利的效应尤其是如果降解产物是安全的。

[0012] 在20世纪70年代，建议可生物降解聚合物作为避免聚合物去除的要求的合适的药物递送原料[7]。脂肪族聚酯诸如聚(ε-己内酯)(PCL)、聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)和其与乙醇酸的共聚物即聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)(PLGA)[8-11]已被广泛使用以配置控释设备。为什么PLA和PLGA在微米和纳米粒子的制备中广泛使用的原因，在于他们是无毒的、人体耐受性好的、可生物降解的及生物相容的事实[12-13]。PLA和PGLA是FDA认可的用于皮下和肌肉注射的聚合物。

[0013] PLGA的降解过程，也称为骨架溶蚀，通过自发水解成低聚物和D，L-乳酸和乙醇酸单体的酯键的自催化裂解发生[14]。乳酸进入三羧酸循环并被代谢并作为CO2和水被排除。乙醇酸在尿液中未改变的被排泄或进入Krebs循环并也作为CO2和水被排除。

[0014] 最近，使用荧光显微术、共聚焦激光扫描显微术和流式细胞术在人皮肤外植体中研究了装载荧光染料作为用于经表皮药物递送的载体的可生物降解的聚乳酸纳米粒子(PLA，MW 30,000)的适宜性[15]。结果显示PLA粒子渗透进入毫毛毛囊的50％，达到相当于在12-15％的所有观察到的毛囊的中皮脂腺的进入的最大深度。粒子在滤泡管道中的积累伴随着染料释放至有活力的表皮和其保留在皮脂腺中长达24h。在体外和在皮肤外植体中的动力学研究显示粒子的不稳定性和缔合染料的显著释放发生在与有机溶剂和皮肤表面接触时。根据作者的这些结果表明基于PLA聚合物的粒子可能是用于毛囊和皮脂腺靶向的理想的载体。

[0015] 参考文献

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[0034] [19]PCT公开号WO 2010/091187

[0035] [20]PCT公开号WO 2004/084871

[0036] [21]美国专利申请号US 2010/0247668

[0037] [22]PCT公开号WO 2010/059253

[0038] 发明概述

[0039] 本发明基于一种用于构建治疗载体的新的方法，其通过他们自身或与多种活性治疗剂结合具有渗入皮肤并引起治疗效果的能力。在载体与有效药剂缔合的情况下，他们能够递送足够量的亲水性剂或亲脂性剂至深的皮肤层中，以因此引起局部的或全身性效果。虽然本发明可主要地被用于递送治疗剂通过皮肤或其他组织屏障，它还可被用于通过如本文进一步公开的例如口服、静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i.m)、眼皮下注射(s.c 
ophthalmic)等许多其他施用途径递送治疗剂。本发明的载体能够穿过生物膜，提供同时递送多于一种剂，特别是疏水性剂和亲脂性剂至所需部位的能力，且最重要的是能够递送以其他方式施用的话被阻碍或不可能的大分子。如可以理解的，已知的纳米粒子递送系统诸如脂质和纳米乳液在他们的能力方面是有限的，主要因为此类系统不能够结合有效浓度的亲水性大分子和/或促进他们的渗透以及延长在皮肤上层的停留时间。

[0040] 本发明的纳米粒子载体以冻干粉末的形式在长的储存期内具有长的理化保质期，其可在使用之前加入纯化水或无菌水重构时保持他们的初始特性。

[0041] 所公开的本发明是基于本身可被使用(即不用另外的活性剂，其中治疗效果由粒子本身表征)或可被修饰以携带一种或多种治疗剂的纳米粒子。本发明的纳米粒子能够裸露的或包含另外的治疗剂以渗透进入组织屏障，例如皮肤，至至少10层浅表表皮层，以达到至少4-20μm(微米)的深度。纳米粒子在其渗透进入的皮肤层内可生物降解并可因此除了可通过缔合的治疗剂发挥效果之外，主要的补水和保湿效果能够通过乳酸和乙醇酸或只有乳酸针对渗透的组织提供至少24小时、72小时时间段、和甚至一周时间段的皮肤干燥治疗(干性皮肤)。

[0042] 因此，本发明的第一个方面提供了具有至多500nm的平均直径的聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子，该PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，其中所述纳米粒子与选自与所述纳米粒子的表面共轭或缔合的亲水性治疗剂和被包含在所述纳米粒子内的亲脂性治疗剂的至少一种剂缔合。

[0043] 在一些实施方案中，本发明提供了具有至多500nm的平均直径的聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，纳米粒子与至少一种亲水性治疗剂表面缔合。

[0044] 在另外的实施方案中，本发明提供了具有至多500nm的平均直径的PLGA纳米粒子，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，纳米粒子在其中包含至少一种亲脂性治疗剂；即，纳米粒子可捕获或包封亲脂性治疗剂。

[0045] 作为本领域的技术人员将了解，如以下进一步说明的治疗剂可与纳米粒子的表面缔合或可被包含在所述纳米粒子内。在一些实施方案中，治疗剂不包含在纳米粒子内，即纳米粒子的核或基体基本上是无此类治疗剂的。

[0046] 在一些实施方案中，PLGA具有在2,000和10,000Da之间的平均分子量。在其他实施方案中，PLGA具有在2,000和7,000Da之间的平均分子量。在其他实施方案中，PLGA具有在2,000和5,000Da之间的平均分子量。在仍然另外的实施方案中，PLGA具有在4,000和20,000Da之间、或在4,000和10,000Da之间、或在4,000和5,000Da之间的平均分子量。在仍然其他实施方案中，PLGA具有约2,000、约4,500、约5,000、约7,000或约10,000Da的平均分子量。

[0047] 如本文所用的，本发明的“纳米粒子”是粒子载体纳米囊(NC)或纳米球(NC)，其是生物相容的并足够耐化学和/或物理破坏，以使得足够量的纳米粒子在施用进入人或动物身体之后基本上保持完整并持续足够的时间以能够到达所需的靶组织(器官)。通常，纳米粒子是球形的形状，具有直到500nm的平均直径。粒子的形状不是球形的情况下，直径指的是粒子的最长轴。

[0048] 在一些实施方案中，平均直径在约10和50nm之间。在另外的实施方案中，平均直径至少约50nm。

[0049] 在一些实施方案中，平均直径在约100和200nm之间。在其他实施方案中，平均直径在约200和300nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约300和400nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约400和500nm之间。

[0050] 在其他实施方案中，平均直径在约50和500nm之间。在其他实施方案中，平均直径在约50和400nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约50和300nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约50和200nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约50和100nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约50和75nm之间。在另外的实施方案中，平均直径在约50和60nm之间。

[0051] 纳米粒子的每一个可基本上具有相同的形状和/或尺寸。在一些实施方案中，纳米粒子具有直径的分布以使得不超过0.01％至10％的粒子具有大于以上提及的平均直径的10％以上或以下的直径，且在一些实施方案中，以使得不超过0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、
0.8％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、或9％的纳米粒子具有大于的上述提及的平均直径的10％以上或以下的直径。

[0052] PLGA聚合物是聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)的共聚物，在一些实施方案中，共聚物选自嵌段共聚物、无规共聚物和接枝共聚物。在一些实施方案中，共聚物是无规共聚物。

[0053] 在一些实施方案中，纳米粒子具有根据联邦食品、药品和化妆品法案的201(s)和409章被列为一般认为安全(GRAS)的PLGA的特性，且被允许在微粒系统中使用。

[0054] 在一些实施方案中，PLA和PGA中的每一种的平均分子量，独立于另一种地，如存在于共聚物中的，在2,000和20,000Da之间。在一些实施方案中，PLA单体过量存在于PLGA中。在其他实施方案中，PLA对PGA的摩尔比选自95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:
35、60:40、55:45和50:50。在一些实施方案中，PLA对PGA的摩尔比是50:50(1:1)。

[0055] 在一些实施方案中，纳米粒子由等摩尔的PLA和PGA的无规共聚物形成，其中共聚物具有至少4,500Da的分子量，并呈具有在100和200nm之间的平均直径的纳米粒子的形式。

[0056] 本发明的纳米粒子或根据本发明使用的纳米粒子，其通过他们自身具有治疗效果的(没有另外的活性剂)主要被用于伴随医疗病症的过渡皮肤干燥情形中的保湿/补水目的，诸如：过敏性和接触性皮炎、牛皮癣、湿疹、甲状腺失调症、鱼鳞癣、硬皮病、干燥症和其他。

[0057] 根据本发明的纳米粒子可被用作诸如引起至少一种效果例如治疗效果，或可与至少一种剂例如治疗剂缔合，其通过治疗或预防受试者的不想要的病症或疾病能够引起、促进、抑制或减少至少一种效果。至少一种剂(物质、分子、要素、化合物、实体或其组合)可选自治疗剂和非治疗剂，所述治疗剂，即当以治疗有效量施用时能够引起或调节治疗效果的剂，所述非治疗剂，即通过其自身不引起或调节治疗效果但是其赋予纳米粒子所选择的特征，如将在下文进一步公开的。

[0058] 至少一种治疗药剂可选自维生素、蛋白、抗氧化剂、肽、多肽、脂质、碳水化合物、激素、抗体、单克隆抗体、疫苗和其他预防剂、诊断剂、造影剂、核酸、营养剂、小分子(具有小于约1,000Da或小于约500Da的分子量)、电解质、药物、免疫剂和任何上述的任何组合。

[0059] 在一些实施方案中，至少一种剂是大分子(分子量超过1000Da)，其递送穿过皮肤层否则是不可能的。此类大分子可以是亲脂的。

[0060] 在一些实施方案中，至少一种治疗剂选自降血钙素、环孢菌素、胰岛素、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、可的松、强的松和其他。

[0061] 对于某些应用，至少一种治疗剂根据其分子量选择。因此，至少一种治疗剂可被选择以具有高于1,000Da的分子量。在其他实施方案中，剂被选择以具有不超过300Da的分子量。在另外的实施方案中，剂被选择以具有在500和1,000Da之间的分子量。

[0062] 在一些实施方案中，本发明的纳米粒子还可与非活性剂缔合。非活性剂(非治疗剂)可被选择以调节纳米粒子的至少一个特征，此特征例如可以是尺寸、极性、疏水性/亲水性、电荷、反应性、化学稳定性、清除率、分布、靶向性和其他中的一种或多种。

[0063] 在一些实施方案中，非活性剂基本上是具有至少5个碳原子的线性碳链，且线性碳链中可以或可以不具有一个或多个杂原子。

[0064] 在一些实施方案中，非活性剂选自不同链长的聚乙二醇(PEG)、脂肪酸、氨基酸、脂肪族或非脂肪族分子、脂肪族硫醇、脂肪胺、和其他。剂可以是带电荷的或可以是不带电荷的。

[0065] 在一些实施方案中，非活性剂是脂肪氨基酸(烷基氨基酸)。在其他实施方案中，所述烷基氨基酸的烷基部分具有在10个和30个之间的碳原子并可以是直链的或支链的、饱和的、半饱和的或不饱和的。在另外的实施方案中，所述烷基氨基酸的氨基酸部分可选自天然的或非天然的氨基酸中，和/或从α-和/或β-氨基酸。

[0066] 在一些实施方案中，纳米粒子可以未被聚乙二醇化，即非活性剂与PEG不同。

[0067] 因此，取决于与例如治疗的或非活性的至少一种剂缔合的多种参数(其可以是治疗的或非治疗的)，(参数是，例如，溶解度、分子量、极性、疏水性/亲水性、电荷、反应性、化学稳定性、生物活性和其他)，剂可被包含(包封)在所述纳米粒子内，嵌入在构成纳米粒子的聚合物基体中和/或化学地或物理地与纳米粒子的表面(整个表面或其部分)缔合。对于所选择的用途，纳米粒子可因此呈核/壳(在下文中还被叫作纳米囊)的形式，具有聚合物壳和可以是无活性物质或包含至少一种剂的核。

