用于检测试样中的微生物的方法 |
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申请号 | CN200780030875.4 | 申请日 | 2007-06-22 | 公开(公告)号 | CN101506373B | 公开(公告)日 | 2013-07-10 |
申请人 | 纳内克蒂斯生物技术公司; | 发明人 | 吕克·蒙塔尼耶; 贾迈勒·艾萨; | ||||
摘要 | 本 发明 涉及一种配制 试剂 的方法,所述试剂用于检测 微 生物 、尤其用于检测人或动物中的感染的试验,其特征在于所述方法包括以下步骤:a)对包含 选定 的特种微生物的生物液体或人造液体的培养基进行离心分离;b)对在步骤a)中获得的上层清液进行过滤;c)配制一系列与在步骤b)中获得的滤液的递增稀释、直到滤液的至少10-15倍的稀释相对应的稀释试样;d)使在步骤c)中获得的稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场;e)在对通过螺线管检测到的电 信号 进行模拟/数字转换之后对所述 电信号 进行分析并且对所述电信号进行数字记录;f)选择在步骤e)中提供了特征电信号的稀释试样,特征电信号也就是幅度是由 水 辐射 的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的信号;g)将在步骤f)中选择的稀释试样引入防护罩中,防护罩保护所述稀释液免受外部电 磁场 的干扰;h)将步骤g)的所述稀释试样之一逐渐分配到两个管中,一个是T1,保留在保护所述稀释试样免受外部 电磁场 的干扰的一个防护罩中,该管用作参考溶液,而另一个管T2也处于防护罩中,该管后面将面对或 接触 怀疑包含所述选定的特种微生物的试样。 | ||||||
权利要求 | 1.一种配制试剂的方法,所述试剂用于检测微生物,其特征在于所述方法包括以下步骤: |
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说明书全文 | 用于检测试样中的微生物的方法[0003] 还在现有技术(WO 09417406)中已知一种用于将生物活性从称作带菌者的第一介质传送到称作目标的第二介质(不含所述带菌者介质的任何痕量并在物理上与带菌者介质分离)的方法和设备,在开始时目标不具有所述生物活性。该方法包括(i)使包括关注的生物活性的带菌者介质暴露给电信号或电磁信号的传感器,(ii)放大辐射出的表示生物活性的特征电磁信号或电信号,然后(iii)使目标介质暴露给电信号或电磁信号的辐射器,所述辐射器通过传输和放大电路连接到所述传感器,以便将生物活性的特征信号传送到所述目标。 [0004] 在2005年12月14日提交的至今尚未公开的先前的法国专利申请05/12686中,本发明的发明人描述了用于表征具有生物活性的生物化学成分的方法,在存在微生物的情况下,通过分析低频电磁信号,所述方法提供了对现有技术的改进。所述方法还涉及包括以下步骤的生物学分析:记录与已知的生物化学成分相对应的电磁的或电的“标记”,并且将所述预先记录的“标记”与待表征的生物化学成分的“标记”相比较。所述方法包括过滤和稀释的步骤以便消除出现在初始试样中的微生物和单元,最强的稀释产生最强的电信号或电磁信号,而最少稀释试样往往不产生电信号或电磁信号。发明人还示出不同性质的微生物,如细菌和病毒,产生持续在水溶液中的“纳米结构”,并且正是这些“纳米结构”辐射电磁信号。所述“纳米结构”表现如同具有对于病毒而言小于0.02μm而对于常规尺寸的细菌而言小于0.1μm的尺寸的聚合物,并且具有介于1.12和1.30g/ml之间的密度。 [0005] 在本申请中描述的方法基于以下惊人的观测:在没有物理接触的情况下,包含细菌的或病毒的滤液的试样(弱稀释的并且在电信号或电磁信号的辐射方面为阴性)的密闭管的直观邻近区域,抑制由同一滤液的更强稀释的试样(在电信号或电磁信号的辐射方面初始为阳性)所产生的信号。在本申请中,该抑制将不加区别地称为“抑制效应”或“阻碍效应”(effetnégativant)。类似地,在本申请中,“抑制”和“阻碍”将被不加区别地使用并具有相似的含义。