测量血液样品中蛋白水解级联的肽降解产物的方法 |
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| 申请号 | CN201280072781.4 | 申请日 | 2012-06-06 | 公开(公告)号 | CN104395750B | 公开(公告)日 | 2017-06-30 |
| 申请人 | 阿托奎特诊断有限公司; | 发明人 | M·波格利特施; C·施瓦格尔; H·洛博内; M·舒斯特; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了测量 生物 样品，特别是血液样品中蛋白 水 解 级联(例如肾素‑血管紧张素体系(RAS)和缓激肽体系)的肽降解产物的方法，其中将所述样品温育直至对所述蛋白水解级联中涉及的至少一种肽降解产物达到稳态平衡，且其中在所述样品中定量所述蛋白水解级联的处于稳态平衡的所述至少一种肽降解产物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.测量生物样品中包含至少两个连续的蛋白水解反应的蛋白水解级联的肽降解产物的方法，其中将所述样品温育直至至少一种肽降解产物的实际总体降解率等于所述至少一种肽降解产物的实际总体形成率且对所述蛋白水解级联中涉及的所述至少一种肽降解产物达到稳态平衡且其中在所述样品中定量处于稳态平衡浓度的所述至少一种肽降解产物。 |
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| 说明书全文 | 测量血液样品中蛋白水解级联的肽降解产物的方法[0001] 本发明涉及对血液样品中蛋白水解级联的肽降解产物的测量。 [0002] 血液中蛋白水解级联的肽降解产物存在的质量和数量随受试对象的生理或生化状态而显著变化。其可例如取决于关于给定或怀疑疾病受试对象的健康状况，和/或药物治疗，和/或其它因素。蛋白水解性降解产物主要取决于血液系统中蛋白水解酶的调节和活性，而后者本身取决于患者的生理状态。 [0003] 肾素-血管紧张素体系(RAS)是一种蛋白水解级联，其由多种酶和肽构成。该级联始于血管紧张素I(血管紧张素1-10或Ang 1-10)通过肾分泌的肾素从前肽血管紧张肽原(AGT)释放。AGT在人类肝脏中丰富表达并分泌入循环构成实质上无穷尽的血浆AGT池。通过多种蛋白酶从Ang 1-10产生的肽代谢产物充当不同组织中血管紧张素受体的配体，导致一组多种多样的由血管紧张素肽类介导的生理功能。 [0004] 血压的调节是研究充分的受血管紧张素肽类影响的生理反应。血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)由血管紧张素转换酶(ACE)的蛋白水解作用通过从Ang 1-10除去两个C-末端氨基酸而产生。Ang1-8与细胞受体结合，导致血管收缩和血压连续升高。 [0005] ACE在Ang 1-8产生中的这一关键作用使其成为有利的药理学靶标，抗高血压治疗的主要焦点集中于降低Ang 1-8水平，导致血压降低。这也反映在有多种ACE抑制剂用于治疗高血压。最近，其它可靶向的RAS酶包括肾素或中性内肽酶(NEP)被鉴定为抗高血压治疗的药理学靶标，而ACE抑制剂被进一步优化以减少副作用发生频率，所述副作用被认为是因缺乏ACE结构域选择性而引起的。在施用ACE抑制剂期间发生的常见副作用包括干咳和血管性水肿，认为其是由这些抑制剂对缓激肽(BK)降解的抑制造成的，因为据描述不仅Ang 1-10而且某些BK肽也被ACE切割。 [0006] 这样有限的底物选择性是在RAS酶中观察到的非常普遍的特征。除ACE(由于其两个结构域的结构而与其它RAS酶稍有不同)外，还已知血管紧张素转换酶2(ACE2)能分别切割Ang 1-8和Ang 1-10而生成血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-9(Ang 1-9)。 [0007] 此外，不同的RAS蛋白酶可共享其底物，导致酶竞争给定底物。例如，已知Ang 1-10被ACE、ACE2、NEP和不同氨肽酶切割。所有这些考虑结果导致非常复杂的RAS图像，表现为不同酶、受体和肽的网络，导致肽浓度受到多种因素影响。 [0008] 比较公开的可溶性ACE血浆水平与Ang 1-10血浆浓度，可明显看出在循环中ACE酶以与Ang 1-10肽相比显著摩尔过量存在。这导致无法用基于存在巨大过量底物的经典酶动力学来描述RAS。在循环中的血管紧张素肽水平不超过10-200fmol/ml的生理条件下，大多数酶与其底物相比以摩尔过量存在，迫使研究者背离经典的米氏动力学来获得对原始样品基质中生理条件下的生化过程的可靠了解。 [0009] 例如，Ang 1-10据述以比Ang 1-8低得多的催化效率被ACE2降解。显示这一点的试验在人工基质中使用与各对应酶相比巨大过量的底物进行，所生成的Ang 1-8向Ang 1-7的最大ACE2转化率比Ang 1-10向Ang1-9的转化率高65倍[Rice et al.,Biochem J.,383(2004),45-51]。 [0010] 将先前的考虑与多种血管紧张素肽显示出生物活性的事实联系在一起，显然非常需要评价生物样品中的RAS，确保样品中维持生理性的底物浓度。通过药理学手段操纵RAS在所述体系的多个水平改变酶活性和肽转化率，这明显有利于综合评价RAS，以监测对于确定酶反应的药物效力和抑制剂选择性。 [0011] 例如，据述ACE抑制剂在生理性底物浓度抑制两个ACE结构域至未知程度，可研究ACE抑制剂对于Ang 1-10转化为Ang 1-8的抑制，以及其对于Ang 1-7向血管紧张素1-5(Ang 1-5)或者缓激肽1-9(BK 1-9)向缓激肽1-7(BK 1-7)或者BK 1-7向缓激肽1-5(BK 1-5)的转化的抑制潜能，以优化其副作用谱。 [0012] 将对于人血浆中血管紧张素肽类和代谢酶的浓度的公开数据联系在一起，可明显看出不同组之间的极大差异，这指向所用方法的可重复性低。尽管如此，据报道人血浆中前激素AGT与肾素相比存在巨大摩尔过量，意味着其作为非常长久的Ang 1-10来源，后者通过血浆样品中恒定的肾素活性产生。这一事实也被用在现有技术的PRA测定中，其中用在限定时间段内产生的Ang 1-10量反算样品中的肾素活性。遗憾的是，这些值常常过低，这是由于缺乏对于所产生的Ang 1-10的稳定作用(对降解的不完全抑制)，其需要明确的一组蛋白酶抑制剂来确保Ang 1-10的降解率接近零[Bystrom et al.,Clin.Chem.56(2010),1561-1569]。这些缺陷结合供体间的显著差异导致可重复性差的操作程序，仅有有限的诊断价值。 [0013] 因此本发明的目的是提供一种新的改进的工具，通过使用受试对象的血液样品来分析这类受试对象的生理或生化状态，特别是受试对象或人类患者在某种特定治疗性疗法(包括但不限于药物施用、手术或血液透析)之前、期间和之后的生理或生化状态。 [0014] 因此，本发明提供了测量生物样品，特别是血液样品中蛋白水解级联的肽降解产物的方法，其中将所述样品温育直至对于所述蛋白水解级联中涉及的至少一种肽降解产物达到稳态平衡，并且其中在样品中定量处于稳态平衡浓度的所述至少一种肽降解产物。 [0015] 如本文所用的术语“稳态平衡”(SSE)意指蛋白水解级联中涉及的至少一种肽降解产物的实际总体降解率等于所述肽降解产物的实际总体形成率，从而导致所述肽降解产物的稳定浓度，即在特定时间段内不实质性变化的稳态平衡肽浓度，如下进一步详述。肽降解产物的实际总体形成率定义为所述肽降解产物形成中涉及的所有酶的实际转换率的总和，即所述肽降解产物是所述酶的直接产物。肽降解产物的实际总体降解率定义为所述肽降解产物降解中涉及的所有酶的实际转换率的总和，即所述肽降解产物是所述酶的直接底物。 [0016] 如本文所用的术语“蛋白水解级联”应指包含至少两个连续的蛋白水解反应的级联。在一个实施方案中，所述蛋白水解级联是至少两个、三个、四个或五个连续蛋白水解反应的级联。这样的蛋白水解级联可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续或不连续的蛋白水解反应，或其组合，其可为分支或多重分支的。例如，根据本发明的蛋白水解级联包括肾素-血管紧张素体系(RAS)，也称为肾素-血管紧张素-醛固酮体系(RAAS)，缓激肽体系，激肽-激肽释放酶体系，凝血级联，补体系统，凋亡途径，神经肽级联(例如催产素体系)、内皮素肽级联，和利尿钠肽级联。 [0017] 如本文所用的术语“蛋白水解级联中涉及的肽降解产物”或“蛋白水解级联的肽降解产物”应指为所述给定蛋白水解级联组成部分的肽，作为所述蛋白水解级联中涉及的至少一种酶的底物(前体肽)或产物，或者作为所述蛋白水解级联中涉及的至少两种酶的底物和产物。相应地，对于RAS蛋白水解级联，所述蛋白水解级联中涉及的肽(或肽降解产物)可选自血管紧张肽原、血管紧张素I(Ang 1-10)及其生物降解产物，特别是血管紧张素I(Ang 1-10)、血管紧张素2-10(Ang 2-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素III(血管紧张素2-8或Ang 2-8)、血管紧张素IV(血管紧张素3-8或Ang 3-8)、血管紧张素 1-9(Ang 1-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)、血管紧张素2-7(Ang2-7)、血管紧张素3-7(Ang 3-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)。对于缓激肽蛋白水解级联，所述蛋白水解级联中涉及的肽(或肽降解产物)可选自胰激肽(KD或Lys-缓激肽)及其生物降解产物，特别是缓激肽1-9(BK1-9)、缓激肽2-9(BK 2-9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。在一个实施方案中，所述一种或多种肽降解产物可选自一种或多种蛋白水解级联中涉及的肽，例如来自两种或多种蛋白水解级联，作为单独分开的级联或可例如通过一种或多种相同或类似的酶或肽而相关或关联的级联。在一个实施方案中，所述蛋白水解级联是肾素-血管紧张素体系(RAS)或缓激肽体系或这两者。例如，所述一种或多种肽降解产物可选自RAS和缓激肽体系。在一个实施方案中，所述肽降解产物选自血管紧张肽原、血管紧张素I(Ang 1-10)、血管紧张素2-10(Ang 2-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素III(血管紧张素2-8或Ang 2-8)、血管紧张素IV(血管紧张素3-8或Ang 3-8)、血管紧张素1-9(Ang 1-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)、血管紧张素2-7(Ang 2-7)、血管紧张素 3-7(Ang 3-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)、胰激肽(KD或Lys-缓激肽)、缓激肽1-9(BK 1- 9)、缓激肽2-9(BK 2-9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。 [0018] 在一个实施方案中，所述肽降解产物选自血管紧张素I(1-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)。在一个实施方案中，被定量的肽降解产物是血管紧张素I(1-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)。 [0019] 在另一个实施方案中，所述肽降解产物选自血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang1-5)。在一个实施方案中，被定量的肽降解产物是血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang1-5)。 [0020] 在另一个实施方案中，所述肽降解产物选自缓激肽1-9(BK 1-9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。在一个实施方案中，被定量的肽降解产物是缓激肽1-9(BK 1-9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。 [0021] 在另一个实施方案中，所述肽降解产物选自缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。在一个实施方案中，被定量的肽降解产物是缓激肽1-8(BK 1- 8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。 [0022] 如本文所用的术语“蛋白水解级联中涉及的酶”或“蛋白水解级联的酶”应指为所述给定蛋白水解级联组成部分的酶，其形成或降解所述蛋白水解级联中涉及的至少一种肽。相应地，对于RAS蛋白水解级联，所述蛋白水解级联中涉及的酶可选自肾素、氨肽酶(AP，特别是氨肽酶A(APA)和氨肽酶N(APN))、二肽基氨肽酶(DAP)、羧肽酶(特别是ACE2)、二肽基羧肽酶(特别是ACE)和内肽酶(特别是中性内肽酶，也称为脑啡肽酶)。对于缓激肽蛋白水解级联，所述蛋白水解级联中涉及的酶可选自激肽释放酶、氨肽酶(AP，特别是氨肽酶A(APA)和氨肽酶N(APN))、二肽基氨肽酶(DAP)、羧肽酶(特别是ACE2)、二肽基羧肽酶(特别是ACE)和内肽酶(特别是中性内肽酶，也称为脑啡肽酶)。如本文所用的术语“实际”意指，在如样品中存在的条件下，肽的实际(或有效)的形成或降解率，或酶的实际或有效的转换率。 [0023] 如本文中所用的术语“等于”意指，所述肽的任何这类相等同的形成或降解率所导致的肽浓度(“稳态平衡肽浓度”或“稳态平衡肽水平”)，或所述肽的形成或降解中涉及的至少两种酶的任何这类相等同的转换率(“稳态平衡酶转换率”)所导致的肽浓度，在至少30分钟(min)、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟的时间段内不变化超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。相应地，所述肽的降解中涉及的酶的实际总体转换率由其底物肽的实际总体形成率来决定，从而使得任何新形成或额外形成的底物被降解。但是，这不必然意味着所述肽的净浓度是零，而是如样品中存在的处于稳态平衡的净浓度如上进一步所述不显著改变。 [0024] 相应地，在本发明的一个实施方案中，尽管存在连续的形成和降解流，所述蛋白水解级联的至少一种肽降解产物的浓度在稳态平衡期间内保持在恒定范围之内。在本发明的一个实施方案中，处于稳态平衡的所述至少一种肽降解产物的浓度在至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟的时间段内不变化超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施方案中，处于稳态平衡的所述至少一种肽降解产物的浓度在60分钟内不变化超过 15％，或不超过10％。相应地，所述肽在上述时间段期间既不显著累积也不显著减少。 [0025] 在一个实施方案中，在样品中定量处于稳态平衡浓度的所述至少一种肽降解产物之前，将所述样品温育长达15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或长达300分钟。在另一个实施方案中，可将所述样品温育超过6小时(h)，特别是长达8h、12h、18h、24h或长达48h。适宜的温育时间段主要取决于给定的蛋白水解级联，待定量的肽分析物、样品的性质以及温育参数。这样的温育时间段可容易地由本领域技术人员来确定。在一个实施方案中，在温育后保存(或稳定或冻结或猝灭)所述稳态平衡。如本文所用的术语“保存”、“稳定”、“冻结”和“猝灭”应指保存生化状态，例如保存肽水平，例如通过对蛋白水解降解的抑制。对稳态平衡肽水平(或体内肽水平)的稳定可通过加入一种或多种蛋白酶抑制剂、特别是加入蛋白酶抑制剂混合物来进行。相应地，一种或多种蛋白酶抑制剂可在温育直至对至少一种肽降解产物达到稳态平衡后加入。适宜的蛋白酶抑制剂或其组合可由本领域技术人员选择，且可例如包含特异性或非特异性酶抑制剂的组合或其组合。所述一种或多种蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物确保特别是所述级联中感兴趣的蛋白水解步骤(即形成和降解待测量的肽的酶)或者所述蛋白级联的每种酶受到完全抑制。 [0026] 在一个实施方案中，所述蛋白水解级联的每个步骤都受到抑制，即所述蛋白水解级联中涉及的每种酶被所述蛋白酶抑制剂混合物的至少一种组分抑制。在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂混合物包含对所述蛋白水解级联中涉及的每一类蛋白酶的至少一种特异性或非特异性抑制剂。所述蛋白酶抑制剂混合物可包含抑制所述蛋白水解级联中涉及的一种或多种酶的一种或多种抑制剂。对RAS的这类抑制剂的实例是赖诺普利(ACE抑制剂)和阿利吉仑(肾素抑制剂)。所述蛋白酶抑制剂混合物还可包含抑制所述蛋白水解级联中涉及的一组或多组酶的一种或多种抑制剂，例如EDTA(抑制金属蛋白酶)。此外，所述蛋白酶抑制剂混合物可包含一种或多种非特异性抑制剂。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂混合物包含上述类别抑制剂中至少两种的组合。在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂包含对供给(feeding)酶的一种或多种抑制剂，特别是对供给酶的特异性抑制剂。 [0027] 例如，将至少两种、至少三种或至少四种蛋白酶抑制剂加入样品中。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂混合物包含胃酶抑素A、1，10-二氮杂菲、EDTA、对羟基汞基苯甲酸和Z-Arg。 [0028] 或者，或除了使用一种或多种蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物外，稳态平衡可通过添加一种或多种离散剂来保存，所述离散剂诸如碘化钠、高氯酸钠、高氯酸锂、氯化镁、硫氰酸胍(GTC)、氯化胍、苯酚、丙醇、丁醇、乙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、尿素或其它。 [0029] 或者，或除了使用一种或多种蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物外，稳态平衡可通过对样品中的酶的其它物理灭活方式来保存，例如由热、盐、pH或去污剂诱导的酶变性；或通过冷却，例如温育后直接将样品置于冰上。对于一个或多个对所述样品的进一步加工处理步骤，例如血浆或血清分离和通过固相提取(SPE；例如用于基质耗尽和/或肽富集)分离，也可选择相符的环境温度以确保样品中的所有酶都是无活性的。例如，在样品分析之前的任何样品预处理或样品加工处理可在4℃环境温度(或更低)进行，至少直到蛋白水解级联中涉及的酶完全变性或灭活(例如直到从SPE柱洗脱)。 [0030] 相比之下，经典的PRA测定旨在取样后立即对Ang I降解途径完全抑制，且酶活性基于由所述酶形成的肽的累积率来计算。即使在这类PRA测定中对Ang I降解途径的抑制可以是不完全的，它们仍远离根据本发明的任何稳态平衡，因为Ang I的净浓度随时间而显著改变。在例如Bystrom等人(Clin.Chem.56(2010),1561-1569)所述的PRA测定中，Ang I浓度随时间显著增加。此外，现有技术的测定通过用基于ELISA和RIA的方法测量血浆样品中构象活化形式的肾素来寻求评估RAS的总体活性(DRG Diagnostics,http://www.drg-diagnostics.de/49-1-DRG+Renin+active+ELISA.html)。与RSSE-指纹分析相比，这些测定关键取决于所用抗体的特异性，且无法获得关于样品中负责产生RAS生理学效应的效应肽的浓度的结论。其原因是存在多种影响效应肽水平的酶。所有这些酶通过RSSE-指纹分析同时进行分析，而现有技术测定集中于每一样品仅一种酶活性或浓度。 [0031] 在本发明的一个实施方案中，在稳态平衡中，供给酶的实际转换(turnover)率是最大的，即供给底物以与供给酶相比巨大摩尔过量存在，且外部供给底物的任何添加都不会进一步增加供给酶的实际转换率。相应地，蛋白水解级联的供给酶是负责供给转化反应的酶，该反应即随后蛋白水解级联的限速步骤(或蛋白水解级联的瓶颈)。对于生理条件下的RAS蛋白水解级联，所述供给酶是肾素，其负责血管紧张肽原向血管紧张素I的转化。