一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法 |
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| 申请号 | CN201610024474.9 | 申请日 | 2016-01-13 | 公开(公告)号 | CN105494103B | 公开(公告)日 | 2017-12-29 |
| 申请人 | 中国科学院华南植物园; 东莞市农业科学研究中心; | 发明人 | 曾宋君; 罗白雪; 江南; 傅艳燕; 周慧君; 吴坤林; 张建霞; 段俊; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法。本发明在对摩帝类兜兰母株进行一系列药剂处理的 基础 上，以新生侧芽为外植体，采用独特的培养基进行不定芽的诱导、丛生芽增殖和生根培养获得优质种苗快速繁殖的方法，为满足摩帝类兜兰优质种苗市场的需要提供一条有效的途径。技术切实可行，应用价值高。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法技术领域： [0002] 摩帝兜兰(Paphiopedilum Maudiae)是由劳氏兜兰(P.lawrenceanum)和胼胝兜兰(P.callosum)杂交育成。以其为亲本又育成了许多杂交后代，市场上把具有与摩帝兜兰花朵形态相似的一类兜兰，统称为“摩帝类兜兰(P.Maudiae type)”，他们的花色十分丰富，从紫黑色、红褐色至绿白色均有，斑点和线条形态也十分丰富，是国际、国内市场上商品兜兰的主要品种。摩帝类兜兰的常规繁殖可采用分株，但繁殖速度慢，繁殖率低，远不能满足商业市场的需要。目前，世界市场上销售的摩帝类兜兰多是采用无菌播种而来。但由于摩帝类兜兰是杂交种，无菌播种后代分离大，不能保持亲本的优良性状获得性状统一的种苗，严重地制约了它的规模化生产。同时，由于兜兰在组织培养时，外植体去污难及增殖速度慢等原因，其组织培养难度极大，世界上还没有从温室中选取优良株系作外植体进行摩帝类兜兰组织培养快速繁殖的报道。发明内容： [0003] 本发明的目的是提供一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，从而进行摩帝类兜兰优良株系的无性克隆获得性状统一的种苗。 [0004] 本发明的摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： [0005] a、不定芽的诱导和丛生芽的增殖：切取摩帝类兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，接种到诱导培养基中，诱导出不定芽，然后将诱导出的不定芽转移到增殖培养基上进行增殖培养，获得丛生芽，所述的诱导培养基和增殖培养基都为每升含有6-苄基嘌呤3.0～10.0毫克、萘乙酸0.5～1.0毫克、椰子汁100～200毫升、磷酸二氢钠150～200毫克、蔗糖20～30克和6～7克琼脂，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；每隔60天继代一次，至第6代时，增殖系数可达到2.5～3.0倍。 [0006] b、生根壮苗培养：将增殖获得的丛生芽接种到壮苗培养基中进行壮苗，获得粗壮的丛生芽，然后将其切成单芽后转接到生根培养基中进行生根培养，获得完整植株，所述的壮苗培养基每升含有6-苄基嘌呤1.0～2.0毫克、萘乙酸0.5～1.0毫克、椰子汁100～200毫升、磷酸二氢钠150～200毫克、蔗糖20～30克和6～7克琼脂，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；所述的生根培养基每升含有6-苄基嘌呤0.3～0.5毫克、萘乙酸0.5～1.0毫克、椰子汁 100～200毫升、磷酸二氢钠150～200毫克、香蕉匀浆50～150克、活性炭0.1～1.0克、蔗糖20～30克和6～7克琼脂，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0； [0007] c、将完整植株转移到自然光下炼苗，炼苗后，洗净其根部培养基移入植金石：树皮按质量比1-3：1的混合基质中培养获得摩帝类兜兰种苗。一般保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％以上。 [0008] 所述的步骤a的接种到诱导培养基中，以及转移到增殖培养基上进行增殖培养、步骤b的将丛生芽接种到壮苗培养基中进行壮苗和将丛生芽切成单芽后转接到生根培养基中进行生根培养，其培养温度24～28℃，光照度1500～2000lx，光照12～16小时/天。 [0009] 所述的切取摩帝类兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，其外植体是通过以下方法获得的： [0010] 选择植株生长势强、花型圆整的摩帝类兜兰为母株，在切取外植体消毒的35天前，先用多菌灵的500～800倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，5天后用35％尅土菌可湿性粉剂的500～800倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，再过5天后，用72％农用链霉素可溶性粉剂的3000～4000倍的稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，然后每过5天，重复上述步骤一次，最后1次浇灌农用链霉素后5天，用体积分数75％酒精水溶液消过毒的解剖刀切取长度1.5～2.5厘米的侧芽为外植体。 [0011] 其消毒具体为：在超净工作台上将切下的外植体先用体积分数75％酒精水溶液中浸泡10～30秒后，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡5～10分钟，无菌水冲洗4～5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒5～10分钟，无菌水冲洗4～5次，然后切掉叶片，放置于医用链霉素的1500～2000倍稀释水溶液中振荡24小时，得到消毒后的外植体。如此处理可以使消毒成功率为50～60％，从而有效的解决了外植体去污难的难题。 [0012] MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T,Skoog F(1962)(A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15:473–497)。1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/2，其余成份不变。 [0013] 本发明在对摩帝类兜兰母株进行一系列药剂处理的基础上，以新生侧芽为外植体，采用独特的培养基进行不定芽的诱导、丛生芽增殖和生根培养获得优质种苗快速繁殖的方法，为满足摩帝类兜兰优质种苗市场的需要提供一条有效的途径。