[0068] 纳米粒子可选地是基本均匀的不具有明显的核/壳结构特征的组合物。这些纳米粒子在本文指的是纳米球(NS)。在一些实施方案中，纳米粒子的内部(核或内部基体)缺乏至少一种亲水性剂但可包含分散或溶解在核或基体中的亲脂性剂，即，至少一种亲水性剂可位于纳米粒子的表面上或与纳米粒子的表面缔合。

[0069] 在其他实施方案中，纳米粒子基本上由PLGA构成。

[0070] 在采用纳米囊(NC)的情形下，至少一种(活性)亲脂性剂可被包含在纳米粒子核(腔)内，例如，在被PLGA共聚物的壳包围的油性基体中。

[0071] 在一些实施方案中，至少一种治疗剂与纳米粒子的表面缔合且至少一种不同的治疗剂被缔合以被包含在所述纳米粒子的核内或所述纳米粒子的基体内。

[0072] 在一些实施方案中，纳米粒子是包含至少一种疏水性剂(剂被包含在油核中从而是亲脂性的)的纳米囊。取决于特定的预期的用途，油性核可选自任何油性有机溶剂或介质(单一物质或混合物)，以非限制性的方式，此类物质可选自辛酸、油酸、三丁酸甘油酯、长链甘油三酯(诸如大豆)和其他。

[0073] 可选地，可采用相对均匀的结构，例如纳米球，其中至少一种剂可被嵌入纳米粒子基体内，例如，均匀地，导致在其中纳米粒子内的活性剂的浓度是均匀的纳米粒子。

[0074] 在一些实施方案中，纳米粒子(纳米囊或纳米球)表面的修饰可被要求增强纳米粒子在递送治疗剂中的效力。例如，纳米粒子的表面电荷可被修饰以获得被修饰的纳米粒子的可生物降解和清除。粒子(不论是纳米囊中的核或纳米球中的均匀的基体)的聚合物要素的孔隙率也可被优化以获得治疗剂的缓释和控释。

[0075] 在本发明另外的表现中，纳米粒子被修饰以允许至少一种(治疗的或非治疗的、或靶向的)剂与其缔合；该缔合可以是化学缔合或物理缔合，化学缔合诸如共价键键合、静电键合、离子相互作用、偶极-偶极相互作用、亲水作用、范德华相互作用、氢键键合。物理缔合可以是使得至少一种剂的至少一部分(或与其缔合的连接基部分(linker moiety))被捕获、嵌入、吸附或锚固到纳米粒子的元件或表面内。本文中，物理缔合通常被称为“物理锚固”。

[0076] 纳米粒子可与治疗剂或非治疗剂的多种剂中的一种或多种缔合。例如，当两种或多种剂被使用时，他们可以是相似的或不同的。在特定的纳米粒子中使用多种剂可允许多个生物靶的靶向性或可提高对于特定靶的亲和力。此外，纳米粒子可包含两种剂，每一种具有不同的溶解度—一种是疏水性的(例如，在核中)和一种是亲水性的(例如，在壳中或延伸出粒子)。

[0077] 基于预期的用途，每一种纳米粒子与不同的剂之间的缔合可被选择成是不稳定的，即在特定条件下进行离解，或是非不稳定的。通常地，在至少一种剂是治疗剂的情况下，它通过不稳定的键或通过一种或多种连接基部分与纳米粒子的表面缔合。

[0078] 在一些实施方案中，至少一种剂是通过一个或多个连接基部分与纳米粒子缔合的治疗剂，连接基部分是双官能的，即具有能够与纳米粒子的表面缔合(相互作用)的第一(例如，疏水性)部分和能够与治疗剂缔合的第二(例如，亲水性)部分。

[0079] 在本文中，与多个此类连接基部分缔合的纳米粒子被称为“被修饰的纳米粒子”，即按照定义其表面的至少一部分与能够与至少一种剂缔合的连接基部分进行缔合的纳米粒子。与纳米粒子的表面相互作用的多个连接基，不需要全部与治疗剂缔合。一些可与其他非治疗剂缔合；其他的可具有裸露的端基(未与任何剂缔合)。在一些实施方案中，连接基与一种或多种不同的治疗剂缔合。

[0080] 连接基和纳米粒子表面之间的缔合通常选自连接基的至少一部分与纳米粒子的表面的共价键键合、静电键合、氢键键合及物理锚固(非共价的)。连接基和至少一种治疗剂之间的缔合选自共价键键合、静电键合和氢键键合。

[0081] 在一些实施方案中，连接基部分通过共价键键合与(a)至少一种治疗剂和(b)纳米粒子表面中的一种或两种缔合。在其他实施方案中，连接基和纳米粒子表面之间的缔合是通过将连接基的至少一部分锚固到纳米粒子表面内(例如，在纳米粒子的表面内且可渗透入纳米粒子的固体/油核)，且连接基的另外的部分暴露并延伸离开纳米粒子的表面。

[0082] 在另外的实施方案中，连接基共价键键合至所述至少一种治疗剂。在一些实施方案中，(a)连接基与治疗剂的缔合和(b)连接基与纳米粒子表面的缔合中的一种或两种是不稳定的。

[0083] 在一些实施方案中，在其表面上具有锚固(非共价地)多个连接基部分的纳米粒子中，所述多个连接基部分的每一个共价键键合至至少一种剂；表面锚固和共价键键合两者都是不稳定的。

[0084] 连接基和任何纳米粒子及剂的缔合可以是不稳定的，即连接基可以是容易裂解的连接基，其在体内存在的条件下易离解。例如，采用本发明的纳米粒子作为用于局部的或全身性的皮肤施用的药物递送系统的情形下，当传递进入并穿过一层或多层皮肤层时，治疗剂可从连接基或纳米粒子载体释放出来。容易裂解的缔合可以是使得通过特异性活性的酶或通过水解作用进行裂解。对于皮肤施用，连接基和治疗剂之间或纳米粒子和连接基之间的缔合可被选择成通过存在于皮肤组织的一层或多层中的酶是可裂解的。

[0085] 在一些实施方案中，连接基部分包含羧酸基团(以形成酯类)或硫醇基团(以形成硫键)。

[0086] 在其他实施方案中，根据裂解缔合的半衰期即从连接基离解的治疗剂的数量来选择连接基部分。在一些实施方案中，连接基至治疗剂的缔合具有在1分钟和48小时之间的半衰期。在一些实施方案中，半衰期小于24小时。

[0087] 在另外的实施方案中，连接基部分包括选自-S-、-NH-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NH-、-C(＝S)NH-、-OC(＝O)NH-、-NH(＝O)NH-、-S(＝O)NH-、-S(＝O)2NH-以及其他的官能团。

[0088] 在一些实施方案中，连接基选自具有不同链长的聚乙二醇(PEG)。基于逃脱免疫系统和避开攻击性降解酶的目的，PEG连接基还可被采用与其他连接基组合。

[0089] 在一些实施方案中，连接基部分是脂肪氨基酸(烷基氨基酸)，其中烷基部分具有在10个和30个之间的碳原子且可以是直链的或支链的、饱和的、半饱和的或不饱和的。氨基酸部分可选自天然的或非天然的氨基酸，和/或选自α-和/或β-氨基酸。连接基的氨基酸基团可源自所选择的氨基酸，不限制，来自α-和β-氨基酸。

[0090] 在一些实施方案中，连接基是具有至少10个碳原子的烷基链的脂肪半胱氨酸。

[0091] 在另外的实施方案中 ，连接基是具有式I的油基半胱氨酸酰 胺(oleylcysteineamide)。

[0092]

[0093] 在一些实施方案中，连接基部分是硫醇化化合物，且因此被修饰的纳米粒子是能够与例如大分子(分子量超过1000道尔顿)、亲水性分子及电解质缔合的硫醇化纳米粒子。硫醇化纳米粒子与剂之间可通过剂上的活性基团缔合，此基团可以是马来酰亚胺官能团。

[0094] 本发明还提供了在其表面上具有多种治疗剂的聚合物纳米粒子，每一种剂通过连接基部分缔合(键合)到所述纳米粒子，纳米粒子具有选自聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-乙交酯共聚物)(PLG)、聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)、聚(丙交酯)、聚乙醇酸(PGA)、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)和/或其共聚物的聚合物材料的性质。在一些实施方案中，所述聚合物材料选自PLA、PGA和PLGA。在另外的实施方案中，聚合物纳米粒子具有PLGA。

[0095] 在一些实施方案中，连接基部分是油基半胱氨酸酰胺。在其他实施方案中，纳米粒子具有在上文公开的物理特征。在一些实施方案中，纳米粒子是具有至多500nm的平均直径的聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子，PLGA具有至多20,000Da的平均分子量。

[0096] 本发明的纳米粒子可用于制备医用药物组合物。在一些实施方案中，组合物在治疗性治疗的方法中使用，即-治疗和/或预防皮肤病、眼睛疾病以及通过本发明的组合物可治疗的任何其他疾病。

[0097] 纳米粒子在药物组合物中的浓度可被选择，以致量是足以递送期望有效量的治疗剂至受试者，并根据所选择的特定的施用方式。作为已知的，用于本文目的的“有效量”可通过本领域已知的此类注意事项被确定。量必须是有效的以获得所需的治疗效果，尤其(inter alia)取决于待治疗的疾病的类型和严重程度和治疗方案。有效的量通常在合理设计的临床试验(剂量范围研究)中被确定且精通本领域的人员将了解如何适当地进行此类试验以确定有效的量。众所周知，有效的量取决于多种因素包括配体与受体的亲和力、其在体内的分布概况、多种药物参数诸如在体内的半衰期、不希望的副作用(如果有的话)、诸如年龄和性别的因素以及其他。

[0098] 本发明的药物组合物可包括利用不同的或相同的分散材料的具有不同的或相同的分散特性的不同的纳米粒子类型或尺寸。

[0099] 纳米粒子还可被用作药物或生物活性递送系统以在施用之后局部地、口服地、通过吸入、经鼻地或非肠道地运送多种治疗剂进入循环系统。本发明的纳米粒子递送系统还由于降低的清除率、减少的施用频率及最少的副作用而促进靶向药物递送和控释应用、增强药物在作用部位的生物利用度。

[0100] 最概括地，本发明的递送系统包括：

[0101] (i)如本文公开的聚合物纳米粒子；和

[0102] (ii)与所述纳米粒子缔合的至少一种剂，所述至少一种剂任选地通过连接基部分与所述表面缔合。

[0103] 在一些实施方案中，连接基具有物理锚固(非共价地缔合)至所述表面的第一部分和与所述至少一种剂缔合的第二部分。在一些实施方案中，物理锚固至所述表面的第一部分是疏水性的，而与所述至少一种剂缔合的第二部分是亲水性的。

[0104] 本发明的递送系统能够以允许在至少约12小时内、或在一些实施方案中，至少约24小时内、或在其他实施方案中，在10-20天的时间段内受控释放剂的速率来递送治疗剂。
正因为如此，递送系统可被用于多种用途，诸如，不限于，药物递送、基因治疗、医疗诊断、及用于例如皮肤病理、肿瘤、病原体传播疾病、激素相关疾病、与器官移植相关的反应副产品、及其他异常的细胞或组织生长的医学治疗。

[0105] 递送系统通常作为药物组合物包括系统和药学上可接受的载体被施用。药学上可接受的载体可选自对公众是容易得到的载体、佐剂、赋形剂和稀释剂。药学上可接受的载体被选择为对本发明的递送系统或对其任何组分是化学惰性的且其在使用条件下不具有有害的副作用或毒性。

