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人GM-CSF抗原结合蛋白质
申请号 CN200880116214.8 申请日 2008-09-18 公开(公告)号 CN101861336A 公开(公告)日 2010-10-13
申请人 安姆根有限公司; 发明人 J·A·柯奇纳; K·A·布拉塞尔; K·奥尔森; J·C·埃斯科巴; D·巴罗恩;
摘要 提供了与人GM-CSF 蛋白质 结合的 抗原 结合蛋白质。还提供了编码抗原结合蛋白质的核酸、和编码其的载体和细胞。抗原结合蛋白质可以抑制GM-CSF与GM-CSFR结合，抑制GM-CSF诱导的髓系细胞系增殖和 信号 传递，并且抑制GM-CSF诱导的人单核细胞活化。
权利要求

1.结合GM-CSF的经分离的抗原结合蛋白质，其包括：
A)选自下组的一个或多个重链互补决定区(CDRHs)：
(i)选自SEQ ID NO：10、22、70 94和142的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；
(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过4个氨基酸；
B)选自下组的一个或多个轻链互补决定区(CDRLs)：
(i) 选 自 SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的CDRL1；
(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；
(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过4个氨基酸；或
C)A)的一个或多个重链CDRHs和B)的一个或多个轻链CDRLs。
2.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其包括A)的至少1个CDRH和B)的至少1
个CDRL。
3.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其包括A)的至少两个CDRH和B)的至少两个CDRL。
4.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其包括所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
5.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其中
A)的所述CDRH选自：
(i)选自SEQ ID NO：10、22、70 94和142的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；
(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过两个氨基酸；B)的所述CDRL选自：
(i) 选 自 SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的CDRL1；
(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；
(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过两个氨基酸；或
C)A)的一个或多个重链CDRHs和B)的一个或多个轻链CDRLs。
6.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其包括
A)选自下组的CDRH：
(i)选自SEQ ID NO：10、22、70 94和142的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；
(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；
B)选自下组的CDRL：
(i) 选 自 SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的CDRL1；
(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；
(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；或C)A)的一个或多个重链CDRHs和B)的一个或多个轻链CDRLs。
7.权利要求6的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质包括：
A)SEQ ID NO：10、22、70和142的CDRH1，SEQ ID NO：11、23、35、47、59、71、95和143的CDRH2，以及SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、96、108、120、132和144的CDRH3，和B)SEQ ID NO：4、16、40、52、64、88、100、112、124 和 136的 CDRL1，SEQ ID NO：5、17、
29、41、65、77、89、101、113和137的CDRL2，以及SEQ ID NO：6、18、42、66、78、126和138的CDRL3。
8.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质包括与选自SEQ ID NO：9、21、33、45、57、69、81、93、105、117、129和141的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区(VH)，和/或与选自SEQ ID NO：3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、
123和135的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区(VL)。
9.权利要求8的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述VH与选自SEQ ID NO：9、21、33、
45、57、69、81、93、105、117、129和141的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，和/或所述VL与选自SEQID NO：3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、123和135的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
10.权利要求8的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述VH选自SEQ ID NO：9、21、33、
45、57、69、81、93、105、117、129和141，和/或所述VL选自SEQ ID NO：3、15、27、39、51、63、
75、87、99、111、123和135。
11.结合GM-CSF的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质包括：
A)选自下组的一个或多个重链CDRs(CDRHs)：
(i)选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；
(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；
B)选自下组的一个或多个轻链CDRs(CDRLs)：
(i) 选 自 SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的CDRL1；
(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；
(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；或C)A)的一个或多个重链CDRHs和B)的一个或多个轻链CDRLs。
12.权利要求11的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质包括：
A)选自下组的一个或多个CDRHs：
(i)选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；
(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；
B)选自下组的一个或多个CDRLs：
(i)选自SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL
1；
(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；
(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；或C)A)的一个或多个重链CDRHs和B)的一个或多个轻链CDRLs。
13.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
14.权利要求13的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗体片段是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。
15.权利要求13的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质是人抗体。
16.权利要求13的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质是单克隆抗体。
17.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
18.权利要求17的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质是IgG1型或IgG2型。
19.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质与标记基团偶联。
20.权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质，其中所述抗原结合蛋白质抑制GM-CSF与人GM-CSF的细胞外部分结合。
21.核酸分子，其编码根据权利要求1的抗原结合蛋白质。
22.根据权利要求21的核酸分子，其中所述核酸分子与控制序列可操作地连接。
23.载体，其包括根据权利要求21的核酸分子。
24.载体，其包括根据权利要求22的核酸分子。
25.宿主细胞，其包括根据权利要求22的核酸分子。
26.宿主细胞，其包括根据权利要求24的载体。
27.制备根据权利要求1的抗原结合蛋白质的方法，其包括从分泌所述抗原结合蛋白质的宿主细胞中制备所述抗原结合蛋白质的步骤。
28.药物组合物，其包括至少一种权利要求1的抗原结合蛋白质和药学上可接受的赋形剂。
29.权利要求28的药物组合物，其进一步包括另外的活性剂。
30.权利要求29的药物组合物，其中所述另外的活性剂选自放射性同位素、放射性核素、毒素、或治疗和化学治疗基团。
31.用于治疗或预防患者中与GM-CSF相关的状况的方法，其包括给患者施用有效量的至少一种根据权利要求1的经分离的抗原结合蛋白质。
32.权利要求31的方法，其中所述状况选自风湿性病症、自身免疫病症、血液系统病症、肿瘤病症、炎性病症、神经系统的变性状况、胃肠道、生殖泌尿系统病症和内分泌病症。
33.权利要求31的方法，其中所述状况选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、哮喘、牛皮癣、特应性皮炎和肉样瘤病。
34.权利要求31的方法，其中所述经分离的抗原结合蛋白质单独或作为联合治疗进行施用。
35.抑制患者中的GM-CSF与GM-CSFR的细胞外部分结合的方法，其包括施用有效量的至少一种根据权利要求1的抗原结合蛋白质。
36.抑制患者中的GM-CSF活性的方法，其包括施用有效量的至少一种根据权利要求1的抗原结合蛋白质。
37.权利要求36的方法，其中所述GM-CSF活性选自髓系细胞的分化、存活、增殖和活化。
说明书全文

人GM-CSF抗原结合蛋白质

[0001] 与相关申请的交叉参照
[0002] 本申请要求于2008年8月8日提交的美国临时申请序列号61/087,551、和于2007年9月18日提交的美国临时申请序列号60/994,343的利益，本文依赖所述申请的公开内容并且通过引用将所述申请的内容并入本文。
[0003] 背景
[0004] 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；CSF2)是充分研究的蛋白质，长期以来已认识到其造血性质(即刺激髓系(myeloid lineage)的祖细胞增殖和分化以及成熟细胞增殖)(在Blood 77：1131，1991；Rev Infect Dis 12：41，1990；Med.Oncol.13：141，1996中综述)。GM-CSF通过肺上皮细胞和肠的Paneth细胞组成性产生(BBRC312：897，2003)，但广泛多样的细胞在活化后表达GM-CSF，其中占优势的表达来自T细胞、巨噬细胞/单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞(J Infect Dis 172：1573，1995；J Infect Dis 185：1490，2002；J Allergy CinImmunol 112：653，2003)。GM-CSF受体(GM-CSFR；CSFR2)由两种蛋白质的异源复合物组成：对于GM-CSF特异的高亲和力α多肽，以及由GM-CSF、IL-3和IL-5共享的低亲和力共有β多肽(在J AllergyCin Immunol 112：653，2003；Cytokine and Growth Factor Reviews 12：19，2001中综述)。GM-CSFR在髓系的所有细胞上表达。
[0005] GM-CSF通过介导信号来增加先天性免疫系统的活性，所述信号引起或实现髓系细胞的分化、存活、增殖和活化，所述髓系细胞包括巨噬细胞/单核细胞、树突细胞(DCs)、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(在J Immun 143：1198，1989；Rev Infect Dis 12：41，1990；Blood77：1131，1991；Trends in Immun.23：403，2002；Growth Factors22：225，2004中综述)。GM-CSF是用于体外产生单核细胞衍生的DCs和1型巨噬细胞的重要因子(PNAS 101：
4560，2004)，并且已显示在体内诱导DCs的分化和活化(Blood 95：2337，2000)。在GM-CSF的存在下产生的人单核细胞衍生的巨噬细胞(1型巨噬细胞)产生高水平的促炎细胞因子，例如IL-23，而不是IL-12，而在M-CSF(CSF1)的存在下产生的2型巨噬细胞产生抗炎细胞因子，例如IL-10，而不是IL-23(PNAS 101：4560，2004)。
[0006] 用GM-CSF刺激的人单核细胞或巨噬细胞具有增加的功能，包括细胞毒性、其他促炎细胞因子(IL-1β、TNFα和IL-6)的产生和吞噬作用。基于这些作用，近期已付出许多努力以开发作为有效佐剂用于在传染病中使用或伴随疫苗施用的GM-CSF(在Eur J Clin MicrobiolInfect Dis.13::S47，1994；Curr Opin Hematol.7：168，2000中综述)。事实上，在某些临床环境中，rhGM-CSF的施用极大改善真菌感染的结果和清除(Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13：S18，1994；J Med Microbiol47：1998)。
[0007] 小胶质细胞是CNS的驻留巨噬细胞，并且来自体外研究的数据指出GM-CSF是关键细胞因子，其增强胎儿和成人小胶质细胞的存活、活化、增殖且甚至分化(Glia 12：309，1994；J Immunol Methods 300：32，2005)。此外，存在来自小鼠MS模型研究的几个报告，其提供关于在CNS血管周间隙中的APCs(小胶质细胞或DCs)对于疾病起始和持续的关键作用的证据(Nat.Med.11：146，，2005；Nat.Med.11：328，2005；Nat.Med.11：335，2005)。小胶质细胞的GM-CSF刺激上调MHCII且增强抗原呈递。
[0008] 仅最近确定GM-CSF在疾病中作为促炎细胞因子的作用，和作为造血生长因子的可省略性(在Trends in Immun.23：403，2002；Growth Factors 22：225，2004中综述)及其在引起或增强炎性/自身免疫疾病中的作用。
[0009] 在多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)、哮喘、牛皮癣、特应性皮炎和肉样瘤病中的炎症局部部位处已观察到升高水平的GM-CSF。GM-CSF的升高一般无法在血清中观察到，因此测定疾病关联需要靶组织的分析。在MS中，执行2项临床研究，其中在来自伴随活动性疾病(在组织收集2周内的新症状或现有症状的恶化)的复发-缓解(RR)MS患者的脑脊髓液(CSF)和血清中，通过ELISA测量GM-CSF蛋白质水平，并且与具有稳定疾病(前6个月无发作)或其他神经疾病(OND)对照的RRMS患者比较(Eur Neurol 33：152，1993；
Immunopharmacol.Immunotoxicol.20：373，1998)。重要的是，OND对照不包括阿尔茨海默病或血管性痴呆患者，因为在此种患者的CSF和血清中报告高度增加水平的GM-CSF(Acta Neurol Scand 103：166，2001)。
[0010] GM-CSF水平在低pg范围中，但与稳定性疾病CSF比较，在RRMS活动性疾病CSF中明显更高，并且与OND CSF比较，在MS活动性疾病CSF中明显更高。此外，与稳定性疾病比较，在活动性疾病的CSF中存在更高水平的TNF-α，并且与稳定性疾病比较，在活动性疾病的CSF中存在更高水平的TGF-β和IL-10。研究包括就患者正在进行的治疗和活动性与稳定性疾病比较的临床确诊而言的非常谨慎的选择标准，以及样品收集的同步性。有趣的是，在任何组之间的血清中不存在GM-CSF水平的显著差异。此外，一项研究观察到在MS病变的星形细胞中而不是对照CNS白质中GM-CSF的选择性免疫组织化学检测(n＝3个MS供体，Glia 12：309，1994)。最后，活化T细胞和单核细胞/巨噬细胞在炎症应答过程中在活化后能够产生大量GM-CSF。存在关于这些细胞类型在MS病变(Ann Neurol.47：707，2000)、和关于T细胞在CSF中(在Curr.Neurol.Neurosci.Rep.1：257，2001中综述)存在的大量证据。
[0011] 除GM-CSF表达与MS的关联外，存在关于其他炎性/自身免疫疾病的大量疾病关联数据和甚至关于施用外源GM-CSF疾病加重的某些证据。在RA中，与OA比较(生物测定，Clin.Exp.Immunol.72：67，1988)以及与非RA对照比较(生物测定，Rheumatol Int.14：177，1995)，已在RA或牛皮癣关节炎(PsA)患者的滑液(SF)中检测出升高水平的GM-CSF。
此外，在关节中CD68+巨噬细胞的存在与RA患者中的疾病严重度之间存在强关联(Ann Rheum Dis 64：834，2005)。最后，已报告具有Felty综合征(中性粒细胞减少症)的RA患者的GM-CSF治疗可以加重疾病(Blood 74：2769，1989)。
[0012] 在哮喘中，通过免疫组织化学已发现GM-CSF在来自哮喘患者的支气管活检物中是升高的，并且观察到在类固醇疗法后GM-CSF水平的减少和FEV1的增加之间的关联(Chest 105：687，1994；Am RevRespir Dis 147：1557，1993)。还报告GM-CSF在间歇性、轻微哮喘患者的痰中是升高的(Ann Allergy Asthma Immunol 86：304，2001)。支持GM-CSF的拮抗性的数据包括其中通过抗GM-CSF mAb减弱来自有症状患者的BALF的嗜酸性粒细胞促进活性的研究(在体外，Eur.Respir.J.12：872，1998)。
[0013] 在牛皮癣中，在牛皮癣皮肤而不是对照皮肤样品中检测出GM-CSF表达(Arch Dermatol Res.287：158，1995；Clin Exp Dermatol.19：383，1994；Dermatologica.181：16，1990)。还已报告牛皮癣的GM-CSF治疗可以加重疾病(Br J Dermatol.128：468，1993)。
[0014] 在特应性皮炎(AD)中，通过原位杂交检测出在慢性AD病变的活检物中比在急性AD或非病变皮肤中明显更多数目的GM-CSFmRNA表达细胞(p＜0.05；J Clin Invest.95：211，1995)。在第二项研究中，通过病变AD皮肤(表皮和真皮区室)的免疫组织化学检测出更高水平的GM-CSF，并且与来自非特应性对照的角化细胞比较，由AD患者的未受累皮肤建立的角化细胞培养显示GM-CSF增加的自发性和PMA刺激性产生(J Clin Invest.99：3009，
1997)。
[0015] 通过多个研究组产生GM-CSF(Science 264：713，1994；PNAS91：5592，1994)和GM-CSFRc(Immunity 2：211，1995；PNAS92：9565，1995)缺陷的小鼠。该小鼠在造血的稳态水平中没有明显差异，但的确具有肺泡蛋白沉积症的组织学证据，对感染更敏感，并且显示IgG产生的适度延迟和在KLH免疫后减少的抗原特异性T细胞应答(PNAS 94：12557，1997)。GM-CSF-/-小鼠对MOG35-55诱导的EAE(J Exp Med.194：873，2001)、胶原诱导的关节炎(CIA；JI 161：3639，1998)和mBSA/IL-1诱导的关节炎(Arthritis Rheum 44：111，
2001)有抗性。相比之下，GM-CSF转基因(Tg)小鼠已在许多实验室中产生，并且与炎性/自身免疫疾病的发展相关(Cell 51：675，1987；JI 166：2090，2001；J Clin Invest 97：
1102，1996；J Allergy Clin Immunol 111：1076，2003；Lab Invest 77：615，1997)。
[0016] 因此，本领域存在对GM-CSF抑制剂的需要。
[0017] 概述
[0018] 提供了结合GM-CSF特别是人GM-CSF的抗原结合蛋白质。人GM-CSF抗原结合蛋白质可以抑制、干扰、或调节与GM-CSF相关的至少一种生物应答，并且因此，用于改善GM-CSF相关疾病或病症的作用。某些抗原结合蛋白质与GM-CSF的结合因此可以抑制、干扰或阻断GM-CSF信号传递，减少单核细胞迁移到肿瘤内，并且减少肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的累积。
[0019] 还提供了用于产生GM-CSF抗原结合蛋白质的表达系统，包括细胞系，以及用于诊断且治疗与人GM-CSF相关的疾病的方法。
[0020] 提供的某些经分离的抗原结合蛋白质包括(A)选自下组的一个或多个重链互补决定区(CDRHs)：(i)选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、
60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过4个氨基酸；(B)选自下组的一个或多个轻链互补决定区(CDRLs)：(i)选自SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、
100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、
101、113、130、131和137的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、
102、114、126和138的CDRL3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过4个氨基酸；或(C)(A)的一个或多个重链CDRHs和(B)的一个或多个轻链CDRLs。
[0021] 在一个实施方案中，经分离的抗原结合蛋白质可以包括上述(A)中的至少一个或两个CDRH和上述(B)中的至少一个或两个CDRL。在另外一个方面，经分离的抗原结合蛋白质包括CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
[0022] 此外，上述(A)的CDRH进一步选自：(i)选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；(iii)选自SEQ IDNO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过两个氨基酸；上述(B)的CDRH选自：(i)选自SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)选自SEQ IDNO：5、17、29、34、41、65、
77、101、113、130、131和137的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、
90、102、114、126和138的CDRL3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过两个氨基酸；或(C)(A)的一个或多个重链CDRHs和(B)的一个或多个轻链CDRLs。
[0023] 在另外一个实施方案中，经分离的抗原结合蛋白质可以包括(A)选自下组的CDRH：(i)选自SEQ ID NO：10、22、70 94和142的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、
96、108、120、132和144的CDRH3；(B)选自下组的CDRL：(i)选自SEQ ID NO：4、16、30、40、
52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、
41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、
84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；或(C)(A)的一个或多个重链CDRHs和(B)的一个或多个轻链CDRLs。在一个实施方案中，经分离的抗原结合蛋白质可以包括(A)选自SEQ ID NO：10、22、70 94和142的CDRH1；选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和
143的CDRH2；选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；
和(B)选自SEQID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；
选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；和选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3。在另一个实施方案中，可变重链(VH)与选自SEQ ID NO：9、21、33、45、57、69、81、93、105、117、129和141的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，和/或可变轻链(VL)与选自SEQ ID NO：3、15、27、39、51、
63、75、87、99、111、123和135的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一个进一步的实施方案中，VH选自SEQ IDNO：9、21、33、45、57、69、81、93、105、117、129和141，和/或VL选自SEQ ID NO：3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、123和135。
[0024] 在另一个方面，提供了与包含GM-CSF序列的表位特异性结合的经分离的抗原结合蛋白质，其中与GM-CSF结合的抗体在包含GM-CSFR的细胞中拮抗GM-CSF介导信号的活化。
[0025] 在另外一个方面，提供了结合GM-CSF的经分离的抗原结合蛋白质，其包括：(A)选自下组的一个或多个重链CDRs(CDRHs)：(i)与选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1具有至少80％同一性的CDRH1；(ii)与选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2具有至少80％同一性的CDRH2；(iii)与选自SEQ ID NO：12、24、36、48、
60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3具有至少80％同一性的CDRH3；(B)选自下组的一个或多个轻链CDRs(CDRLs)：(i)与选自SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、
112、118、124、125和136的CDRL1具有至少80％同一性的CDRL1；(ii)与选自SEQ ID NO：
5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2具有至少80％同一性的CDRL2；
(iii)与选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3具有至少80％同一性的CDRL3；或(C)(A)的一个或多个重链CDRHs和(B)的一个或多个轻链CDRLs。在一个实施方案中，经分离的抗原结合蛋白质包括(A)选自下组的一个或多个CDRHs：(i)与选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1具有至少90％同一性的CDRH1；
(ii)与选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2具有至少90％同一性的CDRH2；(iii)与选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3具有至少90％同一性的CDRH3；(B)选自下组的一个或多个CDRLs：(i)与选自SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1具有至少90％同一性的CDRL1；(ii)与选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2具有至少90％同一性的CDRL2；(iii)与选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、
90、102、114、126和138的CDRL3具有至少90％同一性的CDRL3；或(C)(A)的一个或多个重链CDRHs和(B)的一个或多个轻链CDRLs。
[0026] 在一个进一步的方面，提供了结合GM-CSF的经分离的抗原结合蛋白质，所述抗原结合蛋白质包括A)选自下组的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自SEQ ID NOs：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRH3在氨基酸序列中不同的CDRH3；(iii)选自
X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9(SEQ ID NO：83)的CDRH3氨基酸序列，其中X1选自E和无氨基酸，X2选自G和无氨基酸，X3选自P、D和G，X4选自Y、W、R和K，X5选自S、W、F和T，X6选自Y和L，X7选自D和G，X8选自Y、无氨基酸和A，并且X9选自M、T和V；和/或B)选自下组的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自SEQ ID NOs：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；
(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRL3在氨基酸序列中不同的CDRL3；和iii)选自X1QX2X3X4X5X6X7T (SEQ ID NO：84)和X1X2X3X4DSSNX5X6X7(SEQ ID NO：89)的CDRL3氨基酸序列，X1QX2X3X4X5X6X7T中X1选自Q和L，X2选自Y和S，X3选自D、G和F，X4选自R、T和S，X5选自S和V，X6选自F和P，并且X7选自R和W；X1X2X3X4DSSNX5X6X7中X1选自S和A，X2选自S和A，X3选自W和F，X4选自D和T，X5选自G、W和无氨基酸，X6选自V、L和P，并且X6选自V和无氨基酸。