在生理系统中(例如在体内、在血液、血浆或血清样品中)，血管紧张肽原作为肾素的底物以较肾素的巨大摩尔过量存在。然而，在本发明的一个实施方案中，RAS蛋白水解级联的一种或多种酶或所有其它酶，如氨肽酶(特别是APA和/或APN)、二肽基氨肽酶、羧肽酶(特别是ACE2)、二肽基羧肽酶(特别是ACE)和/或内肽酶(特别是中性内肽酶，也称为脑啡肽酶)，以足以降解任何新形成或额外形成的底物的浓度存在于样品中，从而允许在温育期间对所述酶和肽建立稳态平衡，即它们的实际总体转换率由其底物肽的实际总体形成率来决定。 [0032] 根据本发明，术语“供给酶”应指具有最大实际转换率的酶，即其实际转换率是对于样品中所述酶的最大可实现转换率。术语“最大可实现转换率”应指，如果底物肽是(或将会)以与酶相比巨大摩尔过量(或实质上无穷尽的量)存在至少直至达到稳态平衡，可在样品中给定条件下实现的样品中所含酶的转换率。相应地，供给酶的实际转换率不能通过加入外部底物而进一步增加，因为供给底物已经以与供给酶相比的巨大摩尔过量存在。如果例如在温育直至达到稳态平衡之前或期间将任何外部底物肽(即所述蛋白水解级联中涉及的肽)或这类底物的类似物加入样品，这可-根据本发明的定义-导致所述蛋白水解级联的限速步骤的改变，因而也导致所述蛋白水解级联的供给酶的改变，如果加入底物肽的量足以导致所述底物肽的降解中涉及的至少一种酶(即生理条件下除供给酶以外的酶)的最大可实现转换率的话。例如，如果所研究的蛋白水解级联是RAS，并且如果在温育直至达到稳态平衡之前或期间将与Ang 1-10降解中涉及的一种或多种或所有酶相比巨大摩尔过量的Ang1-10(或其类似物，例如携带质量标记或任何共价修饰包括氨基酸替换的Ang 1-10)加入样品中，Ang 1-10降解中涉及的至少一种或甚至所有的酶(例如ACE、ACE2、AP和/或NEP)会达到最大可实现转换率，因而会成为级联中随后蛋白水解反应的限速供给步骤。 [0033] 在本发明的一个实施方案中，可将供给酶加入样品中。供给酶的加入增加酶级联的流通(flow-through)，从而导致肽绝对水平增加而相对水平(肽比率)保持不变。相应地，所述一种或多种酶的稳态平衡水平仍然反映生理情况，即酶活性，但总体肽水平成比例地增加。例如如果不添加供给酶测得的肽水平会低于用于定量所述肽的方法的检测限，这将会是有用的。可选地，也可加入供给底物。这可确保供给底物是并且保持与供给酶相比处于摩尔过量，且供给底物仍然以实质上无穷尽的量存在，导致供给酶的转换率保持稳定持续定义稳态平衡的特定时间，即使加入了供给酶。 [0034] 在进一步的实施方案中，在稳态平衡中，供给酶的产物(即供给酶所形成的肽)的实际总体降解率等于其实际总体形成率。在另一个实施方案中，所述蛋白水解级联是RAS，且根据上述定义供给酶的产物是Ang I。在所述实施方案中，如果在样品中仅仅一种酶促Ang I降解途径“开放”(即仅一种Ang I降解酶有活性)的话，处于稳态平衡的所述Ang I降解酶的实际转换率等于肾素(其为Ang I形成酶)的实际转换率。如果样品中多于一种Ang I降解酶有活性，则在所述实施方案中所述活性Ang I降解酶的实际转换率的总和(即Ang I的实际总体降解率)等于肾素的实际转换率(即实际总体Ang I形成率)。 [0035] 在另一个实施方案中，在稳态平衡中，所述蛋白水解级联中涉及的多于一种肽(特别是两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种肽)的实际总体降解率等于所述肽的实际总体形成率。在又一个实施方案中，在稳态平衡中，所述蛋白水解级联中涉及的每种肽的实际总体降解率等于所述肽的实际总体形成率。 [0036] 相应地，对于一种或多种肽及相关的酶(即形成或降解所述肽的酶)达到稳态平衡。如上所述，如果所述蛋白水解级联中涉及的至少一种肽、两种或多种肽或所有肽的净浓度在至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟的时间段内不变化超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％，则达到稳态平衡。当将样品温育15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、 60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟，或者8、 12、18、24或48小时后，达到所述稳态平衡。所述稳态平衡持续至少30分钟、60分钟、90分钟、 120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟。 [0037] 在本发明的一个实施方案中，在稳态平衡中，所述蛋白水解级联中涉及的至少一种肽的总体最大可实现降解率等于或高于其实际总体形成率。根据本发明，肽的最大可实现降解率是在给定条件下在与降解所述肽的每种酶相比巨大摩尔过量的所述肽(或实质上无穷尽量的所述肽)(即通过加入外部肽)存在下可实现的总体降解率。相应地，肽的最大可实现降解率是所述肽降解中涉及的所有酶的最大可实现转换率的总和。 [0038] 在一个实施方案中，在温育时间开始时，所述蛋白水解级联中涉及的所有酶的量超过其各自底物的量，所述蛋白水解级联的供给酶除外。在另一个实施方案中，所述蛋白水解级联中涉及的所述一种或多种酶或所有酶的量在整个温育期间超过其各自底物的量，所述蛋白水解级联的供给酶除外。 [0039] 在另一个实施方案中，如上所述的条件(即酶的量超过各自底物的量，和/或在稳态平衡时肽的形成率等于降解率)至少适用于有待分析的一种或多种肽，和/或形成或降解所述有待分析的肽的各种酶。 [0040] 例如，如果本发明方法用于检查RAS蛋白水解级联的一种或多种组分，且有待分析的肽是例如Ang 1-10和Ang 1-8，这意味着直至达到稳态平衡，肾素对Ang 1-10的实际形成率高于Ang 1-10降解中涉及的所有酶(包括但不限于ACE、氨肽酶和ACE2)的实际降解率的总和；ACE对Ang 1-8的实际形成率高于Ang 1-8降解中涉及的所有酶(包括但不限于ACE2、AP和/或DAP)的实际降解率的总和。相应地，Ang 1-10和Ang 1-8浓度增加，即Ang 1-10和Ang 1-8累积，直至达到稳态平衡。当达到稳态平衡时，Ang 1-10的实际形成率等于Ang 1-10降解中涉及的所有酶的实际转换率的总和(Ang 1-10的实际总体降解率)；且Ang1-8的实际形成率等于Ang 1-8降解中涉及的所有酶的实际转换率的总和(Ang 1-8的实际总体降解率)。如果例如RAS中涉及的所有十种肽都有待分析(例如图2、3和4A、4C1和4C2所示)，上述条件应适用于所有十种肽或RAS中涉及的所有酶。 [0041] 相应地，在本发明的稳态平衡的一个实施方案中，至少一种蛋白水解降解反应必须对于所述蛋白水解级联的至少一种特别是每种肽是活跃或“开放”的，其程度使得所述肽的实际总体降解率等于其实际总体形成率，即不被例如使用一种或多种蛋白酶抑制剂所抑制或“关闭”至所述肽的实际总体形成率超过实际或最大可实现总体降解率的程度。 [0042] 在一个实施方案中，在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间不加入螯合剂，例如EDTA、EGTA、8-羟基喹啉、邻二氮杂菲和二巯基丙醇(也称为British-anti-Lewisite或BAL)，特别是对于RAS级联或其它涉及金属蛋白酶的蛋白水解级联，因为螯合剂通过螯合二价离子对金属蛋白酶有抑制作用。 [0043] 在一个实施方案中，在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间不加入离散剂，例如碘化钠、高氯酸钠、高氯酸锂、氯化镁、硫氰酸胍(GTC)、氯化胍、苯酚、丙醇、丁醇、乙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、尿素和/或其它。 [0044] 在一个实施方案中，在对所述蛋白水解级联的生理条件下达到稳态平衡，这意味着所述蛋白水解级联的组分(酶和底物或产物肽)，其如取自机体的生物样品存在中的总量和/或相对量，以及就样品的组成和/或pH而言的基质，在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间不经修改或不经实质性修改。在一个实施方案中，如取自机体的生物样品中存在的所述蛋白水解级联中涉及的酶和/或肽的浓度在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间不经修改。 [0045] 在另一个实施方案中，在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间不加入所述蛋白水解级联中涉及的任何酶的底物或底物类似物，如内标或降解标准，无论以其天然形式或通过标记修饰(例如同位素和/或荧光标记，和/或氨基酸修饰或至少一个氨基酸的替换)。在本发明的一个实施方案中，所述蛋白水解级联是RAS，且在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间既不加入血管紧张肽原、血管紧张素I和/或血管紧张素II，也不加入其任何类似物。 [0046] 在另一个实施方案中，在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间，不加入进一步的物质或试剂，例如缓冲物质(Tris、PBS、MES、HEPES、柠檬酸盐、硼酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐(或重碳酸盐)和/或其它缓冲物质或各自相应的缓冲溶液。 [0047] 在又一个实施方案中，在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间，不加入诸如EDTA、EGTA、PMSF、AEBSF、BSA、马来酸、马来酸酐、甲酸和/或水(任何形式，例如去离子和/或蒸馏等)的物质或试剂。 [0048] 但是，尽管如前所述，一旦达到稳态平衡并任选地加以猝灭，可加入一种或多种这类上述的蛋白酶抑制剂、螯合剂、离散剂、底物、标准、BSA、缓冲剂和/或其它物质或试剂。 [0049] 特别是，一旦达到稳态平衡并冻结，可加入一种或多种标准物，例如内标和/或降解标准。标准是例如所述蛋白水解级联的肽，其通过质量标记和/或化学标记修饰(例如同位素和/或荧光标记，和/或氨基酸修饰，和/或使用质量标签，和/或至少一个氨基酸的替换)。相应地，内标是稳定同位素标记的内标，例如WO 03/016861 A中所披露的。 [0050] 在一个实施方案中，将生物样品如取自受试对象般(离体)温育，即样品的基质和/或有待分析的蛋白水解级联的组分的浓度不经修改，但可选地可进一步加工处理(例如以获得血浆或血清)，在达到稳态平衡并稳定之前或之后。可选地，可在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间向生物样品中加入抗凝剂，即防止凝血(阻止血液凝结)的物质。但是，这类抗凝剂不应实质性影响有待分析的蛋白水解级联的蛋白酶。用于本发明方法的一种适宜抗凝剂是肝素。 [0051] 如果有待分析的蛋白水解级联是凝血级联，本领域技术人员可确定在温育直至达到稳态平衡之前或期间加入样品的适宜抗凝剂，其会阻止血液凝结但仍会允许对有待分析的至少一种肽建立稳态平衡。例如，可选择这样的抗凝剂，其在蛋白水解级联更下游的步骤抑制凝血，即不抑制有待分析的肽的降解中涉及的任何酶(蛋白水解级联的上游)。 [0052] 在分析之前，可对样品进行预处理或进一步加工处理，例如通过血浆或血清分离(例如通过离心或激活凝血然后离心)，和/或通过固相提取(SPE)纯化，例如用于基质耗尽和/或肽富集。相应地，固相提取可用反相色谱材料、疏水相互作用色谱材料、离子交换材料、亲和色谱材料来进行，例如反相色谱材料，特别是C18、C8或C6H5(苯基)材料。 [0053] 在一个实施方案中，所述一种或多种分析物在从固体表面洗脱后被浓缩至干，并可在HPLC相容性溶剂(意味着溶剂的组成不干扰所述一种或多种分析物与MS偶联HPLC柱的结合)中复原。复原溶剂是例如水性溶剂，其可补充有添加剂包括丙醇、丁醇、2-丁醇、戊醇、2-丙醇、丙酮、甲乙酮、乙腈、甲醇、乙醇、酸或碱以增加分析物的溶解度和/或促进分析物与HPLC柱结合。 [0054] 在另一个实施方案中，根据本发明的方法包括步骤：提供用抗凝剂处理的样品；可选地，进一步加工处理所述样品以获得血浆或血清样品；将样品温育直至对蛋白水解级联中涉及的至少一种肽降解产物达到稳态平衡；保存所述稳态平衡；可选地，一旦稳态平衡得以保存，加入一种或多种内标；对样品进行固相提取；和分析样品。血浆或血清分离可在温育直至达到(并可选地稳定)稳态平衡步骤之前或之后进行，取决于是要在血浆、血清或全血中研究所述稳态平衡。 [0055] 对所述稳态平衡浓度的至少一种肽降解产物的分析可例如通过质谱法(MS)；通过液相色谱法，如高压液相色谱法(也称为高效液相色谱法，HPLC)；特别是通过液相色谱-电喷雾电离-质谱法(LC-MS)和/或液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)来进行。例如Cui等人(Anal Biochem.369(2007),27-33)公开了液相色谱-电喷雾电离-质谱和液相色谱-串联质谱方法来定量血管紧张素肽。对于每种肽和对应的内标，可测量不同的质量跃迁(mass transition)。所述方法的性能表现可用质量控制样品来监测。 [0056] 这类质量控制样品可包括例如具有预定分析物浓度的生物样品，以及包含预定浓度合成肽混合物的合成样品。例如，质量控制样品可以是合并的血液、血浆或血清样品或合并的组织匀浆样品，其具有预定浓度的一种或多种肽。血管紧张素肽浓度可通过将内源肽信号与内标信号相关联来计算，条件是集成信号(integrated signal)达到10以上的信噪比。 [0058] 在一个实施方案中，样品预处理、样品加工处理和/或样品分析可以多孔格式例如在96孔板上进行。 [0059] 本发明提供了分析受试对象的生理或生化状态的新工具，其基于对受试对象中一种或多种蛋白水解级联的观察，特别是在受试对象的血液系统中。特别是，本发明的方法允许确定蛋白水解级联稳态条件下的多种肽水平。而且，本发明的方法允许以隔室(compartment)特异性方式评价蛋白水解级联，例如可在不同隔室如全血、血清以及血浆中分析RAS。根据本发明对蛋白水解级联的肽降解产物的测量提供了受试对象生理或生化状态的“指纹样”结果，或受试对象的“指纹样”酶活性谱，其可表明某些特定疾病存在与否或对该疾病的治疗是否有效(当然条件是所述疾病直接或间接影响所述蛋白水解级联)。此外，本发明的方法允许比较体内指纹(样品被立即稳定，因而反映循环肽水平)和离体指纹(血浆、血清或全血中的稳态平衡肽水平)。 [0060] 相应地，根据本发明的方法可用于研究总体的蛋白水解级联，其在患者或患者群体中的生理或生化状态，用于诊断直接或间接与所述蛋白水解级联(或其变异)相关的疾病，确定对于这类疾病的疗法或治疗方案，确定固定剂量组合，调查作用机制，使与药物有关的副作用或不良事件最小化，或调查在使用中的药物或候选药物的药理学，例如调查短期和长期作用或毒性。 [0061] 此外，根据本发明的方法可用于筛选和开发新药物、生物标记或生物标记参数，特别是在所述药物或生物标记的生理基质中的这类筛选。 [0062] 在一个实施方案中，根据本发明的方法用作为对与用本发明方法进行研究的蛋白水解级联相关的病理状况或疾病的生物标记测定。例如，不仅一种肽降解产物的浓度，而且包含根据本发明所研究的蛋白水解级联中涉及的数种或所有肽的整个稳态平衡指纹(SSE-指纹)，和/或两种或多种肽降解产物的浓度的数学函数(例如乘积、比率、总和、差异)，和/或所述数学函数中至少两种的组合，都可用作为生物标记(或生物标记编辑)。 [0063] 在另一个实施方案中，根据本发明的方法可用于确定对于治疗的特定患者群体，例如鉴别治疗的响应者和无应答者。 [0064] 根据本发明的方法还可用作伴随式诊断(companion diagnostics)。伴随式诊断是旨在协助医师对其患者做出治疗决定的测定(检验或测量)。它们是通过提供关于药物如何在体内起效的信息并因此阐明特定药物或药物类别对单一患者、定向患者群体或子群的效力和/或安全性来这样做的。有两组主要的伴随式诊断，包括用于已经上市的药物的测试，以及已经用于潜在药物的临床前或临床开发期的测试。对已经处于早期开发的药物使用伴随式诊断，通过以更快、更具成本效益的方式产生具有更少副作用、具有增强治疗效力的更安全药物，而具有显著改变药物开发过程和候选药物商业化的潜能。 [0065] 相应地，取生物样品的受试对象可已用一种或多种药物组合物例如包含蛋白酶抑制剂的药物组合物进行治疗(体内)，特别是如果根据本发明的方法用于监测药物组合物的作用，或确定药物组合物的最佳剂量，或评估一种或多种药物组合物的任何潜在毒性相互作用，或调查多种药物相互作用。 [0067] 根据本发明的方法是对于血液样品中蛋白水解级联的总体评价的标准化操作，也适于其它样品中的蛋白水解级联，特别是组织活检、组织匀浆、组织切片、液体、胆汁、尿等。本发明原则上可用于发生在血液系统中的所有蛋白水解级联(在将蛋白质或肽酶促切割成肽降解产物为代谢产物或蛋白水解级联的中间产物或终产物的控制下)。本发明特别适于人类血液系统中最相关的蛋白水解级联，如RAS、凝血级联、补体系统、凋亡途径、神经肽级联、内皮素肽级联、利尿钠肽级联。本发明提供了测量稳态平衡肽浓度的方法，所述浓度反映其代谢酶的活性和转化率。在该上下文中肽的稳态平衡浓度意指其形成率等于其降解率，导致肽浓度持续一段特定的时间不随时间而实质性或显著改变，且该肽浓度强烈取决于所述酶与其底物在给定条件下的亲和力而非最大酶转化率，如上详述。由于本发明涉及生物体系，显然术语“稳态平衡”不能被认为是有待达到的单一一点，而更是肽浓度的动态靶区域，其持续一段特定时间不随时间而显著改变。直至达到这类稳态平衡浓度的更准确时间段主要取决于给定的蛋白水解级联、有待定量的肽分析物、样品的性质和温育参数。对于每种级联，这可容易地确定。一般而言，“稳态平衡窗”-在其中可进行根据本发明的定量-相当大，至少对于一些蛋白水解级联而言，特别是在血液中的那些。通常，稳态平衡在特定温育时间(其根据经验确定，例如对于RAS体系为30分钟)后达到，然后保持稳定延续一段时间(例如对于RAS体系为6小时)。然后稳态平衡受到诸如所涉及酶的降解和失活或样品中缺乏供给底物的影响作用而被扰乱。对于给定级联基于供给底物浓度的稳定性时间(ts)可通过将供给底物(或供给前体肽)浓度(cf)减去定义实现样品中供给酶最大转换率的最小底物浓度的酶-和样品-特异性常数(cmin)除以级联的供给酶的转换率从而定义级联的供给率(Vf)来计算。 [0068] tS＝(cf-cmin)/Vf [0069] tS 基于供给底物浓度的稳定性时间[h] [0070] cf 供给底物浓度[mol/L] [0071] cmin 实现样品中供给酶的最大转换率的样品特异性最小底物浓度[mol/L][0072] Vf 剂量的供给率[[mol/L]/[h]] [0073] 且 [0074] cmin＝f·cE [0075] f 过量系数 [0076] cE 供给酶浓度 [0077] 例如，将上面这些公式应用于RAS，其中供给转化由肾素进行，经计算生成RAS稳态平衡的基于供给底物浓度的稳定性时间为大约60-200小时，这是基于对PRA(血浆肾素活性)、PRC(血浆肾素浓度)的不同公开值，参见例如[Nishiyama et al.2010,and Bystrom et al.,Clin.Chem.56(2010),1561-1569]，并应用例如70μg/ml血浆的AGT浓度和例如1000的过量系数。当然，所述经计算的基于供给底物浓度的稳定性时间只应充当粗略和理论性的参考点，因为实际的稳态平衡稳定性时间在样品中可显著不同。 [0078] 根据本发明的方法特别适于监测和分析Ang 1-10及其降解产物，从而观察人血液样品中RAS的状态。Ang 1-10及其降解产物的稳态平衡浓度高度指示受试对象的生理或生化状态。例如，偏离Ang 1-10降解产物的正常分布表明RAS和/或缓激肽体系的酶功能障碍，其可导致例如血压的病理性升高或其它病理状况或疾病。另一方面，从根据本发明处于稳态平衡的Ang 1-10降解产物的分布和相对浓度，可以监测靶向RAS的治疗性疗法的类型和有效性。令人惊讶的是，根据本发明的稳态平衡浓度提供比测定血液样品中Ang 1-10或其它降解产物但不使其达到稳态平衡(即立即稳定的“经典”血液样品)要好得多的指示和关联。 [0079] 与其中成功率有限地使用抑制剂立即稳定某些特定酶产生的肽[Bystrom等人,Clin.Chem.56(2010),1561-1569]的现有技术方法相比，根据本发明，使样品对于蛋白水解级联中涉及的至少一种肽达到酶活性定义的稳态平衡。这种创新的途径使得在生理样品基质中对蛋白水解级联特别是RAS的总体评价高度可重复，同时整合了所述蛋白水解级联的肽的代谢中涉及的所有酶活性。