Characterization method of biological activity biochemical elements by analyzing the low-frequency electromagnetic signal

本発明は、濾過後、好ましくは希釈段階後に生じた電磁シグナルの分析による、微生物又はその構造的もしくは分子的成分由来の生化学的材料の特徴付けの分野に関する。

Jacques Benveniste教授の研究から、生物活性分子の特定の活性を保存し及びデジタル化することが知られている。 先行技術において分析された分子は、天然物質（ヒスタミン、カフェイン、ニコチン、アドレナリン等）又は薬物である。

先行技術では、類推的又は好ましくはデジタル形態で、このシグナルを感知し、発信する。

そのような研究の範囲内で、欧州特許EP0701695は、生物活性又は所定の物質に特異的な生物的挙動の証明を特徴付けるシグナルの形態で、発信する方法及び装置を開示している。 該生物活性を有する第１の担体材料から、第１の材料から物理的に分離されかつ該所定の物質の物理的存在が最初から無い第２の材料までのそのようなシグナルの処理、及びこのような方法によって得られた材料も開示している。 先行技術のこの方法は、第１の物質によって放出されセンサーによって感知された電子的又は電磁的シグナルの増幅、及び第１の材料の生物活性又は生物的挙動の証明を特徴付けるシグナルのエミッタへの発信、次いで、該所定の物質に特異的であって、高増幅率の増福手段によってこのような第２の材料に発信された生物活性の証明を特徴付けるシグナルの第２の材料での検出、を含む。

本発明の目的は、そのような技術の適用分野及び能力を広げるためにそのような技術に改良を与えることである。

例えば、最も広い意味で、本発明は、分析可能な材料試料から調製された溶液により発信された低周波数電磁シグナルを分析することによって、生物活性な生化学的要素を特徴付ける方法であって、予備-濾過段階を含むことを特徴とする方法に関する。

好ましくは、試料は、分析段階の前に、150 nm以下、より具体的には20 nm〜100 nmの多孔率を有するフィルターによって濾過される。

有利には、希釈段階は、10 ^-2 〜10 ^-20 、より具体的には10 ^-2 〜10 ^-9の希釈からなる。

好ましい実施態様によれば、本方法は、激しい攪拌段階及び/又は遠心段階を含む。

好ましい実施態様によれば、溶液は、磁場シグナルの取得中にホワイトノイズの手段によって励起される。

本発明は、より具体的には、微生物の分析への特徴付け方法の適用に関する。

本発明はまた、公知の生化学的要素への特徴付けの適用によって得られるサインを記録し、及び、得られたサインを、先に記録されたサインで特徴付けられた生化学的要素のサインと比較することから成る生物的分析に関する。

本発明はまた、少なくとも１つの公知の生物化学的要素に特徴付け方法を適用することによって得られた少なくとも１つのサインを記録し、及び、該サインに依拠する阻害シグナルを試料に適用することから成る生物的阻害方法に関する。

本発明はまた、生化学的要素を特徴付けるための装置であって、本発明に従う特徴付け方法の実行によって溶液によって発信された電磁シグナルの取得のためのセンサー、分析された試料のサインを計算するための該シグナルを処理するための回路、及びそのように計算されたサインを、先に記録されたサインの基準と比較するための比較回路を含む装置に関する。

本発明は、以下の記載を読み、非限定的な具体的実施態様に対応する添付図面を参照すると、より特理解されるだろう。

下記の事項において、以下の点に留意されたい：
＊生物は、血液試料、特に具体的には抗凝結薬、好ましくはヘパリンを与えた人から採取された血漿中のin vitro又はin vivo培養培地中に懸濁される；
＊ナノ構造発信シグナルは、任意の生物を除くためにろ過された培養培地又は血漿から単離される（細菌については、0.45μm、0.1μm又は0.02μm、ウイルスについては、0.45μm、0.02μm）。
電磁シグナルはコンピュータに記録され、種々の方法で表示される：
−全体的に、連続して6秒間に2回測定されるので、シグナルの強度がバックグラウンドノイズの強度の少なくとも1.5倍に達する時に、シグナルは陽性であると考えられる。
−分析は、3次元ヒストグラムの形態である。
−分析は、フーリエ変換による。