该观测促使发明人研究基于被感染的人体的相似的抑制现象。已观察到:在患有感染源的自身免疫微血管炎的病人身上,其血浆的稀释试样对于辐射电磁信号(下面表示为SEM)的E.coli(大肠杆菌)稀释滤液具有抑制效应,从而提示病人受到该病原体微生物或类似病原体微生物的慢性感染。还可发现前面示例中提到的患有微血管炎的病人,抑制从他/她的经过滤和稀释的血浆中辐射出的SEM,并且还抑制由存在于密闭管中的经过滤和稀释的E.coli的培养的试样所辐射的SEM。在这种情况下,阳性稀释液在病人手中接触5分钟或到距离50cm时经过10分钟就足以观察到抑制效应。 [0006] 因此该抑制能力同时涉及其自身血浆的辐射结构和特种细菌病原体微生物的辐射结构,这允许使用后者作为通用的鉴定方法。 [0007] 因此本发明可允许在尚未鉴定病原体微生物的疾病中确定细菌源或病毒源。 [0008] 本发明的第一目的涉及一种配制试剂的方法,所述试剂用于检测微生物、尤其用于检测人或动物中的感染的试验。根据其最广泛的含义,所述方法包括以下步骤: [0010] b)对在步骤a)中获得的上层清液进行过滤; [0011] c)配制一系列与在步骤b)中获得的滤液的递增稀释、直到滤液的至少10-15倍的稀释相对应的稀释试样; [0012] d)使在步骤c)中获得的稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场; [0013] e)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换之后对所述电信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录; [0014] f)选择在步骤e)中提供了特征电信号的稀释试样,特征电信号也就是幅度是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的信号; [0016] h)将步骤g)的所述稀释试样之一逐渐分配到两个管中,一个管T1,保留在保护所述稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护罩中,管T1将用作参照溶液,而另一个管T2也处于一个防护罩中,管T2在以后将面对或接触被怀疑包含所述选定的特种微生物的试样。 [0017] “针对所述选定的特种微生物存在与否而进行试验的试样”是指(i)疑为被所述选定的特种微生物感染的人或动物的个体,或者(ii)疑为包含所述选定的特种微生物的生物提取物、生物液体或人造液体,或者(iii)倾向于包含所述选定的特种微生物的食用、美容用或药用的成分。 [0018] 生物液体是指任何来自人或动物的液体,例如血液、尿液以及各种分泌物。人造液体是指任何允许微生物培养的重构液体,例如用于细菌、酵母菌、霉菌以及被病毒感染的细胞的培养基的各种肉汤培养液(bouillonsde culture)。 [0019] 本发明的另一个目的涉及一种在试样中检测微生物的系统。该系统包括: [0020] a)包含辐射特征电磁信号的参照试样的管T1,特征信号也就是幅度是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的信号; [0021] b)包含辐射特征电磁信号的试样的管T2,所述试样与所述管T1中包含的试样相同; [0022] c)保护所述管T1和T2免受极低频率的外部电磁场的干扰的防护罩; [0023] d)包含不呈现电磁信号辐射的核对溶液的管T3; [0024] e)电磁信号的接收设备。 [0025] 在检测时,管T2被设置为与针对选定的特种微生物的存在与否而进行试验的试样X相面对或接触。 [0026] 本发明的另一目的涉及一种在试样中检测微生物的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤: [0027] a)将应该被证实疑有微生物存在的试样X布置为面对如在根据权利要求1-3中任一项所述方法的步骤f)之后获得的试样,所述微生物例如是E.coli,如在步骤f)之后获得的所述试样是来自包含疑为存在于试样X中的所述微生物的培养或生物培养基的滤液的稀释液; [0028] b)将由在步骤a)中获得的、面对如在步骤f)之后获得的试样的试样X所辐射的电磁信号与由未受试样X影响的、如在步骤f)之后获得的相同试样的等分试样所辐射的电磁信号进行比较。 [0029] “试样X”是指(i)疑为被所述选定的特种微生物感染的人或动物的个体,或者(ii)疑为包含所述选定的特种微生物的生物提取物、生物液体或人造液体,或者(iii)倾向于包含所述选定的特种微生物的食用、美容用或药用的成分。 [0030] 根据本发明的方法允许(i)在必须有迅速和不扩散的响应的情况下(例如涉及检测禽流感病毒的情况),配制用于检测与慢性疾病相关的微生物的试验的和/或用于检测系统潜伏性感染的试剂,(ii)鉴定人或动物的感染。 [0031] 一旦已鉴定了致病微生物,就可以通过借助该微生物的特种寡核苷酸引物以实现超敏感PCR(聚合酶链反应)来确认该病原体微生物的存在。 [0032] 通过阅读后面的描述可更好地理解本发明,所述描述非限定性地示出根据本发明的方法的实施例。 [0034] 示例1:弱稀释的并且不辐射电磁信号的细菌培养“阻碍”来自相同培养的强稀释液所辐射的电磁信号 [0035] 1)试样的配制 [0036] E.coli(Escherichia coli,大肠杆菌)的以LB(Luria broth)培养基进行的培养被以8000rpm(每分钟转数)离心分离15分钟,以便除去细胞。然后细菌的上层清液在孔隙度为0.45μm的PEVD(极化电化学气相沉积)Millipore过滤器上被滤出,接着在孔隙度为0.1μm的Millipore过滤器上重新过滤。 [0037] 基于得到的E.coli培养的滤液(完全无菌),可通过在用于可注入配制的水中每-15次10倍地对滤液进行稀释直到10 来配制一系列稀释试样。在每次稀释之间,使用涡旋在15秒期间内对相继的稀释液进行强烈搅动。 [0038] 这些稀释后的试样被分配到多个1.5毫升的Eppendorf锥形塑料管中。液体的体积通常是1毫升。 [0039] 2)产生电磁信号的稀释试样的选择。 [0040] 对每个稀释试样进行低频电磁信号的辐射测试。 [0041] 用于检测SEM的方法包括旨在通过接受来自各个稀释试样的电磁场的螺线管来将所述电磁场转换成信号、尤其是电信号的步骤。 [0042] 从来自被分析的稀释试样的电磁场到电信号的转换被执行如下: [0043] (i)在检验期间使稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场; [0044] (ii)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换后对所述电信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录; [0045] (iii)将产生特征电信号的稀释试样的选择结果存放在保护所述稀释试样免受外部电磁场干扰的 材料的防护罩中,特征就是信号的幅度是由水所辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号具有向更大数值的频移)。 [0046] 使用在图1中示意性表示的设备来实现信号的检测。所述设备包括位于绝缘材料桌子上的、从0到20000赫兹敏感的螺线管读取单元1。用于步骤(ii)中的所述螺线管包括具有软铁心的线圈。该线圈具有300欧姆的阻抗、6毫米的内径、16毫米的外径以及6毫米的长度。磁性软铁心被设置为与包括待分析的稀释液的管的外壁相接触。 [0047] 要被读取的稀释试样被分配到1.5毫升的Eppendorf(商业名字)锥形塑料管2中。液体的体积通常是1毫升。 [0048] 特征电信号的采集是在预定时段(例如介于1和60秒之间)期间进行的。在本示例中,在6秒钟期间,每个试样被连续读取两次。 [0049] 螺线管发送的电信号被放大并且通过信号采集卡(声卡)4进行模拟-数字信号转换,所述信号采集卡4包括结合到计算机3的模拟-数字转换器。所述模拟-数字转换器的抽样频率是需要数字化的最大频率的两倍,例如44千赫兹。 [0051] 为了处理特征电信号,可使用例如Matlab和SigView(商业名字)的两个软件。