另一个相对现有技术的优势是，根据本发明测定中的底物浓度一般保持低于代谢酶(除外供给酶)的浓度，考虑到所述酶对于每个单一底物在样品中给定条件(例如生理条件)下的亲和力，这与体外酶活性测定形成对比，后者因通过使用过量的底物的简化手段而忽视了这个重要特征。 [0080] 最后，通过根据本发明方法测量稳态平衡肽水平可鉴别患者样品中解除调节(de-regulation)的潜在位点，为在治疗性操纵受患者疾病影响的蛋白水解级联中提供患者特异性途径(例如在高血压治疗中选择RAS靶向药物治疗的类型和预测耐药性)铺平了道路，并且对于该方法用于发现生物标记具有显著潜能。 [0081] 本发明因此提供了用于诊断性分析的优异离体平台，特别是用于诊断与蛋白水解级联特别是RAS相关的疾病。这类与RAS相关的疾病包括例如高血压、心脏疾病特别是充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、动脉硬化、心肌梗塞、肾脏疾病特别是肾衰、糖尿病性肾病、肺疾病特别是急性肺损伤和/或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肝脏疾病特别是纤维化、炎性疾病特别是脓毒症、关节炎、风湿病(rheumatitis)和/或癌症。本发明还适于对患者的大量常规分析，用于例如鉴别影响RAS的物质、评价影响RAS的物质的作用和/或监测处于影响RAS的药物治疗的患者。这类影响RAS的药物治疗可包括一种或多种活性成分，例如氨肽酶抑制剂，特别是阿吗他定；ACE抑制剂，特别是卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、哌林多普利、喹那普利、雷米普利、群多普利、苯那普利；血管紧张素II受体拮抗剂，特别是坎地沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、洛沙坦、奥美沙坦、替米沙坦、缬沙坦；醛固酮受体拮抗剂，特别是依普利酮、螺内酯；和/或ACE2，特别是重组可溶性人ACE2，和肾素抑制剂，特别是阿利吉仑。 [0082] 具体地对于血液样品，对于对蛋白水解级联中涉及的至少一种肽达到稳态平衡而言重要的是，有待用本发明方法观察的蛋白水解级联的蛋白酶不受向样品加入蛋白酶抑制剂的抑制，至少不被抑制到这样的程度：即不允许所述至少一种肽的降解中涉及的至少一种酶发挥作用直至对所述至少一种肽达到稳态，也即所述肽的至少一种降解酶必须保持活性至对所述肽允许稳态平衡的程度。因此，在一个实施方案中，在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间，向样品中添加蛋白酶抑制剂的程度不使得有待分析的至少一种肽的形成和降解中涉及的蛋白酶的活性受到显著抑制。根据所述实施方案，样品不与这类蛋白酶抑制剂合并，或者如果已经加入了这类抑制剂，则在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间抑制(就其蛋白酶抑制功能)或除去这类抑制剂。当然，不影响应通过根据本发明方法研究的相关蛋白水解级联的蛋白酶、但抑制其它蛋白水解活性(例如如果研究RAS的话，凝血的抑制剂)的抑制剂可加入样品中，因为这不会影响相关蛋白水解级联(即有待分析的级联，例如RAS)达到对所述级联的至少一种肽的稳态平衡的能力。 [0083] 蛋白水解级联存在于很多种生理过程中，从对蛋白质(例如食物蛋白或有待从机体细胞或体液排除的蛋白质)的简单消化，到高度调节的级联，如RAS或凝血系统。蛋白酶可裂解特异性肽键(有限的蛋白水解)，取决于蛋白质的氨基酸序列，或者将整个肽分解为氨基酸(无限的蛋白水解)。对肽键的特异性切割是调节复杂生物过程的中枢机制。特别是肽激素经常作为以过量存在于循环中的无活性的前体肽产生。必需由选择性蛋白酶来释放活性激素，其然后再被其它蛋白酶降解。 [0084] 在一个实施方案中，可根据本发明分析的样品的类型是血液样品。根据本发明的“血液样品”可以是任何含有血液或一种或多种其级分(含有相关蛋白水解级联的蛋白酶)的样品。具体而言，常规由人类供体提供的所有血液样品都可根据本发明而使用，即全血、血浆或血清，特别是新鲜或冷冻的抗凝全血或者新鲜或冷冻的抗凝血浆。“抗凝”血液或血浆含有抗凝剂，即防止凝血(阻止血液凝结)的物质，其当然不影响有待分析的蛋白水解级联的蛋白酶达到稳态平衡的能力。适宜的抗凝剂是肝素；肝素化血液样品因此是根据本发明方法的适宜源材料。在应用根据本发明的方法之前可对肝素化血液样品作进一步加工处理。例如，肝素化血浆或血清可源自血液样品。或者，根据本发明的方法也可对全血进行，即所有血细胞仍然存在(以及在这类细胞之上或之中的蛋白酶)。更通常起到蛋白酶抑制剂作用的抗凝剂，如柠檬酸盐或EDTA，不那么适宜；或者，作为备选方案(如果样品例如已经含有这类抗凝剂)，可需要加入对这类蛋白酶抑制剂的中和物质以允许样品温育直至达到稳态平衡。 [0085] 以根据本发明的方法，可鉴别不只一种特异性肽或肽降解产物作为蛋白水解级联状态的标记。有可能分析多于一种所述级联的肽成员，从而允许对受试对象中该级联的生理或生化状态作再进一步微调的分析。在本发明过程中已显现，处于稳态平衡的蛋白水解级联的不同肽成员的相对量高度指示受试对象中该级联的生理或生化状态。例如，处于稳态平衡的两种或多种蛋白水解降解产物的摩尔量或浓度的比率可表明酶活性、相关生理状况或病变。本发明提供的一个实例是，处于稳态平衡时Ang 1-8与Ang 1-10的摩尔比(或其它Ang 1-10降解产物的相对比率)，其表明受试对象的RAS状态和/或应用于受试对象的影响RAS的治疗方案(例如用象赖诺普利、阿吗他定、ACE、ACE2、NEP等的物质进行治疗)。 [0086] 因此，本发明的一个实施方案包括对处于稳态平衡浓度的样品中蛋白水解级联的至少两种、至少三种、特别是至少四种肽降解产物的定量。以本发明的方法，有可能定量尽可能多(或如已知那么多)的处于稳态平衡的蛋白水解级联的降解产物，以得到对所述蛋白水解级联的状态的“指纹样”评估。 [0087] 根据本发明，必需定量所述处于稳态平衡的一种或多种蛋白水解降解产物。这在本质上区别于现有技术分析，后者通常在蛋白水解级联在从受试对象取样(即血液样品)后立即稳定(即非稳态平衡)的状态进行对分析物的定量。通常，这类现有技术样品已在取样后立即用蛋白酶抑制剂处理以抑制不想要的酶依赖性级联变化。然而本发明通过特别使得所研究的所述级联的蛋白酶实施其蛋白水解活性直至达到稳态平衡，使用这类酶依赖性变化来分析受试对象有关所述蛋白水解的生理或生化状态。这将通常导致所研究的蛋白水解级联中的肽降解产物的量和组成与在从受试对象取样后立即稳定的样品相比发生变化。根据本发明，样品特异性蛋白水解活性导致稳态平衡，其比立即稳定的样品(不进行根据本发明温育直至达到稳态平衡的步骤)对于受试对象有关该级联的生化状态有高得多的指示作用。 [0088] 如上所述，根据本发明的稳态平衡不是单一的、确切定量确定的和孤立的点，而是相对比率的变化已在样品中实质性减少的状态。通常，这样的稳态平衡可通过对给定样品和所研究的级联应用通常温育条件来达到。