[0027] 在另一个实施方案内，抗原结合蛋白质进一步包括：A)选自下组的CDRH：(i)选自SEQ ID NOs：10、22、7094和142的CDRH1；(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRH1在氨基酸序列中不同的CDRH1；(iii)选自
X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9(SEQ ID NO：94)的CDRH1氨基酸序列，其中X1选自G和无氨基酸，X2选自G和无氨基酸，X3选自Y和F，X4选自T和S，X5选自T、S和G，X6选自G和S，X7选自Y和G，X8选自I和M，并且X9选自H和S，或(iv)选自SEQ ID NOs：5、17、29、34、41、65、
77、101、113、130、131和137的CDRH2；(v)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(iv)的CDRH2在氨基酸序列中不同的CDRH2；或(vi)由X1X2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X1
2X13X14X15G(SEQ ID NO：106)组成的CDRH2氨基酸序列，其中X1选自W和无氨基酸，X2选自I和Y，X3选自N、S和I，X4选自P、A和Y，X5选自N和Y，X6选自S和N，X7选自G和N，X8选自T和R，X9选自N和D，X10选自Y和S，X11选自A和N，X12选自Q和R，X13选自K和R，X14选自F和L，并且X15选自Q、K和R；或B)选自下组的CDRL：(i)选自SEQ IDNOs：4、16、
30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRL1在氨基酸序列中不同的CDRL1；(iii)选自KSSQSX1XLYSSX2NX3NX4LX5(SEQ ID NO：107)、RASX1X2X3X4X5X6YX7X8(SEQ ID NO：118)或X1X2X3X
4X5X6YX7X8X9X10NX11VX12(SEQ ID NO：125)的CDRL1氨基酸序列，KSSQSX1XLYSSX2NX3NX4LX5中X1选自V和I，X2选自S和N，X3选自E和K，X4选自Y和F，并且X5选自T和A；RASX1X2X3X4X5X6YX7X8中X1选自Q和P，X2选自S和Y，X3选自V、L和I，X4选自S和C，X5选自S和N，X6选自S、I、T和无氨基酸，X7选自F和L，并且X8选自A和N；X1X2X3X4X5X6YX7X8X9X10NX11VX12中X1选自I、S和T，X2选自R和G，X3选自T和S，X4选自R和S、X5选自G和S，X6选自S、H和D，X7选自I和V，X8选自A和G，X9选自无氨基酸和G，X10选自S和Y，X11选自Y和T，并且X12选自Q、N和S；或(iv)选自SEQ ID NOs：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；(v)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(iv)的CDRL2在氨基酸序列中不同的CDRL2；或(vi)选自X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO：130)或X1X2X3X4RPS(SEQ ID NO：131)的CDRL2氨基酸序列，X1X2X3X4X5X6X7中X1选自G、T和W，X2选自T和A，X3选自S和A，X4选自S和T，X5选自R和L，X6选自A、E和Q，并且X7选自T和S；X1X2X3X4RPS中X1选自E和S，X2选自D、V和N，X3选自D、S和N，并且X4选自Q、G和H。
[0028] 在一个方面，本文提供的经分离的抗原结合蛋白质可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在另一个实施方案中，经分离的抗原结合蛋白质的抗体片段可以是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体(diabody)或单链抗体分子。在一个进一步的实施方案中，经分离的抗原结合蛋白质是人抗体，并且可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0029] 在另外一个方面，经分离的抗原结合蛋白质可以与标记基团偶联，并且可以与所提供的经分离的抗原结合蛋白质之一的抗原结合蛋白质竞争与人GM-CSF的细胞外部分结合。
[0030] 在另外一个方面，经分离的抗原结合蛋白质与如本文所提供的抗原结合蛋白质竞争与人GM-CSF的受体相互作用部分结合。在一个实施方案中，抗原结合蛋白质是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在相关实施方案中提供了人抗体和单克隆抗体以及抗原片段，包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在其他实施方案中，抗原结合蛋白质是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。进一步提供了与标记基团偶联的经分离的抗原结合蛋白质。
[0031] 在另外一个方面，本发明进一步考虑了抑制GM-CSF活性，以限制引起或实现髓系细胞，包括巨噬细胞/单核细胞、树突细胞(DCs)、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分化、存活、增殖和活化，和/或DCs的分化和/或活化的信号。此外，本发明考虑了抑制GM-CSF活性，以限制单核细胞衍生的巨噬细胞(1型巨噬细胞)产生高水平的促炎细胞因子例如IL-23。
[0032] 在一个进一步的方面，还提供了编码与GM-CSF结合的抗原结合蛋白质的经分离的多核苷酸，其中所述经分离的多核苷酸与控制序列可操作地连接。
[0033] 在另一个方面，还提供了表达载体和用表达载体转化或转染的宿主细胞，所述表达载体包括编码可以与GM-CSF结合的抗原结合蛋白质的上述经分离的多核苷酸。
[0034] 在另一个方面，还提供了制备抗原结合蛋白质的方法，其包括从分泌抗原结合蛋白质的宿主细胞制备抗原结合蛋白质的步骤。
[0035] 在另外一个方面，提供了药物组合物，其包括所提供的上述抗原结合蛋白质中的至少一种和药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，药物组合物可以包括另外的活性剂，其选自放射性同位素、放射性核素、毒素、或治疗和化学治疗基团。
[0036] 在另外一个方面，提供了用于治疗或预防患者中与GM-CSF相关的状况的方法，其包括给患者施用有效量的至少一种经分离的抗原结合蛋白质。在一个实施方案中，所述状况选自风湿性病症、自身免疫病症、血液系统病症、肿瘤病症、炎性病症、神经系统的变性状况、胃肠道、生殖泌尿系统(gastrourinary)病症、内分泌病症等。在一个实施方案中，所述状况是选自下组的病症或疾病：多发性硬化症(MS)、类风湿关节炎(RA)、哮喘、牛皮癣、特应性皮炎和肉样瘤病。在另一个实施方案中，包括用单独或作为联合治疗的经分离的抗原结合蛋白质进行处理。在另外一个实施方案中，所述状况选自乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜腺癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、胃癌、星形细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和卵巢癌。
[0037] 在另一个方面，本发明提供了抑制患者中的GM-CSF与GM-CSFR的细胞外部分结合的方法，其包括施用有效量的本文提供的至少一种抗原结合蛋白质。
[0038] 在另外一个方面，本发明提供了抑制患者中的人GM-CSFR磷酸化的方法，其包括施用有效量的如本文所描述的至少一种抗原结合蛋白质。
[0039] 在另外一个方面，当施用于患者时，经分离的抗原结合蛋白质减少单核细胞趋化性。在一个实施方案中，抗原结合蛋白质抑制单核细胞迁移。在另外一个实施方案中，当经分离的抗原结合蛋白质施用于患者时，抑制单核细胞迁移到肿瘤内。
[0040] 作为另外一个方面，进一步提供了治疗多发性硬化症的方法，其包括施用如本文所描述的经分离的抗原结合蛋白质。
[0041] 还考虑了以下状况，即其中多发性硬化症是复发-缓解性多发性硬化症、进行性-复发性多发性硬化症、原发性-进行性多发性硬化症或继发性进行性多发性硬化症。
[0042] 在一个方面，还提供了治疗类风湿关节炎的方法，其包括施用如本文所描述的经分离的抗原结合蛋白质。
[0043] 在另外的方面，提供了经分离的抗原结合蛋白质，如在GM-CSF依赖性测定中测量的，其在人GM-CSF的1个对数内与猕猴GM-CSF交叉反应，并且以＜1nM的IC50结合GM-CSF。
[0044] 这些和其他方面将在本文中更详细地描述。所提供的方面各自可以包括本文提供的各种实施方案。因此预期涉及一种元件或元件组合的实施方案各自可以包括在所描述的每个方面中。所公开的其他特征、目的和优点在下述详述中是显而易见的。
[0045] 附图简述
[0046] 图1a-d：A)在活动性EAE中抗鼠类GM-CSF MAb的预防施用延迟了发作，并且减少发病率。为了诱导活动性SJL/PLP139-151 EAE，给予11只小鼠皮下250μg PLP139-151+CFA，并且实施3周评估。在免疫接种当天时，给予11只小鼠/组500μg抗鼠GM-CSF mAb、同种型对照mAb或PBS。获得每日体重和评分。临床评分0：无疾病；1：软尾；2：翻正反射的轻微损害或异常步态；3：严重后肢虚弱，部分后肢麻痹；4：完全后肢麻痹，使用前肢活动。抗GM-CSF mAb显示与对照比较发作延迟，其中发生率为45％，而对照为91-100％。
[0047] B和C)抗GM-CSF mAb的预防施用阻止体重减轻(B)且减少平均临床得分(C)。
[0048] D)来自在疾病发作当天时单剂量抗mGM-CSF mAb、同种型对照mAb或PBS的结果，n＝14只小鼠。在活动性EAE中抗GM-CSF的治疗施用减少平均临床得分。与同种型对照或PBS比较P＜0.05。
[0049] 图2a-c：A)在活动性EAE中抗mGM-CSF MAb的治疗施用加速恢复。恢复＝≥1的全部得分在连续≥2天中减少至得分≤1。
[0050] B)与用抗mGM-CSF mAb、同种型对照mAb或PBS对照处理的小鼠比较，在疾病发作当天时(免疫接种后第13天)的治疗性抗mGM-CSF mAb处理减少CNS炎症。
[0051] C和D)在过继转移EAE中抗mGM-CSF mAb的预防或治疗施用改善疾病。在过继转移EAE模型中，给予15只小鼠100μg PLP139-151+CFA，并且在免疫接种后第10天时收获淋巴结，用PLP肽在体外刺激4天，并且注射到接受小鼠内。对小鼠实施体重和临床得分的3周评估。图C显示在细胞转移当天时的处理，图D显示在EAE发作当天时的处理。
[0052] 图3：显示抗GM-CSF mAb抑制或0.4ng/mlrhGM-CSF-Ile的代表性TF-1 Stat5磷酸化测定。
[0053] 图4：显示在来自大肠杆菌(E.coli)rhGM-CSF免疫接种小鼠的杂交瘤上清液的TF-1STAT5磷酸化测定中的rhGM-CSF-Ile抑制分布的直方图。
[0054] 图5：显示0.15ng/ml rhGM-CSF-Ile的抗GM-CSF mAb抑制的代表性AML-5增殖测定。
[0055] 图6a-f：在AML-5增殖测定中通过从杂交瘤上清液中纯化的mAb抑制GM-CSF和CSF-1。
[0056] 图7a-b：在TF-1 Stat5磷酸化测定中通过从杂交瘤上清液中纯化的mAb抑制GM-CSF和IL-3。
[0057] 图8a-b：来自测量杂交瘤上清液抗GM-CSF mAb或重组抗GM-CSF mAb与来自各个物种的GM-CSF的结合的ELISA的结果。
[0058] 图9：在AML-5增殖测定中通过重组mAb(2nd TT和2nd SCL)抑制人和猕猴GM-CSF。
[0059] 图10：在TF-1 Stat-5磷酸化测定中通过重组mAb(2nd TT和2ndSCL)抑制人和猕猴GM-CSF。
[0060] 图11：在TF-1 Stat-5磷酸化测定中通过重组mAb(1st TT)抑制天然人和猕猴肺来源的GM-CSF。
[0061] 图12：在TF-1 Stat-5磷酸化测定中通过重组mAb(2nd SCL)IgGB抑制天然猕猴PBMC来源的GM-CSF。
[0062] 图13：在人单核细胞测定中通过重组mAb(2nd TT)抑制人GM-CSF。
[0063] 图14：通过重组mAb(2nd SCL)IgG B抑制全血中GM-CSF诱导的MIP-1b和ENA78产生。
[0064] 图15a-b：在AML-5增殖测定(a)或单核细胞测定(b)中，从杂交瘤上清液中纯化的mAb不抑制酵母来源的rhGM-CSF(Leukine )。
[0065] 图16：mAb 中 和 大 肠 杆 菌 来 源 的rhGM-CSF，但 不 中 和 酵 母 来 源 的rhGM-CSF(Leukine )或未糖基化的、大肠杆菌来源的rhGM-CSF-R23L。
[0066] 详述
[0067] 应当理解本发明并不限制于本文描述的具体方法、方案和试剂等，并且因此可以改变。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不希望限制仅仅由权利要求限定的所公开的范围。
[0068] 除非另有说明，一般根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的，执行本申请的方法和技术。参见例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)和Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)，and Harlowand Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)。
[0069] 术语“多核苷酸”包括单链和双链核酸，并且包括基因组DNA、RNA、mRNA、cDNA或合成来源或其某些组合，其不与自然界中通常发现的序列结合。除指定序列外，包括指定序列的经分离的多核苷酸还可以包括关于最多10种或甚至最多20种其他蛋白质或其部分的编码序列，或可以包括可操作地连接的调节序列，其控制所述核酸序列编码区的表达，和/或可以包括载体序列。包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或经修饰形式的任意类型核苷酸。所述修饰包括碱基修饰例如溴尿苷和肌苷衍生物，核糖修饰例如2’，3’-双脱氧核糖，和核苷酸间键修饰例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和氨基磷酸酯。
[0070] 术语“寡核苷酸”意指包括100个或更少核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸长度是10至60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸长度是12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如用于构建突变基因。
寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包括用于检测测定的可检测标记，例如放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可以例如用作PCR引物、克隆引物或杂交探针。
[0071] 术语“控制序列”指可以影响它与之连接的编码序列表达和加工的多核苷酸序列。此种控制序列的性质可以依赖于宿主生物。在具体实施方案中，用于原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，用于真核生物的控制序列可以包括启动子，其包括转录因子的一个或多个识别位点、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合配偶体序列。
[0072] 术语“载体”意指用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞内的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。术语“表达载体”或“表达构建体”指适合于转化宿主细胞且包含核酸序列的载体，所述核酸序列指导和/或控制(与宿主细胞结合)与之可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达。表达构建体可以包括但不限于，影响或控制转录、翻译的序列，以及如果存在内含子，影响与之可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。
[0073] 如本文所使用的，“可操作地连接的”意指该术语所适用的组分处于允许其执行其固有功能的关系中。例如，在载体中与蛋白质编码序列“可操作地连接的”控制序列，例如启动子如此排列：即，使得控制序列的正常活性导致蛋白质编码序列的转录，从而导致所编码蛋白质的重组表达。
[0074] 术语“转染”意指外来或外源DNA经由细胞的摄取，并且当外源DNA已引入细胞膜内时，细胞已进行“转染”。许多转染技术是本领域众所周知的，并且在本文中公开。参见例如，Graham等人，1973，Virology52：456；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，supra；Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等人，1981，Gene 13：197。此种技术可以用于将一种或多种外源DNA部分引入合适的宿主细胞内。
[0075] 术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质的氨基酸序列的大分子，所述天然蛋白质即由天然存在和非重组细胞产生的蛋白质；或它通过基因工程或重组细胞产生，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的分子。该术语还包括其中一个或多个氨基酸是相应天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物的氨基酸聚合物。术语“多肽”和“蛋白质”包括GM-CSF抗原结合蛋白质，抗体，或具有抗原结合蛋白质的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”指与全长天然蛋白质比较，具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。此种片段还可以包含与天然蛋白质比较经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段长度为约5至500个氨基酸。例如，片段长度可以为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫学功能片段，包括结合域。在GM-CSF-结合抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重或轻链的可变结构域、抗体链的部分或仅其包括两个CDRs的可变区等。
[0076] 术语“经分离的蛋白质”指纯化掉将干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他污染物的蛋白质。
[0077] 多肽(例如，抗原结合蛋白质或抗体)的“变体”包括这样的氨基酸序列：相对于另一种多肽序列，其中一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列内、从氨基酸序列中缺失和/或取代到氨基酸序列内。变体包括融合蛋白。多肽的“衍生物”是这样的多肽(例如，抗原结合蛋白质或抗体)：其已经通过与插入、缺失或取代变体不同的某一方式进行化学修饰，例如经由与另一种化学部分缀合。
[0078] 如说明书自始至终结合生物材料使用的，术语“天然存在的”指在自然界中发现的材料，所述生物材料例如多肽、核酸、宿主细胞等。
[0079] 如本文所使用的，“抗原结合蛋白质”意指特异性结合指定靶抗原的蛋白质；所提供的抗原是GM-CSF或人GM-CSF。
[0080] 当解离常数(Kd)是≤10-8M时，抗原结合蛋白质被说成“特异性结合”其靶抗原。-9 -10
当Kd是≤5x10 M时，抗体以“高亲和力”特异性结合抗原，并且当Kd是≤5x10 M时，以“极-9 -4
高亲和力”特异性结合抗原。在一个实施方案中，抗体具有≤10 M的Kd和约1x10 /秒的-5
解离速率(off-rate)。在一个实施方案中，解离速率是＜1x10 。在其他实施方案中，抗体-8 -10
将以约10 M至10 M的Kd与GM-CSF或人GM-CSF结合，并且在另外一个实施方案中，它将-10
以Kd≤2x10 结合。
[0081] “抗原结合区”意指特异性结合指定抗原的蛋白质或蛋白质的部分。例如，包含氨基酸残基与抗原相互作用且对抗原结合蛋白质赋予其对于抗原的特异性和亲和力的抗原结合蛋白质的部分称为“抗原结合区”。抗原结合区一般包括一个或多个“互补结合区”(“CDRs”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“构架”区。“CDR”是促成抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“构架”区可以帮助维持CDRs的适当构象，以促进抗原结合区和抗原之间的结合。
[0082] 在某些方面，提供了结合GM-CSF蛋白质或人GM-CSF的重组抗原结合蛋白质。在本文的上下文中，“重组蛋白质”是使用重组技术即通过如本文所描述的重组核酸的表达制备的蛋白质。用于产生重组蛋白质的方法和技术是本领域众所周知的。
[0083] 术语“抗体”指任何同种型的完整免疫球蛋白，或其可以与完整抗体竞争与靶抗原特异性结合的片段，并且包括例如嵌合、人源化、全人和双特异性抗体。“抗体”因此是抗原结合蛋白质的种类。完整抗体一般将包括至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可以包括更少的链，例如在骆驼科动物(camelids)中可以仅包括重链的天然存在的抗体。抗体可以单独来自单一来源，或可以是“嵌合的”，即如下文进一步描述的，抗体的不同部分可以来自两种不同抗体。抗原结合蛋白质、抗体或结合片段可以在杂交瘤中，通过重组DNA技术，或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有说明，除包括两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，术语“抗体”还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白质，其例子在下文描述。
[0084] 术语“轻链”包括全长轻链及其具有足够序列以赋予结合特异性的片段。在一般的哺乳动物抗体中，将发现包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL的全长轻链，其中轻链的可变区结构域朝向多肽的氨基末端。一般的人抗体轻链包括κ链或λ链。
[0085] 术语“重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。哺乳动物全长重链抗体一般包括可变区结构域VH以及3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域朝向多肽的氨基末端，并且CH结构域朝向羧基末端，其中CH3与多肽的羧基末端最接近。人重链一般可以是包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE的同种型。
[0086] 如本文所使用的，术语抗体或免疫球蛋白链(重或轻链)的“功能性片段”(或简单地“片段”)是包括抗体的部分(不管那个部分是获得还是合成的)的抗原结合蛋白质，所述部分缺乏全长链中存在的至少某些氨基酸，但能够与抗原特异性结合。此种片段是生物学活性的，因为它们与靶抗原特异性结合，并且可以与其他抗原结合蛋白质，包括完整抗体竞争与给定表位特异性结合。在一个方面，此种片段将保留全长轻或重链中存在的至少一个CDR，并且在某些实施方案中，将包括单条重链和/或轻链或其部分。这些生物学活性片段可以通过重组DNA技术产生，或可以通过抗原结合蛋白质，包括完整抗体的酶促或化学切割产生。免疫学功能性免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可以来自任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔。进一步考虑本文公开的抗原结合蛋白质的功能性部分，例如一个或多个CDRs，可以与第二种蛋白质或小分子共价结合，以产生针对体内特定靶的治疗剂，其具有双功能治疗性质，或具有延长的血清半衰期。
[0087] “Fab片段”包括1条轻链以及1条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链无法与另一种重链分子形成二硫键。
[0088] “Fc”区包括两个重链片段，所述片段包括抗体的CH1和CH2结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
[0089] “Fab′片段”包含1条轻链和1条重链的部分，所述部分包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，从而使得链间二硫键可以在两个Fab′片段的两条重链之间形成，以形成F(ab′)2分子。
[0090] “F(ab′)2片段”包含含有CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的两条轻链和两条重链，从而使得链间二硫键在两条重链之间形成。F(ab′)2片段因此由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
[0091] “Fv区”包括来自重和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
[0092] “单链抗体”是其中重和轻链可变区已通过柔性接头连接以形成单条多肽链的Fv分子，其形成抗原结合区。单链抗体在PCT公开号WO88/01649以及美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论。
[0093] “结构域抗体”是仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫学功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接，以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶定相同或不同抗原。
[0094] “二价抗原结合蛋白质”或“二价抗体”包括两个抗原结合位点。在某些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。二价抗原结合蛋白质和二价抗体可以是双特异性的，参见下文。
[0095] 多特异性抗原结合蛋白质”或“多特异性抗体”是靶定超过一个抗原或表位的抗原结合蛋白质或抗体。
[0096] “双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合蛋白质或抗体是分别具有两个不同抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白质或抗体。双特异性抗原结合蛋白质和抗体是多特异性抗原结合蛋白质抗体的种类，并且可以通过各种方法产生，包括但不限于杂交瘤融合或Fab′片段连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白质或抗体的两个结合位点将与可以存在于相同或不同蛋白质靶上的两个不同表位结合。
[0097] 术语“中和抗原结合蛋白质”或“中和抗体”分别指这样的抗原结合蛋白质或抗体：其与配体结合、阻止配体与其结合配偶体结合、并且中断原本将由配体与其结合配偶体结合引起的生物应答。在评估抗原结合蛋白质例如抗体或其免疫学功能性片段的结合和特异性中，当过量抗体使与配体结合的结合配偶体量减少至少约20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多时(如在体外竞争结合测定中测量的)，抗体或片段将显著抑制配体与其结合配偶体的结合。在GM-CSF抗原结合蛋白质的情况下，这样的中和分子将减少GM-CSF与GM-CSFR结合的能力。
[0098] 当在竞争相同表位的抗原结合蛋白质(例如，中和抗原结合蛋白质或中和抗体)的上下文中使用时，术语“竞争”意指抗原结合蛋白质之间的竞争通过这样的测定进行测定：其中测试的抗原结合蛋白质(例如，抗体或其免疫学功能性片段)阻止或抑制参照抗原结合蛋白质(例如，配体或参照抗体)与共同抗原(例如，GM-CSF或其片段)特异性结合。可以使用众多类型的竞争结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人，1983，Methods in Enzymology9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Kirkland等人，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlow和Lane，1988，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel等人，1988，Molec.Immunol.25：
7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Cheung，等人，1990，Virology 176：
546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。一般地，此种测定涉及使用与具有未标记测试抗原结合蛋白质和标记的参照抗原结合蛋白质中任一种的固体表面或细胞结合的纯化抗原。
[0099] 竞争性抑制通过测定在测试抗原结合蛋白质的存在下与固体表面或细胞结合的标记量进行测量。通常测试抗原结合蛋白质过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白质(竞争抗原结合蛋白质)包括结合于与参照抗原结合蛋白质相同的表位结合的抗原结合蛋白质，以及结合于与由参照抗原结合蛋白质结合的表位足够接近的邻近表位以便发生空间位阻的抗原结合蛋白质。关于用于测定竞争性结合的方法的另外细节在本文实施例中提供。通常，当竞争抗原结合蛋白质过量存在时，它将使参照抗原结合蛋白质与共同抗原的特异性结合抑制至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在某些情况下，结合抑制至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。
[0100] 术语“抗原”指这样的分子或分子部分：其能够由选择性结合剂例如抗原结合蛋白质(包括例如，抗体或其免疫学功能片段)结合，并且另外能够在动物中用于产生能够与那种抗原结合的抗体。抗原可以具有能够与不同抗原结合蛋白质例如抗体相互作用的一个或多个表位。
[0101] 术语“表位”包括能够与抗原结合蛋白质特异性结合的任何决定簇。表位是由特异性靶定抗原的抗原结合蛋白质结合的抗原区域，并且当抗原是蛋白质时，包括接触抗原结合蛋白质的特定氨基酸。最通常地，表位位于应理解为包括非氨基酸翻译后修饰的蛋白质上，但在某些情况下可以位于其他种类的分子例如核酸上。表位可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，并且可以具有特异性三维结构特征，和/或特异性电荷特征。一般地，对于特定靶抗原特异的抗体将优先识别在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原上的表位。
[0102] 术语“同一性”指两个或更多个多肽分子或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比对且比较序列测定的。“同一性百分比”意指在比较的分子中氨基酸或核苷酸之间的相同残基百分比，并且基于被比较的最小分子的大小进行计算。对于这些计算，比对中的空位(如果存在)必须通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决。可以用于计算所比对核酸或多肽的同一性的方法包括下述文献中描述的那些：Computational Molecular Biology，(Lesk，A.M.，编辑)，1988，New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics andGenome Projects，(Smith，D.W.，编辑)，1993，New York：