技术切实可行，应用价值高。具体实施方式： [0014] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 [0015] 实施例1：红摩帝奇迹(Paphiopedilum SCBG Miracle)的组织培养[0016] (1)材料选择和处理 [0017] 选择植株生长势强、花型圆整的摩帝类兜兰[红摩帝奇迹(Paphiopedilum SCBG Miracle)]为母株。在切取外植体(侧芽)消毒的35天前，先用多菌灵的500倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，5天后用35％尅土菌可湿性粉剂的500倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，再过5天后，用72％农用链霉素可溶性粉剂的3000倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片。然后每过5天，重复上述步骤一次，最后1次浇灌农用链霉素后5天，用体积分数75％酒精水溶液消过毒的解剖刀切取长度2.5厘米的侧芽为外植体。 [0018] (2)外植体消毒 [0019] 在超净工作台上将切下的外植体先用体积分数75％酒精水溶液中浸泡30秒后，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，再用质量分数0.1％升汞水溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次。得到消毒后的外植体，然后切掉叶片，剩余的侧芽放置于医用链霉素的2000倍稀释水溶液中在摇床中振荡24小时后，再接种到诱导培养基中，培养温度28℃，光照度2000lx，光照16小时/天，所述的诱导培养基为每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)10.0毫克、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁200毫升、磷酸二氢钠150毫克、蔗糖20g和琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0，其配制方法是将上述培养基中的成份混合均匀后，消毒灭菌得到诱导培养基(下同)。消毒成功率60％。 [0020] (3)不定芽诱导和丛生芽增殖 [0021] 接种后的外植体在10天左右可见明显的褐色分泌物形成，在30天时要将转入新的诱导培养基，再培养25天左右能在外植体上形成不定芽。然后将不定芽接种到增殖培养基中进行继代增殖培养，所述的增殖培养基为每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)4.0毫克、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁200毫升、磷酸二氢钠150毫克、蔗糖20克和琼脂6克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0，培养温度28℃，光照度2000lx，光照16小时/天，每隔60天继代一次，至第6代时，增殖系数可达到3.0倍，获得丛生芽。 [0022] (4)生根壮苗培养 [0023] 将丛生芽接种到壮苗培养基中壮苗培养，培养温度28℃，光照度2000lx，光照16小时/天，60天后将高度3.0厘米的丛生芽切成单芽后转到生根培养基中生根培养，培养温度28℃，光照度2000lx，光照16小时/天，60天后以形成6厘米高的完整植株，所述的壮苗培养基每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)1.5毫克、萘乙酸(NAA)0.75毫克、椰子汁150毫升、磷酸二氢钠175毫克、蔗糖20g和琼脂6g，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0，其配制方法是将上述培养基中的成份混合均匀后，消毒灭菌得到壮苗培养基(下同)；所述的生根培养基每升含有 6-苄基嘌呤(6-BA)0.5毫克、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁200毫升、磷酸二氢钠200毫克、香蕉匀浆150克、1.0克活性炭、蔗糖20克和琼脂6克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0，其配制方法是将上述培养基中的成份混合均匀后，消毒灭菌得到生根培养基(下同)。 [0024] (6)试管苗移栽 [0025] 将具6厘米左右高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗20天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入植金石(日本进口)：树皮按质量比为3：1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％。 [0026] 实施例2：绿摩帝云之君(Paphiopedilum SCBG Yunzhijun)的组织培养[0027] (1)材料选择和处理 [0028] 选择植株生长势强、花型圆整的摩帝类兜兰[绿摩帝云之君(Paphiopedilum SCBG Yunzhijun)]为母株。在切取外植体(侧芽)消毒的35天前，先用多菌灵的600倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，5天后用35％尅土菌可湿性粉剂的600倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，再过5天后，用72％农用链霉素可溶性粉剂的3500倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片。然后每过5天，重复上述步骤，最后1次浇灌农用链霉素后5天，用体积分数75％酒精水溶液消过毒的解剖刀切取长度2.5厘米的侧芽为外植体。 [0029] (2)外植体消毒 [0030] 在超净工作台上将切下的外植体先用体积分数75％酒精水溶液中浸泡20秒后，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡7.5分钟，无菌水冲洗5次，再用质量分数0.1％升汞水溶液消毒7.5分钟，无菌水冲洗5次。得到消毒后的外植体，然后切掉叶片，剩余的侧芽放置于医用链霉素的1750倍稀释水溶液中在摇床中振荡24小时后，再接种到诱导培养基中，培养温度24℃，光照度1500lx，光照12小时/天，所述的诱导培养基为每升含有6-苄基嘌呤(6-BA) 7.5毫克、萘乙酸(NAA)0.75毫克、椰子汁150毫升、磷酸二氢钠175毫克、蔗糖30克和琼脂7克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0，其配制方法是将上述培养基中的成份混合均匀后，消毒灭菌得到诱导培养基(下同)。