含有8种甘油三酯的药物组合物、制剂及其应用 |
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申请号 | CN201410342495.6 | 申请日 | 2014-07-18 | 公开(公告)号 | CN105287479A | 公开(公告)日 | 2016-02-03 |
申请人 | 浙江康莱特集团有限公司; 浙江康莱特药业有限公司; | 发明人 | 李大鹏; | ||||
摘要 | 本 发明 涉及一种含有甘油酯的药物组合物,具体由如下8种化合物组成:三亚油酸甘油酯、1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯、1-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯、1,3-二油酸-2-亚油酸甘油酯、1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯、1,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯、三油酸甘油酯、1-棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯,本发明还包括上述药物组合物的制剂、制备方法及其作为抗 肿瘤 药物和提高 机体 免疫功能药物中的应用。 | ||||||
权利要求 | 1.一种药物组合物,其特征在于由以下质量百分含量的8种成分组成: |
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说明书全文 | 含有8种甘油三酯的药物组合物、制剂及其应用技术领域背景技术[0002] 薏苡仁是禾本科薏苡属植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var ma-yuen(Roman.)Stapf的成熟干燥种仁,为利水渗湿药,很久以来为药食两用品种。现代研究发现薏苡仁具有镇痛抗炎、免疫调节、抗溃疡、降血脂和减肥等药理作用。近年来,国内外学者通过TLC、HPLC-MS、GC等方法对薏苡仁的化学成分进行了研究,发现其含有多种活性成分,主要包括薏苡仁酯、甘油三酯类、脂肪酸类、内酰胺类、薏苡仁内酯、糖类、甾醇类、三萜类等化合物。其中,酯类是首先被发现的具有抗肿瘤活性的成分,也是报道最多最受关注的化学成分。虽然目前在中国临床上以薏苡仁油为有效成分的康莱特注射剂已得到普遍应用,但关于其物质基础和抗癌活性成分的研究鲜有报道,向智敏等[中国中药杂志,2005,30(18):1436-1438]仅采用液质联用法对薏苡仁油中三酯类成分进行了定性分析,初步推定12种甘油三酯成分:三亚油酸甘油酯、二亚油酸油酸甘油酯、棕榈酸二亚油酸甘油酯、亚油酸二油酸甘油酯、棕榈酸亚油酸油酸甘油酯、二棕榈酸亚油酸甘油酯、三油酸甘油酯、油酸亚油酸硬脂酸甘油酯、棕榈酸二油酸甘油酯、棕榈酸亚油酸硬脂酸甘油酯、二棕榈酸油酸甘油酯和二油酸硬脂酸甘油酯,但并未对各成分的具体化学结构及药理活性进行深入研究。而薏苡仁油中不仅含有上述甘油三酯成分外,还含有甘油一酯、甘油二酯和脂肪酸酯等。由此可见,薏苡仁油脂成分的复杂性,这必然会使实际生产过程中的质量控制和临床用药安全面临很大的挑战。 [0003] 因此,开发一种安全、有效、可控的治疗肿瘤的药物即成为本发明关注的热点。本发明对薏苡仁油中甘油三酯成分逐一进行了分离、结构确证、药效活性筛选,选取了8种具有显著抗肿瘤和增强免疫功能的甘油三酯单体,将其按照不同比例组合,进行药效试验研究,得到了本发明所述的药物组合物、制剂及其在抗肿瘤和增强免疫能力中的应用。采用本发明所述组合物用药,成分及组成确定,可有效保障工业生产中各批次成品质量的稳定性,也避免了因直接采用薏苡仁粗油入药因成分复杂不清而导致的毒副反应。 发明内容[0004] 本发明的目的在于提供一种含有甘油酯的药物组合物,具体由如下质量百分含量的8种成分组成: [0005] [0006] 优选的,上述8种成分的质量百分含量为: [0007] [0008] [0009] 更优选的,上述8种成分的质量百分含量为: [0010] [0011] 其中,所述8种甘油三酯成分可以通过如本发明实施例所述方法分离获得,也可以采用本领域常规合成方法制备或者直接市场购买。 [0012] 本发明的又一目的在于提供一种含有甘油酯的药物制剂,具体包括本发明所述药物组合物及一种或几种药学上可接受的载体。 [0013] 其中,所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、润滑剂或抗氧化剂,必要时还可以加入香味剂、甜味剂、防腐剂或着色剂。 [0014] 所述药学上可接受的载体可以选自:甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、大豆磷脂、维生素C、维生素E、EDTA二钠、EDTA钙钠,一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸钾、醋酸氯己定、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙或硬脂酸镁。 [0015] 所述药物制剂可以是口服固体制剂、口服液体制剂或注射剂。 [0016] 优选的, [0017] 所述口服固体制剂选自胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、浓缩丸中的一种;所述口服液体制剂选自水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂,或是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品;所述注射剂选自纳米混悬剂、脂质体、乳剂、冻干粉针剂和水针剂中的一种。 [0018] 更优选的, [0019] 所述注射剂包括如下成分:本发明所述药物组合物50~350g,注射用大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂10~40g,注射用甘油或可供注射用甘油15~50g,注射用水加至1000ml。 [0020] 其可通过如下方法制备: [0021] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油或可供注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0022] 另称取含有8种活性成分的药物组合物,将称取的油酯与水相分别加热至60~70℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为5~12MPa,高压为25~50MPa,再循环均质3~6遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH至4.8~8.5,优选6.8~7.0,最优选为6.8; [0024] 所述胶囊剂包括如下成分:含有8种活性成分的药物组合物200~800g,抗氧化剂和/或乳化剂0.20~0.60g,制成1000粒。 [0025] 其可通过如下方法制备: [0026] 胶液配制:按重量比为1:0.6~1.2:0.3~0.8:0.0001~0.01称取适量明胶、纯化水、甘油和防腐剂;依次将甘油、纯化水、防腐剂(选自10%羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸钾和醋酸氯己定中的一种)加入化胶罐内,加热至70℃~90℃后,再加入明胶不断搅拌、抽真空,直至明胶完全溶解,将胶液过滤,在56~62℃下存放,备用; [0027] 药液配制:将配方量的药物组合物、抗氧化剂和/或乳化剂(抗氧化剂为维生素E,乳化剂为吐温80)加入配料罐内,不断搅拌,直至混合均匀; [0028] 压胶囊:根据胶囊大小选择合适的压丸模具,在15~30℃、相对湿度小于35%条件下进行压丸定型后干燥,剔除大小丸,再用95%药用乙醇洗丸后,继续干燥至含水量小于12%,目检剔除不合格胶囊,印字,包装即得。 [0029] 本发明通过药效实验表明,所述药物组合物及其制剂对多种人肿瘤细胞株均有不同程度的抑制作用,可作为治疗肿瘤疾病药物。 [0030] 因此,本发明的目的还在于提供一种上述药物组合物、药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。以及上述药物组合物在制备提高机体免疫功能药物中的应用,及其与LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)的组合在制备抗肿瘤药物中的应用。 [0032] 以下通过实验数据说明本发明所述组合物及其制剂在抗肿瘤和提高机体免疫功能方面的有益效果。 [0033] 一、体外MTT法测定药物组合物及其制剂对8种人肿瘤细胞株的抑制作用[0034] 1、实验材料及配制 [0035] (1)细胞株:PANC-1(人胰腺癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、Bcap-37(人乳腺癌细胞)、SMMC-7721(人肝癌细胞)、HepG-2(人肝癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、H460(人肺癌细胞),上述细胞株由上海医药工业研究药理评价研究中心保存,传代维持。 [0036] (2)DMEM完全培养基:添加10%新生牛血清(GIBCO BRL)、双抗。 [0037] (3)0.25%胰蛋白酶溶液(Trypsin):购自Invitrogen公司,-20℃保存。 [0038] (4)磷酸缓冲液(PBS):NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.15g,KH2PO40.2g,溶于1L双蒸水,121℃高压消毒20min,4℃保存。 [0039] (5)MTT(AMRESCO)溶液:用PBS配成5mg/ml溶液。 [0040] (6)溶解液:每100ml去离子双蒸水含SDS10g,异丁醇5ml,浓盐酸0.1ml。 [0041] 2、实验方法 [0042] 样品对上述细胞株的抑制作用通过MTT法测得。 [0043] 具体步骤如下: [0044] (1)细胞培养:①将细胞从液氮中取出,在37℃水浴中迅速解冻,细胞在无菌操作台中移入10ml无菌离心管中加6ml细胞培养基,1000转/分钟离心5分钟。弃去上清液,沉淀中加入5-6ml细胞培养基,滴管吹打使其悬浮后移入细胞培养瓶中,置37℃细胞培养箱内。②次日,自培养箱中取出细胞,弃去细胞瓶中细胞培养基,加入5~6ml细胞培养基,置37℃细胞培养箱内。③隔日,自培养箱中取出细胞,弃去细胞瓶中细胞培养基,加入PBS(pH7.4)2~3ml晃动清洗,倒掉PBS溶液后再重复一次清洗。在培养瓶中加入3~5滴0.25%胰蛋白酶溶液晃动均匀,加盖置于37℃细胞培养箱内3分钟左右,于显微镜下观察发现细胞自培养瓶壁上脱离,加细胞培养基2ml,滴管吹打使细胞完全脱离瓶壁后,分别移入2个干净培养瓶中,加入细胞培养基5~6ml吹打均匀,置于37℃细胞培养箱内。④隔日,重复③步骤。在整个培养过程中,贴壁细胞不允许生长过密,悬浮细胞始终保持对数生长期。(2)样品及对照品制备:称取适量药物组合物样品溶解于DMSO中,得到浓度为10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀释,得到浓度10mg/ml、5000μg/ml、2500μg/ml、1250μg/ml、 625μg/ml、312.5μg/ml的稀释样品。 [0045] (3)将稀释好的样品加入平底96孔板中,每孔10μl,每点作两个平行测试。将DMSO相应作梯度稀释后加入板中,作为对照。 [0047] (5)将加入细胞的平底96孔板在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48小时。 [0048] (6)每孔中加入20μl的5mg/ml MTT溶液,继续在培养箱中保温3~4小时。 [0049] (7)每孔加入100μl溶解液,继续在培养箱中保温过夜,使生成的甲臢晶体充分溶解。测定570nm光吸收值。 [0050] (8)根据光吸收值计算各样品浓度组的细胞生长抑制率。计算公式如下: [0051] (1-实验孔平均光吸收值/对照孔平均光吸收值)×100% [0052] 3、实验结果 [0053] 表1不同浓度样品对8种细胞株的生长抑制率(%) [0054] [0055] 表2样品在体外对8种细胞株的IC50(μg/ml) [0056] [0057] 4、结论 [0058] 不同浓度的本发明组合物及其制剂在体外对上述8种人肿瘤细胞株有不同程度的抑制作用。 [0059] 二、测定本发明注射液对对小鼠免疫功能的影响 [0060] 1、动物与材料 [0061] 1.1动物 [0062] 昆明种小鼠,雄性,18~22g,上海医药工业研究院动物房提供,沪动合证字107号。 [0063] C57BL/6小鼠,雄性,18~20g,上海实验动物中心提供。 [0064] DBA/6小鼠,雄性,18~20g,上海实验动物中心提供,中科动管会第005号。 [0065] 1.2材料 [0066] 本发明注射液:由浙江省中医院提供,按照本发明所述方法制备。 [0067] 相应溶剂:由浙江省中医院提供,本实验中作为空白对照。 [0068] 香菇多糖:福州梅峰制药厂生产,批号911026,每2ml含香菇多糖4mg,本实验中作为阳性对照。 [0069] 培养液:RPMI1640,美国Difco产品,内含15%小牛血清,巯基乙醇,Hepes等。 [0071] 刀豆球蛋白A(ConA):Sigma产品,50μg/ml。 [0072] YAC-1细胞,L1210细胞,CTLL细胞,本实验室备用。 [0073] 2、方法与结果 [0074] 2.1本发明注射液对小鼠体外ConA诱导脾淋巴细胞增殖的影响 [0075] C57BL/6小鼠,无菌条件下取脾,分离脾细胞,以RPMI1640+15%FCS培养液调7 整细胞浓度为1×10 个/ml,药物组各设四个剂量组,在96孔培养板上,毎孔加细胞 100μl,各种不同浓度药液100μl,ConA50μl,以香菇多糖为阳性对照组,同时设相应溶剂对照组及培养液空白对照组,各组均设三复孔,37℃、5%CO2条件下培养48小时,加入 3 H-TdR0.5μci/孔,继续培养20小时,收集细胞在液闪仪上测CPM值并与对照组比较。结果见表3,本发明注射液与香菇多糖一样,均能对小鼠体外脾淋巴细胞增殖有明显的促进作用,并呈浓度线性关系。 [0076] 表3本发明注射液对小鼠体外脾淋巴细胞增殖的影响 [0077] [0078] **P<0.01,与相应溶剂及培养液对照组比较。 [0079] 2.2本发明注射液对荷瘤动物脾淋巴细胞增殖反应的影响 [0080] DBA/2小鼠60只,每鼠皮下接种L1210小鼠白血病细胞1×104个,次日起随机分为6组,毎组10只,即香菇多糖20mg/kg,本发明注射液6.25ml/kg、12.5ml/kg、25ml/kg及相应溶剂对照组,生理盐水对照组,iv×7,给药结束后处死动物,无菌条件下取脾,计数脾细胞,并调整细胞浓度为1×107个/ml,在96孔板上加细胞100μl,培养液100μl,各组均设三复孔,37℃、5%CO2条件下培养48小时后,加入3H-TdR0.5μci/孔,继续培养20小时,收集细胞测CPM值并与对照组比较,结果见表4。本发明注射液对荷瘤(L1210)动物有提高脾淋巴细胞增殖作用,并随剂量加大免疫促进作用加大,香菇多糖也呈现免疫促进作用。 [0081] 表4本发明注射液对荷L1210白血病小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响 [0082] [0083] **P<0.01,与相应溶剂组或生理盐水组比较。△P>0.1,与生理盐水组比较。 [0084] 2.3本发明注射液对小鼠体外自然杀伤细胞(NK细胞)活性的影响 [0085] 用3H-TdR掺入抑制检测法测定小鼠NK活性。 [0086] C57BL/6小鼠,无菌条件下取脾,配成1×106个/ml细胞浓度,作为效应细胞,另取已培养24小时的YAC-1细胞,也调整成1×104个/ml细胞浓度,作为靶细胞,检测样品以1:1稀释,以效靶之比为100:1的细胞及样品加在96孔培养板上,另加3H-TdR0.5μci/孔, 37℃、5%CO2条件下培养24小时后,收集细胞,测CPM值,计算特异性抑制百分率(Pi)表示NK细胞活性,以香菇多糖为阳性对照,相应溶剂及培养液为空白对照组。Pi计算公式如下: [0087] [0088] 结果见表5,本发明注射液与香菇多糖一样均能不同程度的激活小鼠体外NK活性,说明本发明注射液有免疫激活作用。 [0089] 表5本发明注射液对小鼠体外NK细胞活性的影响 [0090] [0091] **P<0.01,与效应溶剂组及培养液对照组比较。 [0092] 2.4本发明注射液对荷瘤动物NK细胞活性的影响4 [0093] DBA/2小鼠60只,每鼠腋皮下接种L1210小鼠白血病1×10 个,次日起随机分为6组,每组10只,即阳性对照香菇多糖20mg/kg,本发明注射液6.25ml/kg、12.5ml/kg、25ml/kg及相应溶剂对照组,生理盐水对照组,均为iv×7,给药结束后,无菌条件下取脾, 6 3 制备脾细胞,调整细胞浓度为1×10 个/ml,采用 H-TdR掺入抑制法检测法测定小鼠NK活 4 性,即在96孔板上加入脾细胞100μl(效应细胞),YAC-1细胞(靶细胞浓度为1×10 个/ 3 ml)100μl,H-TdR0.5μci/孔,毎组均设三复孔,37℃、5%CO2条件下培养24小时后,收集细胞,测CPM值,计算特异性抑制百分率(Pi)表示NK细胞活性(计算公式同前)。 [0094] 结果见表6,本发明注射液与香菇多糖一样均能对荷瘤动物NK活性有激活作用,说明有免疫激活作用。 [0095] 表6本发明注射液对荷瘤动物NK细胞活性的影响 [0096] [0097] **P<0.01,与相应溶剂及生理盐水对照组比较△P>0.1,与生理盐水对照组比较[0098] 2.5本发明注射液对荷瘤小鼠产生IL-2的影响 [0099] DBA/2小鼠60只,每鼠腋皮下接种L1210小鼠白血病1×104个,次日起随机分为6组,毎组10只,即香菇多糖20mg/kg,本发明注射液6.25ml/kg、12.5ml/kg、25ml/kg及混悬液对照组及生理盐水对照组,均为iv×7,给药结束后,处死动物,在无菌条件下取脾,制 7 备脾细胞,调整细胞浓度为1×10 个/ml,在24孔细胞培养板上每孔加2ml及Con A5μg/ 3 ml,37℃、5%CO2条件下培养24小时后收集上清液,用IL-2依赖性细胞株CTLL以 H-TdR掺入法测定IL-2活性。 [0100] 结果见表7,本发明注射液对荷瘤动物有促进产生IL-2的作用,且在所试三档剂量中随剂量增加作用明显增强。 [0101] 表7本发明注射液对L1210白血病小鼠产生IL-2的影响 [0102]△ [0103] **P<0.01,与生理盐水组比较 P>0.1,与生理盐水组比较 [0104] 2.6本发明注射液对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 [0105] 取体重18-22g的健康昆明种小鼠,随机分成给药组和对照组,以相应溶剂为对照组,连续7天腹腔给药,最后一次给药后每鼠腹腔注射2%鸡红细胞悬液l ml,间隔30分钟,颈椎脱臼处死,仰位固定于鼠板上。