AcademicPress；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，(Griffin，A.M. 和Griffin，H.G.，编辑)，1994，New Jersey：Humana Press；von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis in Molecular Biology，New York：AcademicPress；Sequence Analysis Primer，(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)，1991，New York：M.Stockton Press；和Carillo等人，1988，SIAM J.Applied Math.48：1073。
[0103] 在计算同一性百分比中，被比较的序列以产生序列之间的最大匹配的方式进行比对。用于测定同一性百分比的计算机程序是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid Res.12：387；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)。计算机算法GAP用于比对待测定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。序列进行比对，以得到各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配的跨度”，如通过算法测定的)。空位开放罚分(其计算为3x平均对角线，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵对每个完全氨基酸匹配指定的得分或数目)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62与算法结合使用。在某些实施方案中，标准比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等人，1978，Atlas of ProteinSequence and Structure 5：345-352；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)也由算法使用。
[0104] 对于使用GAP程序测定关于多肽或核苷酸序列的同一性百分比推荐的参数是下述：
[0105] 算法：Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.48：443-453；
[0106] 比较矩阵：来自Henikoff等人，同上的BLOSUM 62；
[0107] 空位罚分：12(但对于末端空位无罚分)
[0108] 空位长度罚分：4
[0109] 相似性阈值：0
[0110] 用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可以导致仅两个序列的短区域的匹配，并且尽管在两个全长序列之间不存在显著关系，这个小比对区可能具有极高的序列同一性。因此，如果希望导致跨靶多肽的至少50个邻接氨基酸的比对，那么可以调整所选择的比对法(GAP程序)。
[0111] 如本文所使用的，“基本上纯的”意指所述分子种类是存在的占优势种类，即，在摩尔基础上，它比相同混合物中的任何其他单个种类更丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子是其中目标种类包括存在的所有大分子种类的至少50％(在摩尔基础上)的组合物。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将包括组合物中存在的所有大分子种类的至少80％、85％、90％、95％或99％。
[0112] 在某些实施方案中，基本上均质的物质已纯化至此种程度：即，使得污染种类通过常规检测法无法在组合物中检测出，并且因此组合物由单个可检测大分子种类组成。
[0113] 术语“治疗有效量”指测定为在哺乳动物中产生任何治疗反应的GM-CSF抗原结合蛋白质的量。此种治疗有效量通过本领域普通技术人员可以容易地确定。
[0114] “氨基酸”包括其在本领域中的通常含义。20种天然存在的氨基酸及其缩写遵循常规使用。参见Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub和D.R.Gren，编辑)，Sinauer Associates：Sunderland，Mass.(1991)。20种常规氨基酸，非天然氨基酸例如[α]-，[α]-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸及其他非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)也可以是多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、[γ]-羧基谷氨酸、[ε]-N，N，N-三甲基赖氨酸、[ε]-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、[σ]-N-甲基精氨酸、及其他相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽标记中，依照标准使用和常规，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。
[0115] A.一般概述
[0116] 本文提供了结合GM-CSF蛋白质特别是人GM-CSF(hGM-CSF)蛋白质的抗原结合蛋白质。所提供的抗原结合蛋白质是如本文所描述的一个或多个互补决定区(CDRs)包埋和/或连接到其内的多肽。在某些抗原结合蛋白质中，CDRs包埋到“构架”区内，其使一个或多个CDR定向，使得达到一个或多个CDR的适当抗原结合性质。一般而言，所提供的抗原结合蛋白质可以干扰、阻断、减少或调节GM-CSFR和GM-CSF之间的相互作用。
[0117] 本文描述的某些抗原结合蛋白质是抗体或衍生自抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白质的多肽结构基于抗体，分别包括但不限于，单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体(minibodies)、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(有时在本文中称为“抗体缀合物”)及其片段。各种结构在本文中进一步描述。
[0118] 已证实本文提供的抗原结合蛋白质与GM-CSF特别是人GM-CSF的某些表位结合。因此，本文提供的抗原结合蛋白质能够抑制GM-CSF活性。特别地，与这些表位结合的抗原结合蛋白质抑制GM-CSF信号传递的诱导、GM-CSF诱导的细胞生长或分化、和在与GM-CSFR结合后由GM-CSF诱导的其他生理效应，等等。
[0119] 本文公开的抗原结合蛋白质具有各种效用。某些抗原结合蛋白质例如用于特异性结合测定、GM-CSF特别是hGM-CSF或其配体的亲和纯化，以及鉴定GM-CSF活性的其他拮抗剂的筛选测定中。某些抗原结合蛋白质用于抑制GM-CSFR与GM-CSF的结合，或抑制GM-CSF的自磷酸化。
[0120] 如本文说明的，抗原结合蛋白质可以用于各种治疗应用中。例如，某些GM-CSF抗原结合蛋白质可用于治疗与GM-CSF相关的状况，例如减少患者中的单核细胞趋化性，抑制单核细胞迁移到肿瘤内，或抑制肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中的累积，如本文进一步的描述。抗原结合蛋白质的其他用途包括例如，GM-CSF相关疾病或状况的诊断和用于测定GM-CSF的存在或不存在的筛选测定。本文描述的某些抗原结合蛋白质可用于治疗与GM-CSF活性相关的后果、症状和/或病理状态。这些包括但不限于各种类型的炎性疾病。
[0121] B.GM-CSF抗原结合蛋白质
[0122] 提供了可用于调节GM-CSF活性的各种选择性结合剂。这些试剂包括例如抗原结合蛋白质，其包含抗原结合结构域(例如，单链抗体、结构域抗体、免疫粘附素和具有抗原结合区的多肽)，并且与GM-CSF多肽特别是人GM-CSF特异性结合。某些试剂例如可用于抑制GM-CSFR与GM-CSF结合，并且因此可以用于抑制与GM-CSF信号传递相关的一种或多种活性。
[0123] 一般而言，所提供的抗原结合蛋白质一般包括如本文所描述的一个或多个CDRs(例如，1、2、3、4、5或6个CDRs)。在某些情况下，抗原结合蛋白质包括(a)多肽结构和(b)插入多肽结构内和/或与多肽结构连接的一个或多个CDRs。多肽结构可以采取各种不同形式。例如，它可以是或包括天然存在的抗体、或其片段或变体的构架，或性质上可以是完全合成的。各种多肽结构的例子在下文进一步描述。
[0124] 在某些实施方案中，抗原结合蛋白质的多肽结构是抗体或衍生自抗体，分别包括但不限于，单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)、和各自的部分或片段。在某些情况下，抗原结合蛋白质是抗体的免疫学片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv)。各种结构在本文中进一步描述且定义。
[0125] 如本文所提供的某些抗原结合蛋白质与人GM-CSF特异性结合。如本文所使用的，-8 -10 -9 -10“特异性结合”意指平衡解离常数是＜10 至＜10 M，或者＜10 至＜10 M。
[0126] 在抗原结合蛋白质用于治疗应用的实施方案中，抗原结合蛋白质可以抑制、干扰或调节GM-CSF的一种或多种生物活性。在这种情况下，当过量抗体使与GM-CSFR结合的人GM-CSF量减少(或反之亦然)至少约40％、60％、80％、85％或更多(例如通过在体外竞争结合测定中测量结合)时，抗原结合蛋白质特异性结合和/或显著抑制人GM-CSF与GM-CSFR结合。GM-CSF具有许多独特生物效应，其可以在许多不同测定在不同细胞类型中进行测量，此种测定的例子在本文中提供。
[0127] 所提供的某些抗原结合蛋白质具有一般与天然存在的抗体相关的结构。这些抗体的结构单位一般包括一个或多个四聚体，各自包含两个等同的多肽链偶联体，尽管某些哺乳动物物种也产生仅具有单条重链的抗体。在典型抗体中，每个对或偶联体包括1条全长“轻”链(在特定实施方案中，约25kDa)和1条全长“重”链(在特定实施方案中，约50-70kDa)。每条单个免疫球蛋白链包含数个“免疫球蛋白结构域”，所述结构域各自由约90至110个氨基酸组成并且表达特征性折叠模式。这些结构域是基本单位，其组成抗体多肽。
每条链的氨基末端部分一般包括负责抗原识别的可变结构域。羧基末端部分在进化上比链的另一个末端更保守，并且称为“恒定区”或“C区”。人轻链一般分类为κ和λ轻链，并且这些链各自包含1个可变结构域和1个恒定结构域。重链一般分类为μ、δ、γ、α或ε链，并且这些使抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有数个亚型，包括但不限于，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。在人中，IgA和IgD同种型包含4条重链和4条轻链；IgG和IgE同种型包含两条重链和两条轻链；并且IgM同种型包含5条重链和5条轻链。重链C区一般包括可以负责效应物功能的一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数目将依赖于同种型。IgG重链例如各自包含3个C区结构域，称为CH1、CH2和CH3。所提供的抗体可以具有这些同种型和亚型中的任何。在特定实施方案中，GM-CSF抗体是IgG1、IgG2或IgG4亚型。
[0128] 在全长轻和重链中，可变和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见例如，Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul，W.，编辑)1989，New York：Raven Press。每个轻/重链对的可变区一般形成抗原结合位点。
[0129] 1.抗体的可变结构域
[0130] 本文提供的各种重链和轻链可变区在表1中描述。这些可变区各自可以与上述重和轻链恒定区连接，以分别形成完整抗体重和轻链。进一步地，如此产生的重和轻链序列各自可以组合，以形成完整抗体结构。
[0131] 提供了抗原结合蛋白质，其包含选自VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11和VH12的抗体重链可变区，和/或选自VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11和VL12的抗体轻链可变区，如下表1中所示。
[0132] 这个类型的抗原结合蛋白质一般可以通过式“VHx/VLy”命名，其中“x”与重链可变区数目对应，并且“y”与轻链可变区数目对应，如表1中所列出的：
[0133] 表1
[0134] 示例性VH和VL链
[0135] 命名 氨基酸序列
[0136] VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHW
[0137] VRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNSAQKFRGRVTMT
[0138] RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGGYSYGYFD
[0139] YWGQGTLVTVSS
[0140] [SEQ.ID.NO：9]
[0141] VH2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKS SGYTFTGYYMH
[0142] WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFKGRVT
[0143] MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDKWLDGF
[0144] DYWGQGTLVTVSS
[0145] S[SEQ.ID.NO：21]
[0146] VH3 QVQLVQSGAAVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHW
[0147] VRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMT
[0148] RDTSISTASMELSRLRSDDTAVYFCARDRWLDAFDIW
[0149] GQGTMVTVSS
[0150] [SEQ.ID.NO：33]
[0151] VH4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMH
[0152] WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQRFRGRVT
[0153] MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARAPYDWTF
[0154] DYWGQGTLVTVSS
[0155] [SEQ.ID.NO：45]
[0156] VH5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHW
[0157] VRQAPGQGLEWMGWINPNSGGRNYAQKFQGRVTMT
[0158] RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRWLDAFEIW
[0159] GQGTMVTVSS
[0160] [SEQ.ID.NO：57]
[0161] 命名 氨基酸序列
[0162] VH6 QVQLVQSGAEVKQPGASVKVSCEASGYTFTSYGISW
[0163] VRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTDYAQKLQGRVTMT
[0164] TDTSTSAAYMELRSLRSDDTAVYYCARQRYYYSMDV
[0165] WGQGTTVTVSS
[0166] [SEQ.ID.NO：69]
[0167] VH7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMH
[0168] WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVT
[0169] MTRDTSISTAYMELSWLRSDDTAVYYCARDRWLDAF
[0170] DIWGQGTMVTVS
[0171] [SEQ.ID.NO：81]
[0172] VH8 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSGYYMY
[0173] WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYARKFQGRVT
[0174] MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARRPWELPFD
[0175] YWGQGTLVTVSS[SEQ.ID.NO：93]
[0176] VH9 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMH
[0177] WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFKGRVT
[0178] MTRDTSISTAHMELSRLRSDDTAVYYCVRNGDYVFT
[0179] YFDYWGQGTLVTVSS
[0180] [SEQ.ID.NO：105]
[0181] VH10 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMH
[0182] WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFRGRVT
[0183] MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARFGYFGYYF
[0184] DYWGQGTLVTVSS
[0185] [SEQ.ID.NO：117]
[0186] VH11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMH
[0187] WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFRGRVT
[0188] MTRDTSISTAYVELSRLRSDDTAVYYCARDPYTSGFD
[0189] YWGQGTLVTYSS
[0190] [SEQ.ID.NO：129]
[0191] 命名 氨基酸序列
[0192] VH12 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRSGGYYWS
[0193] WIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVD
[0194] TSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCAREDTAMDYFDYW
[0195] GQGTLVTVSS
[0196] [SEQ.ID.NO：141]
[0197] VL1 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSILYSSSNENFLT
[0198] WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF
[0199] TLTISSLQPEDVAVYYCQQYFSVFRTFGQGTRVEIK
[0200] [SEQ.ID.NO：3]
[0201] VL2 EIVLTQSPGTLSLSPGDRATLSCRASQSVSSSYFAWYQ
[0202] QKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIS
[0203] RLEPEDFAVYYCQQYDRSPRTFGQGTKVEIK
[0204] [SEQ.ID.NO：15]
[0205] VL3 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYFAWYQ
[0206] QKPGQAPRLLIYGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTV
[0207] SRLEPEDFAVYYCQQYDRSPRTFGQGTKVEIK
[0208] [SEQ.ID.NO：27]
[0209] VL4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQYISNTYLAWFQ
[0210] QKPGQAPRLLIYGAATRATGIPDRFSGSGSGTDFTFTIS
[0211] RLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTTVEIK
[0212] [SEQ.ID.NO：39]
[0213] VL5 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVCSSYLAWY
[0214] QQKPDQAPRLLISGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI
[0215] SSLEPEDFAVYYCQQYDRSPRTFGQGTKVEIK
[0216] [SEQ.ID.NO：51]
[0217] VL6 NFMLAQPHSVSESPGKTVTISCIRTSGSIASNYVQWYQ
[0218] QRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLT
[0219] ISGLKTEDEADYYCQSCDISNVVFGGGTKLTVL
[0220] [SEQ.ID.NO：63]
[0221] 命名 氨基酸序列
[0222] VL7 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQ
[0223] QKPGQVPRLLIYGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTV
[0224] SRLEPEDFAVYYCLQYDRSPRTFGQGTKVEIK
[0225] [SEQ.ID.NO：75]
[0226] VL8 EIVLTQSPGTLSLSLGERAILSCRASQSLSSIYLAWYQQ
[0227] KPGQAPGLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISS
[0228] LEPEDFAVYYCQQYATSPWTFGQGTKVEVK
[0229] [SEQ.ID.NO：87]
[0230] VL9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQ
[0231] QKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTIS
[0232] SLQPEDFATYYCQQSFSFPITFGPGTKVDIK
[0233] [SEQ.ID.NO：99]
[0234] VL10 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWY
[0235] QQHPGKAPKLMIYEVSGRPSGVSNRFSGSKSGNTASL
[0236] TISGLQAEDEADYYCSSFTGSSTWLFGGGTKLTVL
[0237] [SEQ.ID.NO：111]
[0238] VL11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASPSVSSSYFAWYQ
[0239] QKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIS
[0240] RLEPEDFAVYYCQQYGWSPRTFGQGTKVEIK
[0241] [SEQ.ID.NO：123]
[0242] VL12 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSHIGSNTVNWYQ
[0243] HLPGTAPKLLIYSNNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI
[0244] SGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL
[0245] [SEQ.ID.NO：135]
[0246] 表1中列出的重链可变区各自可以与表1中所示的任何轻链可变区组合，以形成抗原结合蛋白质。此种组合的例子包括与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11和VL12中任何一个组合的VH1，或与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11和VL12中任何一个组合的VH2等。
[0247] 在某些情况下，抗原结合蛋白质包括来自表1中列出区域的至少1个重链可变区和/或1个轻链可变区。在某些情况下，抗原结合蛋白质包括来自表1中列出区域的至少两个不同重链可变区和/或轻链可变区。此种抗原结合蛋白质的例子包括(a)1个VH1，和(b)VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11或VH12之一。
[0248] 另一个例子包括(a)1个VH2，和(b)VH1、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11或VH12之一。另外一个例子包括(a)1个VH3，和(b)VH1、VH2、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11或VH12之一等。
[0249] 此种抗原结合蛋白质的另外一个例子包括(a)1个VL1，和(b)VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11或VL12之一。此种抗原结合蛋白质的另外一个例子包括(a)1个VL2，和(b)VL1、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11或VL12之一。此种抗原结合蛋白质的另外一个例子包括(a)1个VL3，和(b)VL1、VL2、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11或VL12之一等。
[0250] 重链可变区的各种组合可以与轻链可变区的各种组合中任何一个组合。
[0251] 在其他情况下，抗原结合蛋白质包含两个等同的轻链可变区和/或两个等同的重链可变区。例如，抗原结合蛋白质可以是抗体或免疫学功能性片段，其包括与表1中列出的轻链可变区对和重链可变区对组合的两个轻链可变区和两个重链可变区。
[0252] 所提供的某些抗体包括重链可变结构域，所述结构域包含仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基处与选自VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11和VH12的重链可变结构域序列不同的氨基酸序列，其中每个此种序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或取代。某些抗体中的重链可变区包括与VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11和VH12的重链可变区的氨基酸序列具有至少70％、75％、
80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。
[0253] 某些抗体包括轻链可变结构域，所述结构域包含仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基处与选自VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11和VL12的轻链可变结构域序列不同的氨基酸序列，其中每个此种序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或取代。某些抗体中的轻链可变区包括与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11和VL12的轻链可变区的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、
90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。
[0254] 另外其他的抗原结合蛋白质例如抗体或免疫学功能性片段包括如刚才描述的各种形式的可变重链和可变轻链。
[0255] 2.CDRs
[0256] 在常规抗体中，CDRs包埋在重和轻链可变区中的构架内，其中它们构成负责抗原结合和识别的区域。相同种类的免疫球蛋白链的可变结构域一般显示相似的总体结构，包括通过高变区连接的相对保守的构架区(FR)，所述高变区更通常称为“互补决定区”或CDRs。可变区包括至少3个重或轻链CDRs。来自上文提及的每个重链/轻链对的两条链的CDRs一般通过构架区比对，以形成与靶蛋白质(例如，GM-CSF)上的特定表位特异性结合的结构。从N末端到C末端，天然存在的轻和重链可变区一般都符合这些元件的下述顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已设计编号系统用于对占据这些结构域中每一个结构域的位置的氨基酸指定编号。给定抗体的互补决定区(CDRs)和构架区(FR)可以使用这种系统进行鉴定。这种编号系统在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH公开号91-3242，
1991或Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：
878-883中定义。如本文所描述的，本文提供的CDRs不仅可以用于定义常规抗体结构的抗原结合结构域，还可以包埋在各种其他多肽结构中。
[0257] 本文公开的抗原结合蛋白质是一个或多个CDRs移植、插入和/或连接到其内的多肽。抗原结合蛋白质可以具有1、2、3、4、5或6个CDRs。然而，还考虑抗原结合蛋白质可以具有超过6个CDRs。抗原结合蛋白质因此可以具有例如1个重链CDR1(“CDRH1”)、和/或1个重链CDR2(“CDRH2”)、和/或1个重链CDR3(“CDRH3”)、和/或1个轻链CDR1(“CDRL1”)、和/或1个轻链CDR2(“CDRL2”)、和/或1个轻链CDR3(“CDRL3”)。某些抗原结合蛋白质包括CDRH3和CDRL3两者。本文公开的某些抗原结合蛋白质包括这样的一个或多个氨基酸序列：其与表2(CDRHs)和表3(CDRLs)中呈现的一个或多个CDRs的氨基酸序列等同或具有显著序列同一性。
[0258] 表2
[0259] 示例性CDRH序列
[0260] SEQ ID NO：氨基酸序列
[0261] 10 GYYIH
[0262] 11 WINPNSGGTNSAQKFRG
[0263] 12 EGGYSYGYFDY
[0264] 22 GYYMH
[0265] 23 WINPNSGGTNYAQKFKG
[0266] 24 DKWLDGFDY
[0267] 35 WINPNSGGTNYAQKFQG
[0268] 36 DRWLDAFDI
[0269] 47 WINPNSGGTNYAQRFRG
[0270] 48 APYDWTFDY
[0271] 59 WINPNSGGRNYAQKFQG
[0272] 60 DRWLDAFEI
[0273] 70 SYGIS
[0274] 71 WISAYNGNTDYAQKLQG
[0275] 72 QRYYYSMDV
[0276] 94 GYYMY
[0277] 95 WINPNSGGTNYARKFQG
[0278] 96 RPWELPFDY
[0279] 108 NGDYVFTYFDY
[0280] 119 WINPNSGGTNYAQKFRG
[0281] 120 FGYFGYYFDY
[0282] 132 DPYTSGFDY
[0283] 142 SGGYYWS
[0284] SEQ ID NO：氨基酸序列
[0285] 143 YIYYSGSTYYNPSLKS
[0286] 144 EDTAMDYFDY
[0287] 表3
[0288] 示例性CDRL序列
[0289] SEQ ID NO：氨基酸序列
[0290] 4 KSSQSILYSSSNENFLT
[0291] 5 WASTRES