[0106] 本发明提供了配置用于多种用途的组合物。在一些实施方案中提供了适合用于透皮施用的组合物，例如，递送治疗剂进入受试者的循环系统。在另外的实施方案中提供了用于局部施用的组合物。通常采用局部组合物用于递送治疗剂穿过角质层。在另外的实施方案中提供了适用于治疗剂的口服施用的组合物。还提供了适用于治疗剂的眼部施用的组合物。眼用组合物可作为滴眼液或通过注射进入眼睛来施用。

[0107] 在一些实施方案中，提供了包括至少一种根据本发明的纳米粒子的眼用组合物，所述纳米粒子与治疗大分子缔合，该缔合任选地通过至少一个连接基进行。在一些实施方案中，组合物呈适于眼内注射(interoccular injection)的形式或呈滴眼液的形式。

[0108] 载体的选择将部分地由特定治疗剂以及由用于施用组合物或递送系统的特定方法来确定。因此，本发明的药物组合物或递送系统可被配制用于口服、肠内、口腔、经鼻、局部、经上皮、直肠、阴道、喷雾、经粘膜、表皮、透皮、经皮、眼部、肺部、皮下、皮内和/或非肠道的施用途径。在一些实施方案中，透皮地、局部地、皮下地和/或非肠道地施用药物组合物或递送系统。

[0109] 可在生物相容的水或脂质溶液中施用递送系统。该溶液可包括但并不限于盐水、水或药学上可接受的有机介质。

[0110] 在一些实施方案中，本发明的组合物是基本上不含水的。

[0111] 可在一定的时间间隔之后以单一的剂量或以重复一次或几次的剂量实施递送系统制剂的施用。适当的剂量可根据此类参数如根据被治疗个体口述的和直接取决于被治疗个体的治疗上有效的剂量、施用方式、治疗剂的独特特征及待实现的特定治疗效果而不同。可由本领域技术人员确立适当的剂量。

[0112] 可选择本发明的药物组合物以治疗、预防或诊断任何病理或病情。术语“治疗”或其任何语言的变化形式，如本文所用的，指的是施用有效改善不想要的疾病相关的症状的本发明的组合物或系统的治疗量，以在他们发作之前预防此类症状的表现，以减缓疾病的发展、减缓症状的恶化，以增强缓解期的开始、减缓在疾病发展慢性阶段引起的不可逆的损害，以延迟所述发展阶段的开始，以减轻疾病的严重程度或治愈疾病，以提高存活率或诱导更快的恢复，或以预防疾病免于发作或以上两种或更多种的组合。

[0113] 本发明的药物组合物可对那些被物理屏障保护的组织特别有利。此类屏障可以是皮肤、血液屏障(例如，血胸腺、血脑、血气、血睾等)、器官外膜和其他。在屏障是皮肤的情况下，可通过本发明的药物组合物治疗的皮肤病理包括，但不限于抗真菌疾病或疾患、痤疮、牛皮癣、白癜风、瘢痕疙瘩、灼伤、疤痕、干燥病、鱼鳞癣、角化症、角皮病、皮炎、瘙痒、湿疹、皮肤癌和胼胝。

[0114] 可使用本发明的药物组合物以预防或治疗任何皮肤病症。在一些实施方案中，皮肤病症选自皮肤疾病，诸如皮炎、湿疹、接触性皮炎、过敏性接触性皮炎、刺激性接触性皮炎、特应性皮炎、婴儿湿疹、Besnier痒疹、过敏性皮炎、屈部湿疹、播散性神经性皮炎、脂溢性(或皮脂溢性)皮炎、婴儿脂溢性皮炎、成人脂溢性皮炎、牛皮癣、神经性皮炎、疥疮、全身性皮炎、疱疹样皮炎、口周皮炎、盘状湿疹、钱币状皮炎、主妇湿疹、出汗障碍疹、掌趾的顽拗性脓疱疹、Barber型或脓疱性银屑病、泛发性表皮脱落性皮炎、瘀滞性皮炎、静脉曲张性湿疹、出汗障碍性湿疹、慢性单纯性苔藓(局部划伤性皮炎；神经性皮肤炎)、扁平苔藓、真菌感染、擦烂性念珠菌病、头癣、白斑、panau、癣、足癣、念珠菌病(moniliasis)、念珠菌病(candidiasis)；皮肤真菌感染、水疱皮炎、慢性皮炎、棘细胞层水肿性皮炎、dermatitis venata、Vidal癣(Vidal's lichen)、皮脂缺乏性湿疹性皮炎、自体敏感性湿疹或其组合。

[0115] 在另外的实施方案中，可使用本发明的组合物以预防或治疗丘疹、寻常性痤疮、胎记、雀斑、纹身、疤痕、烧伤、太阳灼伤、皱纹、眉间纹、鱼尾纹、咖啡斑、良性皮肤肿瘤，其在一个实施方案中是脂溢性角化病、黑色丘疹性皮肤病、皮肤结节、皮脂腺增生、汗腺腺瘤、黄斑瘤、或其组合；良性皮肤增生、病毒疣、尿布念珠菌病、毛囊炎、疔疮、生疖、痈、皮肤的真菌感染、点状色素减少症、脱发、脓疱病、黄褐斑、传染性软疣、红斑痤疮、疥疮、带状疱疹(shingles)、丹毒、红癣、带状疱疹(herpes zoster)、水痘带状疱疹病毒、水痘(chicken pox)、皮肤癌(诸如鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤)、癌前增生(诸如先天性痣、光化性角化病)、荨麻疹(urticaria)、荨麻疹(hives)、白癜风、鱼鳞癣、黑棘皮病、大疱性类天疱疮、鸡眼与茧、头皮屑、干性皮肤、结节性红斑、Graves皮肤病、过敏性紫癜、毛囊角化病、光泽苔癣、扁平苔癣、硬化性苔癣、肥大细胞增多症、传染性软疣、玫瑰糠疹、毛发红糠疹、急性痘疮样苔藓样糠疹或穆哈二氏病(Mucha-Habermann Disease)、表皮溶解水疱症、脂溢性角化病、史蒂文斯—约翰逊综合征(Stevens-Johnson Syndrome)、天疱疮、或其组合。

[0116] 在另外的实施方案中，可使用本发明的组合物以预防或治疗昆虫叮咬或蛰刺。

[0117] 在额外的实施方案中，可使用本发明的组合物以预防或治疗与眼区相关的，诸如汗腺腺瘤、黄斑瘤、脓疱病、特应性皮炎、接触性皮炎或其组合；与头皮、指甲相关的，诸如由细菌、真菌、酵母和病毒引起的感染、甲沟炎、或牛皮癣；与嘴区相关的诸如口腔扁平苔癣、唇疱疹(疱疹性龈口炎)、口腔白斑、口腔念珠菌病或其组合；或其组合的皮肤病症。

[0118] 如所了解的，人皮肤由可被分为三个主要组的层的许多层组成：位于皮肤外表面的角质层、表皮和真皮。角质层是在细胞外富含脂质基质中的细胞的角质填充层，其事实上是药物递送进入皮肤的主要屏障，表皮和真皮层是活体组织。表皮没有血管，但是真皮包含可引导治疗剂用于经上皮的全身性分布的毛细血管环。

[0119] 尽管药物的透皮递送似乎是选择的途径，只有有限数量的药物可通过此途径被施用。不能够透皮递送更多种类的药物主要取决于对药物的低分子量(具有分子量不超过500Da的药物)、亲脂性和小剂量的要求。本发明的递送系统明显克服了这些障碍。如上面提到的，本发明的系统能够支持多种分子量和亲水性的治疗剂。本发明的递送系统允许至少一种治疗剂运送穿过至少一层皮肤层，穿过角质层、表皮和真皮层。不希望被理论约束，递送系统运送治疗剂穿过角质层的能力取决于一系列包括完整系统或离解的治疗剂和/或离解的纳米粒子扩散穿过水化的角蛋白层并进入更深皮肤层的事件。

[0120] 因此，本发明还提供了递送系统，包括：

[0121] (i)如本文定义的PLGA纳米粒子；和

[0122] (ii)与所述纳米粒子缔合的至少一种治疗剂，所述至少一种治疗剂任选地通过具有的连接基部分与所述表面缔合，或可选地被包含在所述纳米粒子内。

[0123] 还提供了多级递送系统，其包括：

[0124] (i)如本文公开的聚合物纳米粒子；

[0125] (ii)与所述聚合物纳米粒子的表面缔合的连接基部分；

[0126] (iii)与所述连接基部分缔合的至少一种治疗剂；和

[0127] (iv)任选地可与纳米粒子缔合的至少一种额外的剂。

[0128] 具有本发明的递送系统在生物条件下离解的能力，多级系统提供了一种或多种以下的优势：(1)多级系统允许通过多种机制运送治疗剂穿过组织屏障；(2)在剂直接与纳米粒子缔合的情形下，治疗剂可从连接基或从纳米粒子离解并因此可递送至施用递送系统的受试者身体中的特定的靶向组织或器官；和(3)被修饰的纳米粒子，包括聚合物纳米粒子和连接基部分(无治疗剂)可进一步经过另外的屏障组织，增强他们的水合作用并引起另外的治疗效果；和(4)在纳米粒子是在囊核内也容纳剂的纳米囊的情况下，他们可允许多种治疗剂的同时递送与定位。

[0129] 因此，在本发明的递送系统中，每一种组分可被设计以具有单独的预期功能，其可与另外组分的预期功能不同。例如，可设计以特定的部位为靶的治疗剂，其可与连接基部分或裸露的纳米粒子的靶部位不同并因此克服或绕过特定的生物屏障，其可与系统作为整体来克服或绕过生物屏障不同。例如，在至少一种剂是连接至纳米粒子的抗体的情形下，它可结合至表皮或真皮中的细胞表面上的特异性抗原，同时在纳米粒子核内的剂可通过简单的扩散被较早地释放。此外，所结合的剂可主要从纳米粒子释放，同时纳米粒子可更缓慢地被分裂或被生物降解且作为PLA或PGA单体通过真皮被清除。

[0130] 本发明还提供了根据本发明的递送系统的制备步骤，步骤包括：

[0131] -获得纳米粒子，如本文定义的；

[0132] -在允许纳米粒子的表面和连接基部分之间的缔合的条件下使所述纳米粒子与连接基部分反应，以因此获得表面被修饰的纳米粒子；和

[0133] -将表面被修饰的纳米粒子与至少一种剂接触，例如，治疗的或非治疗的，以允许在连接基的端基之间发生缔合；以因此获得根据本发明的递送系统。

[0134] 在一些实施方案中，连接基部分可在与纳米粒子接触之前与治疗剂缔合且该步骤可因此包括：

[0135] -获得纳米粒子，如本文定义的：

[0136] -获得缔合连接基部分的治疗剂；和

[0137] -将缔合连接基的治疗剂与所述纳米粒子反应以允许至少所述连接基的部分与纳米粒子的表面缔合。

[0138] 在一些实施方案中，递送系统/多级系统包括与油基半胱氨酸酰胺缔合的纳米粒子，其锚固在纳米粒子的界面处从而可容易地应用至多种具有不同分子量的PLA和PLGA聚合物混合物，因此产生多种硫醇化的纳米粒子。

[0139] 连接过程不要求形成粒子的聚合物的在先化学修饰。这通过利用分子连接基获得，例如，具有非共价地锚固至粒子的聚合物基体或聚合物纳米囊壁的亲脂性部分和包括可以在后续的步骤中直接地或通过马来酰亚胺基团活化而结合所需治疗剂的硫醇化合物的第二部分的油基半胱氨酸酰胺。这种方法消除了调整不同的纳米粒子组合物用于每一种不同的治疗剂的需求，并使得可被用于不同的治疗用途的通用的连接基(具有活性治疗剂)成为可能。

