基于微流体芯片的测试血小板的功能和药物反应的设备和方法 |
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| 申请号 | CN201380068489.X | 申请日 | 2013-12-26 | 公开(公告)号 | CN104903728A | 公开(公告)日 | 2015-09-09 |
| 申请人 | 高丽大学校产学协力团; | 发明人 | 申世铉; 林菜承; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及基于微 流体 芯片进行血小板功能和药物反应测试的设备和方法。本发明所述的测试设备可包括：测量装置，其容纳血液样品，并测量由于所述血液样品的流动而产生的血小板的凝集和粘附；和流体驱动装置，其与所述测量装置相连接，并在血液样品中产生振荡剪切流。根据本发明，可以确保如血小板和血管性血友病因子(vWF)等因子的均匀且完全的激活，并可以改善血小板凝集的可再现性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种基于微流体芯片的测试血小板的功能和药物反应的设备，其包括： |
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| 说明书全文 | 基于微流体芯片的测试血小板的功能和药物反应的设备和方法 技术领域[0001] 本发明涉及测试血小板的功能和药物反应的设备和方法，特别是涉及基于微流体芯片的测试血小板的功能和药物反应的设备和方法，以便能够利用少量血液通过在一次性微芯片中的流动来自动地进行各种测试，从而进行血栓性缺血和易出血者疾病的早期诊断。 背景技术[0002] 血栓是凝血或血块在血管内部的形成。心脏的冠状动脉或脑血管部分中的血栓导致心脏病或脑梗塞。被称作无声杀手的血栓正在变成我们当代人的主要死因。问题是血栓或出血性疾病并非仅由基因缺陷引发，并且其成因还未明确发现。 [0003] 更严重地，血栓患病率由于基因缺陷和后天因素而正在快速增加。因此，已经需要设备和方法来进行血栓或出血性疾病的定量测试，并且进行早期诊断和预后决策。 [0004] 血管损伤部位的凝血过程中存在发挥作用的多种因子。各因子的全部生化和生物机制都发挥关键作用，而血小板的凝血发挥最为关键的作用。血小板在无损伤部位不与动脉管壁粘附，但是生化和生物机制在血管损伤部位将激活，由此不管流动条件如何都将造成凝血。 [0005] 已经开发了多种方法和仪器来细分和测试血小板功能。在不具有血小板数量疾病的出血性疾病的情况中，血小板功能测试是辨别由血小板功能的先天性或后天疾病引起的出血性疾病的重要测试。另外，此种血小板功能测试正在用于检验出血趋势的增大或由用于治疗或预防心血管疾病的抗血小板药剂引发的药物耐受性。 [0006] 如果血管中的内皮细胞有损伤，则内皮细胞中的如胶原蛋白等内部物质将暴露在血液中，并且血小板将与该物质粘附并被激活。血小板的粘附机制根据血液流动条件将具有不同的特性。 [0007] 特别是，如果血液流动速度在动脉中较高并且施加在血管壁上的剪切力较高，则血小板不易与血管的内膜粘附。在此种条件下，血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)将激活并将容易地与血管壁粘附，并且血小板将借助vWF而与血管壁粘附。当然，已知的是血小板细胞膜中包含的如GPIb-IX-V等糖蛋白受体复合物将诱发与vWF的反应，由此导致粘附。 [0008] 如此，粘附的血小板将通过吸引同类的血小板而诱发凝集，并导致凝血。然后，凝血将通过血纤蛋白得到加强。 [0009] 不过，血小板的功能并不总是有利的，而是可能在特定的流动条件或情况下引发副作用。例如，当血管壁因为动脉硬化而变得局部狭窄时，途经该狭窄部的血小板将暴露在高剪切比下并被激活，而后在该狭窄部的后部发生粘附和凝集并导致血栓，后者使血管阻塞。 [0010] 如上所述，血小板和vWF受血液流动的大小(即因流动造成的剪切应力)激活，由此导致粘着性增大，并导致凝血发生。已知的是，激活血小板或vWF所需的剪切应力至少为8Pa，剪切速率至少为5,0001/s。 [0012] 出血时间(BT)方法是约100年前开发出的，其测量出血时间并仍在用于血小板功能的筛选测试。不过，现存的血小板功能测试具有诸如难以标准化、较低的诊断有效性和使用介入技术等问题，因而需要一种客观化的测量方法来测量血小板功能。 [0013] 为了解决上述问题，开发了血小板功能分析仪(如PFA-100)，其正在用于测量血小板功能。该分析仪使用以下特征：血小板在高剪切速率下因激活的vWF而凝集。为了测量该特征，在全血流入长的毛细管后，血小板在涂覆有ADP或肾上腺素的管嘴中与胶原蛋白一起凝集，并通过压力或流速等测量管嘴阻塞的时间。 [0014] 此种血小板功能测试完全依赖于vWF的功能。此种测试具有以下缺陷：该测试依赖于血细胞比容(Hct)，并且不能进行抗血小板测试，如使用阿司匹林或氯吡格雷的测试。另外，不利的是，需要两步测试来进行血小板的功能测试，并且提高了测试的费用。 [0015] 特别地，为了激活vWF，血液样品必须以预定的时间暴露于高剪切速率。为此，PFA-100采用了使血液以高速流入长的毛细管的方法。不过，不利的是，该方法需要大量血液。另外，还存在以下缺陷，vWF在剪切速率最低的毛细管中心处并不会被激活，而vWF在剪切速率最高的近管壁处激活，由此并不能保证测试结果的重复性。 [0016] Diamed Co.,Ltd.的IMPACT采用了圆锥平板形式的旋转型库艾特流动。在此种方法中，对其中包含的血液施加均匀的剪切应力，并在施加高剪切应力时测量血小板的粘附程度。与PFA-100类似，此种方法具有以下缺点：其过度依赖纤维蛋白原和vWF的浓度和功能。 [0017] Verify-NOW(Accumetrics)采用了利用光学传感器借助浑浊度测量血小板的凝集程度的方法。在此种方法中，将激动剂与血液混合，然后使其上涂覆有胶原蛋白的微珠反应，由此使血液中的血小板凝集。然后，测量浑浊度随时间的变化。近来，使用该方法的频率正在增大，不过该方法仍具有现有的浑浊度测量方法的缺点。 发明内容[0018] 技术问题 [0019] 本发明的目的在于解决上述问题，并且本发明提供了基于微流体芯片的测试血小板的多种功能和药物反应的设备和方法，借助该设备和方法可以进行多种测试，包括经一次测试进行出血性疾病和血栓的早期诊断和预后，由此节省测试成本并提高测试的可重复性和准确性。 [0020] 本发明的另一目的在于提供基于微流体芯片的测试血小板的多种功能和药物反应的设备和方法，借助该设备和方法可以自动测量血流的封闭时间。 [0021] 本发明的目的并不限于上述目的。本发明所属领域的普通技术人员从下文的说明可以清楚地理解未提及的其它目的。 [0022] 技术方案 [0023] 为实现上述目的，本发明提供了基于微流体芯片的测试血小板的功能和药物反应的设备，其包括：测量装置，其容纳血液样品，并测量由于血液样品的流动而产生的血小板的凝集和粘附；和流体驱动装置，其与测量装置相连接，并产生血液样品的振荡剪切流。 [0024] 该测量装置包括：其中容纳血液样品的样品容器；与样品容器连接并导引血液样品的剪切流的微流道；与微流道连接的测量室，其中血小板的凝集和粘附产生于该测量室中；和对该测量室中产生的血小板的凝集和粘附进行测量的感测部件。 [0026] 进一步，测量装置和流体驱动装置之间安装有阀，并且该阀控制驱动压力的供给和切断。 [0027] 进一步，该阀通过周期性打开和关闭而可以产生脉动流。 [0028] 进一步，多个微流道是并行排列的。 [0029] 进一步，将彼此不同的试剂供给至与并行排列的微流道相连接的测量室中。 [0031] 进一步，电极传感器具有安装在测量室两侧的两个电极，并测量电阻抗变化，该电阻抗是由于血小板在测量室中的凝集和粘附而变化的。 [0033] 进一步，将压力传感器布置在连接测量装置和流体驱动装置的阀处，或布置在样品容器内，并测量脉动压力的变化，该脉动压力是由于血小板在测量室中的凝集和粘附而变化的。 [0036] 进一步，测量室安置在微流道的中心部，并且在测量室中形成流道快速扩张部，该流道快速扩张部降低血液样品的流动速度。 [0037] 进一步，测量室中安装有多个微柱，该多个微柱通过促进血小板的凝集和粘附而诱发血液样品的流动减少。 [0038] 进一步，测量室中配备有多个珠。 [0039] 进一步，测量室中供给有一种或多种试剂，其选自纤维蛋白原、花生四烯酸、胶原蛋白、肾上腺素、二磷酸腺苷(ADP)、前列腺素E1(PGE1)、凝血酶受体激活肽(TRAP)、P2Y1受体拮抗剂和P2Y12受体拮抗剂。 [0040] 进一步，P2Y1受体拮抗剂包括以下药剂的一种或多种，该药剂选自MRS 2179、MRS2279、MRS 2500、A2P5P、A3P5P和A3P5PS。 [0041] 进一步，P2Y12受体拮抗剂包括以下药剂的一种或多种，该药剂选自氯吡格雷、噻氯匹啶、普拉格雷、AR-C67085MX、坎格雷洛、C1330-7、MRS 2395和2-甲基硫代腺苷-5’-单磷酸盐。 [0042] 进一步，上述药剂通过表面涂覆和液体注射中的至少一种方法供给。 [0043] 流体驱动装置产生的剪切流中的最小剪切速率为至少5000s-1，并且流体驱动装置产生的剪切流中的最小剪切应力为至少8Pa。 [0044] 另外，本发明提供了基于微流体芯片进行血小板功能和药物反应测试的方法，其包括：将血液样品注射入设置在两侧的样品容器中；通过与样品容器连接的微流道产生血液样品的振荡剪切流；将药剂供给至安置在微流道中心部的测量室中，该药剂与血小板反应；以及在测量室中测量由血小板的凝集和粘附造成的变化。 [0045] 技术效果 [0046] 根据上述特征，可以通过并行流道使用彼此不同的试剂来测试血液样品。另外，仅采用一次测试，通过对一个血液样品在多个流道中进行多种药剂测试，可以实现复杂血小板功能的多种测试，由此节省测试的时间和费用。 [0047] 另外，血液样品在各流道中可以在大于临界剪切应力下在剪切振动流中暴露足够的时间，由此与单程流动相比可以均匀且完全地使诸如血小板和血管性血友病因子(vWF)等因子激活，并且可以增大血小板凝集的重复性。 [0048] 进一步，可以通过显微镜实时观察血小板的粘附和凝集状态。因此，可以通过药剂进行定量分析。 [0049] 进一步，要与血液接触的元件可以由一次性材料制成，并且使用后可以丢弃。因此，其容易使用并容易避免经血液的传染。 [0050] 进一步，容易凭借具有较短测量时间并能够对多个样品进行同步测试的系统进行批量测试。 [0052] 图1显示了本发明的一个实施方式所述的基于微流体芯片进行血小板功能和药物反应测试的设备和方法。 [0053] 图2a和2b显示了本发明的一个实施方式所述的测量装置。 [0054] 图3显示了安置于测量室中的微柱。 [0055] 图4显示了安置于测量室中的珠。 [0056] 图5a显示了基于电阻抗进行测量的感测部件。 [0057] 图5b是利用图5a的感测部件进行测量的图示。 [0058] 图6a显示了通过光学传感器测量混浊度的感测部件。 [0059] 图6b是利用图6a的感测部件进行测量的图示。 [0060] 图7a显示了通过图像传感器测量微流道中血液样品的流动距离的感测部件。 [0061] 图7b是利用图7a的感测部件进行测量的图示。 [0062] 图8a显示了测量脉动压力的感测部件。 [0063] 图8b和8c是利用图8a的感测部件进行测量的图示。 具体实施方式[0064] 下文将结合附图说明本发明一个实施方式所述的基于微流体芯片进行血小板功能和药物反应测试的设备和方法。 [0065] 图1显示了一个实施方式所述的基于微流体芯片的测试血小板的功能和药物反应测试的设备的结构。图2a和2b显示了本发明的一个实施方式所述的测量装置的结构。 [0066] 如图1、2a和2b所示，本发明的基于微流体芯片的测试血小板的功能和药物反应的设备包括：测量装置10，其容纳血液样品，并测量由于血液样品的流动而产生的血小板的凝集和粘附；和流体驱动装置20，其与测量装置相连接，并产生血液样品的振荡剪切流。 [0067] 测量装置10包括样品容器11，其中容纳血液样品。而且，微流道12与样品容器11的一侧相连接。连接微流道12的目的在于导引血液样品的剪切流，并且微流道12连接在样品分选室11之间。 [0068] 微流道12可具有如四边形等多边形、圆形或椭圆形作为截面形状。例如，在具有方形作为截面形状的情况下，一边长可以是1μm～1000μm，优选为10μm～20μm，更优选为20μm～50μm。在具有圆形作为截面形状的情况下，直径可以是上述范围。 [0069] 微流道12可以如图2a所示包括一个流道，或者如图2b所示包括并行排列的多个流道。当微流道12并行排列时，可以将不同种类的试剂供给至各测量室14中。 [0070] 另外，用于测量血小板的凝集和粘附的测量室14与微流道12的一侧相连接。测量室14优选位于出现血小板的凝集和粘附的微流道12的中心部。此处，微流道12的末端可以安装有密封用密封部件16。 [0071] 参照图3和4，测量室14中可以安装有多个微柱17，该微柱17通过促进血小板的凝集和粘附而诱发血液样品的流动减少。最终，微柱17可容易地停止流道中的血液样品的振荡流。另外，测量室14中还配备有多个珠19。 [0072] 此外，测量室中可以形成有流道快速扩张部，该流道快速扩张部可以降低血液样品的流动速度。 [0073] 测量室14中可以供给有药剂。药剂可以是下述一种药剂或两种以上试剂的组合，其选自纤维蛋白原、花生四烯酸、胶原蛋白、肾上腺素、二磷酸腺苷(ADP)、前列腺素E1(PGE1)、凝血酶受体激活肽(TRAP)、P2Y1受体拮抗剂和P2Y12受体拮抗剂。 [0074] 例如，可以获得纤维蛋白原和花生四烯酸的组合、胶原蛋白和肾上腺素的组合、胶原蛋白和二磷酸腺苷(ADP)的组合、胶原蛋白和花生四烯酸的组合、胶原蛋白和二磷酸腺苷(ADP)和前列腺素E1(PGE1)的组合(或P2Y12测定)、胶原蛋白和MRS 2179的组合、胶原蛋白和MRS 2395的组合、胶原蛋白和TRAP的组合、胶原蛋白和P2Y1拮抗剂的组合或胶原和P2Y12拮抗剂的组合作为试剂的组合。 [0075] 另外，测量室14中可以供给阿司匹林、P2Y1拮抗剂氯吡格雷和噻氯匹啶之一作为抗凝集试剂。 [0076] 同时，测量室14中供给的药剂的供给方法包括以下方法中的一种：将药剂涂覆在测量室14表面的方法；在测量室14中添加涂覆有药剂的微柱17和/或珠19的方法；以及将液态的药剂注射入测量室14中的方法。另外，可以应用上述方法中两种以上方法的组合作为药剂供给方法。 [0077] 接下来，测量室14中布置有感测部件18，其通过使用各种传感器对血小板的凝集和粘附进行测量。可以使用以下部件中的至少一种作为感测部件18：测量电阻抗的电极传感器、测量混浊度的光学传感器、测量脉动压力的压力传感器和测量血液样品的振荡流动距离的图像传感器。另外，感测部件18与模数转换器30连接，以便可以转换所测量的信号。 [0078] 下文，在对感测部件18的具体实施方式进行说明之前，参照图1说明流体驱动装置20。 [0079] 流体驱动装置20使流入微流道12的血液样品产生线性往复运动，并且包括线性致动器21、受线性致动器21驱动而直线往复运动的活塞22和其中安装有活塞22并使活塞22在其中直线往复运动的缸体24。 [0080] 另外，测量装置10和流体驱动装置20之间连接有阀26。