血液、血浆或滑液制品的抗凝处理

本发明涉及用可以适度地与钙结合的抗凝剂对血液、血浆或滑液制 品进行抗凝处理，以及任意地用一种可溶性钙盐把钙离子活性调节到生 理水平的方法。 背景

生物液体，具体说，血液、淋巴、滑液及脑液以及上述液体的无细 胞制剂，如血浆，可以在流变学，即粘性-弹性，性质上发生激烈的变 化。这些液体可以从一种流变学性质与水相似的液体转变为一种流变学 性质与松软干酪更相似的凝胶状物质。上述流变学转变，通常被称为凝 固或凝块，可以在生物液体被从其天然环境中取出并收集于某种人造容 器中时发生。

为了防止在收集生物液体时发生凝固，应该添加一些具有抗凝特性 的物质。被用于抑制凝固的物质，也称抗凝剂，包括草酸盐、EDTA、 柠檬酸盐、肝素及水蛭素。这些抗凝剂或是能对参与凝固作用的酯产生 特异性抑制作用，或是可以改变生物液体中的条件，从而使凝固过程无 法进行。这些条件包括自由钙离子浓度，也称Ca2+活性，以及pH。

根据已有的理论，一些抗凝剂的作用机制是：抗凝剂与Ca2+离子形 成复合物从而使生物溶液中自由Ca2+的水平，也即Ca2+活性降低到一个 无效的水平。因此可以理解，凝固过程需要有一定水平的Ca2+活性才能 进行。本发明具体涉及的是后面一种抗凝作用，即当钙活性低于0.8mM 或pH值低于7时，凝固作用受到阻碍。

如果是通过降低Ca2+活性来对生物液体进行抗凝处理，那么通过添 加Ca2+，如CaCl2溶液，来使钙活性恢复到允许凝固的水平即可使生物 溶液恢复到可凝固状态。

以可逆的方式，即以允许液体恢复到可凝固状态的形式，来对生物 液体进行抗凝处理的过程是液体凝固活动分析所常用、也是所必需的。 草酸盐、EDTA、柠檬酸盐是一些根据已有工艺通过降低生物液体中的 Ca2+活性来行使功能的抗凝剂的例子。另外，根据已有工艺，任何能够 充分地降低生物液体中的Ca2+活性的物质都可以充当抗凝剂。

根据已有工艺，所有通过降低Ca2+活性而充当抗凝剂的物质形成相 对稳定的Ca2+复合物，这些复合物的特征在于其表观解离常数等于或小 于0.5mM。例如，柠檬酸盐与EDTA是这类抗凝剂中最常用的，其中 的柠檬酸盐所形成的Ca2+复合物在生理状态下的表观解离常数是大约 为4mM。Ca2+EDTA复合物及Ca2+草酸盐复合物被认为结合得较紧 密。

如上所讨论的，生物液体中凝固分析物的分析通常采用的是经过柠 檬酸盐抗凝处理的样品。由于柠檬酸盐对Ca2+的亲和力相对较低，所以 使用最少量的柠檬酸盐进行抗凝，从导致生物溶液中蛋白及磷脂-蛋白 结构的变性和脱稳定来考虑，用柠檬酸盐进行抗凝是温和的。然而，用 柠檬酸盐进行抗凝被认为有一些不利影响。例如，在经过柠檬酸盐处理 的血液或血浆中的凝血因子VIII，比起血液循环中的，稳定性就比较 差。另外，对经过柠檬酸盐处理的血液或血浆进行激活凝血酶原时间 (activated prothrombin time，APTT)分析，结果表明稳定性有限。 因此，根据已有工艺，一些凝固分析物显示了一定程度的不稳定性，这 需要在临床实验的常规操作给予特别的考虑。这些更加严格的常规操作 给医疗实验步骤增加了费用和不便。

当用一种经过抗凝处理的生物液体样品进行各种不同的凝固活性 分析时，将样品与包括Ca2+的试剂混合。所添加的Ca2+的数量应该足以 使反应混合物中Ca2+的浓度处于0.8至8mM的范围，在上述条件下凝 固活性得以表现。