[0140] 除了采用可用于化学缔合治疗剂至连接基的方法，例如，碳化二亚胺介导的共轭，被硫醇修饰的纳米粒子表面还可或可选地被用于螯合作用和至关重要的电解质的经皮递送，电解质例如二价金属，诸如铜、硒、钙、镁和锌。硫醇化的纳米粒子还可作为递送系统以螯合不需要的过量的金属，且从而减少由金属催化的ROS(活性氧物质)介导的对皮肤的毒害作用。

[0141] 本发明还提供了聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，所述纳米粒子与至少一种剂(治疗的或非治疗的)表面缔合并具有至多500nm的平均直径，纳米粒子通过包括以下的步骤可获得：

[0142] -获得具有至多500nm平均直径的PLGA纳米粒子，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量；

[0143] -在允许纳米粒子表面和连接基部分之间缔合的条件下使所述纳米粒子与连接基部分反应，以因此获得表面被修饰的纳米粒子；和

[0144] -将表面被修饰的纳米粒子与选自治疗剂或非活性剂的至少一种剂接触，以允许连接基的端基与所述至少一种剂之间发生缔合。

[0145] 还提供了用于制备聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子的步骤，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，所述纳米粒子与至少一种剂表面缔合并具有至多500nm的平均直径，步骤包括：

[0146] -获得具有至多500nm的平均直径的PLGA纳米粒子，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量；

[0147] -在允许纳米粒子表面和连接基部分之间缔合的条件下使所述纳米粒子与连接基部分反应，以因此获得表面被修饰的纳米粒子；和

[0148] -将表面被修饰的纳米粒子与选自治疗剂或非活性剂的至少一种剂接触，以允许连接基的端基与所述至少一种剂之间发生缔合。

[0149] 在一些实施方案中，在步骤和因此产生的产物中，连接基部分(例如，油基半胱氨酸酰胺)在与纳米粒子缔合之前与至少一种剂缔合。至少一种剂通常为治疗剂。

[0150] 进一步提供了用于制备聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子的步骤，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，所述纳米粒子与至少一种剂表面缔合并具有至多500nm的平均直径，步骤包括：

[0151] -获得具有至多500nm平均直径的PLGA纳米粒子，PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量。

[0152] -将所述纳米粒子与选自治疗剂或非治疗剂的至少一种剂反应，以允许至少一种剂与所述纳米粒子的表面之间的缔合。

[0153] 还提供了具有至多500nm平均直径的聚乳酸(PLA)纳米粒子，PLA具有高达10,000Da的平均分子量。

[0154] 在一些实施方案中，PLA具有在1,000和10,000Da之间的平均分子量。在其他实施方案中，PLA具有在1,000和5,000Da之间的平均分子量。在另外的实施方案中，PLA具有在1,000和3,000Da之间的平均分子量。在仍然其他实施方案中，PLA具有约1,000、约2,000、约3,
000、约4,000或约5,000Da的平均分子量。

[0155] 进一步提供了油基半胱氨酸酰胺在制备用于递送治疗剂至受试者的递送系统的过程中的用途，所述过程包括使所述油基半胱氨酸酰胺与待被递送至所述受试者的治疗剂反应。

[0156] 还提供了用于在与至少一种纳米粒子缔合中使用的油基半胱氨酸酰胺。

[0157] 进一步提供了与油基半胱氨酸酰胺化学缔合(例如，通过共价键键合)的大分子。

[0158] 还提供了其表面具有多个表面暴露的硫醇基的PLGA纳米粒子，所述硫醇基被活化用于与选自治疗剂和非治疗剂的至少一种剂缔合，如本文公开的。在一些实施方案中，所述硫醇基是油基半胱氨酸酰胺。

[0159] 本申请提供了以下项目：

[0160] 项目1.一种具有至多500nm的平均直径的聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子，所述PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，其中所述纳米粒子与选自与所述纳米粒子的表面共轭或缔合的亲水性治疗剂和被包含在所述纳米粒子内的亲脂性治疗剂的至少一种剂缔合。

[0161] 项目2.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述PLGA具有在2,000和10,000Da之间的平均分子量。

[0162] 项目3.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述PLGA具有在2,000和7,000Da之间的平均分子量。

[0163] 项目4.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述PLGA具有在2,000和5,000Da之间的平均分子量。

[0164] 项目5.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述PLGA具有在4,000和20,000Da之间、或在4,000和10,000Da之间、或在4,000和5,000Da之间的平均分子量。

[0165] 项目6.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述PLGA具有约2,000、约4,500、约5,000、约7,000、或约10,000Da的平均分子量。

[0166] 项目7.根据项目1至6中任一项所述的纳米粒子，其中所述PLGA聚合物是聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)的共聚物。

[0167] 项目8.根据项目7所述的纳米粒子，其中所述共聚物选自嵌段共聚物、无规共聚物和接枝共聚物。

[0168] 项目9.根据项目8所述的纳米粒子，其中所述共聚物是无规共聚物。

[0169] 项目10.根据项目9所述的纳米粒子，其中PLA和PGA中的每一种的平均分子量，独立于另一种地，在2,000和20,000Da之间。

[0170] 项目11.根据项目7所述的纳米粒子，其中PLA单体过量存在于所述PLGA中。

[0171] 项目12.根据项目11所述的纳米粒子，其中PLA对PGA的摩尔比选自95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45和50:50。

[0172] 项目13.根据项目12所述的纳米粒子，其中PLA对PGA的摩尔比为50:50(1:1)。

[0173] 项目14.根据项目1至13中任一项所述的纳米粒子，其中所述平均直径在约100和200nm之间。

[0174] 项目15.根据项目1至13中任一项所述的纳米粒子，其中所述平均直径在约50和100nm之间。

[0175] 项目16.根据项目1至13中任一项所述的纳米粒子，其中所述平均直径在约50和75nm之间。

[0176] 项目17.根据项目9所述的纳米粒子，其中所述PLGA是等摩尔的PLA和PGA的无规共聚物，其具有至少4,500Da的平均分子量并具有在100和200nm之间的平均直径。

[0177] 项目18.根据项目1至17中任一项所述的纳米粒子，其呈纳米囊或纳米球的形式。

[0178] 项目19.根据项目1至18中任一项所述的纳米粒子，其中所述至少一种治疗剂被选择以引起、增强、抑制或削弱与医疗病症相关的至少一种效果。

[0179] 项目20.根据项目19所述的纳米粒子，其中所述治疗剂选自维生素、蛋白、抗氧化剂、肽、多肽、脂质、碳水化合物、激素、抗体、单克隆抗体、疫苗、预防剂、诊断剂、造影剂、核酸、营养剂、分子量小于约1,000Da或小于约500Da的小分子、电解质、药物、免疫剂和前述的任何组合。

[0180] 项目21.根据项目20所述的纳米粒子，其中所述至少一种治疗剂是大分子。

[0181] 项目22.根据项目21所述的纳米粒子，其中所述大分子是亲脂性的。

[0182] 项目23.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述至少一种治疗剂选自降血钙素、环孢菌素、胰岛素、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、可的松以及强的松。

[0183] 项目24.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述至少一种治疗剂具有高于1,000Da的分子量。

[0184] 项目25.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述至少一种治疗剂具有至多300Da的分子量。

[0185] 项目26.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述至少一种治疗剂具有在500和1,000Da之间的分子量。

[0186] 项目27.根据项目1至26中任一项所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子还与至少一种非活性剂缔合。

[0187] 项目28.根据项目27所述的纳米粒子，其中所述至少一种非活性剂被选择以调节所述纳米粒子的至少一种特征，所述特征选自尺寸、极性、疏水性/亲水性、电荷、反应性、化学稳定性、清除率、分布和靶向性。

[0188] 项目29.根据项目27所述的纳米粒子，其中所述非活性剂为具有至少5个碳原子的大体线性的碳链，并在所述线性碳链中可以具有或可以不具有一个或多个杂原子。

[0189] 项目30.根据项目27所述的纳米粒子，其中所述非活性剂选自脂肪酸、氨基酸、脂肪族或非脂肪族分子、脂肪族硫醇和脂肪族胺。

[0190] 项目31.根据项目30所述的纳米粒子，其中所述非活性剂为脂肪氨基酸(烷基氨基酸)。

[0191] 项目32.根据项目26所述的纳米粒子，其中所述烷基氨基酸的烷基部分具有在10个和30个之间的碳原子并可以是直链的或支链的、饱和的、半饱和的或不饱和的。

[0192] 项目33.根据项目26或27所述的纳米粒子，其中所述烷基氨基酸的氨基酸部分可以选自天然的或非天然的氨基酸，和/或选自α-和/或β-氨基酸。

[0193] 项目34.根据项目1至33中任一项所述的纳米粒子，其中所述非活性剂为聚乙二醇(PEG)。

[0194] 项目35.根据项目1至33中任一项所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子未被聚乙二醇化。

[0195] 项目36.根据项目27所述的纳米粒子，其中所述至少一种非活性剂被缔合以被包含在所述纳米粒子的核内或所述纳米粒子的基体内。

[0196] 项目37.根据项目36所述的纳米粒子，其中所述至少一种非活性剂与所述纳米粒子的表面缔合。

[0197] 项目38.根据项目1至37中任一项所述的纳米粒子，其中至少一种治疗剂与所述纳米粒子的表面缔合且至少一种不同的治疗剂被缔合以被包含在所述纳米粒子的核内或所述纳米粒子的基体内。

[0198] 项目39.根据项目38所述的纳米粒子，其中所述至少一种亲水性治疗剂或至少一种亲水性非活性剂通过一个或多个连接基部分与所述纳米粒子缔合。

[0199] 项目40.根据项目39所述的纳米粒子，其中所述一个或多个连接基部分具有能够与所述纳米粒子缔合的第一部分和能够与所述非活性剂缔合的第二部分。

[0200] 项目41.根据项目40所述的纳米粒子，其中所述连接基是具有至少10个碳原子的烷基链的脂肪半胱氨酸。

[0201] 项目42.根据项目41所述的纳米粒子，其中所述连接基是油基半胱氨酸酰胺。

[0202] 项目43.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述至少一种治疗剂通过选自共价键键合、静电键合和氢键键合的化学缔合，或通过所述剂的至少一部分与所述纳米粒子的物理缔合与所述纳米粒子缔合。

[0203] 项目44.根据项目43所述的纳米粒子，其中所述缔合是不稳定的。

[0204] 项目45.根据项目1所述的纳米粒子，其中所述至少一种亲水性治疗剂通过一个或多个连接基部分与所述纳米粒子缔合。

[0205] 项目46.根据项目45所述的纳米粒子，其中所述一个或多个连接基部分具有能够与所述纳米粒子缔合的第一部分和能够与所述治疗剂缔合的第二部分。

[0206] 项目47.根据项目46所述的纳米粒子，其中所述连接基部分为脂肪氨基酸(烷基氨基酸)。

[0207] 项目48.根据项目47所述的纳米粒子，其中所述烷基氨基酸的烷基部分具有在10个和30个之间的碳原子并可以是直链的或支链的、饱和的、半饱和的或不饱和的。

[0208] 项目49.根据项目47或48所述的纳米粒子，其中所述烷基氨基酸的氨基酸部分可以选自天然的或非天然的氨基酸，和/或选自α-和/或β-氨基酸。

[0209] 项目50.根据项目49所述的纳米粒子，其中所述连接基是具有至少10个碳原子的烷基链的脂肪半胱氨酸。

[0210] 项目51.根据项目50所述的纳米粒子，其中所述连接基为油基半胱氨酸酰胺。

[0211] 项目52.一种其表面具有多种治疗剂的聚合物纳米粒子，所述治疗剂的每一种通过油基半胱氨酸酰胺与所述纳米粒子缔合。

[0212] 项目53.根据项目52所述的聚合物纳米粒子，所述聚合物纳米粒子是选自聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-乙交酯共聚物)(PLG)、聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)、聚(丙交酯)、聚乙醇酸(PGA)、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)和/或其共聚物的聚合物材料。