正中剪开腹腔皮肤,经腹腔注入生理盐水2ml,转动鼠板1分钟,然后吸出腹腔洗液l ml,平均分滴于两片载玻片上,放人垫有湿纱布的搪瓷盒内,移至37℃培养箱培养30分钟。取出后于生理盐水中漂洗。以除去未贴片细胞,晾干,丙酮-甲醇(1:1)溶液固定。4%(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3分钟,用蒸馏水漂洁,晾干。 [0106] 油镜下计数巨噬细胞,每片100个,按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。 [0107] [0108] [0109] 结果见表8,本发明注射液腹腔连续注射7次,在12.5ml/kg、6.25ml/kg剂量时有明显的促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的功能。 [0110] 表8本发明注射液对小鼠腹腔吞噬功能活化作用 [0111] [0112] **P<0.01与对照组比较 [0113] 3、结论 [0114] 本发明注射液对小鼠淋巴细胞增殖有促进作用,对荷瘤鼠NK细胞活性有激活作用;对荷瘤小鼠有促进IL―2产生的作用;有明显促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的功能。说明本发明注射液可提高机体免疫功能,起到更好的抗肿瘤作用。 [0115] 三、测定本发明注射液对LAK细胞疗效的影响 [0116] 1、材料与方法 [0117] 1.1样品 [0119] K562细胞,Daudi细胞由日本国立癌症研究中心引进。 [0120] 1.3活化液 [0122] 1.4培养液 [0123] PRMI1640培养液+10%新生牛血液(NBS)+2mM谷氨酖胺+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素,用于靶细胞培养等。 [0124] 1.5LAK细胞的诱导 [0125] 取健康献血员外周血,加淋巴细胞分离液,离心,取单个核细胞,用Hanks液洗涤26 次后以1×10/ml的浓度悬浮于LAK细胞活化液中。活化液含RPMI1640、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、灭活的人AB型血清及rIL-2。细胞培养10天,所得细胞离心15分钟,再经Hanks液洗涤2次后,悬浮于含5%正常人血清白蛋白和rIL-2的生理盐水注射液中。 [0126] NK活性是用健康献血员外周血分离得到的单个核细胞的杀伤活性表示。 [0127] 1.6本发明注射液处理肿瘤细胞 [0128] 使用对NK细胞敏感的肿瘤细胞K562及对NK细胞耐受的细胞株Daudi细胞。将5 肿瘤细胞调制为1×10/ml的浓度,再以RPMI1640培养液1:8稀释的本发明注射液添加,细胞悬液:本发明注射液=1:1,作用2小时作为靶细胞。 [0129] 1.7细胞杀伤活性试验 [0130] 将效应细胞用RPMI1640培养液洗涤3次,然后让细胞悬浮,并和靶细胞一起注入3 96孔U底微量细胞板孔,使效靶之比为15。每孔加0.5μciH-TdR l0μl,开始培养18小时后终止反应。用液闪仪测量CPM。按下式计算杀伤活性: [0131] [0132] A:效应细胞和靶细胞混和培养孔的CPM。 [0133] B:效应细胞单独培养孔的CPM。 [0134] C:靶细胞单独培养孔的CPM。 [0135] 2、结果 [0136] 2.1NK活性 [0137] NK杀伤活性对经2小时本发明注射液处理的K562细胞没有变化,而对Daudi细胞由4.8%上升到11.2%(P<0.01)。 [0138] 2.2LAK活性 [0139] LAK细胞活性也是同样,对处理过的细胞K562没有变化,而对Daudi细胞却由30.9%上升到44.6%(P<0.01)。 [0140] 3、讨论 [0141] 本实验结果显示,LAK细胞对于经本发明处理的肿瘤细胞Daudi的杀伤活性显著提高,NK活性亦上升。本发明注射液可增强机体免疫机能,同时具有与LAK疗法合并用药效应。 [0142] 通过试验证实,本发明所述的其它含量的甘油三酯组合物及其制剂均能够达到上述试验例所述的效果。 [0143] 本发明通过以下具体的实施例进一步说明本发明,但不作为本发明的限制。 具体实施方式[0144] 实施例1薏苡仁油的制备 [0145] 取水分≤10%的薏苡仁1000g粉碎成100目,采用超临界二氧化碳萃取,萃取温度50℃,萃取压力22Mpa,分离温度40℃,分离压力8Mpa,二氧化碳流量500L/h,连续萃取3小时,分离得到薏苡仁粗油;加入薏苡仁粗油重量46%的石油醚,及1%的氢氧化钠的水溶液碱炼;分液后取有机相,首先加入5%的活化中性氧化铝过滤,滤液加热至40~50℃,又加入4%经活化的高岭土过滤,减压除溶剂,再加入10%活化中性氧化铝,过滤,150~180℃减压干热灭菌,冷却过滤,得薏苡仁油。 [0146] 实施例2三亚油酸甘油酯的制备 [0147] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行分离,流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积1.5mL;色TM谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~27min: 50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长:208nm; 收集保留时间为12.6~14.2min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得三亚油酸甘油酯。 [0148] HR-EI-MS:m/z=878.7344(Calcd.=878.7363,C57H98O6),不饱和度=9。 [0149] IR(KBr film):1746、1170、1098;2928、2856、724;3008、1655cm-1(弱)。 [0150] 1H-NMR数据见表9。 [0151] 13C-NMR数据见表10。 [0152] 表9实施例2-9所述化合物的1H-NMR图谱数据 [0153] [0154] 其中,A:三亚油酸甘油酯,B:1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯,C:1-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯,D:1,3-二油酸-2-亚油酸甘油酯,E:1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯,F:1,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯,G:三油酸甘油酯,H:1-棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯。 [0155] 表10实施例2-9所述化合物的13C-NMR图谱数据 [0156] [0157] 其中,A:三亚油酸甘油酯,B:1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯,C:1-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯,D:1,3-二油酸-2-亚油酸甘油酯,E:1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯,F:1,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯,G:三油酸甘油酯,H:1-棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯。 [0158] 实施例31-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯的制备 [0159] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行分离,流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积1.5mL;色TM谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~27min: 50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长:208nm; 收集保留时间为15.4~17.3min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯。 [0160] HR-EI-MS:m/z=880.7518(Calcd.=880.7520,C55H98O6),不饱和度=7。 [0161] IR(KBr film):1747,1164,1098;2925,2854,723;3008,1655cm-1(弱)。 [0162] 1H-NMR数据见表9。 [0163] 13C-NMR数据见表10。 [0164] 实施例41-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯的制备 [0165] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行初步分离,流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积TM1.5mL;色谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~ 27min:50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长: 208nm;收集保留时间为17.4~18.1min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,得粗品。 [0166] 二次纯化时流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),将上述粗品用流动TM相B配制成20mg/mL的溶液,每次分离进样体积1.5mL;色谱柱:Superstar Benetnach C18(10mm×250mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~23min:50%~60%,32~43min:60%~ 90%,43~60min:100%;流速:3mL/min;紫外检测波长:208nm,收集保留时间为31.2~ 34.7min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得1-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯单体。 [0167] HR-EI-MS:m/z=854.7370(Calcd.==854.7363,C55H98O6),不饱和度=7。 [0168] IR(KBr Flim):1746,1165,1095;2926,2854,722;3009,1648cm-1(弱)。 [0169] 1H-NMR数据见表9。 [0170] 13C-NMR数据见表10。 [0171] 实施例51,3-二油酸-2-亚油酸甘油酯的制备 [0172] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行分离,流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积1.5mL;色TM谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~27min: 50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长:208nm; 收集保留时间为18.4~20.2min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯。 [0173] HR-EI-MS:m/z=882.7678(Calcd.=882.7672,C57H102O6),不饱和度=7。 [0174] IR(KBr film):1747、1163、1097;2925、2855、723;3007、1655cm-1(弱)。 [0175] 1H-NMR数据见表9。 [0176] 13C-NMR数据见表10。 [0177] 实施例61-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯的制备 [0178] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行初步分离。流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积TM1.5mL;色谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~ 27min:50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长: 208nm;收集保留时间为20.3~21.4min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯。 [0179] HR-EI-MS:m/z=856.7519(Calcd.=856.7513,C55H100O6),不饱和度=6。 [0180] IR(KBr film):1747、1164、1098;2925、2854、723;3008、1655cm-1(弱)。 [0181] 1H-NMR数据见表9。 [0182] 13C-NMR数据见表10。 [0183] 实施例71,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯的制备 [0184] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行初步分离,流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积TM1.5mL;色谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~ 27min:50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长: 208nm;收集保留时间为25.7~26.2min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得1,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯。 [0185] HR-EI-MS:m/z=830.7371(Calcd.=830.7363,C53H98O6),不饱和度=5。 [0186] IR(KBr film):1747、1164、1098;2925、2854、723;3008、1655cm-1(弱)。 [0187] 1H-NMR数据见表9。 [0188] 13C-NMR数据见表10。 [0189] 实施例8三油酸甘油酯的制备 [0190] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行初步分离,流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积TM1.5mL;色谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~ 27min:50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长: 208nm;收集保留时间为26.6~27.7min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得三油酸甘油酯。 [0191] HR-EI-MS:m/z=884.7851(Calcd.=884.7833,C57H104O6),不饱和度=6。 [0192] IR(KBr film):1749,1165,1095;2925,2854,723;3004,1654cm-1(弱)。 [0193] 1H-NMR数据见表9。 [0194] 13C-NMR数据见表10。 [0195] 实施例91-棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯的制备 [0196] 利用P3000A高效液相制备色谱仪进行初步分离,流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),用流动相B配制成50mg/mL的薏苡仁油溶液,每次分离进样体积TM1.5mL;色谱柱:Superstar Benetnach C18(20mm×150mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~ 27min:50%~60%,27~35min:90%,35~45min:100%;流速:18mL/min;紫外检测波长: 208nm;收集保留时间为28.2~29.3min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,得粗品。 [0197] 二次纯化时流动相A:乙腈,流动相B:乙腈-四氢呋喃(1:1),将上述粗品用流动TM相B配制成20mg/mL的溶液,每次分离进样体积1.5mL;色谱柱:Superstar Benetnach C18(10mm×250mm,5μm);梯度条件:流动相B:0~23min:50%~60%,32~43min:60%~ 90%,43~60min:100%;流速:3mL/min;紫外检测波长:208nm,收集保留时间为32.9~ 35.1min的色谱峰流分,在氮气的保护下采用旋转蒸发仪减压浓缩,用氯仿转移至10mL小瓶,在真空干燥箱中35℃干燥6h后,充入氮气,干燥好的样品于冰箱中冷冻保存,即得1-棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯。 [0198] HR-EI-MS:m/z=858.7672(Calcd.=858.7676,C55H102O6),不饱和度=5。 [0199] IR(KBr film):1747,1166,1095;2926,2854,722;3003,1654cm-1(弱)。 [0200] 1H-NMR数据见表9。 [0201] 13C-NMR数据见表10。 [0202] 实施例10本发明药物组合物注射液的制备 [0203] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0204] [0205] 处方: [0206] 上述组合物 100g [0207] 注射用大豆磷脂 10g [0208] 注射用甘油 15g [0209] 注射用水加至 1000ml [0210] 工艺: [0211] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0212] 另称上述组合物,将称取的油酯与水相分别加热至60℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为5MPa,高压为25MPa,再循环均质6遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH至8.5; [0213] 将制得均匀乳剂氮气加压通过≤3μm的微孔滤芯过滤器过滤,充氮灌装灭菌,冷却即得。 [0214] 实施例11本发明药物组合物注射液的制备 [0215] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0216] [0217] [0218] 处方: [0219] 上述组合物 300g [0220] 可供注射用大豆磷脂 40g [0221] 可供注射用甘油 50g [0222] 注射用水加至 1000ml [0223] 工艺: [0224] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0225] 另称取上述组合物,将称取的油酯与水相分别加热至70℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为10MPa,高压为50MPa,再循环均质3遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH至7.1; [0226] 将制得均匀乳剂氮气加压通过≤3μm的微孔滤芯过滤器过滤,充氮灌装灭菌,冷却即得。 [0227] 实施例12本发明药物组合物注射液的制备 [0228] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0229] [0230] 处方: [0231] 上述组合物 200g [0232] 注射用大豆磷脂 25g [0233] 可供注射用甘油 30g [0234] 注射用水加至 1000ml [0235] 工艺: [0236] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0237] 另称取上述组合物,将称取的油酯与水相分别加热至65℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为9MPa,高压为35MPa,再循环均质4遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH至4.8; [0238] 将制得均匀乳剂氮气加压通过≤3μm的微孔滤芯过滤器过滤,充氮灌装灭菌,冷却即得。 [0239] 实施例13本发明药物组合物注射液的制备 [0240] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0241] [0242] 处方: [0243] 上述组合物 150g [0244] 可供注射用大豆磷脂 35g [0245] 注射用甘油或 30g [0246] 注射用水加至 1000ml [0247] 工艺: [0248] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0249] 另称取上述组合物,将称取的油酯与水相分别加热至68℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为8MPa,高压为40MPa,再循环均质5遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH至6.8; [0250] 将制得均匀乳剂氮气加压通过≤3μm的微孔滤芯过滤器过滤,充氮灌装灭菌,冷却即得。 [0251] 实施例14本发明药物组合物胶囊剂的制备 [0252] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0253] [0254] 处方: [0255] 上述组合物 200g [0256] 维生素E 0.20g [0257] 制成 1000粒 [0258] 工艺: [0259] 胶液配制:按重量比为1:1.2:0.8:0.01称取适量明胶、纯化水、甘油和10%羟苯乙酯溶液;依次将甘油、纯化水、10%羟苯乙酯溶液加入化胶罐内,加热至70℃后,再加入明胶不断搅拌、抽真空,直至明胶完全溶解,将胶液过滤,在58℃下存放,备用; [0260] 药液配制:将配方量的上述组合物、维生素E加入配料罐内,不断搅拌,直至混合均匀; [0261] 压胶囊:根据胶囊大小选择合适的压丸模具,在25℃、相对湿度<35%条件下进行压丸定型后干燥,剔除大小丸,再用95%药用乙醇洗丸后,继续干燥至含水量小于12%,目检剔除不合格胶囊,印字,包装即得。 [0262] 实施例15本发明药物组合物胶囊剂的制备 [0263] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0264] [0265] 处方: [0266] 上述组合物 800g [0267] 吐温80 0.60g [0268] 制成 1000粒 [0269] 工艺: [0270] 胶液配制:按重量比为1:1.2:0.8:0.01称取适量明胶、纯化水、甘油和苯甲酸;依次将甘油、纯化水、苯甲酸加入化胶罐内,加热至90℃后,再加入明胶不断搅拌、抽真空,直至明胶完全溶解,将胶液过滤,在56℃下存放,备用; [0271] 药液配制:将配方量的上述组合物、吐温80加入配料罐内,不断搅拌,直至混合均匀; [0272] 压胶囊:根据胶囊大小选择合适的压丸模具,在20℃、相对湿度<35%条件下进行压丸定型后干燥,剔除大小丸,再用95%药用乙醇洗丸后,继续干燥至含水量小于12%,目检剔除不合格胶囊,印字,包装即得。 [0273] 实施例16本发明药物组合物胶囊剂的制备 [0274] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0275] [0276] 处方: [0277] 上述组合物 500g [0278] 维生素E 0.40g [0279] 制成 1000粒 [0280] 工艺: [0281] 胶液配制:按重量比为1:0.9:0.6:0.005称取适量明胶、纯化水、甘油和山梨酸钾;依次将甘油、纯化水、山梨酸钾加入化胶罐内,加热至80℃后,再加入明胶不断搅拌、抽真空,直至明胶完全溶解,将胶液过滤,在62℃下存放,备用; [0282] 药液配制:将配方量的上述组合物、维生素E加入配料罐内,不断搅拌,直至混合均匀; [0283] 压胶囊:根据胶囊大小选择合适的压丸模具,在30℃、相对湿度<35%条件下进行压丸定型后干燥,剔除大小丸,再用95%药用乙醇洗丸后,继续干燥至含水量小于12%,目检剔除不合格胶囊,印字,包装即得。 [0284] 实施例17本发明药物组合物胶囊剂的制备 [0285] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0286] [0287] 处方: [0288] 上述组合物 600g [0289] 吐温80 0.3g [0290] 制成 1000粒 [0291] 工艺: [0292] 胶液配制:按重量比为1:1.0:0.5:0.008称取适量明胶、纯化水、甘油和醋酸氯己定;依次将甘油、纯化水、醋酸氯己定加入化胶罐内,加热至85℃后,再加入明胶不断搅拌、抽真空,直至明胶完全溶解,将胶液过滤,在56℃下存放,备用; [0293] 药液配制:将配方量的上述组合物、吐温80加入配料罐内,不断搅拌,直至混合均匀; [0294] 压胶囊:根据胶囊大小选择合适的压丸模具,在18℃、相对湿度<35%条件下进行压丸定型后干燥,剔除大小丸,再用95%药用乙醇洗丸后,继续干燥至含水量小于12%,目检剔除不合格胶囊,印字,包装即得。 [0295] 实施例18本发明药物组合物注射液的制备 [0296] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0297] [0298] 处方: [0299] 上述组合物 100g [0300] 注射用大豆磷脂 10g [0301] 注射用甘油 15g [0302] 注射用水加至 1000ml [0303] 工艺: [0304] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0305] 另称取上述组合物,将其与水相分别加热至60℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为6MPa,高压为28MPa,再循环均质4遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH6.8; [0306] 将制得均匀乳剂氮气加压通过≤3μm的微孔滤芯过滤器过滤,充氮灌装灭菌,冷却即得。 [0307] 实施例19本发明药物组合物注射液的制备 [0308] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0309] [0310] 处方: [0311] 上述组合物 300g [0312] 可供注射用大豆磷脂 40g [0313] 可供注射用甘油 50g [0314] 注射用水加至 1000ml [0315] 工艺: [0316] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0317] 另称取上述组合物,将其与水相分别加热至70℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为11MPa,高压为46MPa,再循环均质56遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH至7.5; [0318] 将制得均匀乳剂氮气加压通过≤3μm的微孔滤芯过滤器过滤,充氮灌装灭菌,冷却即得。 [0319] 实施例20本发明药物组合物注射液的制备 [0320] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0321] [0322] 处方: [0323] 上述组合物 200g [0324] 注射用大豆磷脂 25g [0325] 可供注射用甘油 30g [0326] 注射用水加至 1000ml [0327] 工艺: [0328] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂,加适量的注射用水后,用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体,加入按配方量称取的注射用甘油,并加注射用水至规定量,搅拌均匀备用; [0329] 另称取上述组合物,将其与水相分别加热至65℃后,置高压均质机进行高压乳化,乳化时均质机低压为9MPa,高压为36MPa,再循环均质3遍,至2μm以下颗粒应不少于95%,5μm以上颗粒不得检出,必要时用NaOH或HCl调节pH至6.5; [0330] 将制得均匀乳剂氮气加压通过≤3μm的微孔滤芯过滤器过滤,充氮灌装灭菌,冷却即得。 [0331] 实施例21本发明药物组合物胶囊剂的制备 [0332] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0333] [0334] 处方: [0335] 上述组合物 200g [0336] 维生素E 0.20g [0337] 制成 1000粒 [0338] 工艺: [0339] 胶液配制:按重量比为1:1.2:0.8:0.01称取适量明胶、纯化水、甘油和10%羟苯乙酯溶液;依次将甘油、纯化水、10%羟苯乙酯溶液加入化胶罐内,加热至70℃后,再加入明胶不断搅拌、抽真空,直至明胶完全溶解,将胶液过滤,在60℃下存放,备用;上述组合物、维生素E加入配料罐内,不断搅拌,直至混合均匀; [0340] 压胶囊:根据胶囊大小选择合适的压丸模具,在28℃、相对湿度<35%条件下进行压丸定型后干燥,剔除大小丸,再用95%药用乙醇洗丸后,继续干燥至含水量小于12%,目检剔除不合格胶囊,印字,包装即得。 [0341] 实施例22本发明药物组合物胶囊剂的制备 [0342] 组合物中各成分的质量百分含量(%): [0343] [0344] [0345] 处方: [0346] 上述组合物 800g [0347] 吐温80 0.60g [0348] 制成 1000粒 [0349] 工艺: [0350] 胶液配制:按重量比为1:1.2:0.8:0.01称取适量明胶、纯化水、甘油和苯甲酸;依次将甘油、纯化水、苯甲酸加入化胶罐内,加热至90℃后,再加入明胶不断搅拌、抽真空,直至明胶完全溶解,将胶液过滤,在56℃下存放,备用; |