用于检测试样中的微生物的方法 |
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申请号 | CN200780030875.4 | 申请日 | 2007-06-22 | 公开(公告)号 | CN101506373A | 公开(公告)日 | 2009-08-12 |
申请人 | 纳内克蒂斯生物技术公司; | 发明人 | 吕克·蒙塔尼耶; 贾迈勒·艾萨; | ||||
摘要 | 本 发明 涉及一种配制 试剂 的方法,所述试剂用于检测 微 生物 、尤其用于检测人或动物中的感染的试验,其特征在于所述方法包括以下步骤:a)对包含 选定 的特种微生物的生物液体或人造液体的培养基进行离心分离;b)对在步骤a)中获得的上层清液进行过滤;c)配制一系列与在步骤b)中获得的滤液的递增稀释、直到滤液的至少10-15倍的稀释相对应的稀释试样;d)使在步骤c)中获得的稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场;e)在对通过螺线管检测到的电 信号 进行模拟/数字转换之后对所述 电信号 进行分析并且对所述电信号进行数字记录;f)选择在步骤e)中提供了特征电信号的稀释试样,特征电信号也就是幅度是由 水 辐射 的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的信号;g)将在步骤f)中选择的稀释试样引入防护罩中,防护罩保护所述稀释液免受外部电 磁场 的干扰;h)将步骤g)的所述稀释试样之一逐渐分配到两个管中,一个是T1,保留在保护所述稀释试样免受外部 电磁场 的干扰的一个防护罩中,该管用作参考溶液,而另一个管T2也处于防护罩中,该管后面将面对或 接触 怀疑包含所述选定的特种微生物的试样。 | ||||||
权利要求 | 1.一种配制试剂的方法,所述试剂用于检测微生物、尤其用于检测 人或动物中的感染的试验,其特征在于所述方法包括以下步骤: |
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说明书全文 | 本发明的目的是通过显现由待检查的个体对由微生物产生的电磁信 号的抑制来显现人和动物中的潜伏性感染。根据Jacques BENVENISTE医生的工作和专利申请WO 00/17637, 已知在借助计算机的声卡的模拟-数字转换之后,记录并数字化了具有生 物活性的分子的特征电信号。 还在现有技术(WO 09417406)中已知一种用于将生物活性从称作带 菌者的第一介质传送到称作目标的第二介质(不含所述带菌者介质的任何 痕量并在物理上与带菌者介质分离)的方法和设备,在开始时目标不具有 所述生物活性。该方法包括(i)使包括关注的生物活性的带菌者介质暴 露给电信号或电磁信号的传感器,(ii)放大辐射出的表示生物活性的特征 电磁信号或电信号,然后(iii)使目标介质暴露给电信号或电磁信号的辐 射器,所述辐射器通过传输和放大电路连接到所述传感器,以便将生物活 性的特征信号传送到所述目标。 在2005年12月14日提交的至今尚未公开的先前的法国专利申请 05/12686中,本发明的发明人描述了用于表征具有生物活性的生物化学成 分的方法,在存在微生物的情况下,通过分析低频电磁信号,所述方法提 供了对现有技术的改进。所述方法还涉及包括以下步骤的生物学分析:记 录与已知的生物化学成分相对应的电磁的或电的“标记”,并且将所述预 先记录的“标记”与待表征的生物化学成分的“标记”相比较。所述方法 包括过滤和稀释的步骤以便消除出现在初始试样中的微生物和单元,最强 的稀释产生最强的电信号或电磁信号,而最少稀释试样往往不产生电信号 或电磁信号。发明人还示出不同性质的微生物,如细菌和病毒,产生持续 在水溶液中的“纳米结构”,并且正是这些“纳米结构”辐射电磁信号。 所述“纳米结构”表现如同具有对于病毒而言小于0.02μm而对于常规尺 寸的细菌而言小于0.1μm的尺寸的聚合物,并且具有介于1.12和1.30g/ml 之间的密度。 