虽然通常都是首先通过降低Ca2+活性来对一生物液体进行抗凝处 理，但这一过程在某些方面并不合用。例如，如上所讨论的，一些我们 所关心的结构变性了或变得不稳定了。另外，在一个给定的过程中，不 可能用添加Ca2+来完全平衡添加抗凝剂的影响。重新被钙化的样品中的 Ca2+与天然液体中的很可能会有所不同，而且，在一系列此种液体的样 品中，Ca2+活性的变化比起其在原来的天然液体中的变化还要大。被重 新钙化的生物液体中的钙活性偏离天然水平，也即生理水平的偏差最可 能对凝固化验系统及其结果产生不合需要的影响。

一个与通过Ca2+的减少而造成的抗凝作用产生实际问题相关的医 疗领域是血液库存行业。待被用于输血的血液或血浆通常都是经过抗凝 处理的。这是因为，凭借目前的技术，天然的血液或血浆在有机体外只 能被处理很短的一段时间内而不致凝固。

由于柠檬酸盐毒性低、新陈代谢快而且具有良好的抗凝特性，所以 它是血液库存行业通常使用的抗凝剂。在许多情形中，在输血用血液或 血浆中柠檬酸的含量并不致给受血的患者造成不利影响。但在一些情形 中，特别是当患者肝功能失调时，用柠檬酸盐抗凝的血液及血浆就不能 很好地被耐受。由于柠檬酸盐在这些患者中代谢缓慢，所以它会使Ca2+活性显著降低从而导致痉挛和肠胃不适。

需要有一种对血液、血浆及滑液制品进行抗凝处理的改善的方法， 用以改善这些制品被用于运输和贮存、输血、止血及凝血特性分析时的 特性。

本发明的描述

本发明提供了一种对血液、血浆及滑液制品进行抗凝处理的方法。 该方法包括异柠檬酸盐，以及供选的可溶性钙盐的添加。

本发明的方法对于完成，例如，如下过程是有用的：

1)增加经过抗凝处理的制品中的凝固分析物的稳定性并减少其变 性，2)使凝固分析物的化验系统中的Ca2+活性更接近生理水平并减小 Ca2+活性的偏差，3)当经过柠檬酸盐抗凝处理的血液或血浆被输注给 患者时，减少Ca2+的降低效果。

因此，本发明的一个方面涉及的是一种对血液、血浆或滑液制品进 行抗凝处理的方法。它包括把有效剂量的异柠檬酸盐加入到制品中的步 骤。

在本发明这一方面的一个实施例中，这一方法另外还包括用一可溶 性钙盐把经过抗凝处理的制品中钙离子的活性调节到生理水平的步 骤。

在本上下文中所提及的是，可以通过添加柠檬酸盐或其它与钙结合 的物质来降低本发明的经过抗凝处理的制品中钙离子的活性，而且也可 根据特定的目的对pH进行调整。

在本发明这一方面的一个优选实施例中，异柠檬酸盐的有效用量是 每升血液制品含5-50mmol或者每升血浆或滑液制品含7-70mmol， 而在一个最优选的实施例中，异柠檬酸盐的用量是每升血液制品含15 -25mmol，或者每升血浆或滑液制品含25-35mmol。

本发明的另一方面涉及的是一种含有抗凝剂量的由异柠檬酸盐组 成的抗凝剂的血液、血浆或胃液制品。

在本发明这一方面的一个实施例中，抗凝剂除了包含异柠檬酸盐以 外，还包含有柠檬酸盐。

在本发明这一方面的一个优选实施例中，异柠檬酸盐的抗凝剂量是 每升血液样品含5-50mmol或者每升血浆或滑液制品含7-70mmol， 而在一个最优选的实施例中，异柠檬酸盐的抗凝数量是每升血液制品含 15-25mmol或者每升血浆或滑液制品含25-35mmol。