[0292] 6 QQYFSVFRT
[0293] 16 RASQSVSSSYFA
[0294] 17 GASSRAT
[0295] 18 QQYDRSPRT
[0296] 40 RASQYISNTYLA
[0297] 41 GAATRAT
[0298] 42 QQYGSSPWT
[0299] 52 RASQSVCSSYLA
[0300] 64 IRTSGSIASNYVQ
[0301] 65 EDDQRPS
[0302] 66 QSCDISNVV
[0303] 77 GTSSRAT
[0304] 78 LQYDRSPRT
[0305] 88 RASQSLSSIYLA
[0306] 90 QQYATSPWT
[0307] 100 RASQSISNYLN
[0308] 101 TASSLQS
[0309] 102 QQSFSFPIT
[0310] 112 TGTSSDVGGYNYVS
[0311] 113 EVSGRPS
[0312] 114 SSFTGSSTWL
[0313] 124 RASPSVSSSYFA
[0314] SEQ ID NO：氨基酸序列
[0315] 126 QQYGWSPRT
[0316] 136 SGSRSHIGSNTVN
[0317] 137 SNNHRPS
[0318] 138 AAWDDSLNGPV
[0319] 在一个方面，本文公开的CDRs包括来源于相关单克隆抗体组的共有序列。如本文所描述的，“共有序列”指具有在许多序列中共有的保守氨基酸和在给定氨基酸序列内不同的可变氨基酸的氨基酸序列。所提供的CDR共有序列包括与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL中的每一个对应的CDRs。
[0320] 使用与抗GM-CSF抗体VH和VL对应的CDRs的标准系统发生分析来测定共有序列。通过使CDRs在与VH或VL对应的相同序列内保持连续来测定共有序列。
[0321] CDRH1共有序列包括由X1X2GX3X4FX5X6YX7X8X9(SEQ ID NO：94)组成的氨基酸序列，其中X1选自G和无氨基酸，X2选自G和无氨基酸，X3选自Y和F，X4选自T和S，X5选自T、S和G，X6选自G和S，X7选自Y和G，X8选自I和M，并且X9选自H和S。在一个方面，CDRH1共有序列是SEQ ID NO：94，即X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9，其中X1选自G和无氨基酸，X2选自G和无氨基酸，X3选自Y和F，X4选自T和S，X5选自T、S和G，X6选自G和S，X7选自Y和G，X8选自I和M，并且X9选自H和S。
[0322] CDRH2共有序列包括由X1X2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14X15G(SEQ ID NO：106)组成的氨基酸序列，其中X1选自W和无氨基酸，X2选自I和Y，X3选自N、S和I、X4选自P、A和Y，X5选自N和Y，X6选自S和N，X7选自G和N，X8选自T和R，X9选自N和D，X10选自Y和S，X11选自A和N，X12选自Q和R，X13选自K和R，X14选自F和L，并且X15选自Q、K和R。在一个方面，CDRH2共有序列是WINPNSGGTNX1AX2X3FX4G，其中X1是Y或S，X2是Q或R，X3是K或R，并且X4是R、K或Q(SEQ ID NO：28)。
[0323] CDRH3共有序列包括选自X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9(SEQ ID NO：83)的氨基酸序列，其中X1选自E和无氨基酸，X2选自G和无氨基酸，X3选自P、D和G，X4选自Y、W、R和K，X5选自S、W、F和T，X6选自Y和L，X7选自D和G，X8选自Y、无氨基酸和A，并且X9选自M、T和V。
[0324] CDRL1 共 有 序 列 包 括 选 自 KSSQSX1LYSSX2NX3NX4LX5(SEQ IDNO：107)、RASX1X2X3X4X5X6YX7X8(SEQ ID NO：118)和X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10NX11VX12(SEQ ID NO：125)的氨基酸序列，KSSQSX1LYSSX2NX3NX4LX5中X1选自V和I，X2选自S和N，X3选自E和K，X4选自Y和F，并且X5选自T和A；RASX1X2X3X4X5X6YX7X8中X1选自Q和P，X2选自S和Y，X3选自V、L和I，X4选自S和C，X5选自S和N，X6选自S、I、T和无氨基酸，X7选自F和L，并且X8选自A和N；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10NX11VX12中X1选自I、S和T，X2选自R和G，X3选自T和S，X4选自R和S，X5选自G和S，X6选自S、H和D，X7选自I和V，X8选自A和G，X9选自无氨基酸和G，X10选自S和Y，X11选自Y和T，并且X12选自Q、N和S。在一个方面，CDRL1共有序列是RASQX1X2X3X4X5YX6A，其中X1是s或y，X2是V、I或L，X3是S或N、X4是S或C，X4是S、T、S或Y，X5是F或L(SEQ ID NO：30)。
[0325] CDRL2共有序列包括选自X1X2X3X4X5X6X7，(SEQ ID NO：130)和X1X2X3X4RPS(SEQ ID NO：131)的氨基酸序列，X1X2X3X4X5X6X7中X1选自G、T和W，X2选自T和A，X3选自S和A，X4选自S和T，X5选自R和L，X6选自A、E和Q，并且X7选自T和S；X1X2X3X4RPS中X1选自E和S，X2选自D、V和N，X3选自D、S和N，并且X4选自Q、G和H。在一个方面内，CDRL2共有序列是GX1SSRAT，其中X1是a或T(SEQ ID NO：34)。
[0326] CDRL3 共 有 序 列 包 括 选 自 X1QX2X3X4X5X6X7T(SEQ ID NO：84) 和X1X2X3X4DSSNX5X6X7(SEQ ID NO：89)的氨基酸序列，X1QX2X3X4X5X6X7T中X1选自Q和L，X2选自Y和s，X3选自D、G和F，X4选自R、T和S，X5选自S和V，X6选自F和P，并且X7选自R和W；X1X2X3X4DSSNX5X6X7中X1选自S和A，X2选自S和A，X3选自W和F，X4选自D和T，X5选自G、W和无氨基酸，X6选自V、L和P，并且X6选自V和无氨基酸。在一个方面内，CDRL3共有序列是QQX1X2X3X4X5X6T，其中X1是Y或S，X2是F、G或A，X3是S、T或W，X4是V、S、F，X5是F或P，X6是R、W或I(SEQID NO：46)。
[0327] 在另一个方面，所提供的CDRs是(a)选自下组的CDRH：(i)选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1；(ii)选自SEQ IDNO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；
和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过5、4、3、2或1个氨基酸；(B)选自下组的CDRL：(i)选自SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：6、18、
42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过5、4、3、
2或1个氨基酸。
[0328] 在另外一个方面，表2和3中列出的CDRs的变体形式与表2和3中列出的CDR序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。
[0329] 根据一个方面，提供了结合GM-CSF的经分离的抗原结合蛋白质，其包括(A)选自下组的一个或多个重链互补决定区(CDRHs)：(i)选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1；(ii)选自SEQ IDNO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过5、4、3、2或1个氨基酸；(B)选自下组的一个或多个轻链互补决定区(CDRLs)：(i)选自SEQ ID NO：4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；和(iv)包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超过5、4、3、2或1个氨基酸；或(C)(A)的一个或多个重链CDRHs和(B)的一个或多个轻链CDRLs。
[0330] 在另外一个实施方案中，经分离的抗原结合蛋白质可以包括(A)选自下组的CDRH：(i)选自SEQ ID NO：10、22、7094和142的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和143的CDRH2；和(iii)选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72、
83、96、108、120、132和144的CDRH3；(B)选自下组的CDRL：(i)选自SEQ ID NO：4、16、30、
40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)选自SEQ IDNO：5、17、29、
34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：6、18、42、46、66、
78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3；或(C)(A)的一个或多个重链CDRHs和(B)的一个或多个轻链CDRLs。
[0331] 在另一个实施方案中，可变重链(VH)与选自SEQ ID NO：9、21、33、45、57、69、81、93、105、117、129和141的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性，和/或可变轻链(VL)与选自SEQ ID NO：3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、123和135的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性。
[0332] 在一个进一步的方面，提供了结合GM-CSF的经分离的抗原结合蛋白质，所述抗原结合蛋白质包括A)选自下组的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自SEQ ID NOs：12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3；(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRH3在氨基酸序列中不同的CDRH3；(iii)选自
X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9(SEQ ID NO：83)的CDRH3氨基酸序列，其中X1选自E和无氨基酸，X2选自G和无氨基酸，X3选自P、D和G，X4选自Y、W、R和K，X5选自S、W、F和T，X6选自Y和L，X7选自D和G，X8选自Y、无氨基酸和A，并且X9选自M、T和V；和/或B)选自下组的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自SEQ ID NOs：6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126和138的CDRL3，(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRL3在氨基酸序列中不同的CDRL3；和iii)选自X1QX2X3X4X5X6X7T(SEQ ID NO：84)和X1X2X3X4DSSNX5X6X7(SEQ ID NO：89)的CDRL3氨基酸序列，X1QX2X3X4X5X6X7T中X1选自Q和L，X2选自Y和S，X3选自D、G和F，X4选自R、T和S，X5选自S和V，X6选自F和P，并且X7选自R和W；X1X2X3X4DSSNX5X6X7中X1选自S和A，X2选自S和A，X3选自W和F，X4选自D和T，X5选自G、W和无氨基酸，X6选自V、L和P，并且X6选自V和无氨基酸。
[0333] 在另一个实施方案内，抗原结合蛋白质进一步包括：A)选自下组的CDRH：(i)选自SEQ ID NOs：10、22、7094和142的CDRH1；(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRH1在氨基酸序列中不同的CDRH1；(iii)选自
X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9(SEQ ID NO：94)的CDRH1氨基酸序列，其中X1选自G和无氨基酸，X2选自G和无氨基酸，X3选自Y和F，X4选自T和S，X5选自T、S和G，X6选自G和S，X7选自Y和G，X8选自I和M，并且X9选自H和S，或(iv)选自SEQ ID NOs：5、17、29、34、41、65、
77、101、113、130、131和137的CDRH2；(v)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(iv)的CDRH2在氨基酸序列中不同的CDRH2；或(vi)由X1X2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X1
2X13X14X15G(SEQ ID NO：106)组成的CDRH2氨基酸序列，其中X1选自W和无氨基酸，X2选自I和Y，X3选自N、S和I，X4选自P、A和Y，X5选自N和Y，X6选自S和N，X7选自G和N，X8选自T和R，X9选自N和D，X10选自Y和S，X11选自A和N，X12选自Q和R，X13选自K和R，X14选自F和L，并且X15选自Q、K和R；或B)选自下组的CDRL：(i)选自SEQ IDNOs：4、16、
30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和136的CDRL1；(ii)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(i)的CDRL1在氨基酸序列中不同的CDRL1；(iii)选自KSSQSX1XLYSSX2NX3NX4LX5(SEQ ID NO：107)、RASX1X2X3X4X5X6YX7X8(SEQ ID NO：118)或X1X2X3X
4X5X6YX7X8X9X10NX11VX12(SEQ ID NO：125)的CDRL1氨基酸序列，KSSQSX1XLYSSX2NX3NX4LX5中X1选自V和I，X2选自S和N，X3选自E和K，X4选自Y和F，并且X5选自T和A；RASX1X2X3X4X5X6YX7X8中X1选自Q和P，X2选自S和Y，X3选自V、L和I，X4选自S和C，X5选自S和N，X6选自S、I、T和无氨基酸，X7选自F和L，并且X8选自A和N；X1X2X3X4X5X6YX7X8X9X10NX11VX12中X1选自I、S和T，X2选自R和G，X3选自T和S，X4选自R和S、X5选自G和S，X6选自S、H和D，X7选自I和V，X8选自A和G，X9选自无氨基酸和G，X10选自S和Y，X11选自Y和T，并且X12选自Q、N和S；或(iv)选自SEQ ID NOs：5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131和137的CDRL2；(v)通过不超过两个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而与(iv)的CDRL2在氨基酸序列中不同的CDRL2；或(vi)选自X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO：130)或X1X2X3X4RPS(SEQ ID NO：131)的CDRL2氨基酸序列，X1X2X3X4X5X6X7中X1选自G、T和W，X2选自T和A，X3选自S和A，X4选自S和T，X5选自R和L，X6选自A、E和Q，并且X7选自T和S；X1X2X3X4RPS中X1选自E和S，X2选自D、V和N，X3选自D、S和N，并且X4选自Q、G和H。
[0334] 在一个方面，本文提供的经分离的抗原结合蛋白质可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
[0335] 在另一个实施方案中，本文提供的经分离的抗原结合蛋白质的抗体片段可以是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。
[0336] 在一个进一步的实施方案中，本文提供的经分离的抗原结合蛋白质是人抗体，并且可以是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
[0337] 在另外一个方面，本文提供的经分离的抗原结合蛋白质可以与标记基团偶联，并且可以与本文提供的经分离的抗原结合蛋白质之一的抗原结合蛋白质竞争与人GM-CSF的细胞外部分结合。在一个实施方案中，当施用于患者时，本文提供的经分离的抗原结合蛋白质可以减少单核细胞趋化性，抑制单核细胞迁移到肿瘤内，或抑制肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中的累积。
[0338] 如本领域技术人员应当理解的，对于具有来自所述序列的超过一个CDR的任何抗原结合蛋白质，独立地选自所述序列的CDRs的任何组合都是有用的。因此，可以产生具有1、2、3、4、5或6个独立地选择的CDRs的抗原结合蛋白质。然而，如本领域技术人员应当理解的，具体实施方案一般利用非重复CDRs的组合，例如一般用两个CDRH2区制备抗原结合蛋白质，等等。
[0339] 所提供的某些抗原结合蛋白质在下文中更详细地讨论。
[0340] 抗原结合蛋白质和结合表位
[0341] 当抗原结合蛋白质被说成结合特定残基例如GM-CSF或GM-CSF的细胞外结构域内的表位时，例如，这意指抗原结合蛋白质与由特定残基(例如，GM-CSF的特定区段)组成的多肽特异性结合。此种抗原结合蛋白质一般不接触GM-CSF或GM-CSF的细胞外结构域内的每一个残基。GM-CSF或GM-CSF的细胞外结构域内的每一个单个氨基酸取代或缺失也不一定显著影响结合亲和力。抗原结合蛋白质的表位特异性可以以各种方式进行测定。例如，一种方法涉及测试约15个氨基酸的重叠肽集合，所述氨基酸跨越抗原序列且在少量氨基酸(例如3个氨基酸)增量中不同。肽固定在微量滴定皿的孔内。固定可以通过使肽的一个末端生物素化来实现。任选地，相同肽的不同样品可以在氨基和羧基末端处进行生物素化，并且固定在分开孔内用于比较目的。这对于鉴定末端特异性抗原结合蛋白质是有用的。任选地，可以包括在特定目的氨基酸终止的另外的肽。这种方法可用于鉴定GM-CSF(或GM-CSF的细胞外结构域)的内部片段的末端特异性抗原结合蛋白质。筛选抗原结合蛋白质或免疫学功能性片段与多种肽的每一个的特异性结合。表位定义为伴随氨基酸区段存在，所述氨基酸区段是抗原结合蛋白质对其显示特异性结合的所有肽共有的。关于用于限定表位的具体方法的细节在实施例13中阐述。
[0342] 竞争性抗原结合蛋白质
[0343] 在另一个方面，提供了抗原结合蛋白质，其与例示抗体或功能片段之一竞争结合用于特异性结合GM-CSF的上述表位。此种抗原结合蛋白质也可以与本文例示的抗原结合蛋白质之一相同的表位或重叠表位结合。与例示抗原结合蛋白质的相同表位竞争或结合的抗原结合蛋白质和片段预期显示相似的功能性质。例示的抗原结合蛋白质和片段包括上文描述的那些，包括具有表1、2和3中包括的重和轻链、可变区结构域和CDRs的那些。
[0344] 1.单克隆抗体
[0345] 提供的抗原结合蛋白质包括与GM-CSF结合的单克隆抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术来产生，例如在免疫接种方案完成后，通过使从转基因动物中收获的脾细胞永生化。脾细胞可以使用本领域已知的任何技术进行永生化，例如通过使其与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。在杂交瘤产生融合操作中使用的骨髓瘤细胞优选是不产生抗体的，具有高融合效率和使其无法在仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的特定选择性培养基中生长的酶缺陷。在小鼠融合中使用的合适细胞系例子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul；在大鼠融合中使用的细胞系例子包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。对于细胞融合有用的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
[0346] 在某些情况下，杂交瘤细胞系通过下述方法产生：用GM-CSF免疫原免疫动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)；从已免疫的动物中收获脾细胞；使所收获的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，从而产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并且鉴定产生结合GM-CSF多肽的抗体的杂交瘤细胞系。此种杂交瘤细胞系和由其产生的抗GM-CSF单克隆抗体是本发明的方面。
[0347] 由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术进行纯化。可以进一步筛选杂交瘤或mAbs，以鉴定具有特定性质的mAbs，例如阻断Wnt诱导的活性的能力。此种筛选的例子在下文实施例中提供。
[0348] 2.嵌合和人源化抗体
[0349] 还提供了基于前述序列的嵌合和人源化抗体。用作治疗剂的单克隆抗体可以在使用前以各种方式进行修饰。一个例子是嵌合抗体，其是由来自不同抗体的蛋白质区段组成的抗体，所述蛋白质区段共价连接以产生功能性免疫球蛋白轻或重链或其免疫学功能性部分。一般地，重链和/或轻链的部分与来自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源。对于与嵌合抗体相关的方法，参见例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855。CDR移植例如在美国专利号6,180,370，、5,693,762，、5,693,761，、5,585,089和5,530,101中描述。
[0350] 一般地，制备嵌合抗体的目的是制备其中来自预期患者物种的氨基酸数目达到最大的嵌合体。一个例子是“CDR移植”抗体，其中抗体包括来自特定物种或属于特定抗体类或亚类的一个或多个互补决定区(CDRs)，而抗体链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源。对于在人中的使用，来自啮齿类动物抗体的可变区或所选择的CDRs通常移植到人抗体内，替换人抗体天然存在的可变区或CDRs。
[0351] 一个有用类型的嵌合抗体是“人源化”抗体。一般地，人源化抗体由最初在非人动物中产生的单克隆抗体产生。这种单克隆抗体中一般来自抗体的非抗原识别部分的特定氨基酸残基进行修饰，以与相应同种型的人抗体中的相应残基同源。人源化可以例如使用各种方法来执行，所述方法是通过用至少部分啮齿类动物可变区取代人抗体的相应区域(参见例如，美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature 332：323-27；Verhoeyen等人，1988，Science 239：
1534-1536)。
[0352] 在一个方面，将本文提供的抗体的轻和重链可变区的CDRs(参见表2)移植给来自相同或不同系统发生物种的抗体的构架区(FRs)。例如，重和轻链可变区VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11和VH12，和/或VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11和VL12的CDRs可以移植给共有人FRs。为了制备共有人FRs，可以比对来自数个人重链或轻链氨基酸序列的FRs，以鉴定共有氨基酸序列。在其他实施方案中，本文公开的重链或轻链的FRs由来自不同重链或轻链的FRs替换。在一个方面，不替换抗GM-CSF抗体的重和轻链的RFs中的罕见氨基酸，而替换FR氨基酸的其余部分。“罕见氨基酸”是处于一种位置中的特定氨基酸，在FR中，该特定氨基酸通常不存在于该位置中。可替代地，来自一条重或轻链的经移植的可变区可以连同恒定区使用，所述恒定区与如本文公开的那种特定重或轻链的恒定区不同。在其他实施方案中，移植的可变区是单链Fv抗体的部分。
[0353] 在特定实施方案中，来自除人外的物种的恒定区可以连同人可变区一起使用，以产生杂合抗体。
[0354] 3.全人抗体
[0355] 还提供了全人抗体。无需使人类暴露于抗原而制备对于给定抗原特异的全人抗体的方法是可获得的(“全人抗体”)。提供用于实现全人抗体产生的一种具体方法是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源Ig基因已灭活的小鼠内是在小鼠中产生全人单克隆抗体(mAbs)的一种方法，所述小鼠是可以用任何所需抗原免疫接种的动物。使用全人抗体可以使免疫原性和过敏反应降到最低，所述免疫原性和过敏反应有时可以通过将小鼠或小鼠来源的mAbs作为治疗剂施用于人而引起。
[0356] 全人抗体可以通过免疫接种转基因动物(通常是小鼠)而产生，所述转基因动物在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下能够产生人抗体所有组成成分。用于这个目的的抗原一般具有6个或更多个邻接氨基酸，并且任选与载体例如半抗原缀合。参见例如，Jakobovits等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，1993，Nature 362：255-258；和Bruggermann等人，1993，Year in Immunol.7：33。在此种方法的一个例子中，转基因动物通过下述方法产生：使编码小鼠重和轻免疫球蛋白链的内源小鼠免疫球蛋白基因座丧失能力，并且将包含编码人重和轻链蛋白质的基因座的人基因组DNA的大片段插入小鼠基因组内。随后使具有少于人免疫球蛋白基因座的完全互补序列的部分修饰的动物杂交，以获得具有全部所需免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生这样的抗体：其对于免疫原是免疫特异性的，但具有人而不是鼠氨基酸序列，包括可变区。关于此种方法的进一步细节，参见例如，WO96/33735和WO94/02602。关于用于制备人抗体的转基因小鼠的另外方法在美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299 和 5,545,806；PCT公开WO91/10741、WO90/04036，以及EP 546073B1和EP 546073A1中描述。
[0357] 上文描述的转基因小鼠在本文中称为“HuMab”小鼠，包含编码未重排的人重([μ]和[γ])和[κ]轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座(minilocus)，连同灭活内源[μ]和[κ]链基因座的被靶定的突变(Lonberg等人，1994，Nature 368：856-859)。因此，小鼠显示减少的小鼠IgM或[κ]表达并且反应于免疫接种，并且所引入的人重和轻链转基因经历类转换和体细胞突变，以产生高亲和力人IgG[κ]单克隆抗体(Lonberg 等 人，同 上.；Lonberg 和Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.13：65-93；
Harding和Lonberg，1995，Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546)。HuMab小鼠的制备在下述文献中详细描述：Taylor等人，1992，Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen等人，1993，International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1994，J.Immunol.152：
2912-2920；Lonberg 等 人，1994，Nature 368：856-859；Lonberg，1994，Handbook of Exp.Pharmacology113：49-101；Taylor 等 人，1994，International Immunology 6：
579-591；Lonberg和Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding和Lonberg，
1995，Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546；Fishwild 等 人，1996，NatureBiotechnology
14：845-85。进一步参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；
5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；以及美国专利号5,545,807；PCT公开号WO93/1227；WO 92/22646；和WO 92/03918。用于在这些转基因小鼠中产生人抗体的技术也公开于PCT公开号WO 98/24893和Mendez等人，1997，Nature Genetics 15：146-156中。例如，HCo7和HCo12转基因小鼠品系可以用于产生抗GM-CSF抗体。
[0358] 使用杂交瘤技术，可以产生并且从转基因小鼠例如上文描述的小鼠中选择具有所需特异性的抗原特异性人mAbs。此种抗体可以进行克隆，并且使用合适载体和宿主细胞进行表达，或抗体可以从培养的杂交瘤细胞中收获。
[0359] 全人抗体还可以衍生自噬菌体展示文库(如Hoogenboom等人，1991，J.Mol.Biol.227：381；和Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581中公开的)。噬菌体展示技术通过下述来模拟免疫选择：在丝状噬菌体的表面上展示抗体所有组成成分，并且通过其与选择的抗原的结合随后选择噬菌体。一个此种技术在PCT公开号WO 99/10494中描述，其中描述了使用此种方法分离用于MPL-和msk-受体的高亲和力和功能性拮抗性抗体。
[0360] 4.双特异性或双功能抗原结合蛋白质
[0361] 提供的抗原结合蛋白质还包括双特异性和双功能抗体，其包括如上所述的一个或多个CDRs或一个或多个可变区。在某些情况下，双特异性或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过各种方法产生，包括但不限于，杂交瘤融合或Fab′片段连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。
[0362] 5.各种其他形式
[0363] 提供的某些抗原结合蛋白质是上文公开的抗原结合蛋白质(例如，具有表1-4中列出的序列的那些)的变体形式。例如，某些抗原结合蛋白质具有在表1-4中列出的一条或多条重或轻链、可变区或CDRs中的一个或多个保守氨基酸取代。
[0364] 天然存在的氨基酸可以基于共有侧链性质分类：
[0365] 1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
[0366] 2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
[0367] 3)酸性：Asp、Glu；
[0368] 4)碱性：His、Lys、Arg；
[0369] 5)影响链定向的残基：Gly、Pro；和
[0370] 6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
[0371] 保守氨基酸取代可以涉及这些类别之一的成员与相同类别的另一个成员的交换。保守氨基酸取代可以包含非天然存在的氨基酸残基，其一般通过化学肽合成而不是通过在生物系统中合成而掺入。这些包括模拟肽(peptidomimetics)和其他逆转或倒转形式的氨基酸部分。
[0372] 非保守取代可以涉及上述类别之一的成员交换来自另一个类别的成员。此种取代残基可以引入与人抗体同源的抗体区域内或分子的非同源区内。
[0373] 在制备此种改变中，根据特定实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数。蛋白质的亲水性谱通过下述进行计算：对每个氨基酸指定数值(“亲水指数”)，并且随后沿着肽链反复求这些值的平均值。每个氨基酸已基于其疏水性和电荷特征指定亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；