在本申请中描述的方法基于以下惊人的观测:在没有物理接触的情况 下,包含细菌的或病毒的滤液的试样(弱稀释的并且在电信号或电磁信号 的辐射方面为阴性)的密闭管的直观邻近区域,抑制由同一滤液的更强稀 释的试样(在电信号或电磁信号的辐射方面初始为阳性)所产生的信号。 在本申请中,该抑制将不加区别地称为“抑制效应”或“阻碍效应”(effet négativant)。类似地,在本申请中,“抑制”和“阻碍”将被不加区别地 使用并具有相似的含义。该观测促使发明人研究基于被感染的人体的相似 的抑制现象。已观察到:在患有感染源的自身免疫微血管炎的病人身上, 其血浆的稀释试样对于辐射电磁信号(下面表示为SEM)的E.coli(大 肠杆菌)稀释滤液具有抑制效应,从而提示病人受到该病原体微生物或类 似病原体微生物的慢性感染。还可发现前面示例中提到的患有微血管炎 的病人,抑制从他/她的经过滤和稀释的血浆中辐射出的SEM,并且还抑 制由存在于密闭管中的经过滤和稀释的E.coli的培养的试样所辐射的 SEM。在这种情况下,阳性稀释液在病人手中接触5分钟或到距离50cm 时经过10分钟就足以观察到抑制效应。 因此该抑制能力同时涉及其自身血浆的辐射结构和特种细菌病原体 微生物的辐射结构,这允许使用后者作为通用的鉴定方法。 因此本发明可允许在尚未鉴定病原体微生物的疾病中确定细菌源或 病毒源。 本发明的第一目的涉及一种配制试剂的方法,所述试剂用于检测微生 物、尤其用于检测人或动物中的感染的试验。根据其最广泛的含义,所述 方法包括以下步骤: a)对包含选定的特种微生物的生物液体或人造液体的培养基进行离 心分离; b)对在步骤a)中获得的上层清液进行过滤; c)配制一系列与在步骤b)中获得的滤液的递增稀释、直到滤液的至 少10-15倍的稀释相对应的稀释试样; d)使在步骤c)中获得的稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场; e)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换之后对所述电 信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录; f)选择在步骤e)中提供了特征电信号的稀释试样,特征电信号也就 是幅度是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的 频移的信号; g)将在步骤f)中选择的稀释试样引入防护罩中,所述防护罩保护所 述稀释液免受极低频率的外部电磁场的干扰; h)将步骤g)的所述稀释试样之一逐渐分配到两个管中,一个管T1, 保留在保护所述稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护罩中,管T1 将用作参照溶液,而另一个管T2也处于一个防护罩中,管T2在以后将 面对或接触被怀疑包含所述选定的特种微生物的试样。 “针对所述选定的特种微生物存在与否而进行试验的试样”是指(i) 疑为被所述选定的特种微生物感染的人或动物的个体,或者(ii)疑为包 含所述选定的特种微生物的生物提取物、生物液体或人造液体,或者(iii) 倾向于包含所述选定的特种微生物的食用、美容用或药用的成分。 生物液体是指任何来自人或动物的液体,例如血液、尿液以及各种分 泌物。人造液体是指任何允许微生物培养的重构液体,例如用于细菌、酵 母菌、霉菌以及被病毒感染的细胞的培养基的各种肉汤培养液(bouillons de culture)。 本发明的另一个目的涉及一种在试样中检测微生物的系统。该系统包 括: a)包含辐射特征电磁信号的参照试样的管T1,特征信号也就是幅度 是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的 信号; b)包含辐射特征电磁信号的试样的管T2,所述试样与所述管T1中 包含的试样相同; c)保护所述管T1和T2免受极低频率的外部电磁场的干扰的防护 罩; d)包含不呈现电磁信号辐射的核对溶液的管T3; e)电磁信号的接收设备。 在检测时,管T2被设置为与针对选定的特种微生物的存在与否而进 行试验的试样X相面对或接触。 