[0213] 项目54.根据项目53所述的聚合物纳米粒子，其中所述聚合物材料选自PLA、PGA和PLGA。

[0214] 项目55.根据项目54所述的聚合物纳米粒子，其中所述聚合物纳米粒子是PLGA。

[0215] 项目56.一种组合物，所述组合物包含至少一种根据项目1至55中任一项所述的纳米粒子。

[0216] 项目57.根据项目56所述的组合物，所述组合物为药物组合物。

[0217] 项目58.根据项目57所述的组合物，所述组合物适合于透皮施用治疗剂。

[0218] 项目59.根据项目57所述的组合物，所述组合物用于穿过皮肤层来局部施用治疗剂。

[0219] 项目60.根据项目58或59所述的组合物，所述组合物用于递送治疗剂穿过角质层。

[0220] 项目61.根据项目58所述的组合物，其中所述透皮施用导致治疗剂递送进入受试者的循环系统。

[0221] 项目62.根据项目57所述的组合物，所述组合物用于治疗选自痤疮、牛皮癣、白癜风、瘢痕疙瘩、灼伤、疤痕、干燥病、鱼鳞癣、角化症、角皮病、皮炎、瘙痒、湿疹、皮肤癌、和胼胝的皮肤病理。

[0222] 项目63.根据项目56至62中任一项所述的组合物，其中所述组合物是基本上不含水的。

[0223] 项目64.根据项目56所述的组合物，所述组合物适合于通过注射施用治疗剂。

[0224] 项目65.根据项目56所述的组合物，所述组合物适合于口服施用治疗剂。

[0225] 项目66.根据项目56所述的组合物，所述组合物适合于眼部施用治疗剂。

[0226] 项目67.根据项目66所述的组合物，其中所述眼部施用是通过注射。

[0227] 项目68.一种递送系统，其包括：(i)如项目1中所定义的PLGA纳米粒子；和(ii)与所述纳米粒子缔合的至少一种治疗剂，所述至少一种治疗剂任选地通过具有的连接基部分与所述表面缔合，或可选地被包含在所述纳米粒子内。

[0228] 项目69.根据项目1至55中任一项所述的纳米粒子用于制备药物组合物的用途。

[0229] 项目70.根据项目69所述的用途，其中所述药物组合物适用于作为用于局部地、口服地、通过吸入、经鼻地、透皮地、经眼部地或非肠道地运送治疗剂进入受试者的循环系统的递送系统。

[0230] 项目71.根据项目70所述的用途，其中所述药物组合物用于透皮递送治疗剂。

[0231] 项目72.根据项目69至71中任一项所述的用途，其中所述递送系统适用于促进靶向的治疗剂递送及控释施用。

[0232] 项目73.根据项目71所述的用途，其中所述药物组合物适用于递送治疗剂穿过皮肤层。

[0233] 项目74.根据项目69至73中任一项所述的用途，其中所述治疗剂是大分子。

[0234] 项目75.一种用于透皮递送大分子的药物组合物，所述组合物包含至少一种根据项目1至55中任一项所述的纳米粒子，所述纳米粒子与治疗大分子缔合，所述缔合任选地是通过至少一个连接基。

[0235] 项目76.根据项目75所述的组合物，其中所述大分子被局部地递送穿过皮肤层或进入受试者的循环系统。

[0236] 项目77.根据项目76所述的组合物，其中所述皮肤层是角质层。

[0237] 项目78.根据项目75所述的组合物，其中所述连接基是油基半胱氨酸酰胺。

[0238] 项目79.一种眼用组合物，所述眼用组合物包含至少一种根据项目1至55中任一项所述的纳米粒子，所述纳米粒子与治疗大分子缔合，所述缔合任选地是通过至少一个连接基。

[0239] 项目80.根据项目79所述的组合物，所述组合物呈适于眼内注射的形式或呈滴眼液的形式。

[0240] 项目81.一种局部制剂，所述制剂包含至少一种根据项目1所述的纳米粒子。

[0241] 项目82.根据项目81所述的制剂，其中所述至少一种治疗剂是大分子。

[0242] 项目83.根据项目81所述的制剂，其中所述至少一种治疗剂选自降血钙素、环孢菌素、胰岛素、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、可的松以及强的松。

[0243] 项目84.油基半胱氨酸酰胺在制备用于向受试者递送至少一种治疗剂的递送系统的方法中的用途。

[0244] 项目85.油基半胱氨酸酰胺，其用于与至少一种纳米粒子缔合。

[0245] 项目86.一种与油基半胱氨酸酰胺化学缔合的大分子。

[0246] 项目87.一种在其表面具有多个表面暴露的硫醇基团的PLGA纳米粒子，所述硫醇基团被活化以便与选自治疗剂和非治疗剂的至少一种剂缔合。

[0247] 项目88.根据项目87所述的纳米粒子，其中所述硫醇基团是油基半胱氨酸酰胺。

[0248] 项目89.一种聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子，所述PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，所述纳米粒子与至少一种剂表面共轭并具有至多500nm的平均直径，所述纳米粒子是可通过以下方法获得的，所述方法包括：获得具有至多500nm平均直径的PLGA纳米粒子，所述PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量；在允许所述纳米粒子的表面和连接基部分之间缔合的条件下使所述纳米粒子与所述连接基部分反应，以因此获得表面被修饰的纳米粒子；和将所述表面被修饰的纳米粒子与选自治疗剂或非活性剂的至少一种剂接触，以允许在所述连接基的端基与所述至少一种剂之间发生缔合。

[0249] 项目90.一种用于制备聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子的方法，所述PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，所述纳米粒子与至少一种剂表面缔合并具有至多
500nm的平均直径，所述方法包括：获得具有至多500nm的平均直径的PLGA纳米粒子，所述PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量；在允许所述纳米粒子的表面和连接基部分之间缔合的条件下使所述纳米粒子与所述连接基部分反应，以因此获得表面被修饰的纳米粒子；和将所述表面被修饰的纳米粒子与选自治疗剂或非活性剂的至少一种剂接触，以允许在所述连接基的端基与所述至少一种剂之间发生缔合。

[0250] 项目91.根据项目89所述的纳米粒子或根据项目90所述的方法，其中所述连接基部分在与所述纳米粒子缔合之前与所述至少一种剂缔合。

[0251] 项目92.根据项目89所述的粒子或根据项目90所述的方法，其中所述剂是治疗剂。

[0252] 项目93.根据项目89所述的粒子或根据项目90所述的方法，其中所述连接基部分是油基半胱氨酸酰胺。

[0253] 项目94.一种用于制备聚(乳酸乙醇)酸(PLGA)纳米粒子的方法，所述PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量，所述纳米粒子与至少一种剂表面缔合并具有至多
500nm的平均直径，所述方法包括：获得具有至多500nm的平均直径的PLGA纳米粒子，所述PLGA具有在2,000和20,000Da之间的平均分子量；使所述纳米粒子与选自治疗剂或非治疗剂的至少一种剂反应，以允许在所述至少一种剂与所述纳米粒子的表面之间发生缔合。

[0254] 附图简述

[0255] 为了理解本发明并了解如何在实际中实施本发明，现在将仅通过非限制性的实施例并参考附图描述实施方案，其中：

[0256] 图1A-B是在碳网的不同区域的空白PLGA4500纳米粒子(图1A)和在碳网的不同区域的在4℃储存一个月后的空白PLGA4500纳米粒子(图1B)的CRYO-TEM图像。

[0257] 图2A-B是在碳网的不同区域的装载DHEA的PLGA4500纳米囊(图2A)和在碳网的不同区域的装载DHEA的PLGA50000纳米囊(图2B)的CRYO-TEM图像。

[0258] 图3是在局部施用不同的NIR-PLGA纳米球制剂后(2.25mg/cm2)3个多小时，不同的连续的胶带剥离的荧光图像的集合。使用 红外成像系统执行扫描。

[0259] 图4A-D是在局部施用包含DiD的纳米囊或纳米球(4.5mg/cm2)后2小时，整个皮肤样品的重建的荧光图像的描绘。图4A-装载DiD的PLGA4500纳米球；图4B-装载DiD的PLGA50000纳米球；图4C-装载DiD的对照溶液；图4D-装载DiD的PLGA4500纳米囊。使用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜执行Z堆栈扫描。

[0260] 图5A-E是在局部施用不同的荧光纳米囊或纳米球(3.75mg/cm2)后2小时，整个皮肤样品的重建的荧光图像的描绘。图5A-包含DiD并共轭若丹明B的PLGA4500纳米球；图5B-包含DiD并共轭若丹明B的PLGA4500纳米囊；图5C-包含若丹明B的胶乳纳米球；图5D-共轭DiD和若丹明B的PLGA4500水分散液对照；图5E-包含共轭DiD和若丹明B的PLGA4500MCT的水分散液对照。使用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜执行Z堆栈扫描。

[0261] 图6A-B展示使用27μm增量光学切片，在局部施用不同的包含DiD的RhdB-PLGA制剂(3.75mg/cm2)后2小时，DiD(图6A)和若丹明B(图6B)的累积荧光强度随皮肤深度的变化。

[0262] 图7A-D局部施用包含DID的RhdB-PLGA NP(图7A)和NC(图7B)和他们各自的对照(图7C和图7D)(3.75mg/cm2)后2小时的8μm厚的垂直皮肤切片的CLSM图像。条＝100μm。

[0263] 图8展示使用27μm增量光学切片，在局部施用包括不同的含有若丹明B的制剂的PLGA纳米球、纳米囊和乳液纳米球(3.75mg/cm2)后2小时，若丹明B的累积荧光强度随皮肤深度的变化。

[0264] 图9A-D在不同的放射性纳米载体和他们各自的对照的温育之后，[3H]DHEA(图9A3
和图9C)和[H]COE(图9B和图9D)在有活力的表皮(图9A和图9B)和真皮(图9C和图9D)的皮肤隔室(skin compartment)中随时间的分布。图9A和图9C：带正电荷(◆)和负电荷(■)的[3H]DHEA NC和他们各自的油对照(◇，□)；图9B和图9D：[3H]COE NS(▲)，[3H]COE NC(●)和他们各自的对照(Δ，○)。带正电荷(*)和负电荷(**)的DHEA NC与他们各自的对照相比的显著差异(P值<0.05)。

[0265] 图10展示在装载正的(◆)和负的(■)DHEA的NC和他们各自的油性对照(◇，□)的局部施用之后，记录在受体隔室(receptor compartment)流体中的[3H]DHEA的量。值是平均数±SD。带正电荷(*)和负电荷(**)的DHEA NC在他们各自的对照相比的显著差异(P值<0.05)。

[0266] 图11A-C是在不同的放大倍率下使用与12nm金粒子共轭的山羊抗人IgG第二抗体，在温育超过1h后，西妥昔单抗的免疫纳米粒子(INP)的透射电子显微镜显微照片。

[0267] 图12A-C是说明西妥昔单抗的免疫纳米粒子与A549细胞结合的流式细胞术直方图。所描绘的是处于递增浓度(0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml)(图12C)的表面被活化的纳米粒子(图12A)和利妥昔单抗(同种型匹配)的免疫纳米粒子(图
12B)。与利妥昔单抗的免疫纳米粒子(全背景直方图)的1μg/ml等量物相比的西妥昔单抗的INP的0.1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml等量物。