本記載は、発信されたシグナルの分析によって微生物の3つの例を特徴付けるための、本発明に従った代表的な方法の実行を開示する：
−マイコプラズマ・ピルム（M．pirum）
−HIV（ヒト免疫不全ウイルス）、IIIB株（LAI）
−細菌エシェリシア・コリ K12（E．coli）
−HIV-感染患者からの血漿。

実施例１：CEM細胞でのマイコプラズマ・ピルムの培養物への適用
CEM細胞でのマイコプラズマ・ピルムの培養物をRPMI 1640培養培地+10%のウシ胎児血清中で調製した。 良い状態の細胞は、マイコプラズマ・ピルムの存在に関連して典型的な集合体の存在を示した。

細胞を除くために懸濁液を低速で遠心した。 上清液を0.45μPEVDミリポア（商標）フィルターでろ過し、次いで、ろ液を0.02μWhatman Anotop（商標）フィルター又は0.1μミリポア（商標）フィルターでろ過した。

次いで同一の条件下でろ過した、感染されていないCEM細胞由来の上清液について比較した。 層流のフード下で完全なRPMIで溶液を10倍ずつ、10 ^-7まで希釈した。 次いで、各溶液を次の希釈前に15秒間、ボルテックス（最大力）で処理した。

シグナルの検出を図１に示した装置で行った。 装置は、単離された材料からできたテーブル上に位置付けられた0〜20,000ヘルツの感度を有する読みソレノイド細胞（１）を含む。 読まれる溶液は、プラスチック製（２）エッペンドルフ（商標）三角ビーカーに1.5 mlの容積で入れた。 液体溶液は、一般的に、1 mlであり、場合によっては0.3〜0.5 mlである。 注目される応答に差は無い。 各試料は、連続して6秒間に2回読み、各読み値は別々に入力した。

ソレノイドによって発信される電磁シグナルは、オーディオカード（４）を用いてコンピュータ（３）まで増幅され、その好適なソフトェアは記録された要素の視覚的表示を与える。

増幅の未処理の全体的な表示を、図２、３及び４に示す。 いくつかのバックグラウンドノイズ（-）を（図２）に示し、平均化した。 増幅がバックグラウンドノイズの少なくとも1.5倍を超える時に陽性のシグナルを検出し、（+）と定義した。 一般的に、検出された増幅は2倍であり、時には3倍であり、これをバックグラウンドノイズ（++）と定義し、検出されたシグナルは、SEM電磁シグナルと称する。

−試料の存在下でのバックグラウンドノイズの各々の3Dヒストグラム分析は、図５及び６に示す。
−試料の存在下でのバックグラウンドノイズ及びシグナルのそれぞれのフーリエ変換による個々の周波数へのブレークダウンを図７及び８に示す。

結果：
１）SEMの発信 非-ろ過懸濁液：バックグラウンドノイズ（-）は、非感染対照及び感染懸濁液中で注目される。 図２は、検出されたシグナルの増幅非処理（raw）の全体的な表示である。

0.02μmろ過溶液。 図３は、検出されたシグナルの増幅非処理の全体的な表示である：明確な差が注目される。 マイコプラズマ懸濁液由来の溶液は、10 ^-7希釈まで（++）であった。 非感染CEM対照は（-）であった。 追加実験は、10 ^-6希釈から数時間後に行ったが、10 ^-14まで陽性（++）及び10 ^-15希釈まで（+）を取り戻した。 最初の実験における10 ^-6及び10 ^-7希釈は、20℃で数時間の後に（++）を維持した。

0.1μろ過溶液。 図４は、検出されたシグナルの増幅非処理の全体的な表示である。 マイコプラズマ・ピルムろ液は、10-7希釈まで（++）であった。 対照は、10 ^-2希釈の１読み値を除いてすべて陰性であった。 8つの対照チューブは、同一のプラスチック製支持体に位置付けられたマイコプラズマ・ピルムのチューブに近いことに注意されたい。 そのチューブの１つの陽性は、１つのチューブから他のチューブへのその壁によるシグナルの通過によって説明される。

陽性の周波数のフーリエ分析を10 ^-6及び10 ^-7について（すべて0.02ろ液を用いて）、下向きの強度順：1,000、2,000、3,000、1,999、999、2,999、500、399、300、900を示した。