天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
[0374] 亲水性谱在对蛋白质赋予相互作用生物学功能中的重要性是本领域理解的(参见例如，Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知特定氨基酸可以取代具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸，并且仍保留生物活性。在基于亲水指数进行改变中，在特定实施方案中，包括其亲水指数在±2内的氨基酸取代。在某些方面，包括在±1内的那些，并且在其他方面，包括在±0.5内的那些。
[0375] 本领域还理解类似氨基酸的取代可以基于亲水性有效进行，特别是当由此制备的生物学功能性蛋白质或肽预期用于免疫学实施方案中时(如在本文情况下)。在特定实施方案中，由邻近氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原结合或免疫原性相关，即与蛋白质的生物性质相关。
[0376] 下述亲水性值已指定给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变中，在特定实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸取代，在其他实施方案中，包括在±1内的那些，并且在另外其他的实施方案中，包括在±0.5内的那些。在某些情况下，还可以基于亲水性鉴定来自一级氨基酸序列的表位。这些区域还称为“表位核心区”。
[0377] 示例性保守氨基酸取代在表4中阐述。
[0378] 表4
[0379] 保守氨基酸取代
[0380] 原始残基 示例性取代
[0381] Ala Ser
[0382] Arg Lys
[0383] Asn Gln、His
[0384] Asp Glu
[0385] Cys Ser
[0386] Gln Asn
[0387] Glu Asp
[0388] Gly Pro
[0389] His Asn、Gln
[0390] Ile Leu、Val
[0391] Leu Ile、Val
[0392] Lys Arg、Gln、Glu
[0393] Met Leu、Ile
[0394] Phe Met、Leu、Tyr
[0395] Ser Thr
[0396] Thr Ser
[0397] Trp Tyr
[0398] Tyr Trp、Phe
[0399] Val Ile、Leu
[0400] 使用众所周知的技术，技术人员将能够测定如本文所述多肽的合适变体。通过靶定认为对于活性不重要的区域，本领域技术人员可以鉴定可以改变而不破坏活性的合适分子区域。技术人员还将能够鉴定在相似多肽之间保守的残基和分子部分。在进一步的实施方案中，即使可能对于生物活性或对于结构重要的区域也可以进行保守氨基酸取代，而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
[0401] 此外，技术人员可以参考鉴定相似多肽中对于活性或结构重要的残基的结构-功能研究。根据此种比较，可以预测氨基酸残基在蛋白质中的重要性，其与相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基对应。技术人员可以选择化学上相似的氨基酸取代用于此种预测重要的氨基酸残基。
[0402] 本领域技术人员还可以分析与相似多肽中的三维结构相关的三维结构和氨基酸序列。考虑到此种信息，本领域技术人员可以预测在三维结构方面抗体氨基酸残基的比对。本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白质表面上的氨基酸残基进行根本改变，因为此种残基可能涉及与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以制备在每个所需氨基酸残基处包含单个氨基酸取代的测试变体。这些变体随后可以使用GM-CSF中和活性测定来进行筛选(参见下文实施例)，因此产生关于哪些氨基酸可以改变以及哪些一定不能改变的信息。换言之，基于由此种常规实验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定其中进一步取代应单独或与其他突变组合避免的氨基酸位置。
[0403] 许多科学出版物已致力于预测二级结构。参见，Moult，1996，Curr.Op.in Biotech.7：422-427；Chou 等 人，1974，Biochem.13：222-245；Chou 等 人，1974，Biochemistry 113：211-222；Chou等人，1978，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol. Biol.47：45-148；Chou等人，1979，Ann.Rev.Biochem.47：251-276；和Chou等人，1979，Biophys.J.26：367-384。此外，计算机程序目前可用于帮助预测二级结构。预测二级结构的一种方法基于同源性建模。例如，具有超过30％的序列同一性或超过40％的相似性的两种多肽或蛋白质通常具有相似的结构拓扑学。蛋白质结构数据库(PDB)的近期增长已提供二级结构，包括在多肽或蛋白质结构内的潜在折叠数目的增强的可预测性。参见，Holm等人，
1999，Nucl.Acid.Res.27：244-247。已提示(Brenner等人，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7：
369-376)在给定多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠，并且一旦解决关键数目的结构，结构预测将变得明显更精确。
[0404] 预测二级结构的另外方法包括“穿线(threading)”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-387；Sippl等人，1996，Structure 4：15-19)、“谱分析”(Bowie等人，1991，Science 253：164-170；Gribskov等人，1990，Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)、和“进化连接”(参见，Holm，1999，supra；
和Brenner，1997，同上)。
[0405] 在某些实施方案中，进行这样的氨基酸取代，其：(1)减少对蛋白水解的敏感性，(2)减少对氧化的敏感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(4)对此种多肽赋予或修饰其他物理化学或功能性质。例如，可以在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸取代(在特定实施方案中，保守氨基酸取代)。可以在位于形成分子间接触的结构域外的抗体部分中进行取代)。在此种实施方案中，可以使用基本上不改变亲本序列的结构特征的保守氨基酸取代(例如，不破坏表征亲本或天然抗原结合蛋白质的二级结构的一个或多个替换氨基酸)。本领域公认的多肽二级和三级结构的例子在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，编辑)，1984，W.H.New York：Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden和Tooze，编辑)，1991，NewYork：Garland Publishing；和Thornton等人，1991，Nature 354：
105中描述。
[0406] 另外优选的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中在亲本或天然氨基酸序列中的一个或多个半胱氨酸残基缺失或由另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代。半胱氨酸变体是有用的，特别当抗体必须重折叠成生物活性构象时。半胱氨酸变体可以具有比天然抗体更少的半胱氨酸残基，并且一般具有偶数数目，以使起因于未配对半胱氨酸的相互作用降到最低。
[0407] 所公开的重和轻链、可变区、结构域和CDRs可以用于制备包含抗原结合区的多肽，所述抗原结合区可以与GM-CSF多肽特异性结合。例如，表3和4中列出的一个或多个CDRs可以共价或非共价掺入分子(例如，多肽)内，以产生免疫粘附素。免疫粘附素可以掺入一个或多个CDR作为更大多肽链的部分，可以使一个或多个CDR与另一条多肽链共价连接，或可以非共价掺入一个或多个CDR。一个或多个CDR使得免疫粘附素能够与特定目的抗原(例如，GM-CSF多肽或其表位)特异性结合。
[0408] 还提供了基于本文描述的可变区结构域和CDRs的模拟物(例如，“肽模拟物”或“模拟肽”)。这些类似物可以是肽、非肽或肽和非肽区域的组合。Fauchere，1986，Adv.Drug Res.15：29；Veber和Freidinger，1985，TINS第392页；和Evans等人，1987，J.Med.Chem.30：1229。与治疗上有用的肽在结构上相似的肽模拟物可以用于产生相似的治疗或预防作用。此种化合物通常借助于计算机化分子建模来开发。一般地，模拟肽是这样的蛋白质：其与显示所需生物活性(在此处例如特异性结合GM-CSF的能力)的抗体在结构上相似，但具有通过本领域众所周知的方法由选自-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-的键任选替换的一个或多个肽键。共有序列的一个或多个氨基酸由相同类型的D-氨基酸的系统取代(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可以在特定实施方案中用于产生更稳定的蛋白质。此外，包括共有序列或基本上等同的共有序列变异的限制肽可以通过本领域已知的方法产生(Rizo和Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61：387)，例如通过加入能够形成使肽环化的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基。
[0409] 还提供了本文描述的抗原结合蛋白质的衍生物。经衍生的抗原结合蛋白质可以包括任何对抗体或片段赋予所需性质，例如在特定使用中增加的半衰期的分子或物质。经衍生的抗原结合蛋白质可以包括例如可检测(或标记)部分(例如，放射性分子、比色分子、抗原分子或酶分子、可检测珠(例如磁珠或电子致密(例如金)珠)、或与另一种分子(例如生物素或链霉亲和素)结合的分子、治疗或诊断部分(例如，放射性部分、细胞毒性部分或药学活性部分)、或增加抗原结合蛋白质用于特定用途(例如，施用于受试者例如人受试者，或其他体内或体外用途)的适合性的分子。可以用于衍生抗原结合蛋白质的分子的例子包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。抗原结合蛋白质的白蛋白连接的和PEG化的衍生物可以使用本领域众所周知的技术进行制备。在一个实施方案中，使抗原结合蛋白质与运甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其他方式连接。TTR或TTR变体可以用例如选自下组的化学物质进行化学修饰：右旋糖酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。
[0410] 其他衍生物包括GM-CSF抗原结合蛋白质与其他蛋白质或肽的共价或聚集缀合物，例如通过重组融合蛋白表达，所述重组融合蛋白包括与GM-CSF抗原结合蛋白质的N末端或C末端融合的异源多肽。例如，经缀合的肽可以是异源信号(或前导)多肽例如酵母α-因子前导区，或肽例如附加表位。包含GM-CSF抗原结合蛋白质的融合蛋白可以包括加入以促进GM-CSF抗原结合蛋白质的纯化或鉴定的肽(例如，聚-His)。GM-CSF抗原结合蛋白质还可以与如Hopp等人，1988，Bio/Technology 6：1204；和美国专利号5,011,912中描述的FLAG肽连接。FLAG肽是高度抗原性的，并且提供由特异性单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，使得能够快速测定且促进所表达重组蛋白质的纯化。对于制备其中FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白有用的试剂是商购可得的(Sigma，St.Louis，MO)。
[0411] 包含一种或多种GM-CSF抗原结合蛋白质的寡聚物可以用作GM-CSF拮抗剂。寡聚物可以为共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高寡聚物的形式。考虑使用包括两个或更多个GM-CSF抗原结合蛋白质的寡聚物，其中一个例子是同二聚体。其他寡聚物包括异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体、异四聚体等。
[0412] 一个实施方案涉及包括多个GM-CSF结合多肽的寡聚物，所述多肽经由与GM-CSF抗原结合蛋白质融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接。此种肽可以是肽接头(间隔物)，或具有促进寡聚化性质的肽。如下文更详细地描述的，亮氨酸拉链和衍生自抗体的特定多肽包括在可以促进与之连接的GM-CSF抗原结合蛋白质寡聚化的肽之中。
[0413] 在特定实施方案中，寡聚物包括2至4个GM-CSF抗原结合蛋白质。寡聚物的GM-CSF抗原结合蛋白质部分可以是上文描述的任何形式，例如变体或片段。优选地，寡聚物包括具有GM-CSF结合活性的GM-CSF抗原结合蛋白质。
[0414] 在一个实施方案中，使用衍生自免疫球蛋白的多肽制备寡聚物。包括与抗体衍生多肽的多个部分(包括Fc结构域)融合的特定异源多肽的融合蛋白的制备，已例如由Ashkenazi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Byrn等人，1990，Nature 344：677；和Hollenbaugh等人，1992″Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins″，在CurrentProtocols in Immunology，Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页中描述。
[0415] 一个实施方案涉及包括两个融合蛋白的二聚体，其通过使GM-CSF抗原结合蛋白质与抗体的Fc区融合而制备。二聚体可以通过下述方法制备：例如将编码融合蛋白的基因融合物插入合适表达载体内，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合物，并且使所表达的融合蛋白更类似抗体分子而组装，在其上Fc部分之间形成链间二硫键，以产生二聚体。
[0416] 如本文所使用的，术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的天然和突变蛋白质形式的多肽。还包括了包含促进二聚化的铰链区的截短形式的此种多肽。包括Fc部分的融合蛋白(和由其形成的寡聚物)提供通过蛋白质A或蛋白质G柱上的亲和层析容易纯化的优点。
[0417] 在PCT公开号WO 93/10151以及美国专利号5,426,048和5,262,522中描述的一种合适Fc多肽是单链多肽，其从人IgG1抗体Fc区的N末端铰链区延伸到天然C末端。另一种有用的Fc多肽是在美国专利号5,457,035和Baum等人，1994，EMBO J.13：3992-4001中描述的Fc突变蛋白质。这种突变蛋白质的氨基酸序列与PCT公开号WO93/10151中呈现的天然Fc序列的等同，只是氨基酸19已从Leu变成Ala，氨基酸20已从Leu变成Glu，并且氨基酸22已从Gly变成Ala外。突变蛋白质显示对于Fc受体减少的亲和力。
[0418] 在其他实施方案中，例如本文公开的GM-CSF抗原结合蛋白质的重和/或轻链的可变部分可以取代抗体重和/或轻链的可变部分。
[0419] 可替代地，寡聚物是融合蛋白，其包括多个GM-CSF抗原结合蛋白质，其具有或不具有肽接头(间隔肽)。在合适的肽接头中有美国专利号4,751,180和4,935,233中描述的那些。
[0420] 用于制备寡聚GM-CSF抗原结合蛋白质衍生物的另一种方法涉及亮氨酸拉链的使用。亮氨酸拉链结构域是促进它们所存在的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在数种DNA结合蛋白质中鉴定(Landschulz等人，1988，Science 240：1759)，并且从那以后已在各种不同蛋白质中发现。在已知亮氨酸拉链中有天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。适合于产生合适寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的例子在PCT公开号WO 94/10308中描述，并且衍生自肺表面活性蛋白质D(SPD)的亮氨酸拉链在Hoppe等人，1994，FEBS Letters 344：191中描述。允许与之融合的异源蛋白质稳定三聚化的经修饰亮氨酸拉链的使用在Fanslow等人，1994，Semin.Immunol.6：267-278中描述。在一种方法中，在合适宿主细胞中表达包括与亮氨酸拉链肽融合的GM-CSF抗原结合蛋白质片段或衍生物的重组融合蛋白，并且从培养上清液中回收形成的可溶性寡聚GM-CSF抗原结合蛋白质片段或衍生物。
[0421] 提供的某些抗原结合蛋白质对于GM-CSF具有至少104或105/M x秒的结合亲和力6 7 8 9
(Ka)，例如如下文实施例中描述的。其他抗原结合蛋白质具有至少10、10、10 或10/M x
4 -1 -5
秒的Ka。提供的特定抗原结合蛋白质具有低解离速率。某些抗体例如具有1x10 s 、1x10 -1
s 或更低的Koff。在另一个实施方案中，Koff与具有表2和3可变区结构域的下述组合的抗体相同。
[0422] 另一个方面提供了在体外或体内具有至少一天的半衰期(例如当施用于人受试者时)的抗原结合蛋白质。在一个实施方案中，抗原结合蛋白质具有至少3天的半衰期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有4天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有8天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分进行衍生或修饰，从而使得与未衍生或未修饰的抗体比较，它具有更长的半衰期。在另一个实施方案中，例如在PCT公开号WO 00/09560中描述的，抗原结合蛋白质包含点突变以增加血清半衰期。
[0423] 6.糖基化
[0424] 抗原结合蛋白质可以具有与天然种类不同或改变的糖基化模式。如本领域已知的，糖基化模式可以依赖于蛋白质序列(例如特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在，下文讨论)，或产生蛋白质的宿主细胞或生物。下文讨论了具体表达系统。
[0425] 多肽的糖基化一般是N连接的或O连接的。N连接的指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列的任一个在多肽中的存在，产生潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸(最通常丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)连接。
[0426] 给抗原结合蛋白质添加糖基化位点常规通过以下方法来完成：改变氨基酸序列，从而使得它包含一个或多个上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)。改变还可以通过给起始序列添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(对于O连接的糖基化位点)。为了容易起见，抗原结合蛋白质氨基酸序列可以通过在DNA水平上的变化加以改变，特别是通过使编码靶多肽的DNA在预先选择的碱基上突变，从而使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子。
[0427] 增加抗原结合蛋白质上的碳水化合物部分数目的另一种方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些操作是有利的，因为它们不要求在具有用于N和O连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。依赖于所使用的偶联方式，糖可以与下述物质连接：(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在PCT公开号WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev，Biochem.，第259-306页中描述。
[0428] 起始抗原结合蛋白质上存在的碳水化合物部分的去除可以化学或酶促完成。化学去糖基化要求蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大多数或全部糖切割，而留下完整多肽。化学去糖基化由Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131描述。多肽上的碳水化合物部分的酶促切割可以通过使用各种内切和外切糖苷酶来达到，如由Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350描述的。在潜在糖基化位点处的糖基化可以通过使用化合物衣霉素得到阻止，如由Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105描述的。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
[0429] 此处，各方面包括抗原结合蛋白质的糖基化变体，其中与亲本多肽的氨基酸序列比较，糖基化位点的数目和/或类型已加以改变。在特定实施方案中，抗体蛋白质变体包括比天然抗体更多或更少数目的N连接的糖基化位点。N连接的糖基化位点的特征在于序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。氨基酸残基取代以制备这种序列提供用于添加N连接的碳水化合物链的潜在新位点。可替代地，消除或改变这种序列的取代将阻止天然多肽中存在的N连接的碳水化合物链的添加。
例如，通过Asn的缺失或通过用不同氨基酸取代Asn，可以减少糖基化。在其他实施方案中，制备一个或多个新N连接的位点。抗体一般在Fc区中具有N连接的糖基化位点。
[0430] 7.标记和效应物基团
[0431] 在某些实施方案中，抗原结合包括一种或多种标记。术语“标记基团”或“标记”意指任何可检测标记。合适标记基团的例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素3 14 15 35 90 99 111 125 131
(例如 H、C、N、S、Y、Tc、In、 I、I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素、磷光体)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或由次级报道分子(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、附加表位)识别的预定多肽表位。在某些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白质偶联，以减少潜在的立体阻碍。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的，并且可以在合适时使用。
[0432] 术语“效应物基团”意指与充当细胞毒剂的抗原结合蛋白质偶联的任何基团。关于3 14 15 35 90 99 111
合适效应物基团的例子是放射性同位素或放射性核素(例如 H、C、N、S、Y、Tc、 In、
125 131
I、 I)。其他合适基团包括毒素、治疗基团或化学治疗基团。合适基团的例子包括卡奇霉素、auristatins、格尔德霉素和美坦辛。在某些实施方案中，效应物基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白质偶联，以减少潜在的空间位阻。
[0433] 一般而言，标记包括在各个种类内，这依赖于要检测它们的测定：a)同位素标记，其可以是放射性或重同位素；b)磁性标记(例如磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)由次级报道分子(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、附加表位等)识别的预定多肽表位。在某些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白质偶联，以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的。
[0434] 特异性标记包括光学染料，包括但不限于生色团、磷光体和荧光团，其中后者在许多情况下是特异性的。荧光团可以是“小分子”荧光素(fluores)、或蛋白质性质的荧光素。
[0435] “荧光标记”意指可以经由其固有荧光性质检测出的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、Malacite绿、芪、Lucifer Yellow、Cascade BlueJ、Texas Red、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 7055、Oregon green、Alexa-Fluor染料(AlexaFluor350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、AlexaFluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、罗丹明和Texas Red(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。
合适的光学染料，包括荧光团在Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，Richard P.Haugland，Molecular Probes，1992中描述。
[0436] 合适的蛋白质性质的荧光标记还包括但不限于，绿色荧光蛋白包括GFP的Renilla、Ptilosarcus或Aequorea物种(Chalfie等人，1994，Science 263：802-805)、EGFP(Clontech，Mountain View，CA，GenbankAccession Number U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，QuantumBiotechnologies，Inc.，Quebec，Canada；Stauber，1998，Biotechniques24：
462-471；Heim等 人，1996，Curr.Biol.6：178-182)、增强 的 黄 色 荧 光 蛋白 (EYFP，Clontech)、萤光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和Renilla(PCT专利申请号WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019，美国专利号5292658、
5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。
[0437] C.编码GM-CSF抗原结合蛋白质的核酸
[0438] 还提供了编码本文描述的抗原结合蛋白质或其部分的核酸，包括编码抗体的一条或两条链、或其片段、衍生物、突变蛋白质或变体的核酸，编码重链可变区或仅CDRs的多核苷酸，足以用作杂交探针的多核苷酸，用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物，用于抑制多核苷酸表达的反义核酸，和前述序列的互补序列。核酸可以是任何长度。它们可以是长度例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000个或更多个核苷酸，包括两者之间的所有值，和/或可以包括一种或多种另外序列例如调节序列，和/或是更大核酸例如载体的部分。核酸可以是单链或双链的，并且可以包括RNA和/或DNA核苷酸及其人工变体(例如，肽核酸)。
[0439] 可以从已用GM-CSF或其免疫原性片段免疫接种的小鼠B细胞中分离编码特定抗原结合蛋白质或其部分(例如全长抗体、重或轻链、可变结构域、或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3)的核酸。核酸可以通过常规操作例如聚合酶链反应(PCR)进行分离。噬菌体展示是已知技术的另一个例子，由此可以制备抗体和其他抗原结合蛋白质的衍生物。在一种方法中，在任何合适的重组表达系统中表达作为目的抗原结合蛋白质组分的多肽，并且允许所表达的多肽组装，以形成抗原结合蛋白质分子。
[0440] 由于遗传密码的简并性，表1-4中列出或在本文中其他地方描述的多肽序列各自也由除已提供的核酸序列外的大量其他核酸序列编码。本领域普通技术人员应当理解本申请因此提供关于编码每种抗原结合蛋白质的每种简并核苷酸序列的足够书面描述和实现。
[0441] 一个方面进一步提供了在特定杂交条件下与其他核酸杂交的核酸。用于使核酸杂交的方法是本领域众所周知的。参见例如，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文所定义的，中等严格杂交条件使用包含5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗涤溶液，约50％甲酰胺、6x SSC的杂交缓冲液，和55℃的杂交温度(或其他相似杂交溶液，例如包含约50％甲酰胺的溶液，使用42℃的杂交温度)，和在0.5x SSC、0.1％SDS中60℃的洗涤条件。严格杂交条件在6x SSC中于45℃杂交，随后为在0.1x SSC、0.2％SDS中于68℃的一次或多次洗涤。此外，本领域技术人员可以操作杂交和/或洗涤条件，以增加或减少杂交严格性，从而使得包括彼此具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％(包括两者之间的所有值)同一性的核苷酸序列的核酸一般能够保持彼此杂交。
[0442] 影响杂交条件选择的基本参数和用于设计合适条件的指导由例如Sambrook，Fritsch 和 Maniatis(2001，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.and Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等人，编辑，John Wiley & Sons，Inc.，部分2.10和6.3-6.4)阐述，并且可以通过本领域普通技术人员基于例如核酸长度和/或碱基组成容易地确定。
[0443] 改变可以通过突变引入核酸内，从而导致其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列的改变。突变可以使用本领域已知的任何技术引入。在一个实施方案中，一个或多个特定氨基酸残基使用例如定点诱变方案加以改变。在另一个实施方案中，一个或多个随机选择的残基使用例如随机诱变方案加以改变。无论如何制备，突变多肽可以表达且筛选需要的性质。
[0444] 突变可以引入核酸内，而不明显改变其编码多肽的生物活性。例如，可以进行核苷酸取代，导致在非必需氨基酸残基处的氨基酸取代。可替代地，一种或多种突变可以引入核酸内，所述突变选择性改变它编码多肽的生物活性。例如，突变可以定量或定性改变生物活性。量变的例子包括增加、减少或消除活性。质变的例子包括改变抗体的抗原特异性。
[0445] 另一个方面提供了适合于用作引物或杂交探针，从而用于检测核酸序列的多核苷酸。多核苷酸可以仅包括编码全长多肽的核酸序列的部分，例如可以用作探针或引物的片段，或编码多肽活性部分(例如GM-CSF结合部分)的片段。
[0446] 基于核酸序列的探针可以用于检测核酸或相似核酸，例如编码多肽的转录物。探针可以包括标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此种探针可以用于鉴定表达多肽的细胞。