[0268] 图13A-E是在特异性免疫组织化学染色之后，不同的免疫和参考的纳米粒子制剂2 2
的局部施用(6mg/cm等同于0.12mg MAb/cm)后3h，整个皮肤标本的重建的荧光图像。使用Olympus共聚焦显微镜执行扫描。

[0269] 图14描绘了在不同的免疫和参考纳米粒子制剂的局部施用(6mg/cm2等同于0.12mg MAb/cm2)和特异性免疫组织化学染色之后，在直到12个连续的～35μm的切片单独计算的每cm2的单个荧光强度。

[0270] 图15描绘了在不同的免疫和参考纳米粒子制剂的局部施用(6mg/cm2等同于0.12mg MAb/cm2)和特异性免疫组织化学染色之后，计算直到385μm的每cm2的推测的累积荧光强度。

[0271] 图16描绘了在不同的免疫和参考纳米粒子制剂的局部施用(6mg/cm2等同于0.12mg MAb/cm2)和特异性免疫组织化学染色之后，计算直到385μm的每cm2的累积的荧光强度的计算的AUC值。

[0272] 发明详述

[0273] Ⅰ.乳酸和乙醇酸递送至皮肤

[0274] 使用的是临床上被广泛接受的PLGA聚合物和具有特定分子量的PLA粒子，以制备具有某种粒径的被应用到皮肤上、渗入真皮的上层并以被控制的方式随时间释放乳酸和乙醇酸或只有乳酸的纳米粒子，其是允许皮肤的延长的和持续的水合且无害的天然保湿因子。

[0275] PLGA纳米粒子自身，空的或装载合适的活性物，因他们在皮肤中降解导致逐步并持续释放乳酸和乙醇酸而被用作延长的有效保湿成分。即使纳米粒子渗透进入表皮的深层或甚至真皮，它们也不会引起任何损害，如前所述由于水解产物乳酸和乙醇酸是被天然清除或排泄的。

[0276] 应该强调的是作为本发明的组合物的有效保湿成分的PLGA(或PLA)，不是仅用作用于其他成分递送至皮肤的载体，尽管本发明还包含其他有益的有效成分被使用的可能性。因此，根据本发明的组合物预期用于局部施用，即，包含用于局部施用和用于其他用途的载体。

[0277] 本发明的纳米粒子通常具有小于500nm的尺寸。通常，纳米粒子具有在100和200nm之间或50和100nm之间的尺寸范围。

[0278] 在一些实施方案中，PLGA的分子量和PLA与PGA之间的比是定制的以致纳米粒子具有以下的特征：

[0279] (a)渗透进入皮肤至至少10层浅表表皮层；

[0280] (b)渗透进入皮肤至至少4-20微米的深度；

[0281] (c)在他们渗透进入的皮肤层(通常约角质层中的15％)中生物降解；

[0282] (d)乳酸和乙醇酸或只有乳酸的缓释持续超过24小时、优选超过72小时、更优选约1周的时间段。

[0283] 不希望被理论束缚，似乎粒子的尺寸(其影响渗透率和渗透的深度)、PLA和PGA的比以及PLGA的分子量之间通过一些组合可获得以上特征的这样的方式相互影响。参数的一些改变可互相中和。

[0284] 在一些实施方案中，PLA:PGA的比是85:15；72:25；或50:50。在一些实施方案中，比是50:50。

[0285] 在其他实施方案中，PLGA的分子量从2,000到10,000Da的范围。在一些实施方案中，比在2,000和4,000之间。

[0286] 在其他实施方案中，可采用PLA粒子本身，在此实施方案中PLA分子量在4,000和20,000的范围。

[0287] Ⅱ.不溶性化合物在纳米粒子中的包封策略-装载DHEA的PLGA纳米粒子的潜力[0288] 在本发明中，纳米粒子可装载活性物质诸如维生素、肽以及其他如在上文公开的。

[0289] 人具有分泌大量脱氢表雄酮(DHEA)和其硫酸盐的衍生物(DHEAS)的肾上腺。人类血浆DHEA(S)水平的显著特征是他们随着年龄的增长大大减少。研究者已假定DHEA(S)水平的这种年龄相关的下降可解释一些与年龄增长相关的退行性病变。已经确定了DHEA(S)的三种作用机制。DHEA和DHEA(S)是睾酮和雌二醇的前体。DHEA(S)是神经类固醇，其通过与神经递质受体的特异性相互作用调节神经元兴奋性，且DHEA是钙门控钾通道的催化剂。

[0290] 包括280名年龄在60岁的健康个体(140名男性和140名女性)并从头至尾用(接近)DHEA(50mg/天)的生理剂量处理超过1年的随机、安慰剂对照的临床试验已产生非常积极的效果。评价了DHEA的替代治疗对情绪、幸福、认知和性功能、骨质、身体组成、血管危险因素、免疫功能和皮肤的影响。有趣的是，根据水合、表皮厚度、皮脂产生、和皮肤色素沉着观察到皮肤状态的改善，特别是在女性中。此外，在施用这50mg/天的DHEA超过一年后没有观察到有害的结果。

[0291] 众所周知，DHEA可能通过细胞外基质蛋白的调节和降解与皮肤的衰老过程相关。论证了DHEA可通过降低培养的皮肤成纤维细胞中的基质金属蛋白酶(MMP)-1合成并增加基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)的产生增加前胶原合成并抑制胶原降解。DHEA(5％)在乙醇：橄榄油(1:2)中被局部地施用于志愿者的臀部皮肤12次超过4周，并被发现显著增强年老的和年轻的皮肤中前胶原α1(I)mRNA和蛋白的表达。另一方面，局部的DHEA显著降低MMP-1mRNA和蛋白的基础表达，但是增强年老皮肤中TIMP-1蛋白的表达。这些最新的结果表明使用DHEA作为抗皮肤衰老剂的可能性。

[0292] 基于全部报道的结果，局部施用外源性DHEA可促进表皮的角质化、通过增加皮脂的内源性产生和分泌增强皮肤水合作用随后加强皮肤的屏障效应、通过抑制胶原和结缔组织的流失治疗真皮萎缩并最终可调节皮肤的色素沉着。这些特性使得DHEA有效选择作为抗衰老的有效成分，只要DHEA被充分地溶解在局部制剂中，便能够在经皮施用后从制剂向皮肤扩散并可完全地生物利用于皮肤渗透。确实，DHEA在常见的化妆品和制药溶剂诸如水、极性油和植物油中呈现复杂的溶解度限制。DHEA在水中几乎不可溶(0.02mg/ml)且已知因其在局部常规制剂中即使是以小于0.5％的浓度也趋于快速沉淀，产生一些难于控制的并呈现非常慢的溶解速率的多晶型的晶体形式。此外，DHEA在亲脂相中显示低的溶解度，具有在中链甘油三酯中1.77％的最大溶解度。最适合的局部剂型是o/w乳状液，其中DHEA应被溶解在亲脂相中。然而，这种溶液是非常难于获得的，原因是需要非常高浓度的油相(超过70％)以获得引起足够的功效活性的DHEA浓度(约0.5％w/v)。具有如此高的油相浓度的局部用产品将是令人不舒服的且无吸引力的，排除他们作为化妆产品的有用性。

[0293] DHEA的再结晶过程毫无疑问应该被避免，由于其可潜在地造成治疗剂生物利用度和功效显著变化。药物晶体需要在扩散和渗透浅表皮肤层之前首先重新溶解在皮肤中。此过程不大可能容易发生并将显著影响产品的活性。另外，再结晶过程可影响制剂的稳定性和物理外观。因此，对制备令人愉快的并方便的o/w局部用制剂有明显需求，其中装载DHEA的纳米粒子可以以从制剂中沉淀出的足够的浓度被分散。此外，嵌入DHEA的纳米载体应该被包含在局部用制剂中，其可促进活性成分渗透最需要其作用的表皮和真皮层内部。

[0294] Ⅲ.使用硫醇活化的纳米粒子递送表面结合的大分子和矿物进入皮肤

[0295] 利用透皮递送的市售产品主要限制于低分子量的亲脂性药物(MW<500Da)[16]，具有较大分子量(MW>500Da)面临渗透困难[17]。由于角质层针对大分子不能渗透的性质，合适的渗透促进剂应该大幅度改善大分子穿过皮肤的运送。已形成多种技术用于这个目的，包括微针、电穿孔、激光产生的压力波、高热、低频超声波导入、电离子透入疗法、渗透促进剂、或这些方法的组合的使用。许多渗透增强技术面临固有的挑战，诸如尺度和安全关注[17]。本发明通过无损方法，使用大分子至硫醇化的纳米粒子的表面结合技术，提出主要是亲水性大分子的递送。

[0296] 硫醇化NP-现有技术

[0297] 使用马来酰亚胺部分官能化纳米粒子，其随后与硫醇化蛋白共轭。可选地，可用硫醇基团官能化纳米粒子随后与蛋白上的马来酰亚胺残基共轭。传统上，此类递送系统已主要被用于装载药物的纳米粒子的靶向递送，主要至恶性肿瘤，其中表面共轭蛋白被简单用作识别疾病特异性表位的靶向部分。

[0298] IV.实验

[0299] 1.装载DiD的PLGA NP和NC和/或共轭若丹明B的PLGA NP或NCS的制备：

[0300] 将PLGA以0.6％w/v的浓度溶解在含有0.2％w/v吐温80的丙酮中。如果制备NC，将辛酸或MCT以0.13％w/v的浓度同样添加至有机相中。此外如果制备装载DiD的NP，将等份的丙酮DiD溶液以1mg/ml的浓度同样添加至有机相中，得到15-30μg/ml的终浓度。如果制备共轭若丹明B的PLGA NP或NC，将0.03％w/v若丹明B标记的PLGA与0.57％w/v未标记的PLGA一起溶解在丙酮中。将有机相添加至含有0.1％w/v HS 15的水相。以900rpm搅拌悬浮液超过15分钟并随后通过蒸发浓缩至30mg/ml的最终聚合物浓度。水和油对照组合物与以上描述的配方一致，只是没有聚合物的存在。

[0301] 2.[3H]DHEA和[3H]COE PLGA固体纳米粒子的包封和评价

[0302] DHEA NP制备

[0303] 使用界面沉积法[18]制备装载DHEA的PLGA纳米囊。将DHEA溶解在辛酸/MCT/油酸中和丙酮中。如果制备带正电荷的DHEA NC，将阳离子脂质DOTAP[1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷]以0.1％w/v的浓度添加至有机相中。如果制备放射性DHEA NC，15μCi氚标记的DHEA和1mg冷DHEA一起在NC的制备过程中插入NC的油核。如果制备[3H]胆固醇油醚([3H]COE)，将80
3
和127μCi的[ H]COE分别溶解在MCT中以形成NC或简单地添加至有机相用于NP形成。在
900rpm的搅拌下将有机相逐滴加入水相中，且通过蒸发浓缩制剂至8mg/ml的聚合物浓度。
将制剂通过0.8μm的膜过滤并随后将3ml来自不同的[3H]DHEA NC用30ml PBS(pH 7.4)(Vivaspin 300,000MWCO,Vivascience,Stonehouse,UK)透析过滤(dia-filtrated)并通过
1.2μm过滤器(w/0.8μm Membrane,Pall corporation,Ann Arbor,USA)过滤。将全部制剂及他们各自的对照的放射性强度设置以致被应用的有限剂量将在总数为0.63-1.08μCi/ml的范围。将有机相和水相的组成呈现在表1中。

[0304]有机相 水相
PLGA 4500MW–150mg Solutol HS 15–50mg
辛酸–75μl 水–100ml
DHEA–10mg  
吐温80–50mg  
丙酮–50ml  