3D分析（図６）は、陽性要素（+）での最も高い周波数への置換を示す。

実施例２：PBS中での20〜70%の密度勾配平衡での遠心中のSEM現の挙動
遠心は、4℃で35,000回転/分で2時間行い、4℃で終夜維持した最初の0.02μから開始した。 その陽性は遠心の直前にチェックした。

遠心の完了時に、12フラクションをチューブの底から集めた。 フラクションの測定は、その密度勾配を決定させた。

次いで、フラクションを2グループずつに分け、10%濃度のウシ血清を含むRPMI 1640培地で10 ^-7まで希釈した。

ほとんど希釈されていないフラクションの陰性は、非常に多くのソースによって発信されるシグナルの自己干渉によって説明される。 このような自己阻害は、0.1 mlの非希釈要素と0.4 mlの10 ^-4希釈との混合によってチェックした：ボルテックス処理の後に、陰性を示すシグナルの衰退は、効果的に気付くことができる。

電磁シグナルのソースは、大きなサイズ（しかしながら＜0.02μ）及び1.16〜1.26の密度を有するポリマーのように挙動することに留意されたい。

非遠心未処理調製物について観察されていないゾーン効果にも言及しなければならない。 自己干渉は、活性のピークと、10 ^-4までの希釈について起こる（5-6及び7-8）。

実施例３：HIV1/IIIB感染CEM細胞の培養物への適用
このような実験は、以下の2ステップで調製されたHIV1/IIIB感染CEM細胞培養物に関する。
−4日：細胞変性効果（CPE）の開始 −6日：CPE++効果。
非感染CEMの対照培養物と比較した。
−上清液の0.45μmろ過 −次いで、0.02μmろ過 −ウシ血清を含むRPMI培地中で10 ^-7までのろ液の10倍ずつの希釈 −各希釈ステップにおける15秒間のボルテックスでの激しい攪拌。

結果：
１）4日培養では、上記のバックグラウンドシグナルノイズのシグナルは観察されなかった。 10 ^-7希釈までの非感染CEM対照では差が無かった。
２）6日培養では、以下のようであった。

自己干渉実験を再度行った。

0.1 mlの10 ^-1 （陰性）溶液+0.4 mlの10 ^-7 （陽性）溶液：後者は陰性になった。 自己干渉は低希釈で起こった。

３）密度勾配の分析
0.02μmフィルターでろ過した陽性の培養物の上清液を、4℃でベックマン（商標）SW56ローターで35,000回転/分で、20〜70%サッカロースの密度勾配平衡で遠心した。

非感染CEM細胞の対照上清液を同様な方法で処理した。

遠心後、13フラクションを回収し、2つずつ群分けした。 いくつかのフラクションの屈折率を、密度勾配を決定するために、ABBE（商標）屈折計で測定した。

400 mlのフラクションをウシ血清を含むRPMI 1640培地で希釈した。 連続希釈をそのようなフラクションについて10ずつ行った。

1.23〜1.24及び1.19〜1.21密度を有する群は10 ^-7希釈まで全く陽性であったことに留意されたい。 1.15〜1.16密度群は10 ^-7希釈まで全く陽性であった。 チューブの上部の群は、どんなに希釈しても、シグナルを与えなかった。

チューブの底からのフラクション（1.25〜1.28密度）は、数回の希釈のみで陽性シグナルを与えた。

マイコプラズマ・ピルムに対して、自己干渉は、出発ろ液について起こり、勾配フラクションからは自己干渉は起こらなかった。

この場合には、マイコプラズマ・ピルムと同様に、ほとんどのシグナルは、1.19〜1.26密度を有するフラクションに集中し、より軽い1.16フラクションの方へショルダーを有した。

実施例５：マイコプラズマ・ピルム SEM源不活性化試験
1 mlの10 ^-1希釈されたマイコプラズマ・ピルムの0.02μmろ液をエッペンドルフチューブに入れた。 このようなチューブは、増幅後に、同一の希釈率を有するマイコプラズマ・ピルム調製物で先に記録された、先に記録された非処理の電気シグナルで10分間供給されたソレノイド中に置いた。