本发明的另一方面涉及的是把根据本发明的血液、血浆或滑液制品 用于运输及贮存。被运输及贮存的血液、血浆或滑液制品随后可以被直 接用于输注给患者。

本发明的另外一个方面涉及的是把根据本发明的血液、血浆或滑液 制品用于这些制品的止血或凝固特性的分析，即用于诊断目的。

本发明的另一方面涉及的是一个含有一等渗或轻微高渗的异柠檬 酸盐溶液的血样采样容器。

本发明的血液采样容器的另外一个实施例包含有一个十分之一容 器体积的0.1-0.5M的异柠檬酸盐溶液。

根据本发明的血液采样容器除了含有异柠檬酸盐之外，另外还可以 包含使钙离子的最终活性达到大约1mM的有效剂量的氯化钙。

本发明的血液采样容器优选地是常规的，任意地是抽真空的，用于 处理血液及血浆制品的试管、注射器或塑料袋，它们随时可被送到负责 血液采样及分析的实验室。

本发明的另外一个方面涉及的是用于对包含有异柠檬酸盐的血 液、血浆或滑液制品进行分析的试剂。这些试剂应被放置于带有标签和 使用说明的容器中。

附图的描述

图1.在凝血酶原复合物(Prothrombin Complex，PK)系统中加入柠 檬酸盐，不加柠檬酸盐(实心圆)，5mmol/L柠檬酸盐(空心圆)， 10mmol/L柠檬酸盐(实心三角形)以及20mmol/L柠檬酸盐(空心三角 形)后的凝血酶原复合物(PK)时间。通过电位来确定每一数据点的 钙活性。所有的实验点代表合并的血浆。

图2.在凝血酶原复合物(Prothrombin Complex，PK)系统中加入异 柠檬酸盐，不加异柠檬酸盐(实心圆)，5mmol/L异柠檬酸盐(空心圆)， 10mmol/L异柠檬酸盐(实心三角形)以及20mmol/L异柠檬酸盐(空心 三角形)后的凝血酶原复合物(PK)时间。通过电位来确定每一数据 点的钙活性。所有的实验点代表合并的血浆。

图3.在凝血酶原复合物(PK)系统中加入配体，柠檬酸盐(实心圆)， 异柠檬酸盐(空心圆)后的凝血酶原复合物(PK)时间。每一数据点 的钙活性是大约2mmol/L。所有的实验点代表合并的血浆。

图4.在一个用于凝固分析的系统中Ca2+的缓冲能力。在1至4mm的 Ca2+活性范围确定其缓冲能力。所得的是最终加入5mM柠檬酸盐或异 柠檬酸盐的结果。

图5.在一个用于凝固分析的系统中Ca2+的缓冲能力。在1至4mM的 Ca2+活性范围确定其缓冲能力。所得的是最终加入10mM柠檬酸盐或异 柠檬酸盐的结果。

图6.被收集于混合物中的血液中凝血因子VIII复合物的稳定性，其中 上述的混合物含有0.05mol/L的柠檬酸盐及0.08mol/L异柠檬酸盐(实 心圆)，0.20mol/L异柠檬酸盐(空心圆)以及0.13mol/L柠檬酸(三 角形)。把血液于室温下分别贮存0.5小时，6小时，1天及2天后把 血浆分离出来并确定其中的凝血因子VIII复合物的活性。所有的实验点 代表的都是从5个受试者收集的血样的平均结果。

图7.被收集于混合物中的血液中激活部分促凝血酶原激酶时间 (activated partial thromboplastin time，APTT)的稳定性，其中上 述的混合物分别含有0.05mol/L的柠檬酸盐及0.08mol/L异柠檬酸盐(实 心圆)，0.20mol/L异柠檬酸盐(空心圆)以及0.13mol/L柠檬酸盐(三 角形)。把血液于室温下分别贮存0.5小时、6小时、1天及2天后把 血浆分离出来并确定其中的APTT。所有的实验点代表的都是从5个受 试者收集的血样的平均结果。

图8.被收集于混合物中的血液中凝血酶原时间，PT，的稳定性，其中 上述的混合物分别含有0.05mol/L的柠檬酸盐及0.08mol/L的异柠檬酸 盐(实心圆)，0.20mol/L异柠檬酸盐(空心圆)以及0.13mol/L柠檬 酸盐(三角形)。把血液于室温下分别贮存0.5小时、6小时、1天及 2天后把血浆分离出来并确定其中的PT。所有的实验点代表的都是从5 个受试者收集的血样的平均结果。

实验的描述 材料及方法

遵从生产商的建议使用以下试剂来确定激活部分促凝血酶原激酶 时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶原复合物(PK)化 验、凝血因子VIII及血纤蛋白D-二聚体：PTT Automate，Diagnostica Stago，Asnieres-sur-Seine，France；ThromborelS，Behring Diagnostics GmbH，Marburg，Germany；PK-reagent GHI129，Global Hemostasis Institute MGR，Linkoping，Sweden；and Coamatic Factor VIII， Chromogenix，Molndal，Sweden。试验是在-Automated Coagulation Laboratory instrument，ACL，model810 (Instrumentation Laboratory， Milan，Italy)上进行的。