[0305] 表1：有机相和水相的组成

[0306] 粒径分析：在25℃下且使用水作为稀释剂利用ALV Noninvasive背散射高性能粒径分析仪(ALV-NIBS HPPS,Langen，Germany)实施平均直径和粒径分布测量。

[0307] ζ电势测量：使用Malvern zetasizer粒度仪(Malvern,UK)测量在HPLC级水中稀释的NP的ζ电势。

[0308] 扫描电子显微镜(SEM)与透射电子显微镜(TEM)：通过扫描与透射TEM(Philips Technai F20 100KV)执行形态学评价。通过用于负染法的磷钨酸2％(w/v)pH 6.4混合样品制备用于TEM可视化的样品。

[0309] Cryo-透射电子显微镜镜(Cryo-TEM)：

[0310] 将一滴水相放置在300目铜网(Ted Pella Ltd)上支撑的碳涂覆的多孔聚合物膜上，吸干多余的液体且通过在液态乙烷中快速骤冷至-170℃将样品玻璃化。在Vitrobot(FEI)中自动执行该过程。将被玻璃化的样品转移至液氮中用于储存。已知快速冷却来保持存在于本体溶液中的结构且从而提供了在没有干燥下关于本体溶液中的对象的形态学和聚焦状态的直接信息。使用FEI Tecnai 12G2TEM，在120kV下，用保持在-180℃下的Gatan冷冻固定器来研究样品，且将图像记录在Gatan制造的相机的慢扫描冷却电荷耦合元件CCD上。处于低剂量条件下，用数码显微图像软件包记录图像以最小化电子束辐射损伤。

[0311] 3.扩散实验

[0312] 使用具有1/0.2cm2的有效扩散区域的Franz扩散池(Crown Glass,Sommerville,NJ,USA)和8ml的接收器隔室(acceptor compartment)。受体流体(receptor fluid)是磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

[0313] 整个实验期间，通过小的磁力搅拌器持续搅拌受体室的内容物。通过控制在37℃的水循环系统将皮肤的温度保持在32℃。将有限剂量(10-50mg聚合物每池)的载体和制剂施用在皮肤的角质层或纤维素膜上。供体室(donor chamber)通向大气。记录施用的准确时间并看作每一个池的计时起点。在4、8、12和24h或26h，收集完整的受体流体并用新鲜的温度平衡的受体介质代替。从等份中测定扩散的有效成分浓度的测定。在24-或26-h时段末，用100ml的蒸馏水或乙醇洗涤皮肤表面5次。洗涤液被合并且测定等份部分(1ml)的有效成分的浓度。

[0314] 池随后被拆卸且通过如以上描述的升高温度将真皮与表皮分离。通过HPLC或其他经验证的分析技术确定有效成分的含量。此外，检查了受体介质中乳酸或乙醇酸的存在。

[0315] 4.装载DiD的PLGA NP和NC和/或共轭若丹明的PLGA NP或NCS的部位定位：

[0316] 将被切除的人皮肤或猪耳朵皮肤样品放置在具有5/11.28mm的孔径、5/8mL的受体体积和0.2/1.0cm2的有效扩散面积的Franz扩散池(PermeGear,Inc.,Hellertown,PA)上。受体流体是磷酸缓冲液，pH 7.4。整个实验期间，通过小的磁力搅拌器持续搅拌受体室的内容物。通过控制在37℃的水循环系统将皮肤的温度保持在32℃。将溶液和装载有无PLGA的捕获的DiD荧光探针或共价键键合至若丹明B的PLGA的不同的NP和NC制剂，按以下的详细方法施用在皮肤上。这种方法被采用以跟踪被捕获的DiD探针和共轭的若丹明B聚合物两者的皮肤定位。按照在以上实验部分描述的制备多种制剂。在被切割的皮肤样品上施用的每一种制剂的剂量是125μl的具有30μg/ml DiD的初始捕获的荧光含量的30mg/ml PLGA聚合物的浓度。

[0317] 在单一温育期后或以不同的时间间隔，一些皮肤样品被切开以通过共聚焦显微镜确认纳米载体在不同皮肤层的定位部位。使用组织切片的过程如下。使用4％的甲醛固定皮肤样品30分钟。将被固定的组织放置在适当的嵌入组织冷冻介质(OCT，Tissue-Tek)中的塑料立方体中。随后将皮肤样品在-80℃深度冷冻并利用Cryostat在-20℃垂直切成10μm厚的切片。随后，经处理的样品被储存在冰箱中直到进行共聚焦显微术分析。

[0318] 另外，以所选择的2h的时间间隔在Franz池温育之后，保持一些整封的皮肤样品完好并立即通过共聚焦显微术观察并进一步使用来自z-堆栈图片的3D成像重建。使用线性轮廓的纳米载体和各自的对照的荧光强度对皮肤深度(报道了计算的每一个切片的强度和整个样品的累积强度)。样品数据在表2中提供

[0319]

[0320]

[0321] 表2：局部施用的具有特定的当量剂量的每一种制剂的组成的描述

[0322] 5.[3H]DHEA NC部位定位和深皮肤层定位：

[0323] 使用Franz池扩散系统将[3H]DHEA NC制剂施用于皮肤上。通过皮肤隔室解剖技术确定[3H]DHEA在不同皮肤层的定位。将皮片猪皮(600-800μm厚)固定在具有1cm2的有效扩散面积和8ml的接收器隔室(PBS,pH 7.4)的Franz扩散池(Crown Glass,Sommerville,NJ,USA)上。以不同的时间间隔，实施皮肤隔室解剖以确认纳米载体在皮肤表面、上层胶质细胞层、表皮、真皮和受体细胞的定位部位。首先，在连续洗涤之后收集制剂的剩余部分以允许充分复苏。随后，通过适当的连续胶带剥离去除皮肤表面，贡献第一条至供体隔室。通过热升高的温度将剩余的有活力的表皮与真皮分离，并随后通过可溶的消化液化学溶解。最终受体流体也被收集并进一步被分析。

[0324] 此外，试图定量显示NC和NP在皮肤的不同层中的生物命运，将80和127μCi的[3H]胆固醇油醚([3H]COE)分别溶解在NC的油核中或捕获在NP的纳米基质中。放射性示踪剂，[3H]胆固醇油醚([3H]COE)是高度亲脂的具有log P超过15(>15)且因为鉴于其极高的亲脂性，探针不能够从纳米载体释放出，其在皮肤层内的定位反映了NC的油核或NP的纳米基质的定位。

[0325] 6.油基半胱氨酸酰胺的合成和表征

[0326] 油基半胱氨酸酰胺的合成

[0327] 在氮气流下，通过注射器向烧瓶注入油酸(OA)(2.0g，7.1mmol)、60ml干四氢呋喃和三乙胺(0.5ml，7.1mmol)。开始搅拌，且在-5至-10℃使用干冰异丙醇浴将溶液冷却至-15℃的内部温度。加入氯甲酸乙酯(0.87ml，6.1mmol)并将溶液搅拌5min。氯甲酸乙酯的加入导致内部温度升高至+8至+10℃和白色固体沉淀。在沉淀之后，仍然在干异丙醇浴中持续搅拌混合物允许达到-14℃的内部温度。通过注射器针引入烧瓶中的溶解在5％Na2CO3溶液中(10ml)的半胱氨酸(1.0g，8.26mmol)，随着手动搅拌从溶液中剧烈冒泡10min：内部温度骤然升高至25℃。随着烧瓶仍然在冷却浴中，继续搅拌持续另外的30min，且将反应混合物储存在-15℃的冰箱中过夜。在室温下将浆料与四氢呋喃(100ml)一起搅拌5min且通过布氏漏斗抽吸过滤将铵盐去除。用四氢呋喃(20ml)冲洗固体之后，使滤液穿过具有抽吸器吸引的粗孔隙率的烧结玻璃过滤漏斗中的硅胶塞(25gMerck 60230-400目)。使用乙腈(100ml)进一步洗涤漏斗且蒸发(旋转蒸发器)合并的滤液以产生粘性液体。

[0328] 油基半胱氨酸酰胺的形成经H-NMR(Mercury VX 300,Varian,Inc.,CA,USA)和LC-MS(Finnigan LCQDuo,ThermoQuest,NY,USA)确认。

[0329] 油基半胱氨酸酰胺的表征

[0330] 1H-NMR(CDCl3,δ):0.818,0.848,0.868,0.871,0.889,1.247,1.255,1.297,1.391,1.423,1.452,1.621,1.642,1.968,1.989,2.008,2.174,2.177,2.268,2.2932.320,2.348,
3.005,3.054,4.881,5.316,5.325,5.335,5.343,5.353,5.369,6.516,6.540,7.259ppm。

[0331] LC-MS：峰值：384.42。

[0332] NMR分析确认了连接基油基半胱氨酸酰胺的形成，同时LC-MS谱清楚证实了产物的分子量为385.6g/mol。

[0333] 7.表面活化的纳米粒子和大分子共轭物的制备和表征：

[0334] 使用已确定的界面沉积法制备纳米粒子[18]。将油基半胱氨酸酰胺连接基分子溶解在包含被溶解在水溶性有机溶剂中的聚合物的有机相中。随后将有机相逐滴添加至包含表面活性剂的水相中。在37℃的减压条件下将悬浮液蒸发至10ml的最终纳米粒子悬浮体积。在pH 8下将具有间隔分子的马来酰亚胺(LC-SMCC)与所需的大分子反应以便随后共轭至硫醇部分。随后将硫醇活化的NP和相关的具有分子的马来酰亚胺混合并允许在氮气气氛下反应过夜。次日，使用透析过滤法将游离的未结合的分子与共轭的NP分离。

[0335]有机相 水相
聚合物300mg Solutol HS 15 100mg
油基半胱氨酸20mg 水100ml
吐温80 100mg  
丙酮50ml  

[0336] 表3：制剂组成

[0337] 尺寸和ζ电势表征：

[0338] 使用DTS zetasizer粒度仪(Malvern，UK)在水中测量不同的NP的尺寸和ζ电势。

[0339] 不同大分子与NP的共轭效率的测定：

[0340] 使用用于定量蛋白质的量热的二辛可宁酸检定(BCA)(Pierce，IL，USA)测定大分子诸如MAb的共轭效率。

[0341] 应该注意的是本文公开的相同的步骤已被用于连接透明质酸和纳米粒子。

[0342] 8.将纳米粒子包含到无水乳膏(cream)中

[0343] 分散最终产物在无水乳膏中的优势是巨大的。NP的冷冻干燥粉末和所制备的NP的递增的量(0.1-10％)被并入不含水的新的乳膏中。这种乳膏的成分的相对量在表4中详细描述

[0344]

[0345]

[0346] 表4：成分的相对量

[0347] IV.初步结果

[0348] 纳米粒子制剂和表征

[0349] 制备荧光纳米粒子以便于纳米粒子的可视化检测。将PLA与荧光若丹明B探针共轭。随后按照在以上实验部分描述的制备纳米粒子。

[0350] 结果展示了均匀的纳米粒子制剂。由于在激发/发射560/580nm下的用若丹明荧光团标记的荧光，因而可以看见纳米粒子。纳米粒子展示52nm的平均直径和-37.3mV的ζ电势值。

[0351] 这项技术被用于检测和确定在局部施用之后纳米粒子在不同皮肤层随时间推移的定位。

[0352] 制备后一个月PLGA生物可降解NP的Cryo-TEM可视化

[0353] 在图1A中描绘了空白PLGA4500纳米粒子在碳网的不同区域的Cryo-TEM图像。纳米粒子的尺寸和形状显得相当均匀。此外，在图1B中描绘了在4℃储存一个月后空白PLGA4500纳米粒子在碳网的不同区域的cryo-TEM图像。纳米粒子处于不同的降解阶段。可以注意到的是纳米粒子在水环境中随时间推移的降解。