図９は、記載した実施例における、サウンドカード（４）、最大力60ワットを有する増幅器（１０）に接続されているアウトレットを備えたコンピュータ３、を含む装置の図面を示す。 増幅されたシグナルは、エッペンドルフチューブ（１２）が置かれている柔軟なソレノイド（１１）に適用される。

様々な種類の増幅シグナルは、陽性シグナルを与えるマイコプラズマ・ピルム懸濁液に10分間適用した。

ａ）同一の増幅されていないシグナル：出発シグナルは陽性であり続けた。 対照的に、陰性であった、非感染CEM細胞を0.02μmのろ液を含む対照チューブは、陽性になった。 このことは、電磁シグナルは、初期スペクトルが変更されていないことを条件に、非-活性媒体中で発信され得ることを示唆している。

ｂ）最も高い強度周波数（179、374、624、1,000、2,000ヘルツ）は、マイコプラズマ・ピルムのナノ構造によって発信される電磁シグナルのスペクトルの中で選択され、このような増幅周波数の適用後に、シグナルは陽性であり続けた。

ｃ）対照的に、相変換を有する同一のシグナルが適用される場合には、SEM陽性は消えた。 このことは、相変換を有するマイコプラズマ・ピルムによって発信されるSEM細胞のすべてが使用される時に当てはまる。

ｄ）同種干渉によるシグナル、すなわち、別の微生物（コリバシレ）由来のシグナルを無効にすることもできる。

実施例４：様々な感染症（HIV、ウレアプラズマ属ウロリティカム（urolyticum）尿道炎、及びリュウマチ様関節炎）を有する人由来の血漿の分析
このような分析は、一度ろ過され及び好適な方法で希釈されたかかる血漿が、感染原因が未だ同定されていない多発性関節炎を除いて、in vitroで、同一の微生物によって発せられるシグナルと類似したシグナルを発する、ことを示している。

より具体的には、抗-レトロウイルス型の3種の治療法によって治療されたAIDS感染患者の場合には、このようなシグナルは、（10 ^-16までの）血漿の高希釈によって発生した。 このことは、それらが、原形質ウイルスチャージの消失後に豊富に存在し、治療後に残存している残渣的感染の原因となり得ることを示唆している。

全体的な結論
様々な性質の微生物、例えばレトロウイルス（HIV）、グラム陽性菌に近い硬い壁を持たない細菌（マイコプラズマ・ピルム）、硬い壁を持つグラム陰性菌（E．coli）は、水溶液の中でナノ構造を維持した。

微生物の物質的粒子を除くろ過という必須のステップの後に、（100 nm未満のサイズを有する）このようなナノ構造は、記録しデジタル化され得る低周波数での複雑な電磁シグナルを発信する。

同一の結果は、このような生物によって感染された患者の血漿から得られる。

このようなナノ構造は、その大きなスペクトル強度及び急速冷凍へのその感度によって生じる微生物とは異なる。 それらが発信するシグナルは、先に記録された逆相のシグナルとの自己干渉、又は他の微生物からのシグナルとの同種干渉によって無効にされ得る。

図１は、シグナル取得装置の図面を示す。

図２は、任意の放出源（バックグランドノイズ）の非存在下にソレノイドによって生じた電子シグナル（バックグランドノイズ）の図である。

図３は、0.02μm〜0.1μmを濾過後に放出源（マイコプラズマ・ピルム）の存在下にソレノイドによって生じた電子シグナルの図を示す。

図４は、0.02μm〜0.1μmを濾過後に放出源（マイコプラズマ・ピルム）の存在下にソレノイドによって生じた電子シグナルの図を示す。

図５は、任意の放出源の非存在下でソレノイドによって検出された波長の分布の３次元ヒストグラム（バックグランドノイズ）を示す。

図６は、0.02μm濾過後に放出源（マイコプラズマ・ピルム）の存在下にソレノイドによって検出された波長の分布の３次元ヒストグラムを示す。

図７は、同一のバックグランウンドノイズのフーリエ分析（供給電流の非-濾過ハーモニクス）を示す。

図８は、放出源（マイコプラズマ・ピルム）の存在下にソレノイドによって生じたシグナルのフーリエ分析を示す。

図９は、先に記録されたシグナルの適用のための増幅装置の図を示す。