用一内含0.5mL抗凝剂的Monovette(Sarstedt，Numbrect， Germany)管从肘前静脉抽取4.5mL血液。Monovette管含有根据已 有工艺的抗凝剂。当用根据本发明的抗凝剂进行各种不种的实验时，把 Monovette管打开并把原来的抗凝剂去除，然后用0.15M NaCl漂洗管 子，并装入0.5mL选定的抗凝剂。把2mL经过抗凝处理的血液于8000xg 离心3分钟获得血浆，然后把血浆转移到一个塑料管中。在一些实验中， 上述血浆将在-70℃被保存20天以上，然后再被用于分析。例7中经过 柠檬酸盐抗凝处理的血浆来源于22个健康个人及120个患者，其显示 身份的标签已被除去，是蒙Tomas Lindahl允许由Department of Clinical Chemistry and Laboratory of Clinical Chemistry， University Hospital，Linkoping，慷慨馈赠的礼物。来源于健康个人的 血浆在分析前于-70℃贮存了大约六个月的时间。来源于患者的血浆则 在收集后6个小时内即被分析。

DL-异柠檬酸三钠，邻苯二甲酸、2，6-二氨基嘌呤(半硫酸盐)， 反乌头酸、均丙三羧酸、以及膘嘌呤分别是Sigma Chemical Co.St Louis，MO的产品I-1252，P-2944，D-3289，A-7376，T -9251，以及A-8626；CaCl2柠檬酸及草酸分别是Merck，Darmstadt， Germany的产品2382，244及495；柠檬酸三钠是Riedel-de Haen， Seelze，Germany的产品32320；乙酸乙酯是BDH，England的产品 10108；甲基丙二酸是Fluka AG，Buchs SG，Switzerland的产品17503 43；二甲基丙二酸是Aldrich-Chemie，Steinheim，Germany的产品D16 800-9。亚氨基二乙酸盐是Ega-Chemie KG，Steinhein bei Heidenheim，Germany产品号120-0。

把异柠檬酸三钠溶于最少量的稀释盐酸中以36％的产率制备异柠 橡酸，其pH值介于0至1之间，用乙酸乙酯重复提取5次并干燥。缺 乏维生素K依赖型凝血因子的牛血清及兔脑促凝血酶原激酶是来源于 上面所详细描述的PK-试剂GHI129的相应组份。血浆中Ca2+活性及 pH是用一ICA2(Radiometer，Copenhagen，Denmark)装置通过电位 确定的。 例1

为了鉴定可以充当生理水平Ca2+，即大约1.3mM的Ca2+，的缓冲液 的化合物，通过实验试验了已报导的解离常数介于0.5至5mM之间或 者引起兴趣的水溶性化合物。下面把这些化合物称为Ca2+配体或简单地 称为配体，进行下面所描述的实验以推断在与生理相似的条件以及在对 Ca2+缓冲有用的配体浓度下的表观解离常数。

把含有20mM Hepes的200mM的配体溶液调到pH7.4并把它与 等体积的100mM CaCl2溶液相混合。用0.15mM的NaCl把这些混合 物按1∶2，1∶4，1∶8，及1∶16稀释。通过电位确定所有的 Ca2+活性低于10mM且pH介于7.0至7.6之间的混合液及稀释液的Ca2+活性及pH。根据通过实验确定的Ca2+活性以及配体和Ca2+的化学当量 水平可以确定出Ca*配体复合物的推定的表观解离常数(取所有可供数 据的平均值)。在表1中给出了每一个配体的平均值及标准偏差(SD)、 被平均的测定次数(n)以及己发表的估计值。 表1 配体              kd±S.D.           n     已发表的估计值

              (mM)                     (mM) 甲基丙二酸盐      22±3              3     22.4(于0.1M NaClO4中) 草酸盐(沉淀)                               5.0(于0.1M KNO3中) 亚氨基二乙酸盐    29±12             2     8.1(于1M KNO3中) 二甲基丙二酸盐    25±73                   30.2(于0.1M NaClO4中) 邻苯二甲酸盐      26±73                   3.9(于0.1M KCl中) 2，6-二氨基嘌呤   50±24             2     1.6(于0.1M KNO3中) 腺嘌呤            70±40             2     1.1(于0.1M KNO3中) 反乌头酸盐        29±53 均丙三羧酸盐      22±53 异柠檬酸盐        4.5±0.6           5 柠檬酸盐          0.5±0.05          4     0.58