本发明的另一目的涉及一种在试样中检测微生物的方法,其特征在 于,所述方法包括以下步骤: a)将应该被证实疑有微生物存在的试样X布置为面对如在根据权利 要求1-3中任一项所述方法的步骤f)之后获得的试样,所述微生物例如是 E.coli,如在步骤f)之后获得的所述试样是来自包含疑为存在于试样X中 的所述微生物的培养或生物培养基的滤液的稀释液; b)将由在步骤a)中获得的、面对如在步骤f)之后获得的试样的试样 X所辐射的电磁信号与由未受试样X影响的、如在步骤f)之后获得的相同 试样的等分试样所辐射的电磁信号进行比较。 “试样X”是指(i)疑为被所述选定的特种微生物感染的人或动物 的个体,或者(ii)疑为包含所述选定的特种微生物的生物提取物、生物 液体或人造液体,或者(iii)倾向于包含所述选定的特种微生物的食用、 美容用或药用的成分。 根据本发明的方法允许(i)在必须有迅速和不扩散的响应的情况下 (例如涉及检测禽流感病毒的情况),配制用于检测与慢性疾病相关的微 生物的试验的和/或用于检测系统潜伏性感染的试剂,(ii)鉴定人或动物 的感染。 一旦已鉴定了致病微生物,就可以通过借助该微生物的特种寡核苷酸 引物以实现超敏感PCR(聚合酶链反应)来确认该病原体微生物的存在。 通过阅读后面的描述可更好地理解本发明,所述描述非限定性地示出 根据本发明的方法的实施例。 附图对应于非限定性的实施例。 示例1:弱稀释的并且不辐射电磁信号的细菌培养“阻碍”来自相同 培养的强稀释液所辐射的电磁信号 1)试样的配制 E.coli(Escherichia coli,大肠杆菌)的以LB(Luria broth)培养基 进行的培养被以8000rpm(每分钟转数)离心分离15分钟,以便除去细 胞。然后细菌的上层清液在孔隙度为0.45μm的PEVD(极化电化学气相 沉积)Millipore过滤器上被滤出,接着在孔隙度为0.1μm的Millipore过 滤器上重新过滤。 基于得到的E.coli培养的滤液(完全无菌),可通过在用于可注入配 制的水中每次10倍地对滤液进行稀释直到10-15来配制一系列稀释试样。 在每次稀释之间,使用涡旋在15秒期间内对相继的稀释液进行强烈搅动。 这些稀释后的试样被分配到多个1.5毫升的Eppendorf锥形塑料管 中。液体的体积通常是1毫升。 2)产生电磁信号的稀释试样的选择。 对每个稀释试样进行低频电磁信号的辐射测试。 用于检测SEM的方法包括旨在通过接受来自各个稀释试样的电磁场 的螺线管来将所述电磁场转换成信号、尤其是电信号的步骤。 从来自被分析的稀释试样的电磁场到电信号的转换被执行如下: (i)在检验期间使稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场; (ii)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换后对所述电 信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录; (iii)将产生特征电信号的稀释试样的选择结果存放在保护所述稀释 试样免受外部电磁场干扰的材料的防护罩中,特征就是信号的 幅度是由水所辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号具有向更大数 值的频移)。 使用在图1中示意性表示的设备来实现信号的检测。所述设备包括位 于绝缘材料桌子上的、从0到20000赫兹敏感的螺线管读取单元1。用于 步骤(ii)中的所述螺线管包括具有软铁心的线圈。该线圈具有300欧姆 的阻抗、6毫米的内径、16毫米的外径以及6毫米的长度。磁性软铁心被 设置为与包括待分析的稀释液的管的外壁相接触。 要被读取的稀释试样被分配到1.5毫升的Eppendorf(商业名字)锥 形塑料管2中。液体的体积通常是1毫升。 特征电信号的采集是在预定时段(例如介于1和60秒之间)期间进 行的。在本示例中,在6秒钟期间,每个试样被连续读取两次。 螺线管发送的电信号被放大并且通过信号采集卡(声卡)4进行模拟 -数字信号转换,所述信号采集卡4包括结合到计算机3的模拟-数字转 换器。