[0354] 装载DHEA的PLGA纳米粒子

[0355] 将DHEA包封在PLGA(4500或50000Da)纳米囊的油核内。在图2A和2B中描绘了碳网不同区域的Cryo-TEM图像。纳米囊显示球形的及纳米级的且没有观察到DHEA晶体。

[0356] 包封效率和活性物质含量的测定，将[3H]DHEA包含在MCT NC内。在PBS(pH 7.4)透析过滤之后，阳离子和阴离子NC的初始理论DHEA含量为0.49和0.52％，然而观察到的含量分别为0.18和0.15％。带正电荷和负电荷的NC的包封效率因此分别为36.5和30.4％(如在表5中显示的)。

[0357]

[0358] 表5：MCT NC内的DHEA含量和装载效率

[0359] 荧光标记的纳米球的皮肤渗透

[0360] 为评价NP的皮肤渗透，制备了包括PLGA4500或PLGA50000的纳米球，而一些聚合物用红外染料NIR-783被共价地标记。使用Franz池(2.25mg/cm2)将荧光制剂局部地施用于60岁男性的腹部的人皮肤上。3h后，洗涤皮肤样品并使用 红外成像系统(LI-COR Biosciences,NE,USA)扫描。在图3中呈现局部施用之后，不同的连续胶带剥离的荧光图像。
不被理论束缚，结果表明PLGA4500比PLGA50000渗入较深的皮肤层。这可能由于与PLGA50000相比，PLGA4500的更快的生物降解。

[0361] 荧光标记的纳米囊的皮肤渗透

[0362] 为评价纳米囊(NC)的皮肤渗透，与纳米球(NS)比较，将制剂与荧光探针DiD结合。为了定义PLGA纳米载体的生物命运，制备了用与若丹明B共价结合的PLGA涂布装载DiD荧光探针的MCT NC。在MCT不存在时，形成NP。还研究了不可降解的市售的装载若丹明B的胶乳纳米球。

[0363] 使用Franz池(4.5mg/cm2)将荧光制剂局部地施用于40岁女性的腹部的人皮肤上。2h后，洗涤皮肤样品并用Zeiss LSM710共聚焦激光扫描显微镜扫描。在图4A-D中描绘了整个皮肤样品的重建的荧光图像。结果清楚显示，与DiD对照溶液相比，所有装载DiD的纳米粒子都产生了较大的荧光值。另外，与其他纳米粒子递送系统相比，PLGA4500纳米囊呈现较好的皮肤渗透/保留。

[0364] 将双重标记的纳米载体制剂和他们各自的对照施用于50岁女性的背部人皮肤2小时。在图5A-E中描绘了整个皮肤样品的重建的荧光图像。局部处理2小时后NP和NC的3D显示NC比NP释放更多的荧光装载物，尽管两者都达到了同样的深度(接近200μm)，而各自的对照保持在浅表皮肤层。结果明确显示装载DiD的纳米粒子以与之前描述的相同的方式渗透。此外，与他们的各自的处理相比，当将基于PLGA的纳米粒子载体局部施用时，最初源自与PLGA共轭的荧光探针的若丹明B的强度要高得多(图6A-B)，还如在横截面图像中描绘的(图7A-D)。

[0365] 最终，在不可降解的若丹明B胶乳NS在30岁女性的背部人皮肤上温育2小时后，记录了差的若丹明B强度。这个结果说明当与可降解的系统相比，基于不可降解的载体具有释放其装载物的主要限制(图8)。

[0366] [3H]DHEA的NC部位定位和深皮肤层定位

[0367] 在图9A-D中报告的结果显示在不同温育时期的装载带负电荷和正电荷的[3H]DHEA的PLGA NC和他们各自的对照的局部施用之后，[3H]DHEA在皮肤隔室中的体外皮肤生物分布。在高达24h的每一个时间间隔，从供体细胞回收了来自放射性标记的DHEA应用的最初量、来自不同油对照的90％以上。当施用装载DHEA的NC时，再一次，在供体隔室以平均超过90％直至6小时，分别显著下降至在8、12和24小时记录的约80、65和55％收集了大部分放3
射性化合物。在表6中描述了[H]DHEA在上层皮肤层的分布随连续10次胶带剥离(TS)后SC深度的变化。通过液体闪烁提取并分析了每对TS，导致一系列来自每一个样品的SC的5个亚层描述。无论所施用的处理，都可以注意到在代表SC的最外层的层A和B中检测到最高水平的[3H]DHEA，且在内层C、D和E记录到同等的降低。当施用装载带负电荷和正电荷的[3H]DHEA的NC时，发生放射性化合物在不同的SC层中的与时间相关的积累。应该注意的是不考虑制剂，SC内的放射性浓度是低的(约1-2％)。可清楚观察到在施用后24h，放射性浓度在SC的内层(表6)逐步减少。然而，在有活力的皮肤隔室(表皮和真皮)中记录了装载DHEA的NC和他们各自的对照之间显著的差异。在带正电荷和负电荷的DHEA的NC的6小时温育之后，[3H]DHEA在表皮和真皮中的水平分别达到稳定的～3％和5.5％(图9)，而在表皮和真皮中与各自的油对照一起获得的[3H]DHEA水平在直至24h的所有处理期间未达到1％(图9)(P<0.05)。

[0368]

[0369] 表6：在不同的纳米囊制剂温育之后，猪皮肤的不同SC层中的[3H]DHEA随时间推移的分布。值是平均数±SD。N＝4

[0370] 当温育装载带正电荷和带负电荷DHEA的NC时，在受体隔室流体中发现放射性DHEA的水平随时间推移的增加，在1小时、8和24小时之后从施用的初始剂量分别达到0.5％、2.5％和14％。另一方面，各自的油对照在大多数时间间隔呈现低于1％放射性的恒定的[3H]DHEA水平。尽管观察到不同制剂的3小时的延迟时间，带正电荷和负电荷的NC施用之后，[3H]DHEA在受体流体中的出现显著高于来自各自的油对照。绘制了从不同处理释放的受体流体中的DHEA的总量(μg/cm2)对时间的平方根的图(图10)。从所绘制的图的斜率计算的油对照的低的慢流量值0.063(μg/cm2/h0.5)，与他们的报道的限制释放的概况相关。随后再一次，当局部施用带负电荷和正电荷的DHEA的NC时，记录到受体流体中显著较高的[3H]DHEA水平，强调了当被载入纳米载体制剂时，药物的较好的流量和较好的经皮渗透。应该强调的是在两种NC制剂之间在所有的时间点没有观察到显著差异，表明电荷的性质没有促成增强的皮肤渗透，相反地是所用的纳米结构的类型，即泡状纳米囊。

[0371] 高度亲脂的放射性化合物，[3H]COE，被引入PLGA NS和包含MCT的NC中，以试图确定当局部施用时，空的纳米载体的命运。在用PBS(pH＝7.4)渗滤之后，NS和NC包封效率分别为45％和70％。[3H]COE的无聚合物的水和油对照被制备用于体外实验。再次，在每一个温育期之后，不考虑制剂的类型，从供体隔室收集到来自氚标记的COE的初始量的90％以上(数据未显示)。表7呈现[3H]COE皮肤生物分布随在不同处理后的SC层的变化，如之前关于[3H]DHEA所描述的。温育装载[3H]COE的NS和NC长达8小时，从上层皮肤层提取到少于来自施用的剂量的1％。有趣地，在NS和NC温育12小时后，观察到层A和B中的显著增加，与之前当施用DHEA NC时报道的观察类似。尽管无显著差异，当局部施用不同的对照时，记录了与温育时期相关的[3H]COE的水平，MCT中[3H]COE的恒定的分布与[3H]COE表面活性剂溶液相比是较高的(表7)。最终，当施用纳米载体制剂和他们各自的对照时，在温育期间在有活力的间隔(表皮、真皮和受体流体)中计算出少于5％的放射性(图9)。似乎需要更多的温育时间以区分不同的COE制剂。

[0372]

[0373]

[0374] 表7：在不同的纳米囊制剂温育之后，猪皮肤的不同SC层中的[3H]COE随时间推移的分布。值是平均数±SD。N＝3

[0375] 硫醇表面活化的NP和共轭MAb的NP

[0376] 从下面的聚合物中制备硫醇表面活化的NP：

[0377] ·约48,000Da的MW的PLGA，

[0378] ·PEG-PLGA50,000和PLGA4500，

[0379] ·PEG-PLA100,000

[0380] 共轭不同MAb的免疫NP的制备

[0381] 以下的MAb成功地与硫醇化的NP的表面共轭，具有高的共轭效率(见表8)：

[0382] ·西妥昔单抗(Cetuximab)

[0383] ·利妥昔单抗(Rituximab)

[0384] ·曲妥珠单抗(Herceptin)

[0385] ·阿瓦斯丁(Avastin)

[0386]

[0387]

[0388] 表8：与相关MAb共轭的INP的特性

[0389] 使用TEM的形态学评价

[0390] 使用12nm金标记的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,PA,USA)，通过TEM观察定性确认西妥昔单抗MAb至INP的耦合。在图11A-C中观察到的每一个金黑色点代表附着在INP表面部位与金标记的IgG反应的MAb分子。可推出MAb通过连接基与INP的表面共轭且反应条件没有影响MAb至第二抗体的亲和力。

[0391] 通过流式细胞术在A549细胞系中体外确定结合力

[0392] 为了使用流式细胞术评价结合特征评价，使用0.05％的EDTA溶液分离细胞。细胞被重悬在FACS培养基中(1％BSA，0.02％叠氮化钠在PBS中)。每一次处理中采用在200μl中的200,000个细胞。在4℃以1200rpm离心细胞。随后，将细胞与天然西妥昔单抗抗体或相同浓度的西妥昔单抗免疫纳米粒子一起在冰上温育1h。使用0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml和0.5μg/ml西妥昔单抗抗体或INP的等同物。使用抗-CD-20抗体，利妥昔单抗 作为同种型匹配的不相关的未结合的对照。还将细胞与相同浓度的表面活化的NP及利妥昔单抗INP一起被温育作为阴性对照，以排除INP的非特异性结合。1h温育之后，将细胞离心并用FACS培养基洗涤2次。随后将细胞与FITC共轭的AffiniPure F(ab)’2片段山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch)一起于4℃在黑暗中温育40分钟。随后将细胞离心并用FACS培养基洗涤2次。将细胞重悬在FACS培养基中并通过流式细胞术确定荧光。结果在图12A-C中描绘。结果明确表明，以所有被评价的MAb浓度，西妥昔单抗免疫纳米粒子呈现极佳的结合特性。通过细胞与表面活化的NP(具有硫醇的NP)和同种型匹配的利妥昔单抗免疫纳米粒子一起温育将非特异性结合排除。

[0393] 免疫纳米粒子的皮肤渗透

[0394] 为评价纳米粒子增强大分子渗透进入皮肤的能力，制备了与西妥昔单抗MAb共价2 2
共轭的INP。针对相关的对照，在3h内将相当于0.12mgMAb/cm的6mg/cm 局部施用于44岁女性的腹部的人皮肤。随后，洗涤并用Cy5标记的山羊抗人第二IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,PA,USA)免疫染色皮肤样品。使用Olympus共聚焦显微镜执行重建荧光图像(图13A-E)。

[0395] 图14和15涉及相同的实验。可定性地并定量地注意到NP和INP引起更强的荧光值，具有与NP相比，INP的更多的预先公布的效果。图14清楚地展示由INP引起的每cm2的最显著的定量荧光强度。从图15和图16可以观察到INP引起的每cm2的最高累积强度，清楚表明NP促进MAb的皮肤渗透/保留。