实验表明，在我们所选择的化合物中，只有柠檬酸盐和异柠檬酸盐 这两种化合物能够形成表观解离常数接近生理Ca2+活性水平，即大约 1.5mM的复合物。随后把这两种配体充当Ca2+缓冲物质及抗凝剂进一步 进行试验。然而，完全可以找到具有所要求亲和力的其他配体。具体地， 对上述物质的比如，甲基化、卤化、硝化及羟基化衍生物进行试验是属 于本发明的范围之内的。更具体地，带着亲电基团的柠檬酸盐衍生物， 即在其三羧基碳骨架上附带有氟基、氯基或硝基的衍生物，可能会具有 所要求的特性。其推理是亲电基团可以减少羧基的电子密度从而削弱它 们与Ca2+相互作用的能力。

对于几种配体，如甲基丙二酸盐、二甲基丙二酸盐及柠檬酸盐，我 们所估计的解离常数值与已发表的值是相似的。对于其它的配体，具体 是邻苯二甲酸盐、2，6-二氨基嘌呤及腺嘌呤，已发表的值与我们所观 察到的值有一个量级甚至更大的偏差。可能较高浓度的配体形成的复合 物与Ca2+的亲和力降低了，不管如何在本发明中它们是无用的。 例2

在例6中所描述的实验中显然可以发现，柠檬酸盐及异柠檬酸盐除 了通过它们与Ca2+的结合来抑制血液凝固以外，它们本身也具抗凝作用 (其中异柠檬酸盐抑制能力弱于此)。这就引发了一个思想，而这些物 质甚至在Ca2+活性接近生理水平的情况下也可以充当抗凝剂。因此，把 CaCl2加入到柠檬酸盐或异柠橡酸盐溶液中以使这些Ca2+结合物质溶液 中含有生理水平的Ca2+。这对于异柠檬酸盐是可行的，对于柠檬酸盐则 不可行。同时含有柠檬酸盐和CaCl2的溶液会产生沉淀。因此，以下仅 描述使用异柠檬酸盐的实验。

在四个分别含有一份抗凝剂(0.5mL)的真空塑料容器中分别加入 抽自一个人的九份血液(4.5mL)。抗凝剂分别是溶有使Ca2+活性达到 大约1mM的CaCl2剂量的0.3、0.4、0.6或0.8M的异柠檬酸三钠。 在表II及III中，经过抗凝处理的血样由它们各自的抗凝剂含量来表示， 即标识为30、40、60及80mM的异柠檬酸盐。

在收集的15分钟内，用一细的皮下注射器针头刺过每一容器的弹 性膜并抽出2mL的经过抗凝处理的血液以尽量减少与周围环境的气体 交换。立即把血液于10,000xg离心3分钟以使血细胞沉淀并保持大约 0.8mL的血浆。血浆除了少量被用于确定Ca2+活性及pH(参见表II及 III)之外，剩余的都被转移到一只聚苯乙烯管中。在表格II及III中， 各种不同的血浆及血液制品由血液中抗凝剂的剂量来表示，即标识为 30、40、60或80mM柠檬酸盐，(根据来源于经过柠檬酸盐抗凝处 理的血液的血浆中柠檬酸盐含量的报告可以推定，在血浆制品中抗凝剂 的实际水平大约比血液制品中的高出1.4倍)。

把保存于原来容器中的血液制品及保存于封盖的3mL聚苯乙烯管 中的相应的血浆制品保存于室温并定期检查凝固物的存在。在表II及III 中，有凝固物形成就表示为大写字母C，没有凝固物就标示为NC。表 中给出的时间间隔表示的是所使观察的时间阶段。血液中及血浆中的结 果分别在表II及III中给出。 表II.血液 异柠檬酸盐    Ca2+/pH     0-1小时    1-5小时   5-24小时   24-48小时 (mM) 30            1.00/7.37    C          C         C          C 40            0.95/7.35    NC         C         C          C 60            0.98/7.33    NC         NC        NC         NC 80            0.97/7.33    NC         NC        NC         NC 表III.血浆 异柠檬酸盐    Ca2+/pH     0-1小时    1-5小时   5-24小时   24-48小时 (mM) 30            1.00/7.37    NC         NC        C          C 40            0.95/7.35    NC         NC        NC         NC 60            0.98/7.33    NC         NC        NC         NC 80            0.97/7.33    NC         NC        NC         NC