所述模拟-数字转换器的抽样频率是需要数字化的最大频率的两 倍,例如44千赫兹。 与转换后的电信号相对应的数字文件被以声音文件的形式记录在大 容量的存储器中,所述声音文件例如是WAV(波形声音文件)格式的文 件。 为了处理特征电信号,可使用例如Matlab和SigView(商业名字) 的两个软件。已记录的数字文件可在需要时受到数字处理,例如:用于校 准信号电平的数字放大、用于消除不需要的频率的过滤、计算频谱功率分 布(英文缩写为PSD),然后通过仅保留例如从140赫兹到20千赫兹的 频率带宽对该频谱功率进行截短(Matlab),或者通过Fourier(傅立叶) 变换将该频谱功率转换成频率分量(SigView)。 3)无辐射的弱稀释液对由有源稀释液产生的电磁信号辐射的抑制活 动的评估。 呈现特征电信号的稀释试样是稀释到10-8、10-9、10-10的试样。从10-2 到10-6的稀释液是阴性的(图2)。 将包含10-3的E.coli稀释液的等分试样的密闭管与包含10-8的E.coli 稀释试样的等分试样的密闭管并排存放在一个罩中并在常温下存放24小 时,该罩被材料的磁屏蔽所包围。作为对比,制作了一个核对 组。该核对组由包含10-3的E.coli稀释试样的等分试样的管和另一包含 10-8的E.coli稀释试样的等分试样的管构成,这两个管同上处理,但是存 放在不同的并且彼此远离的材料的罩中。在材料的 罩中的存放消除了极低(5至100赫兹)的激励频率,但是未消除可能来 自环境电磁噪声的较高频率。 在24小时之后,如上述那样对包含稀释试样的管进行重新分析,从 而得出与包含10-3的稀释试样的等分试样的管并排的包含10-8的稀释试样 的等分试样的管不再辐射电磁信号或辐射极弱。反之,所述核对组的管保 持不变;被“保护”不与包含10-3的稀释试样的等分试样的管接触的、包 含10-8的稀释试样的等分试样的管对电磁信号的辐射而言保持阳性。 本发明的重要特征是所观察到的阻碍效应是特殊的,也就是说无辐射 的弱稀释试样和辐射电磁信号的强稀释试样来自相同的微生物种类。 因此,辐射的稀释E.coli试样仅被无辐射的弱稀释E.coli试样所“阻 碍”,而不被无辐射的弱稀释链球菌(Streptocoque)或葡萄球菌 (Staphylocoque)试样所“阻碍”。类似地,辐射的稀释葡萄球菌试样仅 被无辐射的弱稀释葡萄球菌试样所“阻碍”,而不被无辐射的弱稀释E.coli 或链球菌试样所“阻碍”。 示例2:人和动物中的感染的快速并且无扩散的检测方法 1)包含微生物的生物液体或人造液体的试样的配制 血液试样和大肠杆菌(E.coli)K1的以LB(Luria broth)培养基进 行的悬浮培养被离心分离以便消除细胞,所述血液试样是在抗凝血剂(优 选为肝素)的条件下从患有由细菌感染引起的神经病学的疾病的病人身上 提取的。然后用RPMI培养基将得到的细菌上层清液和/或血浆稀释至 10-2。所述溶液在0.45μm的PEVD Millipore过滤器上被过滤,然后所 述滤液在0.02μm的Whatman或0.1μm的Millipore过滤器上被重新 过滤。 基于被感染的个体的血浆的滤液和E.coli K1的培养的滤液,可通过 在层流净化罩(hotte à flux laminaire)的条件下在用于可注入配制的水 中每次10倍地进行稀释来配制一系列与递增稀释、直到10-15的程度相对 应的稀释试样。在每次稀释之间,使用涡旋在15秒期间内对相继的稀释 液进行强烈搅动。 然后稀释后的试样被分配到多个1.5毫升的Eppendorf锥形塑料管 中。液体的体积通常是1毫升。 2)产生电磁信号的稀释试样的选择。 以与上面在第一示例、第二节中描述的方式相同的方式来实现辐射特 征信号(信号的幅度是背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号的频率高于背 景噪声)的稀释试样的选择。方法以及材料与上述的方法以及材料相同。 因此,方法包括旨在通过接受来自各稀释液的电磁场的螺线管来将所述电 磁场转换成信号、尤其是电信号的步骤。 