[0447] 另一个方面提供了包括编码如本文所描述的多肽或其部分(例如，包含一个或多个CDRs或一个或多个可变区结构域的片段)的核酸。载体的例子包括但不限于，质粒、病毒载体、非附加型哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。重组表达载体可以包括以适合于在宿主细胞中表达核酸的形式存在的核酸。重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞选择的一个或多个调节序列，其与待表达的核酸序列可操作地连接。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些(例如，SV40早期基因增强子、劳斯肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子)、指导核苷酸序列仅在特定宿主细胞中的表达的那些(例如，组织特异性调节序列，参见Voss等人，1986，Trends Biochem.Sci.11：287，Maniatis等人，1987，Science 236：1237)，和指导核苷酸序列反应于特定处理或条件的诱导型表达的那些(例如，哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子以及在原核和真核系统中的tet反应性和/或链霉素反应性启动子)(参见同前)。本领域技术人员可以理解，表达载体的设计可以依赖于诸如待转化宿主细胞的选择、所需蛋白质表达水平等因素。表达载体可以引入宿主细胞内，从而产生由如本文所述核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
[0448] 另一个方面提供了已引入了重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如CHO细胞))。载体DNA可以经由常规转化或转染技术引入原核或真核细胞内。对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知依赖于使用的表达载体和转染技术，仅小部分细胞可以将外来DNA整合到其基因组内。为了鉴定且选择这些整合体，一般将编码选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞内。优选的选择标记包括赋予对药物的抗性的那些，所述药物例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。在其他方法中，用引入核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择进行鉴定(例如，已掺入选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
[0449] D.抗原结合蛋白质的制备
[0450] 全人抗体可以如上所述进行制备，即，通过免疫接种包含人免疫球蛋白基因座的转基因动物，或通过选择表达人抗体所有组成成份的噬菌体展示文库。
[0451] 单克隆抗体(mAbs)可以通过各种技术生产，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，1975，Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可替代地，可以采用用于生产单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或癌基因转化。用于制备杂交瘤的一种合适动物系统是鼠系统，其是非常良好建立的操作。用于分离经免疫接种的脾细胞用于融合的免疫接种方案和技术是本领域已知的。对于此种操作，使来自已免疫接种小鼠的B细胞与合适的永生化融合配偶体例如鼠骨髓瘤细胞系融合。需要时，大鼠或另外的其他哺乳动物可以代替小鼠进行免疫接种，并且来自此种动物的B细胞可以与鼠骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤。可替代地，可以使用来自除小鼠外的来源的骨髓瘤细胞系。用于制备杂交瘤的融合操作也是众所周知的。
[0452] 提供的单链抗体可以这样形成：通过经由氨基酸桥(短肽接头)使重和轻链可变结构域(Fv区)片段连接，得到单条多肽链。通过使编码位于两个可变结构域多肽(VL和VH)的编码DNAs之间的肽接头的DNA融合，可以制备此种单链Fvs(scFv)。所得到的多肽可以在其自身上向后折叠，以形成抗原结合单体，或它们可以形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，这依赖于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等人，1997，Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001，Biomol.Eng.18：95-108)。通过使包括不同VL和VH的多肽组合，可以形成与不同表位结合的多聚scFvs(Kriangkum等人，2001，Biomol.Eng.18：31-40)。开发用于产生单链抗体的技术包括在美国专利号4,946,778；Bird，1988，Science 242：423；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879；Ward等人，
1989，Nature 334：544，de Graaf等人，2002，Methods Mol Biol.178：379-387中描述的那些。衍生自本文提供抗体的单链抗体包括但不限于，包括表1中所述的重和轻链可变区的可变结构域组合，或已移植到表2和3中所述的任何CDRs内的轻和重链可变结构域组合的scFvs。
[0453] 使用亚类转换法，可以将作为一个亚类的本文提供的抗体改变成来自不同亚类的抗体。因此，例如，IgG抗体可以衍生自IgM抗体，并且反之亦然。此种技术允许制备新抗体，其具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合性质，还显示与不同于亲本抗体的抗体同种型或亚类相关的生物性质。可以采用重组DNA技术。在此种操作中可以采用编码特定抗体多肽的克隆的DNA，例如编码所需同种型抗体的恒定结构域的DNA。参见例如，Lantto等人，2002，Methods Mol.Biol.178：303-316。因此，提供的抗体包括这样的抗体：其包括例如具有所需同种型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgD)的上文描述的可变结构域组合，以及其Fab或F(ab’)2片段。此外，如果需要IgG4，那么还可能如Bloom等人，1997，Protein Science 6：407)中描述的，需要在铰链区中引入点突变(CPSCP-＞CPPCP)，以减轻形成H链内二硫键(这会导致IgG4抗体中的异质性)的趋势。
[0454] 此外，用于衍生具有不同性质(即，对它们结合的抗原的不同亲和力)的抗体的技术也是已知的。一个此种技术称为链改组，涉及在丝状噬菌体的表面上展示免疫球蛋白可变结构域基因所有组成成份，通常称为噬菌体展示。链改组已用于制备针对半抗原2-苯基噁唑-5-酮的高亲和力抗体，如由Marks等人，1992，BioTechnology 10：779描述的。
[0455] 可以对表1中描述的重和轻链可变区，或表2和3中描述的CDRs进行保守修饰(和对编码核酸的相应修饰)，以产生具有功能和生物化学特征的GM-CSF抗原结合蛋白质。用于达到此种修饰的方法在上文描述。
[0456] GM-CSF抗原结合蛋白质可以以各种方法进行进一步修饰。例如，如果它们待用于治疗目的，那么它们可以与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)，以延长血清半衰期或增强蛋白质送递。可替代地，主题抗体或其片段的V区可以与不同抗体分子的Fc区融合。用于这个目的的Fc区可以进行修饰，从而使得它不结合补体，从而当融合蛋白用作治疗剂时，减少在患者中诱导细胞裂解的可能性。此外，主题抗体或其功能片段可以与人血清白蛋白缀合，以增强抗体或其片段的血清半衰期。用于本发明抗体或其片段的另一种有用的融合配偶体是运甲状腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，从而抗体-TTR融合蛋白可以形成可以增加其结合亲合力的多价抗体。
[0457] 可替代地，本文描述的抗原结合蛋白质的功能和/或生物化学特征的显著修饰可以通过在重和轻链的氨基酸序列中产生取代来达到，所述取代在其对维持下述内容的作用方面显著不同：(a)取代区域中的分子主链结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。“保守氨基酸取代”可能涉及天然氨基酸残基由非天然氨基酸残基取代，所述非天然氨基酸残基对那个位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有很少的影响或无影响。参见表5。此外，在多肽中的任何天然残基都可以由丙氨酸取代，如先前已对于丙氨酸筛选诱变描述的。
[0458] 主题抗体的氨基酸取代(无论是保守还是非保守的)可以通过本领域技术人员通过应用常规技术来实现。氨基酸取代可以用于鉴定本文提供抗体的重要残基，或增加或减少这些抗体对于人GM-CSF的亲和力，或用于修饰本文描述的其他抗原结合蛋白质的结合亲和力。
[0459] E.表达抗原结合蛋白质的方法
[0460] 本文还提供了质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体，其包括如上所述的至少一种多核苷酸，还提供了包括此种表达系统或构建体的宿主细胞。
[0461] 本文提供的抗原结合蛋白质可以通过许多常规技术中的任何进行制备。例如，GM-CSF抗原结合蛋白质可以通过重组表达系统，使用本领域已知的任何技术生产。参见例如，Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，Kennet等 人( 编 辑 )Plenum Press，New York(1980)；和Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow 和 Lane( 编 辑 )，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1988)。
[0462] 抗原结合蛋白质可以在杂交瘤细胞系(例如，特别地可以在杂交瘤中表达抗体)或除杂交瘤外的细胞系中表达。编码抗体的表达构建体可以用于转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。转化可以使用用于将多核苷酸引入宿主细胞内的任何已知方法来执行，包括例如在病毒或噬菌体中包装多核苷酸，并且通过本领域已知的转染操作用构建体转导宿主细胞，如由美国专利号4,399,216；4,912,040；4,740,461；4,959,455例示的。所使用的最佳转化操作将依赖于待转化何种宿主细胞。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞内的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸封装在脂质体中、使核酸与带正电脂质融合、和DNA直接显微注射到核内。
[0463] 重组表达构建体一般包括编码包括下述一种或多种成分的多肽的多核苷酸：本文提供的一个或多个CDRs；轻链恒定区；轻链可变区；重链恒定区(例如CH1、CH2和/或CH3)；和/或GM-CSF抗原结合蛋白质的另一个支架部分。使用标准连接技术将这些核酸序列插入合适表达载体内。在一个实施方案中，重或轻链恒定区附加在抗GM-CSF特异性重或轻链可变区的C末端，并且连接到表达载体内。载体一般选择为在采用的具体宿主细胞中是有功能的(即，载体与宿主细胞机制相容，允许基因扩增和/或表达可以发生)。在某些实施方案中，使用采用蛋白质-片段互补测定的载体，所述测定其使用蛋白质报道分子，例如二氢叶酸还原酶(参见例如，美国专利号6,270,964)。合适的表达载体可以例如购自Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)或BDBiosciences(San Jose，CA)。用于克隆且表达抗体和片段的其他有用载体包括在Bianchi和McGrew，2003，Biotech.Biotechnol.Bioeng.84：439-44中描述的那些。另外的合适表达载体例如在MethodsEnzymol.，第185卷(D.V.Goeddel，编辑)，1990，New York：AcademicPress中讨论。
[0464] 一般地，在任何宿主细胞中使用的表达载体将包含用于质粒维持且用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，统称为“侧翼序列”的此种序列一般将包括一种或多种下述核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多聚接头区域、和选择标记元件。
[0465] 任选地，载体可以包含“标记”编码序列，即位于GM-CSF抗原结合蛋白质编码序列的5′或3′末端处的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码对于其存在商购可得抗体的聚His(例如六His)，或另一种“标记”例如FLAG 、HA(血凝素流感病毒)、或myc。这种标记一般在多肽表达后与多肽融合，并且可以充当用于从宿主细胞中亲和纯化或检测GM-CSF抗原结合蛋白质的方法。亲和纯化可以例如通过柱层析来完成，其中使用抗标记的抗体作为亲和基质。任选地，通过各种方法例如使用特定肽酶用于切割，随后可以从纯化GM-CSF抗原结合蛋白质中去除标记。
[0466] 侧翼序列可以是同源(即与宿主细胞来自相同的物种和/或品系)、异源(即来自除宿主细胞物种或品系之外的物种)、杂合(即来自超过一个来源的侧翼序列组合)、合成或天然的。因此，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎动物或无脊椎动物生物、或任何植物，前提是侧翼序列在宿主细胞机制中是有功能的，并且可以由宿主细胞机制活化。
[0467] 在载体中有用的侧翼序列可以通过本领域众所周知的数种方法中的任何方法获得。一般地，本文有用的侧翼序列先前已通过作图和/或通过限制性核酸内切酶消化进行鉴定，并且因此可以使用合适的限制性核酸内切酶从适当组织来源中分离。在某些情况下，侧翼序列的完整核苷酸序列可以是已知的。此处，侧翼序列可以使用本文描述的用于核酸合成或克隆的方法来合成。
[0468] 无论侧翼序列的全部还是仅仅部分是已知的，它可以使用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用合适探针筛选基因组文库来获得，所述探针例如来自相同或另一个物种的寡核苷酸和/或侧翼序列片段。当侧翼序列未知时，可以从较大的DNA片段中分离包含侧翼序列的DNA片段，所述较大的DNA片段可以包含例如编码序列或甚至另一种或多种基因。分离可以通过限制性核酸内切酶消化来完成，以产生合适的DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化、Qiagen 柱层析(Qiagen，Chatsworth，CA)或本领域技术人员已知的其他方法的分离。选择合适酶以达到这个目的对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
[0469] 复制起点一般是商业购买的那些原核表达载体的部分，并且起点帮助在宿主细胞中扩增载体。如果选择的载体不包含复制起点位点，那么可以基于已知序列化学合成，并且连接到载体内。例如，来自质粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌，并且各种病毒起点(例如，SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒、或乳头瘤病毒例如HPV或BPV)对于在哺乳动物细胞中克隆载体有用。一般地，复制起点组分不是哺乳动物表达载体所需的(例如，通常仅使用SV40起点，因为它还包含病毒早期启动子)。
[0470] 转录终止序列一般位于多肽编码区末端的3′，并且用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，随后为聚-T序列。尽管序列容易从文库中克隆，或甚至作为载体的部分商业购买，但它还可以使用用于核酸合成的方法例如本文描述的那些容易地合成。
[0471] 选择标记基因编码对于在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所需的蛋白质。一般的选择标记基因编码这样的蛋白质：其(a)给原核宿主细胞赋予对于抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)提供从复杂或确定成分培养基中无法获得的关键营养成分。特定选择标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利地，新霉素抗性基因也可以用于在原核和真核宿主细胞中选择。
[0472] 其他可选基因可以用于扩增将表达的基因。扩增是这样一种过程：其中产生对于生长或细胞存活关键的蛋白质所需的基因在连续世代的重组细胞的染色体内串联重复。用于哺乳动物细胞的合适选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。使哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中由于载体中存在的可选基因，仅转化体独特地适合存活。通过在培养基中的选择试剂浓度连续增加的条件下培养经转化的细胞来施加选择压力，从而导致可选基因和编码另一种基因(例如与GM-CSF多肽结合的抗原结合蛋白质)的DNA的扩增。因此，由所扩增的DNA合成增加量的多肽例如抗原结合蛋白质。
[0473] 核糖体结合位点通常是mRNA翻译起始所需的，并且特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件一般位于启动子的3′和待表达多肽的编码序列的5′。
[0474] 在某些情况下，例如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时，可以操作各种前序列或原序列(pre-or pro-sequence)以改善糖基化或产率。例如，可以改变特定信号肽的肽酶切割位点，或添加也可能影响糖基化的原序列。最终蛋白质产物可以在-1位置中(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有伴随表达的一个或多个另外氨基酸，其可能未完全去除。例如，最终蛋白质产物可以具有在肽酶切割位点中发现的与氨基末端连接的一个或两个氨基酸残基。可替代地，如果酶在成熟多肽内的此种区域处切割，那么某些酶切割位点的使用可以导致略微截短形式的所需多肽。
[0475] 表达和克隆一般将包含启动子，其由宿主生物识别且与编码GM-CSF抗原结合蛋白质的分子可操作地连接。启动子是位于结构基因起始密码子上游(即5′)(一般在约100至1000bp内)的非转录序列，其控制结构基因的转录。启动子照常规分组成两个类别之一：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子反应于培养条件的某些改变而起始在其控制下的DNA增加水平的转录，所述改变例如营养物质的存在或不存在或温度中的变化。另一方面，组成型启动子一致地转录与它们可操作地连接的基因，即对基因表达具有很少控制或无控制。由各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过经由限制性酶消化去除来自来源DNA的启动子，且将所需启动子序列插入载体内，使合适启动子与编码重链或轻链，包括GM-CSF抗原结合蛋白质的DNA可操作地连接。
[0476] 与酵母宿主一起使用的合适启动子也是本领域众所周知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子是众所周知的，并且包括但不限于得自病毒基因组的那些，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
[0477] 可能感兴趣的另外启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)；CMV 启 动 子 (Thornsen 等 人，1984，Proc.Natl.Acad. U.S.A.81：659-663)；在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等人，
1982，Nature 296：39-42)；和原核启动子例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。还感兴趣的是下述动物转录调控区，其显示组织特异性并且已在转基因动物中利用：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区(Swift等人，1984，Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl等人，1984，Cell 38：647-658；Adames等人，1985，Nature 318：533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder等人，1986，Cell 45：
485-495)；在肝脏中有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1：
268-276)；在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因调控区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987，Science253：53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1：161-171)；在髓样细胞中有活性的β-珠蛋白基因调控区(Mogram等人，1985，Nature 315：338-340；Kollias等人，
1986，Cell 46：89-94)；在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因调控区(Readhead等人，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区(Sani，1985，Nature314：283-286)；和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因调控区(Mason等人，1986，Science 234：1372-1378)。
[0478] 增强子序列可以插入载体内，以增加高等真核生物对编码轻链或重链，包括人GM-CSF抗原结合蛋白质的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长度为约10-300bp，其作用于启动子以增加转录。增强子是相对定向和不依赖位置，已在转录单位的5′和3′的位置处发现。可从哺乳动物基因获得的数种增强子序列是已知的(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，一般地，使用来自病毒的增强子。
本领域已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强元件。尽管增强子可以定位在载体中编码序列的5′或
3′，但它一般位于启动子5′的位点处。编码合适天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列可以掺入表达载体内，以促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择依赖于待产生抗体的宿主细胞类型，并且异源信号序列可以替换天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中有功能的信号肽的例子包括下述：在美国专利号4,965,195中描述的用于白介素-7(IL-7)的信号序列；在Cosman等人，1984，Nature 312：768中描述的用于白介素-2受体的信号序列；在EP专利号0367 566中描述的白介素-4受体信号肽；在美国专利号
4,968,607中描述的I型白介素-1受体信号肽；在EP专利号0 460 846中描述的II型白介素-1受体信号肽。
[0479] 提供的表达载体可以由起始载体例如商购载体进行构建。此种载体可以包含或不包含所有所需侧翼序列。当本文描述的一个或多个侧翼序列在载体中不存在时，它们可以单独获得且连接到载体内。用于获得每种侧翼序列的方法是本领域技术人员众所周知的。
[0480] 在已构建载体，并且编码轻链、重链或轻链和重链，包括GM-CSF抗原结合序列的多核苷酸已插入载体的合适位点内后，完成的载体可以插入合适的宿主细胞内用于扩增和/或多肽表达。抗原结合蛋白质的表达载体转化到所选择的宿主细胞内，可以通过众所周知方法来完成，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术。所选择的方法将部分是待使用的宿主细胞类型的函数。这些方法和其他合适方法是技术人员众所周知的，并且例如在Sambrook等人，2001，同上中阐述。
[0481] 当在合适条件下培养时，宿主细胞合成抗原结合蛋白质，其随后可以从培养基中(如果宿主细胞将其分泌到培养基内)或直接从产生其的宿主细胞中(如果它不被分泌)收集。合适宿主细胞的选择将依赖于各种因素，例如所需表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。
[0482] 可作为表达宿主而获得的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括但不限于可从美国典型培养物中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、和各种其他细胞系。在特定实施方案中，通过测定何种细胞系具有高表达水平且组成性产生具有GM-CSF结合性质的抗原结合蛋白质，可以选择细胞系。在另一个实施方案中，可以选择来自B细胞系的细胞系，所述B细胞系不制备其自身抗体但具有制备且分泌异源抗体的能力。
[0483] F.人GM-CSF抗原结合蛋白质用于诊断和治疗目的的用途
[0484] 抗原结合蛋白质可用于检测生物样品中的GM-CSF且鉴定产生GM-CSF的细胞或组织。与GM-CSF特异性结合的抗原结合蛋白质可以用于治疗有需要的患者中与GM-CSF相关的疾病。例如，GM-CSF抗原结合蛋白质可以用于诊断测定例如结合测定中，以检测和/或定量组织或细胞中表达的GM-CSF。此外，GM-CSF抗原结合蛋白质可以用于抑制GM-CSF与其受体形成复合物，从而调节细胞或组织中的GM-CSF生物活性。与GM-CSF结合的抗原结合蛋白质因此可以调节和/或阻断与其他结合化合物的相互作用，并且因此可以在改善与GM-CSF相关的疾病中具有治疗用途。
[0485] 1.适应症
[0486] 本发明还涉及GM-CSF抑制剂(如公开的)，例如GM-CSF抗体，在制造用于预防或治疗性处理本文公开的每种医学病症的药物中的用途。GM-CSF抑制剂可用于治疗各种状况，所述状况中过量GM-CSF在促成基础疾病或病症中起作用或以其他方式促成负面症状。
[0487] 本发明的实施方案包括使用所公开的GM-CSF抑制剂，特别是GM-CSF抗体、组合物或联合治疗以治疗或预防各种风湿性病症的方法。这些包括成人和青少年类风湿关节炎；硬皮病；系统性红斑狼疮；痛风；骨关节炎；风湿性多肌痛；血清阴性脊柱关节病，包括强直性脊柱炎和莱特氏(Reiter′s)病。主题GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗也用于治疗牛皮癣关节炎和慢性莱姆(Lyme)关节炎。还可用这些化合物、组合物和联合治疗来治疗或预防的是斯蒂尔氏(Still′s)病和与类风湿关节炎相关的葡萄膜炎。此外，本发明的化合物、组合物和联合治疗用于治疗导致随意肌和其他肌肉炎症的病症，包括皮肌炎、包含体肌炎、多肌炎和淋巴管平滑肌增多症。
[0488] 本发明提供了GM-CSF抑制剂，例如GM-CSF抗体、组合物和联合治疗(例如GM-CSF抑制剂和TNF抑制剂例如ENBREL (依那西普)或其他活性剂)用于治疗骨和关节的非关节炎医学状况。这包括导致骨丢失的破骨细胞病症，例如但不限于骨质疏松症，包括绝经后骨质疏松症、骨关节炎、导致牙松弛或缺失的牙周炎、和在关节置换术后的假体松脱(一般与针对磨损碎屑的炎症反应相关)。后面一种状况也称为“整形外科植入骨溶解”。可用本发明的化合物、组合物和联合治疗治疗的另一种状况是颞下颌关节功能障碍(TMJ)。
[0489] 可用所公开的GM-CSF抑制剂组合物和联合治疗来治疗的各种其他医学病症包括；多发性硬化症；白塞氏(Behcet′s)综合征；干燥综合征；自身免疫性溶血性贫血；β地中海贫血；肌萎缩侧索硬化(LouGehrig′s病)；帕金森氏(Parkinson′s)病；和病因不明腱鞘炎，以及与遗传性缺陷相关的各种自身免疫疾病或疾病，包括x连锁智力发育迟缓。
[0490] 还提供了使用GM-CSF抑制剂、组合物或联合治疗来治疗内分泌系统的各种病症的方法。例如，含有或不含TNF抑制剂(例如，ENBREL)或上文描述的其他活性剂的GM-CSF抑制剂组合物或其他GM-CSF抑制剂组合物，适合于用于治疗青少年型糖尿病(包括自身免疫型糖尿病和胰岛素依赖性糖尿病)以及用于治疗成年型糖尿病(包括非胰岛素依赖性和肥胖介导的糖尿病)。此外，主题化合物、组合物和联合治疗用于治疗与糖尿病相关的继发状况，例如糖尿病视网膜病、在糖尿病患者中的肾移植排斥、肥胖介导的胰岛素抗性和肾衰竭，其自身可能与蛋白尿和高血压相关。其他内分泌紊乱也可用这些化合物、组合物或联合治疗进行治疗，包括多囊卵巢病、X连锁肾上腺脑白质营养不良、甲状腺机能减退和甲状腺炎，包括桥本氏(Hashimoto′s)甲状腺炎(即自身免疫性甲状腺炎)。此外，单独或与其他细胞因子包括TNF抑制剂例如ENBREL组合的GM-CSF抑制剂，包括GM-CSF抑制剂，可用于治疗或预防与甲状腺细胞功能障碍相关的医学状况，包括甲状腺机能正常的病态综合征。
[0491] 胃肠道系统的状况，包括腹腔疾病，可用GM-CSF抑制剂、组合物或联合治疗来治疗或预防。例如，含有或不含TNF抑制剂(例如，ENBREL)或上文描述的其他活性剂的GM-CSF抑制剂组合物适合于治疗或预防腹腔疾病。此外，本发明的化合物、组合物和联合治疗适合于治疗或预防克克隆氏(Crohn′s)病；溃疡性结肠炎；特发性胃轻瘫；胰腺炎，包括慢性胰腺炎；急性胰腺炎、炎性肠病和溃疡，包括胃和十二指肠溃疡。
[0492] 还包括了使用主题GM-CSF抑制剂、组合物或联合治疗用于治疗生殖泌尿系统病症的方法。例如，单独或与IL-1(例如，Kineret (anakinra))或TNF抑制剂(例如，ENBREL)或上文描述的其他活性剂组合的GM-CSF抑制剂组合物，适合于治疗或预防肾小球肾炎，包括自身免疫性肾小球肾炎、由于暴露于毒素导致的肾小球肾炎或由溶血链球菌或其他感染剂感染继发的肾小球肾炎。还可用本发明的化合物、组合物和联合治疗来治疗的是尿毒症综合征及其临床并发症(例如，肾衰竭、贫血和肥厚型心肌病)，包括与暴露于环境毒素、药物或其他因素相关的尿毒症综合征。单独或与TNF抑制剂特别是ENBREL组合的GM-CSF抑制剂，特别是GM-CSF抗体，可用于治疗且预防胆囊壁炎症导致的并发症，所述并发症导致吸收功能的改变。在此种并发症中包括的是胆石症(胆石)和胆管结石症(胆管结石)以及胆石症和胆管结石症的复发。可用本发明的化合物、组合物和联合治疗来治疗的进一步状况是血液透析并发症；前列腺状况，包括良性前列腺肥大、非细菌性前列腺炎和慢性前列腺炎；和血液透析并发症。
[0493] 本文还提供的是使用GM-CSF抑制剂、组合物或联合治疗来治疗各种血液学和肿瘤学病症的方法。例如，单独或与GM-CSF抑制剂、TNF抑制剂(例如，ENBREL)或上文描述的其他活性剂组合的GM-CSF抑制剂，可以用于治疗与各种形式的癌症相关的症状，所述癌症包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、EB病毒阳性鼻咽癌、神经胶质瘤、结肠、胃、前列腺、肾细胞、宫颈和卵巢癌、肺癌(SCLC和NSCLC)，包括癌症相关的恶病质、疲劳、无力、恶病质和高钙血症的副肿瘤综合征。可用主题GM-CSF抑制剂、组合物或联合治疗来治疗的另外疾病是实体瘤，包括肉瘤、骨肉瘤和癌，例如腺癌(例如，乳腺癌)和鳞状细胞癌。此外，主题化合物、组合物或联合治疗可用于治疗食道癌，胃癌，胆囊癌，白血病，包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、髓细胞性白血病(myeloid leukemia)、慢性或急性成淋巴细胞白血病和毛细胞白血病。具有侵入性转移潜力的其他恶性肿瘤，包括多发性硬化症，可以用主题化合物、组合物和联合治疗、和特别地包括GM-CSF抑制剂和可溶性TNF受体(例如，ENBREL)的联合治疗进行治疗。此外，所公开的GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗可以用于治疗贫血和血液系统病症，包括慢性特发性中性粒细胞减少症、慢性病贫血、再生障碍性贫血包括，范可尼氏(Fanconi′s)再生障碍性贫血；特发性血小板减少性紫癜(ITP)；血栓性血小板减少性紫癜、骨髓增生异常综合征(包括难治性贫血、具有环形铁粒幼红细胞的难治性贫血、具有过量胚细胞的难治性贫血、具有变形中的过量胚细胞的难治性贫血)；骨髓纤维化/髓样化生；和镰状细胞血管阻塞危机。