上面所描述的用异柠檬酸盐进行的实验所得的结果显示：根据本发 明可以用象异柠檬酸盐这类与Ca2+的亲和力有限的物质来对生物液 体，具体是血液及血浆，进行抗凝处理而同时又不降低该种液体的Ca2+活性。细胞外生物液体典型的生理Ca2+活性大约为1.2mM。具有中等 Ca2+亲和力的物质被定义为那些Ca2+与其形成的复合物在生理条件，即 大概37℃的温度、7.3的pH及150mM的离子强度下解离常数为0.8 至8mM的物质。

结果表明，具有中等Ca2+亲和力的物质，非常可能还包括具有更强 Ca2+亲和力的物质，具有一种至今仍未被描述过的，或者至少没有被很 好地认识到的作用机制。这一抗凝机制通过直接作用于生物液体中参与 凝固过程的物质，而不是通过降低Ca2+活性来起作用。Ca2+活性的降低 通常被认为是具有钙结合抗凝作用的一组物质的抗凝作用机制。由上面 所示的结果显然可以发现，当Ca2+活性接近生理水平时，具有中等Ca2+亲和力的物质对血浆的抗凝效果比对血液的更强，即对血浆进行抗凝处 理需要较少的抗凝物质。 例3

以与例2类似的方式进行实验。在含有一份抗凝剂溶液的真空塑料 容器中收集九份的血液。抗凝剂分别是溶解于水中的50至300mM范围 内的异柠檬酸三钠，这使得到收集的血液中异柠檬酸盐的水平最终达到 5至30mM的范围。在收集后不久，从各个容器中分别抽取少量的经过 抗凝处理的血液并确定其Ca2+活性及pH。把装着经过抗凝处理的血液 的原来的容器保存在室温下并定期检查凝固物，即凝固的材料或血块， 的存在。标识与例2中的一样，即“ C”代表有凝固物而“NC”代表 没有凝固物，等等。结果示于表IV中。 表IV.血液 异柠檬酸盐  Ca2+  pH     0-1小时  1-5小时  5-24小时  24-48小时 (mM) 5           0.43* 7.64* C        C        C         C 10          0.27* 7.64* C        C        C         C 13          0.21* 7.65* C        C        C         C 15          0.20   7.60   NC       C        C         C 20          0.18   7.46   NC       NC       NC        NC 25          0.15   7.46   NC       NC       NC        NC 30          0.12   7.45   NC       NC       NC        NC *在血清中测定的数值

由上面的结果可以发现，20mM的异柠檬酸盐是长时间抗血液凝 固所需的最少的剂量。在经过抗凝处理的血液中Ca2+活性是 0.18mM，这比含有13mM柠檬酸三钠的血液，即根据已有工艺收集在 含有1/9体积0.13M柠檬酸三钠的容器中的血液中的Ca2+活性大约高10 倍。从例2的结果可以推定，对血浆进行抗凝处理所需的异柠檬酸盐抗 凝剂将会较少。

在本发明的范围之内，期望异柠檬酸盐的抗凝效果可以通过添加柠 檬酸盐或降低pH来得以增强。可以通过用异柠檬酸或柠檬酸代替其钠 盐、钾盐或锂盐来降低pH。根据如上所述进行实验，所不同的是抗凝 剂是(Na+)异柠檬酸盐、(Na+)柠檬酸盐、(H+)异柠橡酸及/或(H+) 柠檬酸的混合物，其结果都概括于表V，VI及VII中。

表V.血液

用(Na+)异柠檬酸盐及(Na+)柠檬酸盐的混合物进行抗凝处理。 它们在血液中浓度的总和为13mM。柠檬酸盐的比例以百分比表示。 柠檬酸盐   Ca2+ pH      0-1小时  1-5小时  5-24小时  24-48小时 (％) 20         0.14  7.48    NC       NC       NC        NC 40         0.09  7.47    NC       NC       NC        NC

表VI

用13mM的(H+)异柠檬酸及(H+)柠檬酸的混合物进行抗凝处理 柠檬酸   Ca2+ pH      0-1小时  1-5小时  5-24小时  24-48小时 (％) 0        0.27  6.54    NC       NC       NC        NC 2.5      0.25  6.39    NC       NC       NC        NC 5        0.23  6.47    NC       NC       NC        NC 10       0.20  6.47    NC       NC       NC        NC