已记录的数字文件可在需要时受到数字处理,例如:用于校准信号电平的数字放大、用于消除不需要的频率的过滤、计算频谱功率分布(英文缩写为PSD),然后通过仅保留例如从140赫兹到20千赫兹的频率带宽对该频谱功率进行截短(Matlab),或者通过Fourier(傅立叶)变换将该频谱功率转换成频率分量(SigView)。 [0052] 3)无辐射的弱稀释液对由有源稀释液产生的电磁信号辐射的抑制活动的评估。 [0053] 呈现特征电信号的稀释试样是稀释到10-8、10-9、10-10的试样。从10-2到10-6的稀释液是阴性的(图2)。 [0054] 将包含10-3的E.coli稀释液的等分试样的密闭管与包含10-8的E.coli稀释试样的等分试样的密闭管并排存放在一个罩中并在常温下存放24小时,该罩被 材-3料的磁屏蔽所包围。作为对比,制作了一个核对组。该核对组由包含10 的E.coli稀释试-8 样的等分试样的管和另一包含10 的E.coli稀释试样的等分试样的管构成,这两个管同上处理,但是存放在不同的并且彼此远离的 材料的罩中。在 材料的 罩中的存放消除了极低(5至100赫兹)的激励频率,但是未消除可能来自环境电磁噪声的较高频率。 [0055] 在24小时之后,如上述那样对包含稀释试样的管进行重新分析,从而得出与包含-3 -810 的稀释试样的等分试样的管并排的包含10 的稀释试样的等分试样的管不再辐射电磁-3 信号或辐射极弱。反之,所述核对组的管保持不变;被“保护”不与包含10 的稀释试样的-8 等分试样的管接触的、包含10 的稀释试样的等分试样的管对电磁信号的辐射而言保持阳性。 [0056] 本发明的重要特征是所观察到的阻碍效应是特殊的,也就是说无辐射的弱稀释试样和辐射电磁信号的强稀释试样来自相同的微生物种类。 [0057] 因此,辐射的稀释E.coli试样仅被无辐射的弱稀释E.coli试样所“阻碍”,而不被无辐射的弱稀释链球菌(Streptocoque)或葡萄球菌(Staphylocoque)试样所“阻碍”。类似地,辐射的稀释葡萄球菌试样仅被无辐射的弱稀释葡萄球菌试样所“阻碍”,而不被无辐射的弱稀释E.coli或链球菌试样所“阻碍”。 [0058] 示例2:人和动物中的感染的快速并且无扩散的检测方法 [0059] 1)包含微生物的生物液体或人造液体的试样的配制 [0060] 血液试样和大肠杆菌(E.coli)K1的以LB(Luria broth)培养基进行的悬浮培养被离心分离以便消除细胞,所述血液试样是在抗凝血剂(优选为肝素)的条件下从患有由细菌感染引起的神经病学的疾病的病人身上提取的。然后用RPMI培养基将得到的细菌上-2层清液和/或血浆稀释至10 。所述溶液在0.45μm的PEVD Millipore过滤器上被过滤,然后所述滤液在0.02μm的Whatman或0.1μm的Millipore过滤器上被重新过滤。 [0061] 基于被感染的个体的血浆的滤液和E.coli K1的培养的滤液,可通过在层流净化罩(hotte àflux laminaire)的条件下在用于可注入配制的水中每次10倍地进行稀释来-15配制一系列与递增稀释、直到10 的程度相对应的稀释试样。在每次稀释之间,使用涡旋在15秒期间内对相继的稀释液进行强烈搅动。 [0062] 然后稀释后的试样被分配到多个1.5毫升的Eppendorf锥形塑料管中。液体的体积通常是1毫升。 [0063] 2)产生电磁信号的稀释试样的选择。 [0064] 以与上面在第一示例、第二节中描述的方式相同的方式来实现辐射特征信号(信号的幅度是背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号的频率高于背景噪声)的稀释试样的选择。方法以及材料与上述的方法以及材料相同。因此,方法包括旨在通过接受来自各稀释液的电磁场的螺线管来将所述电磁场转换成信号、尤其是电信号的步骤。 [0065] 从来自被分析的稀释液的电磁场到电信号的转换被执行如下: [0066] (i)在检验期间使稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场; [0067] (ii)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换后对所述电信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录; [0068] (iii)将呈现特征电信号的稀释试样的选择结果存放在保护所述稀释试样免受外部电磁场干扰的防护罩中,上述特征就是信号的幅度是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号具有向更大数值的频移。 [0069] 3)被感染的个体对由微生物产生的电磁信号的辐射的抑制活动的评估。 [0070] 在前一步骤((iii)处)选择的稀释试样(来自被感染的个体的血浆的滤液、E.coli的培养的滤液的试样,也就是说具有特征电信号的滤出试样的稀释液),被分配(按照每管1毫升)到多个Eppendorf塑料管中并且保持在+4℃。通过将这样分配为等分试样的辐射SEM的稀释试样存放在防电磁场的罩中来使该稀释试样免受外部干扰。优选地,由材料实现的磁屏蔽包围罩,所述磁屏蔽将罩与来自环境中的极低频率的干扰场隔离开。 [0071] 辐射SEM的稀释试样之一(来自被感染的个体的血浆的滤液、E.coli的培养的滤液)被逐渐分配到两个管中,两管之一T1,保留在保护所述稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护罩中,T1管用作参照溶液;后面将受病人影响的另一管T2也被存放在一个防护罩中。所述防护罩优选被 材料实现的屏蔽所包围。 [0072] 图2示意性地表示在研究抑制效应时要被实现的步骤。抑制效应的研究被实现如下: [0073] a)包含参照溶液的管T1保持存放在被 材料实现的磁屏蔽包围的罩3中,因此管T1处在防止待检查的个体4的潜在恶化的位置,而管T2受到待检查的感染个体4的影响,存在于管T1和T2中的血浆来自于感染个体4,所述个体在预定时段期间(例如5分钟)将T2抓在其手5中。 [0074] b)管T2存放在用于接收电磁信号的设备中,优选是如前面在本示例的第二节中描述的螺线管读取单元; [0075] c)然后电信号被放大、处理、如前面在本示例的第二节中描述的那样进行模拟-数字信号转换; [0076] d)所述模拟-数字信号最终通过傅立叶变换被分解成谐波。 [0077] 比较对应于管T1的信号、对应于管T2的信号以及对应于包含水的管T3的信号(背景噪声)。 [0078] 下面的图示出在有源稀释液来自被检查的感染个体的血浆的情况下获得的结果: [0079] -图3示出由面对管T3的螺线管所检测到的电信号(背景噪声)的三维(Matlab)频率分布图; [0080] -图4示出由面对管1的螺线管所检测到的频谱的三维频率分布图; [0081] -图5示出由面对管2的螺线管所检测到的频谱的三维频率分布图; [0082] -图6示出同一背景噪声(供应电流的未经过滤的谐波)的傅立叶分析(SigView); [0083] -图7示出由面对管1的螺线管所检测到的信号的傅立叶分析; [0084] -图8示出由面对被待检查的个体持有的管2的螺线管所检测到的频谱的傅立叶分析。 [0085] 通过分别分析背景噪声(图3)和面对包含辐射SEM的参考溶液的管T1时获得的信号(图4)的三维频率分布图,出现向较高频率的移动。反之,当分析包含受待检查的个体影响的溶液的管T2时(图5),未发现向较高频率的移动;三维频率分布图示出管2的信号与针对背景噪声而获得的信号相似。 [0086] 对由管1产生的阳性频率的傅立叶分析(图7)显示了各个频率处的尖峰。按照信号的强度逐渐变小的顺序,以下频率处呈现信号:1000、2000、3000、4100、5100以及5500。反之,对管2的傅立叶分析显示了与通过对背景噪声的分析所获得的结果相似的结果:不论对于背景噪声,还是对于管T2,都观察不到任何有意义的尖峰。 [0087] 总之,这些分析允许作以下推断:被检查的个体具有对于由其自身血浆的稀释液所辐射的电磁信号的抑制能力。 [0088] 使用基于E.coli K1得到的参照溶液获得了类似的结果。 [0089] 因此,这种抑制能力同时涉及个体自身血浆的辐射结构和大肠杆菌的辐射结构,这提示个体已感染了产生接近大肠杆菌纳米结构的纳米结构的因子。 |