[0494] 各种淋巴组织增殖性病症也可用所公开的GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗进行治疗。单独或与TNF抑制剂例如ENBREL或其他活性剂组合的GM-CSF抑制剂，可用于治疗或预防自身免疫性淋巴组织增殖性综合征(ALPS)、慢性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、外周T细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯基特(Burkitt′s)淋巴瘤、EB病毒阳性T细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤、何杰金氏(Hodgkin′s)病、弥散性进行性淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、Tγ淋巴组织增殖性疾病、皮肤B细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(即，蕈样真菌病)和塞扎莱(Sezary)综合征。
[0495] 此外，主题GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗用于治疗遗传性状况。特别地，单独或与TNF抑制剂例如ENBREL组合的GM-CSF抑制剂，可用于治疗疾病例如高歇氏(Gaucher′s)病、亨廷顿氏(Huntington′s)病、线性IgA病和肌营养不良症。
[0496] 可通过所公开的GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗来治疗或预防的其他状况包括起因于头或脊髓的损伤，包括由于对于头的创伤的硬膜下血肿的状况。例如，单独或与TNF抑制剂例如ENBREL组合的GM-CSF抑制剂，可用于治疗头部损伤和脊髓损伤。与这种治疗相关，所述组合物和联合，适合于预防颅神经损害且预防和治疗颈源性头痛。所述组合物和组合进一步适合于治疗与脑辐射相关的神经病学副作用。
[0497] 所公开的GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗进一步用于治疗肝脏状况。例如，单独或与TNF抑制剂例如ENBREL或其他活性剂组合的GM-CSF抑制剂，可以用于治疗肝炎，包括急性酒精性肝炎，急性药物诱导性或病毒性肝炎，甲型、乙型和丙型肝炎，硬化性胆管炎和由于未知原因的肝脏炎症。与肝脏炎症相关，GM-CSF抑制剂进一步可用于治疗肝窦上皮。
[0498] 此外，所公开的GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗用于治疗各种涉及听力丧失且与异常IL-1表达相关的病症。例如，单独或与TNF抑制剂组合的GM-CSF抑制剂，可以用于治疗或预防耳蜗神经相关的听力丧失，所述听力丧失被认为起因于自身免疫过程，即自身免疫性听力丧失。这种状况目前用类固醇、氨甲蝶呤和/或环磷酰胺进行治疗。此外，可用所公开的GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗来治疗或预防的是美尼尔氏(Meniere′s)综合征和胆脂瘤，即通常与听力损失相关的中耳病症。
[0499] 与移植相关的病症也可用所公开的GM-CSF抑制剂、组合物或联合治疗来治疗或预防。此种病症包括移植物抗宿主病，和起因于实体器官移植或其他移植物包括骨髓移植的并发症，所述实体器官例如心脏、肝脏、皮肤、肾、肺(肺移植气道闭塞)。
[0500] 眼病症也可用所公开的GM-CSF抑制剂、特别地GM-CSF抗体、组合物或联合治疗来治疗或预防，包括孔源性视网膜脱落和炎性眼病，包括与吸烟和黄斑变性相关的炎性眼病。
[0501] GM-CSF抑制剂组合物和联合治疗也可用于治疗影响女性生殖系统的病症。例子包括但不限于，多移植物衰竭/不育；胎儿丢失综合征或IV胚胎丢失(自然流产)；先兆子痫妊娠或子痫；子宫内膜异位症、慢性宫颈炎和早产。
[0502] 此外，所公开的GM-CSF抑制剂组合物和联合治疗可用于治疗或预防坐骨神经痛，衰老症状，严重药物反应(例如，11-2毒性或博来霉素诱导的肺病和纤维化)，或在心脏或其他手术中在同种异体红细胞输入之前、之时或之后抑制炎症反应，或治疗对于肢体或关节的创伤例如创伤性膝部损伤。
[0503] 所公开的GM-CSF抑制剂组合物和联合治疗可用于治疗中枢神经系统(CNS)损伤，包括在中枢神经系统中的炎症激发过程中排出的神经毒性神经递质的作用，以及抑制或阻止在中枢神经系统损伤位点处神经胶质疤痕的发展。与中枢神经系统医学状况相关，GM-CSF抑制剂可用于治疗颞叶癫痫。与癫痫和癫痫发作治疗相关，减少复发性癫痫发作的严重度和次数，并且减少癫痫发作的有害作用的严重度。单独或与本文描述的试剂组合的GM-CSF抑制剂可用于治疗神经元丧失、神经元变性和与癫痫发作相关的神经胶质增生。
[0504] 此外，所公开的GM-CSF抑制剂组合物和联合治疗可用于治疗危重病多发性神经病与肌病(CIPNM)急性多发性神经病；神经性厌食；贝尔(Bell′s)麻痹；慢性疲劳综合征；可传播的痴呆，包括海绵状脑病；脱髓鞘性神经病；格-巴(Guillain-Barre)综合征；椎间盘疾病；海湾战争综合征；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、重症肌无力；无症状脑缺血症；睡眠障碍，包括发作性睡病和睡眠呼吸暂停；慢性神经元变性；和中风，包括脑缺血疾病。
[0505] 可以通过施用单独或与本文所述活性剂组合的GM-CSF抑制剂治疗或预防的其他疾病和医学状况包括厌食症和/或厌食状况、腹膜炎、内毒素血症和脓毒性休克、肉芽肿形成、中暑、丘-施(Churg-Strauss)综合征、在急性感染例如肺结核和麻疯病后的慢性炎症、系统性硬化症和肥厚性瘢痕。除与IL-1抑制剂组合的GM-CSF抑制剂外，TNF抑制剂，IFN-α、-β或-γ和/或IL-4抑制剂适合于治疗肥厚性瘢痕。
[0506] 本文公开的GM-CSF抑制剂可用于减少与抗体治疗、化学治疗、放射治疗和其他凋亡诱导剂例如TRAIL和TRADE的作用相关的毒性。
[0507] 本文提供了治疗或预防牛皮癣病变的方法，其涉及给人患者施用治疗有效量的GM-CSF抑制剂。治疗针对在具有普通牛皮癣或牛皮癣关节炎的患者中发生的牛皮癣病变有效。
[0508] 通过GM-CSF抑制剂有效治疗的状况在炎症反应中起作用。肺病症，包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺泡蛋白沉积症、博来霉素诱导的肺病和纤维化、辐射诱导的肺纤维化、囊性纤维化、肺中的胶原累积和ARDS。GM-CSF抑制剂可用于治疗患有各种皮肤病症的患者，包括但不限于疱疹样皮炎(杜林氏(Duhring′s)病)、特应性皮炎、接触性皮炎、荨麻疹(包括慢性特发性荨麻疹)、和自身免疫性发疱疾病包括寻常性天疱疮和大疱性天疱疮。可用GM-CSF抑制剂组合治疗的其他疾病包括重症肌无力、肉样瘤病包括肺肉样瘤病、硬皮病、反应性关节炎、高IgE综合征、多发性硬化症和特发性高嗜酸性粒细胞综合征。本发明的治疗还用于治疗对于药物的过敏反应和作为关于过敏症免疫治疗的佐剂。
[0509] 在一个实施方案中，GM-CSF抑制剂组合物可用于治疗神经系统的变性状况，例如多发性硬化症、复发缓解性多发性硬化症、进行性-复发性多发性硬化症、原发性和继发性-进行性多发性硬化症。靶定GM-CSF在多发性硬化症的临床前模型中有效，并且在多发性硬化症中在GM-CSF途径中的治疗干预可能经由对单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的直接作用减少CNS炎症，同时不影响适应性免疫。GM-CSF敲除小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)诱导有抗性，McQualter，等人，2001，J.Exp.Med.194：873-881。表达GM-CSF的逆转录病毒转导的T细胞的过继转移诱导加重的EAE，Marusic等人，2002，Neurosci.Lett.332：185-9。GM-CSF敲除T细胞的过继转移无法诱导EAE，Ponomarev等人，2007，J.Immunol.，178：39-48。申请人已显示，与用同种型对照单克隆抗体的处理比较，在复发-缓解性多发性硬化症的SJL-PLP139-151 EAE模型中用抗鼠GM-CSF抗体的预防性处理显著延迟发作且减少发病率，并且减少体重减轻和平均临床得分，参见图1和2。SJL/PLP 125-151 EAE用抗mGM-CSF单克隆抗体的治疗性处理显著减少疾病严重度和CNS炎症且加速恢复。与用同种型对照单克隆抗体的处理比较，在SJL-PLP139-151 AT-EAE中用抗mGM-CSF单克隆抗体的预防和治疗性处理减少平均临床得分，参见图2。GM-CSF抑制剂组合物可以单独或与其他药物组合使用，所述药物例如干扰素β-1a(AVONEX ；Biogen-Idec和REBIF EDM Serono，Inc.，Pfizer，Inc.)、干扰素β-1b(BETASERON ；Bayer Health Care.)、乙酸格拉默(COPAXONE ；Teva Pharmaceuticals)和/或抗VLA4 mAb(TYSABRI ，Biogen-Idec，Elan)。
[0510] 在本发明的一个实施方案中，本文公开的可用GM-CSF抑制剂(例如，GM-CSF抗体)治疗的各种医学病症是与另一种细胞因子或细胞因子抑制剂联合治疗。例如，GM-CSF抑制剂可以在组合物中施用，所述组合物还包含抑制其他炎性细胞因子与其受体的相互作用的化合物。GM-CSF抑制剂和其他细胞因子抑制剂可以作为分开组合物施用，并且这些可以通过相同或不同途径施用。与GM-CSF抑制剂组合使用的细胞因子抑制剂的例子包括拮抗例如TGF-β、IFN-γ、IL-6或IL-8和TNF特别是TNF-α的那些。GM-CSF抑制剂和IL-6的组合可以用于治疗且预防癫痫发作的复发，包括由GABA-A受体拮抗诱导的癫痫发作、与EEG猝发性发作相关的癫痫发作和在癫痫持续状态过程中发生的边缘运动性癫痫发作。此外，GM-CSF抑制剂和IFN-γ-1b和/或c-Kit抑制剂的组合可用于治疗特发性肺纤维化和囊性纤维化。用于治疗疾病的其他组合包括GM-CSF抑制剂与化合物的使用，所述化合物干扰RANK和RANK配体，例如RANK配体抑制剂，或可溶形式的RANK，包括RANK:Fc的结合。例如，GM-CSF抑制剂和RANK:Fc的组合可用于预防各种背景中的骨破坏，包括但不限于各种风湿性病症、骨质疏松症、多发性骨髓瘤或引起骨变性的其他恶性肿瘤、或旨在预防转移至骨的抗肿瘤治疗、或与假体磨损碎屑或与牙周炎相关的骨破坏。
[0511] 本文描述的所公开的GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗在医学中可用于治疗起因于细菌、病毒或原生动物感染的副作用和/或并发症。根据这个实施方案，当感染触发免疫系统的过度刺激，从而使得GM-CSF的产生和/或活性导致对患者的不良影响时，在患有感染的患者中用GM-CSF抑制剂治疗可用于改善与感染或用于治疗感染的治疗相关的这些副作用和/或并发症。此种感染剂和感染的非限制性例子是支原体肺炎，AIDS和与AIDS相关和/或涉及AIDS的状况，例如AIDS痴呆复合症、AIDS相关性消瘦，由于抗逆转录病毒治疗引起的脂营养不良；CMV(巨细胞病毒)、卡波西(Kaposi′s)肉瘤；原生动物病，包括疟疾和血吸虫病；麻疯结节性红斑；细菌或病毒性脑膜炎；结核，包括肺结核；和继发于细菌或病毒感染的肺炎；虱传播的回归热，例如由回归热螺旋体诱导的那种；疱疹病毒例如疱疹基质角膜炎、角膜病变和病毒诱导的角膜病症；人乳头瘤病毒感染；流感感染和传染性单核细胞增多症。
[0512] 心血管病症和损伤可用所公开的GM-CSF抑制剂、药物组合物或联合治疗来治疗和/或预防。特别地，心血管病症可用单独或与TNF抑制剂(例如，ENBREL)和或如上所述的其他试剂组合的GM-CSF抑制剂组合物治疗。因此可治疗的心血管病症包括主动脉瘤；包括腹主动脉瘤、急性冠状动脉综合征、动脉炎；血管阻塞，包括脑动脉阻塞；冠状动脉旁路手术并发症；缺血/再灌注损伤；心脏病，包括动脉粥样硬化心脏病，心肌炎，包括慢性自身免疫性心肌炎和病毒性心肌炎；心力衰竭，包括慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、心力衰竭恶病质；心肌梗塞；在心脏手术后或在颈动脉球囊血管成形术操作后的再狭窄和/或动脉粥样硬化；无症状性心肌缺血；左心室泵功能障碍、左心室辅助装置的植入后并发症；雷诺(Raynaud′s)现象；血栓性静脉炎；脉管炎，包括川崎(Kawasaki′s)脉管炎；静脉阻塞性疾病、巨细胞动脉炎、韦格纳氏(Wegener′s)肉芽肿病；在心肺旁路手术后的精神错乱、和许-亨二氏(Schoenlein-Henoch)紫癜。GM-CSF抑制剂、TNF抑制剂和血管发生抑制剂(例如，抗VEGF)的组合可用于治疗特定心血管疾病例如主动脉瘤和肿瘤。
[0513] 此外，主题GM-CSF抑制剂、组合物和联合治疗用于治疗慢性疼痛状况，例如慢性骨盆痛，包括慢性前列腺炎/骨盆痛综合征。作为进一步例子，本发明的GM-CSF抑制剂以及组合物和联合治疗用于治疗疱疹后疼痛。
[0514] 除人患者外，GM-CSF抑制剂可用于治疗非人动物，例如宠物(犬、猫、鸟类、灵长类动物等)、驯养农场动物(马、牛、绵羊、猪、鸟类等)、或患有IL-1介导的炎性或关节炎状况的任何动物。在此种情况下，合适剂量可以根据动物的体重进行确定。例如，可以使用0.2-1mg/kg的剂量。可替代地，根据动物的体表面积来确定剂量，示例性剂量范围是0.1-20mg/m2或更优选地5-12mg/m2。对于小动物，例如犬或猫，合适剂量是0.4mg/kg。
GM-CSF抑制剂(优选由来源于接受者物种的基因构建的)或另一种可溶性IL-1受体模拟物通过注射或其他合适途径每周施用一次或多次，直至动物的状况改善，或它可以无限施用。
[0515] 2.诊断方法
[0516] 所述抗原结合蛋白质可以用于诊断目的，以检测、诊断或监控与GM-CSF相关的疾病和/或状况。所公开的内容提供使用本领域技术人员已知的常规免疫组织化学方法检测样品中GM-CSF的存在(例如，Tijssen，1993，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，第15卷(编辑R.H.Burdon和P.H.van Knippenberg，Elsevier，Amsterdam)；Zola，1987，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158页(CRC Press，Inc.)；Jalkanen等人，1985，J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen等人，
1987，J.Cell Biol.105：3087-3096)。GM-CSF的检测可以在体内或在体外执行。
[0517] 本文提供的诊断应用包括使用抗原结合蛋白质的检测GM-CSF的表达和配体与GM-CSF的结合。在检测GM-CSF的存在中有用的方法的例子包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
[0518] 对于诊断应用，抗原结合蛋白质一般将由可检测标记基团进行标记。合适的标记3 14 15 35 90 99 111
基团包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如 H、C、N、S、Y、Tc、 In、
125 131
I、 I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或由次级报道分子(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、附加表位)识别的预定多肽表位。在某些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白质偶联，以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的，并且可以使用。
[0519] 所公开的一个方面提供用于鉴定表达GM-CSF的一种或多种细胞。在一个具体实施方案中，抗原结合蛋白质用标记基团进行标记，并且检测经标记的抗原结合蛋白质与GM-CSF的结合。在一个进一步的具体实施方案中，在体内检测抗原结合蛋白质与GM-CSF的结合。在一个进一步的具体实施方案中，使用本领域已知的技术分离且测量GM-CSF抗原结合蛋白质。参见例如，Harlow和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor(编辑1991和定期补充)；John E.Coligan，编辑，1993，Current Protocols In ImmunologyNew York：John Wiley & Sons。
[0520] 所公开的另一个方面提供用于检测测试分子的存在，所述测试分子与所提供的抗原结合蛋白质竞争与GM-CSF结合。一个此种测定的例子将涉及在测试分子的存在或不存在下，检测包含一定量的GM-CSF的溶液中游离抗原结合蛋白质的量。游离抗原结合蛋白质(即，不与GM-CSF结合的抗原结合蛋白质)的量的增加将指示测试分子能够与抗原结合蛋白质竞争GM-CSF结合。在一个实施方案中，抗原结合蛋白质用标记基团进行标记。可替代地，测试分子进行标记，并且在抗原结合蛋白质的存在或不存在下监控游离测试分子的量。
[0521] 3.治疗方法：药物制剂、施用途径
[0522] 还提供了使用抗原结合蛋白质的方法。在某些方法中，给患者提供抗原结合蛋白质。抗原结合蛋白质抑制GM-CSFR与人GM-CSF的结合。在某些方法中，通过抑制GM-CSFR与人GM-CSF的结合，抗原结合蛋白质的施用还可以抑制人GM-CSF的自磷酸化。此外，在特定方法中，通过给患者施用有效量的至少一种抗原结合蛋白质来减少单核细胞趋化性。在某些方法中，通过施用有效量的抗原结合蛋白质来抑制单核细胞迁移到肿瘤内。此外，通过施用如本文所提供的抗原结合蛋白质可以抑制肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中的累积。
[0523] 还提供了药物组合物，其包括治疗有效量的一种或多种抗原结合蛋白质和药学上可接受的稀释剂、载体、加溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。此外，包括通过施用此种药物组合物治疗患者的方法。术语“患者”包括人患者。
[0524] 可接受的制剂材料在采用的剂量和浓度时对于接受者是无毒的。在具体实施方案中，提供了包括治疗有效量的人GM-CSF抗原结合蛋白质的药物组合物。
[0525] 在特定实施方案中，可接受的制剂材料优选在采用的剂量和浓度时对于接受者是无毒的。在特定实施方案中，药物组合物可以包含制剂材料用于修饰、维持或保存组合物的例如pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或穿透。在此种实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖；和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色、调味和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如pluronics、PEG、脱水山梨醇酯、polysorbates例如Polysorbate 20、triton、tromethamine、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；送递媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见，Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，(A.R.Genrmo，编辑)，1995，MackPublishing Company。
[0526] 在特定实施方案中，最佳药物组合物将通过本领域技术人员依赖于例如预期施用途径、送递形式和所需剂量来确定。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，同上。在特定实施方案中，此种组合物可以影响所公开的抗原结合蛋白质的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。在特定实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是水性或非水性的。例如，合适媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有在用于肠胃外施用的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。在具体实施方案中，药物组合物包括约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液、或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且可以进一步包括山梨醇或其合适替代物。在特定实施方案中，通过使具有所需纯度的选择的组合物与冻干团块或水溶液形式的任选的配制试剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，同上)混合，可以制备人GM-CSF抗原结合蛋白质组合物用于贮存。此外，在特定实施方案中，人GM-CSF抗原结合蛋白质可以使用合适的赋形剂例如蔗糖配制为冻干产物。
[0527] 药物组合物可以选择用于肠胃外送递。可替代地，组合物可以选择用于吸入或用于通过消化道例如口服送递。此种药学上可接受的组合物的制备在本领域技术范围内。
[0528] 制剂组分优选以施用部位可接受的浓度存在。在特定实施方案中，缓冲液用于使组合物维持在生理学pH或略微更低的pH下，一般在约5至约8的pH范围内。
[0529] 当考虑肠胃外施用时，治疗组合物可以以无热原、肠胃外可接受的水溶液形式提供，其包括药学上可接受的媒介物中的所需人GM-CSF抗原结合蛋白质。用于肠胃外注射特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中人GM-CSF抗原结合蛋白质配制为适当防腐的无菌、等渗溶液。在特定实施方案中，制备可以涉及用试剂配制所需分子，所述试剂例如可注射微球体、生物可蚀解颗粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体，其可以提供产物的受控或持续释放，所述产物可以经由储存注射(depot injection)进行送递。在特定实施方案中，还可以使用透明质酸；其具有促进在循环中的持久持续时间的作用。在特定实施方案中，可植入药物送递装置可以用于引入所需抗原结合蛋白质。
[0530] 特定药物组合物配制用于吸入。在某些实施方案中，人GM-CSF抗原结合蛋白质配制为干燥、可吸入粉末。在具体实施方案中，人GM-CSF抗原结合蛋白质吸入溶液还可以用推进剂配制用于气溶胶送递。在特定实施方案中，溶液可以雾化。肺施用和配制方法因此在PCT公开号WO94/20069中进一步描述，并且描述了化学修饰蛋白质的肺送递。某些制剂可以口服施用。以这种方式施用的人GM-CSF抗原结合蛋白质可以连同或不连同载体一起配制，所述载体是固体剂型例如片剂和胶囊配制中常用的。在特定实施方案中，胶囊可以设计为在以下时间点在胃肠道中释放制剂的活性部分：即，此时生物利用度最大并且系统前降解最低。可以包括另外试剂以促进人GM-CSF抗原结合蛋白质的吸收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
[0531] 某些药物组合物包括与无毒赋形剂混合的有效量的一种或多种人GM-CSF抗原结合蛋白质，所述赋形剂适合于片剂制造。通过使片剂溶解于无菌水或另一种合适媒介物中，可以制备以单位剂型存在的溶液。合适的赋形剂包括但不限于，惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
[0532] 另外的药物组合物对于本领域技术人员将是显而易见的，包括涉及持续或受控送递制剂中的人GM-CSF抗原结合蛋白质的制剂。用于配制各种其他持续或受控送递工具的技术也是本领域技术人员已知的，所述工具例如脂质体载体、生物可蚀解微粒或多孔珠和储存注射。参见例如，描述了用于送递药物组合物的多孔聚合微粒受控释放的PCT公开号WO 93/15722。持续释放制剂可以包括成形物品例如膜或微胶囊形式的半透聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号EP 058481中公开的)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羟丁酸(欧洲专利申请公开号EP 133,988)。持续释放组合物还可以包括脂质体，所述脂质体可以通过本领域已知的数种方法中的任何方法进行制备。参见例如，Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开号EP 036,676；EP 088,046和EP143,949。
[0533] 用于体内施用的药物组合物一般作为无菌制剂提供。灭菌可以通过经由无菌滤膜过滤来完成。当组合物是冻干的时，使用这种方法的灭菌可以在冻干和重配前或后进行。用于施用的组合物可以以冻干形式或在溶液中贮存。肠胃外组合物一般置于具有无菌出入口的容器内，例如具有可通过皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶。
[0534] 一旦已配制药物组合物，它可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳状液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末贮存于无菌管形瓶中。此种制剂可以以现成可用形式或以施用前重配的形式(例如，冻干的)贮存。还提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。特定试剂盒包含具有干燥的蛋白质的第一个容器和具有含水制剂的第二个容器。在特定实施方案中，提供了包含单室或多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器(lyosyringes))的试剂盒。
[0535] 待采用的包含人GM-CSF抗原结合蛋白质的药物组合物的治疗有效量将依赖于例如治疗背景和目标。本领域技术人员应当理解，用于治疗的合适剂量水平将部分依赖于所送递的分子、使用人GM-CSF抗原结合蛋白质的适应症、施用途径以及患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康)而改变。在特定实施方案中，临床医生可以滴定剂量且修改施用途径以获得最佳疗效。
[0536] 依赖于上述因素，一般剂量将是约0.1μg/kg至最多约30mg/kg。在具体实施方案中，剂量可以是0.1μg/kg直至约30mg/kg、任选1μg/kg直至约30mg/kg、任选10μg/kg直至约10mg/kg、任选约0.1mg/kg至5mg/kg、或任选约0.3mg/kg至3mg/kg。
[0537] 给药频率将依赖于在使用的制剂中的具体人GM-CSF抗原结合蛋白质的药代动力学参数。一般地，临床试验施用组合物直至达到获得所需效应的剂量时。组合物因此可以作为单次剂量，或随时间作为2次或更多次剂量(这可以包含或不包含相同量的所需分子)，或作为连续输注经由植入装置或导管进行施用。合适剂量可以通过使用合适的剂量反应数据进行确定。在特定实施方案中，抗原结合蛋白质可以在延长时间段自始至终施用于患者。抗原结合蛋白质的慢性施用使通常与非全人抗原结合蛋白质相关的不利免疫或过敏反应降到最低，所述非全人抗原结合蛋白质例如在非人动物中针对人抗原产生的抗体，例如在非人物种中产生的非全人抗体或非人抗体。
[0538] 药物组合物的施用途径依照已知方法，例如口服，通过经由静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内或病变内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。在特定实施方案中，组合物可以通过快速浓注或通过输注连续地施用，或通过植入装置进行施用。
[0539] 组合物还可以经由膜、海绵或另一种合适材料的植入进行局部施用，在所述材料上已吸附或封装所需分子。在特定实施方案中，当使用植入装置时，装置可以植入任何合适的组织或器官内，并且所需分子的送递可以经由扩散、定时释放团块或连续施用。
[0540] 还可能希望根据所公开的离体方式使用人GM-CSF抗原结合蛋白质药物组合物。在此种情况下，使已从患者中取出的细胞、组织或器官暴露于人GM-CSF抗原结合蛋白质药物组合物，这之后随后将细胞、组织和/或器官植回患者内。
[0541] 特别地，使用例如本文描述的方法，人GM-CSF抗原结合蛋白质可以通过植入已进行基因工程化的特定细胞进行送递，以表达且分泌多肽。在特定实施方案中，此种细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体、异体或异种的。在特定实施方案中，细胞可以是永生化的。在其他实施方案中，为了减少免疫应答的机会，细胞可以进行封装以避免渗入周围组织。在进一步的实施方案中，封装材料一般是生物相容的、半透聚合外壳或膜，其允许蛋白质产物的释放，但阻止患者的免疫系统或来自周围组织的其他有害因子破坏细胞。
[0542] 指出的所有专利和其他出版物特别通过引入并入本文，用于描述和公开例如在此种出版物中描述的方法的目的，所述方法可以与本文描述的内容关联使用。提供这些出版物仅由于其公开在本申请的提交日期前。在这点上不应解释为承认由于在先发明或由于任何其他原因，本发明人没有资格先于此种公开。关于日期的所有声明或关于这些文件内容的表达基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
[0543] 下述实施例，包括进行的实验和取得的结果，仅用于举例说明性目的而提供，并且不解释为限制所附权利要求的范围。
[0544] 实施例
[0545] 实施例1用于生产、选择且表征抗GM-CSF单克隆抗体的GM-CSF和其他分子的描述
[0546] 几种不同的重组和天然GM-CSF分子用于生产、选择且表征抗GM-CSF杂交瘤和单克隆抗体。
[0547] 人GM-CSF
[0548] 存在两种天然存在的人GM-CSF等位基因变体，其相差在位置117处的单个氨基酸。从瞬时转染的CHO或COS细胞生产在氨基酸位置117处具有苏氨酸(rhGM-CSF-Thr，SEQ ID NO：146)或异亮氨酸(GM-CSF-Ile，SEQ ID NO：145)的重组人GM-CSF分子，并且进行亲和纯化。从用PMA(0.01ug/ml)、离子霉素(0.5ug/ml)和EGF(0.02ug/ml)刺激后的A431细胞的上清液中、从用PMA(10ng/mL)和离子霉素(500ng/mL)于37℃刺激48小时后的人外周血单核细胞(PBMCs)的上清液中，或从用TNFα(25ng/ml)和IL-1(10ng/ml)刺激的人小气道上皮细胞(SAEC)的上清液中，亲和纯化天然人GM-CSF(hGM-CSF)。大肠杆菌来源的rhGM-CSF购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。在氨基酸位置23处用亮氨酸取代精氨酸的酵母来源的rhGM-CSF(Leukine )购自Berlex，Inc.(Montville，NJ)。大肠杆菌来源的rhGM-CSF-R23L是在氨基酸位置23处用亮氨酸取代精氨酸的大肠杆菌来源的rhGM-CSF。酵母来源的rhGM-CSFnhGM-CSF(Leukine )、大肠杆菌来源的rhGM-CSF和大肠杆菌来源的rhGM-CSF-R23L在TF-1 STAT5磷酸化测定中证实等同的GM-CSF活性。
[0549] 猕猴GM-CSF
[0550] 由经转染的大肠杆菌生产重组猕猴GM-CSF(rcynoGM-CSF，SEQID NO：53)。在用TNFα(25ng/ml)和IL-1(10ng/ml)刺激后，从切碎肺组织的上清液中，或在用PMA(10ng/mL)和离子霉素(500ng/mL)于37℃刺激48小时后，从猕猴PBMCs的上清液中，亲和纯化天然猕猴GM-CSF(ncynoGM-CSF)。
[0551] 犬GM-CSF
[0552] 由经转化的大肠杆菌生产犬GM-CSF(SEQ ID NO：54)，并且使用标准柱层析从包含体中纯化。
[0553] 兔GM-CSF
[0554] 由2936E细胞生产具有His标记的重组兔GM-CSF(SEQ IDNO：82)，并且通过用5mM咪唑、20mM NaPO4、300mM NaCl，pH7.2洗涤，并且用咪唑梯度(10mM至300mM)洗脱，通过Talon cobalt IMAC进行纯化。
[0555] 小鼠GM-CSF
[0556] 由经转化的酵母细胞产生重组小鼠GM-CSF(SEQ ID NO：58)，并且用3个柱层析步骤进行纯化：SP-Sepharose(捕获)、C18(反相纯化)和SP-Sepharose(缓冲液更换)。