表VII

用11mM的(H+)异柠檬酸和(H+)柠檬酸的混合物进行抗凝处理 柠檬酸   Ca2+  pH    0-1小时  1-5小时  5-24小时  24-48小时 (％) 0        0.34   6.91  NC       C        C         C 2.5      0.29   6.63  NC       C        C         C 5        0.27   6.68  NC       C        C         C 10       0.22   6.61  NC       C        C         C 20       0.16   6.65  NC       NC       NC        NC 40       0.09   6.59  NC       NC       NC        NC 例4

下面将论证根据本发明进行抗凝处理的血液就凝固反应而言更具 稳定性。因此，根据本发明进行抗凝处理的血液及血浆比起根据已有工 艺的方法进行抗凝处理的血液更适合用于凝固分析。

准备三种不同类型的血液收集管，每管分别抽取4.5mL的血液。把 这三种类型的血液收集管分别标识为“柠檬酸盐”“异柠檬酸盐”及“柠 檬酸盐/异柠檬酸盐混合物”。“柠檬酸盐”管是根据已有工艺的，它 含有0.5mL 0.13M的柠檬酸三钠。“异柠檬酸盐”管是根据本发明的， 它含有0.5mL0.2M的异柠檬酸三钠。“柠檬酸盐/异柠檬酸盐混合物” 管也是根据本发明的，它含有0.5mL 0.078M的异柠檬酸三钠及 0.052M的柠檬酸三钠的混合物。

在少于5分钟的时间间隔内，把血从同一个人抽到每一个血液收集 管“柠檬酸盐”管、“异柠檬酸盐”管及“柠檬酸盐/异柠檬酸盐混合 物”管之中。

尽量不耽误时间，从三个血液收集管中每管抽出1mL经过抗凝处 理的血液。把血液于5000xg离心3分钟。尽可能快地保护0.4mL的血 浆并把其用于凝血因子VIII凝血活性、激活部分促凝血酶原激酶时间 (APTT)及凝血酶原时间(PT)分析。这些分析结果是在血液收集 后的20分钟内获得的，在下面及在图1、2及3中，它们被当作初始 值。

剩下的血液在室温下被贮存于三个血液收集管中。把管子封闭以防 止蒸发损失。在血液收集后5小时、24小时及48小时，以如上所述的 方法抽取血液，保护血浆并对血浆进行分析。这些分析的结果，以与初 始值的关系表示，被示于图1、2及3中。

图1显示，因子VIII的凝血活性在根据本发明进行抗凝处理的血液 中更加稳定。特别是，在标识为“异柠檬酸盐”的管中，根据本发明收 集的血液在室温48小时的贮存期间显示了良好的稳定性，而且因子VIII 的凝血活性保持在初始值的10％之内。在标识为“柠檬酸盐”的管中， 根据已有工艺进行抗凝处理的血液在前5个小时迅速下降到初始活性的 75％，而且随后继续下降，在第48小时下降到55％。在标识为“异柠 檬酸盐/柠檬酸盐混合物”的管中，根据本发明进行抗凝处理的血液与 根据已有工艺进行抗凝处理的血液相比较，其因子VIII的稳定性在贮存 的前15个小时更好，此后则大致相同。

图2显示，在根据本发明进行抗凝处理的血液中的APTT比在根据 已有工艺进行抗凝处理的血液中的更加稳定。在室温下的前48小时， 贮存于“异柠檬酸盐”管中的血液的APTT保持在其初始值的5％以内。 贮存于“柠檬酸盐”管中的血液的APTT上升到113％。贮存于“异柠 檬酸盐/柠檬酸盐混合物”管中的血液的APTT稳定性介于两者之间。

图3显示，PT在根据本发明进行抗凝处理的血液中更为稳定。在 “异柠檬酸盐”管中，PT保持在初始值的2％之内，在“异柠檬酸盐/ 柠檬酸盐混合物”管中，在4％之内，在“柠檬酸盐”管中，在7％之 内。 例5