消毒成功率55％。 [0031] (3)不定芽诱导和丛生芽增殖 [0032] 接种后的外植体在10天左右可见明显的褐色分泌物形成，在30天时要将转入新的诱导培养基，再培养28天左右能在外植体上形成不定芽。然后将不定芽接种到增殖培养基中进行继代增殖培养，所述的增殖培养基为每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)10毫克、萘乙酸(NAA)0.5毫克、椰子汁100毫升、磷酸二氢钠200毫克、蔗糖30克和琼脂7克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0，培养温度24℃，光照度1500lx，光照12小时/天，每隔60天继代一次，至第6代时，增殖系数可达到2.8倍，获得丛生芽。 [0033] (4)生根壮苗培养 [0034] 将丛生芽接种到壮苗培养基中壮苗培养，培养温度24℃，光照度1500lx，光照12小时/天，60天后将高度2.5厘米的丛生芽切成单芽后转到生根培养基中生根培养，培养温度24℃，光照度1500lx，光照12小时/天，60天后以形成5.5厘米高的完整植株，所述的壮苗培养基每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)2毫克、萘乙酸(NAA)1毫克、椰子汁200毫升、磷酸二氢钠 200毫克、蔗糖30克和琼脂7克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；所述的生根培养基每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)0.4毫克、萘乙酸(NAA)0.75毫克、椰子汁150毫升、磷酸二氢钠175毫克、香蕉匀浆100克、0.5克活性炭、蔗糖30克和琼脂7克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～ 6.0；。 [0035] (6)试管苗移栽 [0036] 将具5.5厘米左右高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入植金石(日本进口)：树皮按质量比为2：1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达93％。 [0037] 实施例3：摩帝红宝石(Paphiopedilum SCBG Red Jewel)的组织培养[0038] (1)材料选择和处理 [0039] 选择植株生长势强、花型圆整的摩帝类兜兰[摩帝红宝石(Paphiopedilum SCBG Red Jewel)]为母株。在切取外植体(侧芽)消毒的35天前，先用多菌灵的800倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，5天后用35％尅土菌可湿性粉剂的800倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片，再过5天后，用72％农用链霉素可溶性粉剂的4000倍稀释水溶液浇灌一次并喷施叶片。然后每过5天，重复上述步骤，最后1次浇灌农用链霉素后5天，用体积分数75％酒精水溶液消过毒的解剖刀切取长度1.5厘米的侧芽为外植体。 [0040] (2)外植体消毒 [0041] 在超净工作台上将切下的外植体先用体积分数75％酒精水溶液中浸泡10秒后，用1.0％有效氯的次氯酸溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗4次，再用质量分数0.1％升汞水溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4次。得到消毒后的外植体，然后切掉叶片，剩余的侧芽放置于医用链霉素的2000倍稀释水溶液中在摇床中振荡24小时后，接种到诱导培养基中，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，所述的诱导培养基为每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)3毫克、萘乙酸(NAA)0.5毫克、椰子汁100毫升、磷酸二氢钠200毫克、蔗糖30克和琼脂6.5克，余量为1/ 2MS培养基，pH 5.8～6.0，其配制方法是将上述培养基中的成份混合均匀后，消毒灭菌得到诱导培养基(下同)。消毒成功率50％。 [0042] (3)不定芽诱导和丛生芽增殖 [0043] 接种后的外植体在10天左右可见明显的褐色分泌物形成，在30天时要将转入新的诱导培养基，再培养30天左右能在外植体上形成不定芽。然后将不定芽接种到增殖培养基中进行继代增殖培养，所述的增殖培养基为每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)3.0毫克、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁200毫升、磷酸二氢钠150毫克、蔗糖20克和琼脂6.5克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，每隔60天继代一次，至第6代时，增殖系数可达到2.5倍，获得丛生芽。 [0044] (4)生根壮苗培养 [0045] 将丛生芽接种到壮苗培养基中壮苗培养，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，60天后将高度2厘米的丛生芽切成单芽后转到生根培养基中生根培养，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，60天后以形成5厘米高的完整植株，所述的壮苗培养基每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)1毫克、萘乙酸(NAA)0.5毫克、椰子汁100毫升、磷酸二氢钠150毫克、蔗糖30克和琼脂6克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；所述的生根培养基每升含有6-苄基嘌呤(6-BA)0.3毫克、萘乙酸(NAA)0.5毫克、椰子汁100毫升、磷酸二氢钠150毫克、香蕉匀浆50克、0.1克活性炭、蔗糖30克和琼脂6.5克，余量为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；。 [0046] (6)试管苗移栽 [0047] 将具5厘米左右高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入植金石(日本进口)：树皮按质量比为1：1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％。 |
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