阀26实际上连接至微流道12并执行驱动压力的供给和切断的控制。另外，阀26通过开闭可以产生脉动流，从而有效地传递驱动压力。 [0081] 将微流道12中产生的流动设计为提供下述临界剪切应力和/或临界剪切速率，其足以动态地激发和激活血液样品中的如血小板和血管性血友病因子(vWF)等要素。此处，-1优选的是，最小剪切应力为8Pa且最小剪切速率为5000s 。 [0082] 这需要流动速度和微流道12进行精确设计和控制，从而提供临界剪切流。另外，振荡流的时间可以进行精确控制，从而提供足够的时间以通过剪切流激活血小板和血管性血友病因子(vWF)。 [0083] 同时，线性致动器12与微处理器40连接，从而使微处理器40控制线性致动器12。 [0084] 下文参照图5～8详细说明感测部件18的各种实施方式。 [0085] 首先，对于电学测量法而言，在测量室14内的两侧安装两个电极14a、14b，并测量电阻抗的变化。此处，测量室14的表面可以涂覆有各种激动剂备选物质的至少一种。 [0086] 如果在血液样品以高速在测量室14中振荡流动时在血液中施加高剪切应力和高剪切速率，则暴露在高剪切应力和高剪切速率下的血小板和血管性血友病因子(vWF)将激活。另外，血小板与血管性血友病因子(vWF)的粘着性增大，从而使血小板和血管性血友病因子(vWF)粘附在测量室14的内表面上，并逐步凝集。 [0088] 因此，可以进行设计使电阻抗根据测量室14的内部结构设计和涂覆表面的组成增大或减小。图5a显示了电极14a和14b之间的电阻增大。 [0089] 参照图5b，电阻抗随时间推进而渐进地接近最大值。此时，将达到动态范围的95％的时间定义为封闭时间(closure time)。 [0090] 关于其他测量方法，参考图6a，测量室14由透明材料制成。另外，彼此相对的光源15a和光学传感器15b布置在测量室14外部，分别布置在测量室14的上侧和下侧，并对测量室14中的光学混浊度的变化进行测量。 [0091] 根据光源15a和光学传感器15b之间的激动剂涂覆表面的结构布置，由血小板的凝集和粘附测得的光学信号可能随时间推移而增大或减小。 [0092] 当激动剂涂覆在测量室14的内部表面(其位于布置有光源15a和光学传感器15b的表面之内)上时，如图6b所示，光强度随时间推移而减小。不过，当血小板的凝集和粘附发生在对光学路径有轻微影响的其他表面部分或发生在微柱17处时，光强度将随时间推移而增大。另外，与阻抗的情形相同，将达到动态范围的95％的时间确定为封闭时间。 [0093] 关于另一测量方法，参照图7a，可将诸如CCD传感器阵列等光学测量传感器13b和诸如LED等光源13a布置在分别与测量室14的两侧相连接的微流道12的上侧和下侧。 [0094] 当非透明血液样品振荡流动时，由光学测量传感器13b测得的测量距离较长且恒定。不过，血液样品的测量距离根据血小板的凝集和粘附而降低。另外，当测量室14完全堵塞时(参照图7b)，血液样品的测量距离将变得与微流道14的距离相同，并且变得恒定。另外，与阻抗的情形相同，将达到动态范围的95％的时间确定为封闭时间。 [0095] 关于另一测量方法，参照图8a，可将压力传感器28布置在与连接缸体24的阀26的另一侧相连接的导管处。 [0096] 压力传感器28是在施加振动流时测量脉动压力的器具。在初始阶段，由活塞22的往复运动产生的脉动压力的振幅通过血液样品的振动流而稍有降低。不过，记录了初始脉动压力，这是因为当血小板凝集并粘附在测量室14上并致使流道最终堵塞时，脉动压力在堵塞的通道中没有缓冲。 [0097] 根据该实施方式，图8b显示了随时间推移记录的脉动压力的图示。 [0098] 不过，在于压力传感器28相连接的导管连接至注射有血液样品的样品容器11的上部且在注射血液样品后将入口密封的情况下，如图8c所示，所测量的脉动压力可能随时间推移而逐渐减小。 [0099] 在上述结构中，微流体芯片将由一次性材料制成，这是因为与血液样品接触的所有部分均由相当廉价的塑料或玻璃等制成。如本发明的一个实施方式那样，微流道12可以用毛细管替换，从而测量血细胞比容。另外，使用后可将一次性测试盒丢弃。因此，其容易使用并容易避免经血液的传染。 [0100] 另外，一次性测试盒可以由透明材料制成。因此，可以利用光学测量传感器13b测量血小板的移动性。此外，可以通过显微镜观察血小板的凝集和粘附的状态。 [0101] 可以采用显微镜观察作为研究手段，其可以对测量室14中注入或涂覆的各种试剂进行常规观察并且测试药物动力学反应。 [0102] 试剂可以包括促进血小板粘附的激动剂，如胶原蛋白、二磷酸腺苷(ADP)和肾上腺素等。另一方面，试剂可以包括干扰和阻止血小板凝集的拮抗剂，如阿司匹林、P2Y1受体拮抗剂和P2Y12受体拮抗剂等。 [0103] P2Y1受体拮抗剂可以是以下备选物质中的至少一种，该备选物质例如MRS2179、MRS 2279、MRS 2500、A2P5P、A3P5P和A3P5PS等。P2Y12受体拮抗剂可以是以下备选物质中的至少一种，该备选物质例如氯吡格雷、噻氯吡啶、普拉格雷、AR-C67085MX、坎格雷洛、C1330-7、MRS 2395和2-甲基硫代腺苷-5’-单磷酸盐等。 [0104] 特别是，对于服用上述试剂的取样者来说，可以通过本发明的测试设备来测量血小板的凝集功能以及对试剂的抗性。 [0105] 为了测量血小板的功能，将来自服用了阿司匹林和氯吡格雷的正常人或取样者的血液收集在柠檬酸化管中。然后，取50～100微升的全血，并分别使用最佳浓度的二磷酸腺苷(ADP)、前列腺素E、纤维蛋白原和花生四烯酸来在37℃反应10～30分钟。反应后，通过使用微流道12对微流体芯片施加压力来使血液转移。如果血小板的功能正常，则测量室14中的流动路径将在短时间内堵塞，随后流动停止。相反，如果血小板的功能异常，则与血小板功能正常的情况相比，堵塞时间将加长。 [0106] 关于药物耐受性测试，尤其是服用阿司匹林、氯吡格雷和噻氯匹啶等时，血小板的凝集功能将下降。因此，测量室14中的流动路径将不容易堵塞，从而使堵塞时间增大。由于正常人与药物的反应良好，因而堵塞时间较短。如果与正常人相比堵塞时间的比例显著减小，则可确定对阿司匹林和氯吡格雷的药物耐受性。关于确定标准，在Verify NOW的情况下，可以确定阿司匹林的预定截断OD值(550 ARU-阿司匹林反应单元)，然后，如果测量值低于标准，则可确定为耐受药物反应，如果测量值高于标准，则可确定为正常药物反应。另外，在氯吡格雷的情况下，如果测量值是正常值的40％～60％，则可确定为抑制药物耐受性，如果测量值小于20％，则可确定为耐受性。 [0107] 药剂注射方法包括作为常见方法的涂覆测量室14的表面的方法。另外，测量室14中的微柱17的表面可以涂覆有不同类型的试剂，而且可以将液体化的药剂直接注射入测量室14中。另外，可以将不同种类的试剂涂覆在微流道12的表面上。 [0108] 试剂具有以下特征：其通过本发明的振荡流机制和测量室14的结构而容易与血液样品混合。因此，可以将液体化或固态的各种激动剂和拮抗剂与血液混合，从而用作研究反应的手段。 [0110] <附图标记清单> [0111] 10：测量装置 [0112] 11：样品容器 [0113] 12：微流道 [0114] 13a：光源 [0115] 13b：光学测量传感器 [0116] 14：测量室 [0117] 15a：光源 [0118] 15b：光学传感器 [0119] 16：密封部件 [0120] 18：感测部件 [0121] 20：流体驱动装置 [0122] 21：线性致动器 [0123] 22：活塞 [0124] 24：缸体 [0125] 30：模数转换器 [0126] 40：微处理器 |
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