以许多不同的方法来对血液及血浆进行凝固分析。大部分此类分析 都具有以下相同点。根据已有工艺用柠檬酸盐，或者根据本发明用异柠 檬酸盐，对血液或血浆样品进行抗凝处理。把经过抗凝处理的血液或血 浆与含有Ca2+的试剂相混合，上述试剂可以还原或抵消样品中抗凝剂降 低Ca2+浓度的效果。由于Ca2+活性强烈影响凝固反应从而最终影响分析 的结果，因此，尽可能精确地确定Ca2+活性是很重要的，即应使样品和 试剂的混合物中Ca2+活性的变化尽可能地小。这一变化的大小将取决于 样品中Ca2+的缓冲能力。缓冲能力是把每升溶液中Ca2+化学当量的变化 除以Ca2+活性的变化所得的值。这一Ca2+缓冲能力是在一个包括样品、 缺乏维生素K依赖型凝血因子的牛血清以及兔脑促凝血酶原激酶的系 统中确定的。由于这类系统对其中的凝血因子VII，X及II(凝血酶原 复合物因子)的联合活性敏感，所以它被用于测量凝血酶原复合物的活 性(PK活性)。在本例中，通过添加柠檬酸盐或异柠檬酸盐对这一系 统进行了改进。可通过添加终浓度为5或10mM的钙离子结合物质来改 进这一系统。每一添加的水平都决定了该分析系统的钙离子缓冲能力。 缓冲能力是在Ca2+活性为1至4mM之间时被确定的。最终添加了5mM 柠檬酸盐或异柠橡酸盐所得的结果示于图4，添加了10mM的示于图 5。

图4和5显示，异柠檬酸盐对于增强一个用于凝固分析的系统的 Ca2+缓冲能力而言，其效果比柠檬酸盐更好。当Ca2+活性高于1mM(这 包括了Ca2+活性的一个重要水平，即生理水平1.3mM)时，所增加的 Ca2+缓冲能力最为明显。 例6

研究了例5中所描述的系统的化验反应。把样品、试剂及CaCl2溶 液相混合。记录凝固时间，于10,000xg离心3分钟把凝固物压实，然 后确定Ca2+活性。往试剂中加入一定量的柠檬酸盐或异柠檬酸盐，并使 所加入的物质的最终浓度达到5、10或20mM。在几个CaCl2水平上 进行实验以使系统中Ca2+活性水平阶梯式地达到0.7至9mM之间的不 同数值。

图6显示了凝固时间(KT)是如何依赖于Ca2+活性的。图中示出 了分别添加有0、5、10及20mM的柠檬酸盐的情况。添加有0、5、 10及20mM的异柠檬酸盐的同样的实验示于图7中。

检查图6及7可以发现，在任何一个Ca2+活性水平，柠檬酸盐及异 柠檬酸盐都可以抑制凝固。然而，异柠檬酸盐的抑制效果比柠檬酸的 差。如果把某一Ca2+活性水平的凝固时间对应着所添加剂的柠檬酸盐或 异柠檬酸盐的最终浓度作图，上述情况就会变得非常清楚。图8所示的 是Ca2+活性为1.5时的情况。图8表明，每摩尔单位的柠檬酸盐的抑制 效果是异柠檬酸盐的大致2倍。 例7

分两步来进行APTT分析。第一步，把一个体积的经过柠檬酸盐抗 凝处理的血浆与一个体积的激活剂/脑磷脂溶液相混合并把混合液保温 5分钟。第二步，加入一个体积的25mM CaCl2溶液并记录凝固时间。 根据本发明对这一化验进行改进，使用了同时还含有30mM异柠檬酸盐 的25mM的CaCl2溶液。下面，激活物/脑磷脂溶液及25mM CaCl2溶 液将被称为原始的APTT试剂，而激活物/脑磷脂溶液及含有30mM异 柠檬酸盐的25mM CaCl2溶液则被称为改进的APTT试剂。

在所述两步溶液中钙离子的活性，即钙离子的最终活性，当使用的 是原始的APTT试剂时，为2.7±0.20mM，当使用的是改进的APTT 试剂时，则为1.60±0.70mM。

用原始的及改进的APTT试剂分别对来源于22个正常人及120个 患者的经过柠檬酸盐抗凝处理的血液进行了分析。健康个体的平均凝固 时间及标准偏差(SD)，当使用的是原始的APTT试剂时，为32.5±3.0 秒，当使用的是改进的APTT试剂时，为4.4±4.6秒。用这些平均值及 标准偏差来计算患者跟正常人的偏差，即把患者的APTT减去正常人平 均的APTT，然后再把这一差别除以正常人的标准偏差。

当使用原始的APTT试剂时，患者跟正常人的平均偏差及其标准偏 差为3.6±5.0，当使用改进的APTT试剂时，相应值为4.3±5.7。根据 两组斯氏t-试验的分析，这一差别在统计学上非常显著，p＜ 0.006。因此，当使用的是根据本发明的APTT试剂时，患者APTT跟 正常值的偏离值比使用根据已有工艺的APTT试剂时的更大。