[0557] 大鼠GM-CSF
[0558] 重组大鼠GM-CSF购自R&D Systems。
[0559] 亲和纯化
[0560] 通过下述方法执行来自经刺激细胞上清液的GM-CSF的亲和纯化：使上清液经过抗GMCSF mAb(M8)亲和树脂循环，用NaCitrate pH6.0洗涤，并且用NaCitrate pH 4.5洗脱。使相关级分合并，并且缓冲液更换到PBS中。重组GM-CSF的浓度通过OD280测定，而天然GM-CSF的浓度通过ELISA测定。
[0561] 用于表征抗GM-CSF mAb的非GM-CSF试剂
[0562] 重组人CSF-1购自R&D Systems。由经转染的CHO细胞生产重组hIL-15，并且使用两个柱步骤纯化过程进行纯化。离子交换纯化用以10mg/ml树脂pH 7.5装载的Fractogel TMAE 650M执行，随后用20mMHepes pH 7.5，随后为20mM MES pH 6.5，随后为100mM NaCl、20mMMES洗涤。用200mM NaCl、20mM MES pH 6.5洗脱重组hIL-15。蛋白质保持在10mM NaHPO4 pH 2.0下1小时(病毒灭活步骤)，随后在10mM NaHPO4 pH 2.0下用以20mg/ml树脂装载的Fractogel EMDSO3-650(M)实施阳离子交换纯化步骤，用10mM柠檬酸钠、10mM醋酸钠、10mM MES，pH 4.0进行洗涤，并且用10mM柠檬酸钠、10mM醋酸钠、10mM MES，pH 6.0梯度洗脱进行洗脱，并且缓冲液更换到PBS中。
[0563] 实施例2中和性人抗GM-CSF抗体的生产和选择
[0564] 2.1 GM-CSF结合杂交瘤的免疫接种和选择
[0565] 使用XenoMouse 技术获得抗人GM-CSF的全人单克隆抗体的产生。各10 KLXenomice的两个分开的队列每3-4天进行免疫接种，共7周(总共16次注射)，其分别使用大肠杆菌来源的rhGM-CSF或哺乳动物细胞来源的rhGM-CSF-Ile和rhGM-CSF-Thr的交替注射。在第7和11次加强后，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)监控血清滴度，并且在第16次加强后4天，使来自具有最佳滴度的小鼠的脾细胞与配偶体细胞系融合，以便产生杂交瘤。通过ELISA筛选所得到的多克隆杂交瘤上清液与GM-CSF的结合，并且用Alpha筛选来筛选人重链和κ和/或λ轻链的存在。免疫接种活动产生表达人重和轻链的具有GM-CSF结合活性的499个系。
[0566] 2.2 使用基于hGM-CSF依赖性细胞的生物测定鉴定具有GM-CSF中和活性的杂交瘤
[0567] 使用两种基于细胞的生物测定进一步表征499种杂交瘤上清液的GM-CSF中和活性：在TF-1细胞中GM-CSF诱导的STAT5磷酸化(2.2.1)和GM-CSF诱导的AML-5细胞增殖(2.2.2)。根据这些结果，选择14种杂交瘤用于克隆。
[0568] 2.2.1 TF-1细胞中GM-CSF诱导的STAT-5磷酸化的抑制。
[0569] TF-1细胞在37℃、10％ CO2下在IMDM中进行繁殖，所述IMDM补充有5％ FBS、10mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、55uM β-巯基乙醇、和
10ng/mL大肠杆菌来源的rhGM-CSF。测定前1天，通过在350xg下离心6分钟收获TF-1细
6
胞，并且在PBS中洗涤3次。使细胞以1x10/mL重悬浮，并且在不含GM-CSF的IMDM+0.5％ FBS中在37℃、10％ CO2下培养过夜。在2mL96孔圆底板中以100μL总体积执行测定。使杂交瘤上清液以1∶4最终稀释度一式两份地铺板，并且与rhGM-CSF-Ile(0.4ng/mL终浓度)一起在37℃下温育30分钟。收获血清和GM-CSF饥饿的细胞，在PBS中洗涤，并且以
6 5
6x10 细胞/mL重悬浮于具有0.5％ FBS的IMDM中。加入50μL细胞悬浮液(3x10 细胞/孔)，并且使板在37℃下温育15分钟。为了固定细胞，加入25μL溶于PBS中的10％低聚甲醛，达到2％低聚甲醛的终浓度，并且使板在37℃下温育15分钟。将200μLIMDM+0.5％ FBS加入孔中以停止固定，并且使板在350xg下离心7分钟。去除细胞上清液，并且缓慢加入400μL 90％ MeOH，同时使细胞充分混合。在-20℃温育过夜后，使板旋转，用
400μL PBS/2％ FCS洗涤，并且与50μL 1∶5稀释(在具有2％FBS的PBS中)的抗
PhosphoSTAT5-Alexa488(Becton Dickinson 612598，Franklin Lakes，NJ)一起在室温下温育30分钟。洗涤细胞，重悬浮于具有2％FBS的PBS中，并且转移至圆底微量滴定板，用于使用MultiWell FACScalibur(Becton Dickinson)进行流式细胞术分析。使用FlowJo +
FACS分析软件测定STAT5 细胞百分比。使用下式计算STAT5磷酸化经由杂交瘤上清液的抑制百分比：
[0570] 100-({[A的％STAT5+-B的％STAT5+]/[C的％STAT5+-B的％STAT5+]}*100)
[0571] 其中A＝细胞+杂交瘤上清液+rhGM-CSF，B＝仅细胞，C＝细胞+rhGM-CSF
[0572] 对于每个测定确定抑制GM-CSF依赖性STAT5磷酸化超过阈值的杂交瘤上清液进行进一步表征，对于特异性的表征使用IL-3诱导的STAT5磷酸化，对于针对nhGM-CSF和rcynoGM-CSF的效力的表征，使用TF-1磷流动(phosflow)生物测定和AML-5细胞系GM-CSF诱导的增殖生物测定(2.2.2)。显示GM-CSF依赖性磷酸-STAT5反应和抗hGM-CSF抗体(MAB215，R&D Systems)抑制由0.4ng/mLrhGM-CSF-Ile诱导的STAT5磷酸化的能力的代表性实验显示于图3中。图4显示通过来自用大肠杆菌来源的rhGM-CSF免疫接种的队列的杂交瘤上清液，rhGM-CSF-Ile诱导的STAT5磷酸化的抑制百分比直方图。
[0573] 2.2.2 AML-5细胞的GM-CSF依赖性增殖经由杂交瘤上清液的抑制。
[0574] AML-5细胞在37℃、10％ CO2下在IMDM中进行繁殖，所述IMDM补充有5％ FBS、10mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、55uM β-巯基乙醇、和
10ng/mL大肠杆菌来源的rhGM-CSF。实验当天，在350xg下离心AML-5细胞5分钟，并且在PBS中洗涤4次，以去除残留GM-CSF。为了测试GM-CSF-或CSF-1诱导的AML-5细胞增殖的抑制，使多克隆杂交瘤上清液以1∶10和/或1∶30和/或1∶90最终稀释度在96
孔平底微量滴定板中一式两份地铺板，并且细胞因子以先前测定的EC90值加入：A431细胞来源的nhGM-CSF和rcynoGM-CSF以0.05ng/mL加入；rhGM-CSF-Ile和rhGM-CSF-Thr以
4
0.15ng/mL加入；并且rhCSF-1以10ng/mL加入。在以5x10 个细胞/mL共100μL的总体
3
积(2.5x10 个细胞/孔)加入50μL AML-5细胞前，使抗体/细胞因子混合物在37℃下温育30分钟。使板在37℃、10％ CO2下温育72小时。为了检测AML-5细胞增殖，板用1微居里氚标记胸苷进行脉冲，6小时后进行收获，并且在液体闪烁计数器上进行读数。使用下式计算AML-5增殖经由杂交瘤上清液的抑制百分比：
[0575] 100-({A的CPM/B的CPM}*100)
[0576] 其中A＝细胞+杂交瘤上清液+细胞因子，B＝细胞+细胞因子
[0577] 选择在1∶30稀释度时有效抑制人和猕猴GM-CSF诱导的而不是人CSF-1诱导的AML-5细胞增殖的杂交瘤上清液用于克隆，以产生单克隆抗GM-CSF杂交瘤。显示GM-CSF依赖性增殖反应和抗hGM-CSF抗体(MAB215，R&D Systems)抑制由0.15ng/mL rhGM-CSF-Ile诱导的AML-5细胞增殖的能力的代表性实验显示于图5中。
[0578] 2.3 单克隆杂交瘤细胞系的产生
[0579] 基于来自生物测定筛选的结果，选择14种多克隆杂交瘤系用于通过有限稀释克隆至单克隆性。来自多克隆杂交瘤板的细胞进行计数，以48个细胞/mL重悬浮，并且在20mL培养基中稀释至24个细胞/mL、4.8个细胞/mL和2.4个细胞/mL。细胞以200μl/孔铺板，对于克隆的每个系产生4个不同密度的板(10个细胞/孔、5个细胞/孔、1个细胞/孔和0.5个细胞/孔)。在克隆后2周内，在显微镜下目测检查板，并且收获来自1个细胞/孔和0.5个细胞/孔克隆板的孔的上清液，在所述克隆板中仅检测出单个集落。通过ELISA筛选上清液的抗原特异性，并且通过ELISA分析抗原阳性上清液的重和轻链种类和同种型比较。仅保留且冷冻来自每个系的1至3个子代克隆，所述克隆显示在孔中的单集落生长、抗原特异性免疫反应性、以及人λ或κ和IgG组合。通过每个子代克隆的序列分析证实单克隆性。
[0580] 2.4 通过从单克隆杂交瘤上清液中纯化的抗GM-CSF抗体表征GM-CSF中和活性[0581] 2.4.1 从杂交瘤上清液纯化IgG
[0582] 使用蛋白质A柱层析从单克隆杂交瘤上清液中亲和纯化IgG，并且使用NanoDrop ND-1000 UV-Vis分光光度计在A280(NanodropTechnologies，Wilmington，DE)下进行定量。
[0583] 2.4.2 通过单克隆抗体抑制GM-CSF依赖性AML-5细胞增殖
[0584] 如实施例2.2.2中所述繁殖AML-5细胞并且制备用于测定。为了评估从杂交瘤上清液中纯化的单克隆抗体抑制GM-CSF-或CSF-1诱导的AML-5细胞增殖的能力，抗体各自在96孔平底板(以5μg/mL开始的8倍连续稀释)中一式两份地滴定。细胞因子以先前测定的EC90值加入：nhGM-CSF(A431或人PBMC来源的)以0.1ng/mL加入；rhGM-CSF-Ile以0.3ng/mL加入；rhGM-CSF-Thr以0.8ng/mL加入；rCynoGM-CSF以0.05ng/mL加入；并且rhCSF-1以3ng/mL加入。在每次实验中，GM-CSF和CSF-1也以2倍连续稀释进行滴定，以计
4
算在那次实验中的EC90值。以100μL总体积，以2.5x10 个细胞/mL加入AML-5细胞前，使细胞因子和抗体在37℃下温育30分钟。使板在37℃、10％ CO2下温育。3天后，板用1微居里氚标记的胸苷进行脉冲，6小时后进行收获，并且在液体闪烁计数器上进行读数。使用下式计算AML-5增殖经由从杂交瘤上清液中纯化mAb的抑制百分比：
[0585] ([A的CPM-B的CPM]/[A的CPM-C的CPM])*100
[0586] 其中A＝细胞+细胞因子，B＝细胞+mAb+细胞因子，并且C＝仅细胞
[0587] 使用Microsoft Excel(Redmond，WA)产生非线性回归分析和50％增殖抑制(IC50)值计算。其中用于刺激细胞的细胞因子量在其EC90值2倍内的实验用于计算单克隆杂交瘤抗体的平均IC50值(表5)。使用相同mAb的一个或多个克隆(如由序列证实的)的实验包括在平均值中。
[0588] 表5在AML-5增殖和TF-1 Stat5磷酸化测定中从杂交瘤上清液中纯化的mAb的IC50(nM)值的表。
[0589]
[0590] 如图6和表5中所示，来自杂交瘤上清液的几种单克隆抗体以剂量依赖性方式抑制GM-CSF诱导的但不是CSF-1诱导的AML-5细胞增殖。通过增殖的半最大抑制拟合，单克隆抗体具有针对在这个测定中测试的GM-CSF形式的＜1nM的IC50值。
[0591] 2.4.3 在TF-1细胞中GM-CSF依赖性STAT-5磷酸化经由从杂交瘤上清液中纯化的抗GM-CSF单克隆抗体的抑制。
[0592] 如实施例2.2.1中所述繁殖TF-1细胞并且制备用于测定。为了评估GM-CSF-或rhIL-3诱导的TF-1细胞的STAT5磷酸化的抑制，从杂交瘤上清液中纯化的单克隆抗体各自在96孔圆底深孔板(以2μg/mL开始的5倍连续稀释)中一式两份地滴定。细胞因子以先前测定的EC90值加入：nhGM-CSF(A431)和rcynoGM-CSF以0.3ng/mL加入；rhGM-CSF-Ile和rhGM-CSF-Thr以0.9ng/mL加入；并且rhIL-3以30ng/mL加入。在每个测定中，GM-CSF和IL-3也以2倍连续稀释进行滴定，以计算在每个测定中的EC90值。在以100μL总体积，5
以3x10 细胞/mL血清和GM-CSF饥饿的TF-1细胞前，使细胞因子和抗体在37℃下温育30分钟。使细胞在37℃下刺激15分钟，随后固定，透化处理且分析STAT5磷酸化，如实施例
2.2.1中所述。使用下式计算Stat5磷酸化经由从克隆杂交瘤上清液中纯化mAb的抑制百分比：
[0593] ([A的％Stat5+-B的％Stat5+]/[A的％Stat5+-C的％Stat5+])*100
[0594] 其中A＝细胞+细胞因子，B＝细胞+mAb+细胞因子，并且C＝仅细胞
[0595] 使用GraphPad Prism 4.01计算非线性回归分析和半最大增殖抑制(IC50hm)值。其中用于刺激细胞的细胞因子量在其EC90值2倍内的实验用于计算单克隆抗体的平均IC50值(表5)。
[0596] 如图7和表5中所示，几种单克隆抗体以剂量依赖性方式抑制TF-1细胞中GM-CSF诱导的而不是rhIL-3诱导的STAT5磷酸化。单克隆抗体具有针对在这个测定中测试的GM-CSF形式的＜0.3nM的IC50hm值。
[0597] 实施例3 从经转染的细胞系克隆和表达重组单克隆抗体(mAb)的
[0598] 将抗体克隆的重和轻链可变区亚克隆到人IgG2构架内，并且在COS(瞬时转染)或CHO(稳定转染)细胞中进行瞬时或稳定转染并且表达。使用在TBS，pH 7.4中结合的2.2x10cm MabSelectSure rProteinA，和用50mM柠檬酸盐，pH 3.4+/-0.2洗脱，从上清液中纯化在COS细胞中通过瞬时转染表达的抗体。使用1M Tris碱储液pH 8.0将洗脱物调整至pH 6.0，并且使用透析缓冲液更换到10mM乙酸盐、9％蔗糖，pH 5.2中。1个克隆接受连续透析到具有10mM KP、161mM L-Arg，pH 7.6的缓冲液内，并且随后浓缩至20mg/mL。
[0599] 使用在TBS，pH 7.4中结合的1.1x10cm MabSelectSure rProtein A，和用100mM乙酸盐，pH 3.6洗脱，从上清液中纯化由稳定CHO细胞系表达的抗体。使用GE脱盐柱将5mg洗脱物缓冲液更换到10mM乙酸盐、9％蔗糖，pH 5.2中。随后使用GE脱盐将20-30mg材料缓冲液更换到Cellgro PBS，pH 7.2中。合并物进行0.2微米过滤。来自第二种稳定细胞转染的材料进行第二次纯化，并且维持在10mM乙酸盐、9％蔗糖，pH 5.2缓冲液中。
[0600] 实施例4 通过表面等离子体共振进行的重组mAb与rhGM-CSF-Ile的动力学结合分析
[0601] 使用配备CM4传感器芯片的Biacore 3000仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)，在25℃下采用表面等离子体共振执行抗GM-CSF重组单克隆抗体的动力学结合分析。使用标准胺偶联化学，用HBS-EP作为运行缓冲液，使山羊抗人IgG捕获抗体共价固定于芯片。简言之，每个流动室用0.1M NHS和0.4M EDC的混合物以5μL/分钟流速活化7分钟。10mM乙酸钠，pH 5.5中30μg/mL的山羊抗人IgG以约3200RUs的密度固定在两个流动室上。残留反应性表面用1M乙醇胺以5μL/分钟的7分钟注射灭活。50μL 10mM甘氨酸HCl，pH 1.5以100μL/分钟在每个流动室上注射3次，以去除任何残留非共价结合的捕获抗体，且使每个表面条件化。将运行缓冲液转换成具有0.1mg/mLBSA和2mg/mL CM-Dextran的HBS-EP，用于所有其余步骤。
[0602] 0.5μg/mL的重组抗GM-CSF mAb以10μL/分钟注射在1个山羊抗人IgG表面上，共1.5分钟，以获得约111RUs的表面密度。其余山羊抗人IgG表面留下不修饰，作为参照。最初运行缓冲液空白的5个循环，以使芯片表面条件化。重组hGM-CSF-Ile样品以300、100、
33.3、11.1、3.70和1.23nM的浓度一式三份地制备，并且以随机方式连同6个缓冲液空白一起以100μL/分钟注射在捕获的重组抗GM-CSF IgG和参照表面上。允许每种复合物缔合
2.5分钟，并且解离2.5分钟。此外，100nM rhGM-CSF-Ile和缓冲液空白的一式三份样品以
100μL/分钟在两个表面上交替注射，并且允许缔合2.5分钟，并且解离90分钟，以便收集更多解离相数据。在每次rhGM-CSF-Ile或缓冲液注射后，用100μL/分钟的10mM甘氨酸HCl，pH 1.5的30秒脉冲，随后为缓冲液的30秒注射，使表面再生。
[0603] 通过扣除参照表面反应以去除体积折光指数改变，并且随后扣除平均缓冲液空白反应以去除来自实验流动室的系统伪迹，使数据进行双重参照。由于缺乏动力学信息，从分析中删去从300nM曲线收集的数据，因为数据缺乏曲率并且浓度是约6000x KD。用Scrubber(version2.0a，BioLogic Software，Campbell，Australia)处理数据，并且总体拟合于1∶1相互作用模型，以获得动力学速率常数kd和ka、以及平衡结合常数KD。结果显示于表6中。
[0604] 表6 通过表面等离子体共振进行的重组mAb与rhGM-CSF-Ile的动力学结合分析[0605]mAb Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(pM)
5 -5
IgG A 3.34 x 10 3.03 x 10 90
5 -5
IgG B 6.54 x 10 3.19 x 10 49
5 -5
IgB C 8.67 x 10 7.05 x 10 81
5 -5
IgG E 9.12 x 10 1.16 x 10 128
[0606] 实施例5 通过ELISA测量的抗GM-CSF抗体与来自其他物种的GM-CSF的交叉反应性
[0607] 评估来自上述的杂交瘤mAb克隆和重组mAb结合rhGM-CSF-Ile、rhGM-CSF-Thr、酵母来源的rhGM-CSF(Leukine )、大肠杆菌来源的rhGM-CSF、nhGM-CSF和/或来自一个或多个下述物种的重组GM-CSF的能力：小鼠、大鼠、兔、犬和猕猴(图8A和8B)。96孔板的各个孔用50μL 1ug/mL GM-CSF或对照蛋白质溶液进行包被，并且在4℃下温育过夜。板用PBS/Tween洗涤4次，随后以2ug/ml将前导抗GM-CSF mAb(或对照抗体)加入具有每种GM-CSF蛋白质的孔中，在室温下温育1小时，并且用PBS/Tween洗涤4次。加入1∶8000的HRP缀合的抗人IgG，在室温下温育1小时，并且用PBS/Tween洗涤板4次。加入TMB显像剂，温育10分钟，并且平板在平板读数器上在650nm下进行读数。抗GM-CSF mAb克隆和重组mAb与rhGM-CSF-Ile、rhGM-CSF-Thr、大肠杆菌来源的rhGM-CSF和重组cynoGM-CSF结合，但不与小鼠、大鼠或犬GM-CSF结合。某些但并非所有克隆也与酵母来源的rhGM-CSF(Leukine)结合(图8A)。在分开的测定中，来自杂交瘤上清液和第二种稳定细胞系(SCL)转染的一个抗GM-CSF mAb克隆与PBMC来源的nhGM-CSF、rhGM-CSF-Ile和rcynoGM-CSF结合，但不与小鼠、大鼠、兔或犬GM-CSF结合(图8B)。
[0608] 实施例6 使用多种GM-CSF分子在基于细胞的生物测定和人全血中对重组抗GM-CSF mAb的IC50值的测定
[0609] 如上所述，由瞬时转染细胞和稳定转染细胞系表达全人重组抗hGM-CSF抗体。从两种独立瞬时转染(1st TT和2nd TT)和稳定细胞系的2次分开收获物(1st SCL和2nd SCL)纯化材料。下述实验描述了抗不同形式的人和猕猴GM-CSF的6个重组抗体克隆的IC50值测定(表7-9)。
[0610] 6.1 GM-CSF依赖性AML-5细胞增殖经由重组抗GM-CSF mAb的抑制。
[0611] 如实施例2.4.2中所述执行AML-5增殖测定，其中使用以10μg/mL开始的mRNA的9倍连续稀释物和先前测定的EC90浓度的细胞因子。对于使用2nd TT和1st SCL材料的实验(图9)，细胞因子以下述浓度加入：PBMC来源的nhGM-CSF以0.2ng/mL加入；rhGM-CSF-Ile以0.4ng/mL加入；并且rCynoGM-CSF以0.1ng/mL加入。对于其他测定，除上述细胞因子外，还测定rhGM-CSF-Thr(0.4ng/mL)和肺组织来源的ncynoGM-CSF(3ng/mL)。在每次实验中，所使用的细胞因子还使用2倍连续稀释进行滴定，以计算那次实验的EC90值。在加入
100μL总体积中的2.5x104个AML-5细胞/mL前，使细胞因子和抗体在37℃下温育30分钟。在37℃、10％ CO2下72小时后，加入1微居里氚标记的胸苷/孔。6小时后收获细胞培养物，并且通过液体闪烁计数测量掺入的氚标记的胸苷。与实施例2.4.2一样计算AML-5增殖经由重组mAb的抑制百分比。使用Microsoft Excel产生非线性回归分析和50％增殖抑制(IC50)值计算。其中用于刺激细胞的细胞因子量在其EC90值2倍内的实验用于计算每种mAb的平均IC50值。
[0612] 所有瞬时和稳定细胞系产生的重组抗体都以剂量依赖性方式抑制GM-CSF诱导的AML-5细胞增殖。来自瞬时转染的所有6种前导抗体以IC50值＜0.8nM抑制人GM-CSF，并且以IC50值＜3.5nM抑制猕猴GM-CSF。所有6种稳定转染细胞系前导抗体以IC50值＜1.5nM抑制人GM-CSF，并且以IC50值＜3.5nM抑制猕猴GM-CSF。3种抗体的结果显示于图9中。在AML-5增殖测定中测试的所有抗体和细胞因子的IC50值概括显示于表7中。
[0613] 表7AML-5增殖测定中重组mAb的IC50(nM)值的表。
[0614]
[0615] 6.2 TF-1细胞中GM-CSF依赖性STAT-5磷酸化经由重组抗GM-CSF mAb的抑制。
[0616] 如实施例2.4.3中所述执行TF-1 STAT5磷酸化测定，其中使用以2μg/mL开始的nd stmRNA的6倍连续稀释物和先前测定的EC90浓度的细胞因子。对于使用2 TT和2 SCL
材料的实验(图10)，细胞因子以下述浓度加入：PBMC来源的nhGM-CSF和rhGM-CSF-Ile以st
0.6ng/mL加入；rcynoGM-CSF以0.1ng/mL加入。对于使用1 TT材料的实验(图11)，使用来自受刺激的人小气道上皮细胞(SAEC)培养物(最终nhGM-CSF浓度0.2ng/mL)的上清液和来自受刺激的猕猴肺培养物(最终ncynoGM-CSF浓度0.1ng/mL)的上清液。在图12中，nd
将来自受刺激的猕猴PBMC培养物(最终GM-CSF浓度1ng/mL)的上清液加入来自2 SCL
的GM-CSF mAb。对于其他测定，除上述细胞因子外，还测定0.75ng/mL的rhGM-CSF-Thr。在每次实验中，所使用的细胞因子还使用2倍连续稀释进行滴定，以计算那次实验的EC90值。
在15分钟后，使细胞固定，并且进行透化处理，并且使用抗磷酸-STAT5抗体检测STAT5磷酸化的量，如上文实施例2.2.1和2.4.3中所述。与实施例2.4.3一样计算Stat5磷酸化经由重组mAb的抑制百分比。使用GraphPad Prism 4.01计算非线性回归分析和半最大增殖抑制(IC50hm)值。其中用于刺激细胞的细胞因子量在其EC90值2倍内的实验用于计算单克隆抗体的平均IC50值。
[0617] 6.3 GM-CSF依赖性原代人单核细胞活化经由重组抗GM-CSF mAb的抑制。
[0618] 为了评估mAb中和人单核细胞中GM-CSF诱导的代谢活性的能力，使用Monocyte Isolation Kit II(Miltenyi Biotech)从白细胞去除术包(Amgen Washington Blood Donor Program)中分离原代单核细胞。如通过流式细胞术评估的，阴性选择的细胞是+90％-95％ CD14 细胞(数据未显示)。在96孔平底板中，使PBMC来源的nhGM-CSF或
rhGM-CSF-Ile(0.05ng/mL)与以20μg/mL开始的mAb的6倍连续稀释物一起温育30分钟。
在100μL总培养基(补充有10％ FBS、10mMHepes、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50μg/+
mL链霉素和55μMβ-巯基乙醇的RPMI)中将CD14 细胞(150,000/mL)加入板中，并且在
37℃、5％ CO2下温育5天。通过加入20μL Alamar Blue(BioSource，DAL1025，Invitrogen，Carlsbad，CA)和培养基的1∶1混合物评估GM-CSF诱导的代谢活性，并且在4-8小时后+
计算在570-600nm下的吸光度。使用下式计算人CD14 单核细胞活性经由重组mAb的抑制百分比：
[0619] ([A的OD570-600-B的OD570-600]/[A的OD570-600-C的OD570-600])*100
[0620] 其中A＝细胞+细胞因子，B＝细胞+mAb+细胞因子，并且C＝仅细胞
[0621] 使用Microsoft Excel产生非线性回归分析和50％增殖抑制(IC50)值计算。其中用于刺激细胞的细胞因子量在其EC90值2倍内的实验用于计算mAb的平均IC50值(表8)。瞬时和稳定细胞系产生的重组抗体以剂量依赖性方式抑制GM-CSF诱导的AML-5细胞增殖。抗体以IC50hm值＜0.13nM抑制人GM-CSF，并且以IC50hm值＜0.31nM抑制猕猴GM-CSF。
[0622] 表8TF-1Stat5磷酸化测定中重组mAb的IC50(nM)值表。
[0623]
[0624] 瞬时和稳定细胞系产生的重组抗体以剂量依赖性方式抑制GM-CSF诱导的人单核细胞活性。与表达方法无关，前导抗体以IC50值＜0.55nM抑制天然和重组hGM-CSF。关于1st TT材料的结果显示于图13中。关于在人单核细胞测定中测试的所有抗体的IC50值概括显示于表9中。
[0625] 表9 人单核细胞测定中重组mAb的IC50(nM)值表。
[0626]
[0627] 6.4 在人全血中GM-CSF诱导的ENA-78或MIP-1β的产生经由从稳定CHO细胞系产生的重组抗GM-CSF的抑制
[0628] 在RPMI中制备重组hGM-CSF-Ile(终浓度2ng/mL)，所述RPMI补充有10％正常人血清、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素、2mML-谷氨酰胺和25mM Hepes，并且在96孔平底板中加入以100μg/mL开始的来自稳定CHO细胞系的重组mAb的6倍连续稀释物。将人IgG2同种型匹配的单克隆抗体(抗KLH)加入所有孔中，得到100μg/mL的总IgG终浓度，并且使板在37℃下温育30分钟。细胞因子以4倍连续稀释+/-100μg/mL同种型匹配的人IgG2进行滴定，以计算那次实验的EC90值。通过Amgen Whole Blood Donor Program将人全血收集到Na-Heparin Vacutainer管(Becton Dickinson)内，并且将血液加入孔中，并且伴随轻轻吸取进行混合。在37℃、5％ CO2下温育40小时后，使板在730xg下旋转5分钟，并且小心收集55μL血浆，并且转移至新96孔板且冷冻。使血浆解冻，并且在使用来自R&D Systems的、来自hENA78和hMIP-1b DuoSets的试剂和方案通过ELISA分析ENA78和MIP-1b前合并一式两份孔。使用GraphPad Prism 4.01计算非线性回归分析和半最大增殖抑制(IC50hm)值。
[0629] 在这种人全血测定中，重组人GM-CSF mAb显示抑制GM-CSF诱导的ENA78和MIP-1b产生。对于ENA78产生，IC50hm值测定为0.155nM，并且对于MIP-1b产生为
0.299nM(图14)。
[0630] 实施例7 在GM-CSF诱导的AML-5增殖测定、人单核细胞生物测定和TF-1细胞测定中GM-CSF诱导的TF-1 STAT-5磷酸化中酵母来源的rhGM-CSF和大肠杆菌来源的rhGM-CSF-R23L的中和
[0631] 如实施例2.4.2中所述执行AML-5增殖测定，其中使用以5μg/mL开始的从杂交瘤上清液纯化的GM-CSF mAb的9倍连续稀释物和先前测定的EC90浓度的细胞因子(大肠杆菌来源的rhGM-CSF是0.1ng/mL，酵母来源的rhGM-CSF是0.05ng/mL)。所使用的细胞因子还使用2倍连续稀释进行滴定，以计算那次实验的EC90值。在加入100μL总体积中的4
2.5x10 个AML-5细胞/mL前，使细胞因子和抗体在37℃下温育30分钟。在37℃、10％ CO2下72小时后，加入1微居里的氚标记的胸苷/孔。6小时后收获细胞培养物，并且通过液体闪烁计数测量掺入的氚标记的胸苷。如图15a中所示，4种mAb能够中和大肠杆菌来源的rhGM-CSF，而不是酵母来源的rhGM-CSF(Leukine )的活性。
[0632] 如实施例6.3中所述执行人单核细胞测定，其中使用以12μg/mL开始的从杂交瘤上清液纯化的mAb的3倍稀释物和先前测定的EC90浓度的细胞因子(A431细胞来源的nhGM-CSF和酵母来源的rhGM-CSF是0.04ng/mL)。所使用的细胞因子还使用2倍连续稀释5 +
进行滴定，以计算那次实验的EC90值。加入在100μL总体积中的1.5x10 个人CD14 细胞/mL前，使细胞因子和抗体在37℃下一起温育30分钟。板在37℃下在5％ CO2中温育5天，并且通过测量的Alamar Blue减少来评估GM-CSF诱导的代谢活性。对于两种测定，使用Microsoft Excel产生非线性回归分析和50％增殖抑制(IC50)值计算。其中用于刺激细胞的细胞因子量在其EC90值2倍内的实验包括在分析中。如图15b中所示，4种mAb能够中和A431细胞来源的rhGM-CSF，而不是酵母来源的rhGM-CSF(Leukine )的活性。
[0633] 如实施例2.2.1中所述执行TF-1 STAT5磷酸化测定，其中使用重组抗GM-CSF mAb。在96孔板的一式两份孔内，以2μg/mL开始的抗GM-CSF mAb的6倍连续稀释物和先前测定的EC90浓度的细胞因子(大肠杆菌来源的rhGM-CSF和大肠杆菌来源的rhGM-CSF-R23L是0.5ng/mL，酵母来源的rhGM-CSF-R23L(Leukine )是0.2ng/mL)。30分钟温育后，加入5
3x10 个TF-1细胞/ml至100μL的总体积。使板在37℃下温育15分钟。为了固定细胞，加入25μL溶于PBS中的10％低聚甲醛，得到2％低聚甲醛的终浓度，并且使板在37℃下温育10分钟。将200μL IMDM+0.5％ FBS、10mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、
50μg/mL链霉素、55uM β-巯基乙醇加入孔中以停止固定，并且使板在350xg下离心10分钟。去除细胞上清液，并且缓慢加入400μL 90％ MeOH，同时使细胞充分混合。在-20℃温育过夜后，使板旋转，用400μL PBS/2％ FCS洗涤，并且与50μL 1∶5稀释(在具有2％ FBS的PBS中)的抗PhosphoSTAT5-Alexa488(Becton Dickinson612598，Franklin Lakes，NJ)一起在室温下温育30分钟。洗涤细胞，重悬浮于具有2％ FBS的PBS中，并且转移至圆底微量滴定板，用于使用MultiWell FACScalibur(Becton Dickinson)进行流式细胞术分+
析。使用FlowJo FACS分析软件测定STAT5 细胞百分比。使用下式计算STAT5磷酸化经由杂交瘤上清液的抑制百分比：
[0634] 100-({[A的％STAT5+-B的％STAT5+]/[C的％STAT5+-B的％STAT5+]}*100)
[0635] 其中A＝细胞+杂交瘤上清液+rhGM-CSF，B＝仅细胞，C＝细胞+rhGM-CSF
[0636] 在GM-CSF诱导的TF-1细胞pSTAT5测定中，大肠杆菌来源的rhGM-CSF-R23L显示与酵母来源的rhGM-CSF-R23L(Leukine )(0.130ng/mL)和大肠杆菌来源的
rhGM-CSF(0.298ng/mL)相似的EC90(0.384ng/mL)。如图16中所示，抗GM-CSF mAb中
和大肠杆菌来源的rhGM-CS而不是酵母来源的(Leukine )或未糖基化的大肠杆菌来
源的rhGM-CSF-R23L。这暗示这种区别的基础是由于与天然GM-CSF比较，在酵母来源的rhGM-CSF-R23L(Leukine )和大肠杆菌rhGM-CSF-R23L的一级序列中的相同单氨基酸差异(在位置23处亮氨酸至精氨酸)，而不是由于酵母表达的糖基化差异。
[0637] 实施例8 6种前导抗GM-CSF单克隆抗体经由结合竞争的表位框并
[0638] 使用结合竞争测定执行表位框并，其中一种标记的mAb与过量的其他未标记mAb竞争与rhGM-CSF-Ile的结合。彼此竞争的抗体指定至相同框。6种前导抗GM-CSF mAb中的5种彼此竞争与rhGM-CSF结合，而1种则不是。
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