从来自被分析的稀释液的电磁场到电信号的转换被执行如下: (i)在检验期间使稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场; (ii)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换后对所述电 信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录; (iii)将呈现特征电信号的稀释试样的选择结果存放在保护所述稀释 试样免受外部电磁场干扰的防护罩中,上述特征就是信号的幅度是由水辐 射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号具有向更大数值的频移。 3)被感染的个体对由微生物产生的电磁信号的辐射的抑制活动的评 估。 在前一步骤((iii)处)选择的稀释试样(来自被感染的个体的血浆 的滤液、E.coli的培养的滤液的试样,也就是说具有特征电信号的滤出试 样的稀释液),被分配(按照每管1毫升)到多个Eppendorf塑料管中并 且保持在+4℃。通过将这样分配为等分试样的辐射SEM的稀释试样存 放在防电磁场的罩中来使该稀释试样免受外部干扰。优选地,由 材料实现的磁屏蔽包围罩,所述磁屏蔽将罩与来自环境中的极 低频率的干扰场隔离开。 辐射SEM的稀释试样之一(来自被感染的个体的血浆的滤液、E.coli 的培养的滤液)被逐渐分配到两个管中,两管之一T1,保留在保护所述 稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护罩中,T1管用作参照溶液; 后面将受病人影响的另一管T2也被存放在一个防护罩中。所述防护罩优 选被材料实现的屏蔽所包围。 图2示意性地表示在研究抑制效应时要被实现的步骤。抑制效应的研 究被实现如下: a)包含参照溶液的管T1保持存放在被材料实现的磁屏蔽 包围的罩3中,因此管T1处在防止待检查的个体4的潜在恶化的位置, 而管T2受到待检查的感染个体4的影响,存在于管T1和T2中的血浆来 自于感染个体4,所述个体在预定时段期间(例如5分钟)将T2抓在其 手5中。 b)管T2存放在用于接收电磁信号的设备中,优选是如前面在本示例 的第二节中描述的螺线管读取单元; c)然后电信号被放大、处理、如前面在本示例的第二节中描述的那 样进行模拟-数字信号转换; d)所述模拟-数字信号最终通过傅立叶变换被分解成谐波。 比较对应于管T1的信号、对应于管T2的信号以及对应于包含水的 管T3的信号(背景噪声)。 下面的图示出在有源稀释液来自被检查的感染个体的血浆的情况下 获得的结果: -图3示出由面对管T3的螺线管所检测到的电信号(背景噪声)的 三维(Matlab)频率分布图; -图4示出由面对管1的螺线管所检测到的频谱的三维频率分布图; -图5示出由面对管2的螺线管所检测到的频谱的三维频率分布图; -图6示出同一背景噪声(供应电流的未经过滤的谐波)的傅立叶分 析(SigView); -图7示出由面对管1的螺线管所检测到的信号的傅立叶分析; -图8示出由面对被待检查的个体持有的管2的螺线管所检测到的频 谱的傅立叶分析。 通过分别分析背景噪声(图3)和面对包含辐射SEM的参考溶液的 管T1时获得的信号(图4)的三维频率分布图,出现向较高频率的移动。 反之,当分析包含受待检查的个体影响的溶液的管T2时(图5),未发现 向较高频率的移动;三维频率分布图示出管2的信号与针对背景噪声而获 得的信号相似。 对由管1产生的阳性频率的傅立叶分析(图7)显示了各个频率处的 尖峰。按照信号的强度逐渐变小的顺序,以下频率处呈现 信号:1000、2000、3000、4100、5100以及5500。反之,对管2的傅立 叶分析显示了与通过对背景噪声的分析所获得的结果相似的结果:不论对 于背景噪声,还是对于管T2,都观察不到任何有意义的尖峰。 总之,这些分析允许作以下推断:被检查的个体具有对于由其自身血 浆的稀释液所辐射的电磁信号的抑制能力。 使用基于E.coli K1得到的参照溶液获得了类似的结果。 因此,这种抑制能力同时涉及个体自身血浆的辐射结构和大肠杆菌的 辐射结构,这提示个体已感染了产生接近大肠杆菌纳米结构的纳米结构的 因子。 |