如上所述，可将样品温育长达15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或 300分钟。对于RAS和/或缓激肽体系，可将样品温育至少30分钟到至多300分钟，或者至少30分钟到至多180分钟，或者至少30分钟到至多120分钟，或者至少30分钟到至多90分钟，或者至少30分钟到至多60分钟。合适的温育温度是生理体系中存在的那些或者所研究的蛋白水解级联的蛋白酶具有其最佳作用温度的那些，例如30到50℃，35到40℃，或特别是大约37℃(特别是对于人类血液样品)的温度。 [0089] 如所述的，本发明在实施例部分作进一步例示，特别是就肾素-血管紧张素体系(RAS)和缓激肽体系。有待分析的一种或多种肽降解产物可选自血管紧张素肽类，如血管紧张素I(Ang 1-10)、血管紧张素2-10(Ang 2-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素III(血管紧张素2-8或Ang 2-8)、血管紧张素IV(血管紧张素3-8或Ang 3- 8)、血管紧张素1-9(Ang 1-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)、血管紧张素2-7(Ang 2-7)、血管紧张素3-7(Ang 3-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)；和/或激肽肽类，如胰激肽(KD或Lys-缓激肽)及其生物降解产物如缓激肽1-9(BK 1-9)、缓激肽2-9(BK 2-9)、缓激肽1-8(BK1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。 [0090] 在一个实施方案中，所述肽降解产物选自血管紧张素I(1-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)。在另一个实施方案中，所述肽降解产物选自血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)。在又一个实施方案中，所述肽降解产物选自缓激肽1-9(BK 1-9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)。 [0091] 由于根据本发明的方法应用了样品中所含的蛋白水解活性，所述一种或多种样品，特别是血液样品，在达到稳态平衡之前应无添加的对所述蛋白水解级联的蛋白酶抑制剂。 [0092] 这类蛋白酶抑制剂可在温育直至达到稳态平衡并稳定后加入。这保障了反映稳态平衡的肽浓度在定量步骤期间仍然存在(尽管稳态平衡通常在特定时间段内是稳定的，这为根据本发明的方法提供了额外的质量保证)。 [0093] 以根据本发明的方法，有可能监测RAS和/或缓激肽体系的状态。在一个实施方案中，至少两种肽降解产物被定量，并且计算所述至少两种肽降解产物的稳态平衡定量之比。相应地，本发明的一个实施方案采用对血管紧张素I(Ang 1-10)、血管紧张素2-10(Ang 2- 10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素III(血管紧张素2-8或Ang 2- 8)、血管紧张素IV(血管紧张素3-8或Ang 3-8)、血管紧张素1-9(Ang 1-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)、血管紧张素2-7(Ang 2-7)、血管紧张素3-7(Ang 3-7)和血管紧张素1-5(Ang 1- 5)、胰激肽(KD或Lys-缓激肽)及其生物降解产物如缓激肽1-9(BK 1-9)、缓激肽2-9(BK2- 9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)中至少两种的定量。然后，可计算那些至少两种肽降解产物的比率或乘积来提供特别指示样品中所述蛋白水解级联例如RAS的状态的参数。例如，Ang 1-8与Ang 1-10之间的稳态平衡浓度比表明ACE的生理或生化状态、功能和/或活性。相应地，处于稳态平衡的肽降解产物与其前体肽(即形成所述肽降解产物的酶的底物)之间的比率表明将所述底物切割成所述肽降解产物的酶的生理或生化状态、功能和/或活性。在一个实施方案中，计算肽降解产物与其前体肽之间多于一种比率。所述至少两种比率可再次彼此相关联，例如通过计算所述至少两种比率的比率或乘积，或通过比率的相加或减，或两者(计算总和和/或差异或相减之间的比率)。在另一个实施方案中，计算至少一个体内肽水平(立即稳定的)与处于稳态平衡的相同肽水平之间的比率。 [0094] 根据本发明的方法有赖于对肽降解产物的精确和准确定量。由于许多样品特别是血液样品含有蛋白质、盐、酸、碱、脂质、磷脂或其它组分，其可干扰肽定量，在定量之前可应用样品预处理方法。 [0095] 根据本发明的方法可通过使用试剂盒来进行。 [0096] 相应地，本发明在另一方面涉及用于测量处于稳态平衡浓度的生物样品中蛋白水解级联的肽降解产物的试剂盒。所述试剂盒可包含将样品温育特定时间段直至对所述蛋白水解级联的至少一种肽降解产物达到稳态平衡的指示说明。所述试剂盒可进一步包含一种或多种如上所述实施根据本发明的方法的指示说明。 [0097] 相应地，在一个实施方案中，用于测量处于稳态平衡浓度的生物样品中蛋白水解级联的肽降解产物的试剂盒(即实施根据本发明的方法的试剂盒)包含将一种或多种样品温育特定时间段直至对所述蛋白水解级联的至少一种肽降解产物达到稳态平衡的指示说明。可选地，所述试剂盒进一步包含一种或多种化学、生化和/或生物技术试剂，选自肽、酶、酶抑制剂、缓冲剂、溶剂、离散剂、去污剂及其组合。可选地，所述试剂盒进一步包含一种或多种化学、生化和/或生物技术实验室物品，选自固相提取材料或其它纯化材料、容器及其组合。可选地，所述试剂盒进一步包含一种或多种生物样品，选自血液样品、血清样品、血浆样品、组织样品及其组合。例如，所述生物样品可以是血液、血清、血浆和/或组织样品，且可用作为例如标准和/或质量控制。所述容器可以是管或采样小瓶，或适于包含化学、临床、生化和/或生物技术材料的任何其它标准容器。在一个实施方案中，所述容器是血液或组织容器。所述容器可选地包含一种或多种抗凝剂，例如肝素、EDTA和/或其它抗凝剂。所述容器可进一步包含一种或多种酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物，如以上或实施例部分进一步详述。 [0098] 在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种蛋白酶抑制剂或抑制剂混合物、一种或多种供给底物、一个或多个采血管(可选地涂有肝素)、一种或多种标准物、一种或多种质量控制样品、一种或多种固相提取材料和/或一种或多种溶剂或其组合。 [0099] 所述试剂盒的组成成分及试剂盒包含的指示说明进一步如上文就本发明方法所定义。将样品温育特定时间段直至对至少一种肽降解产物或催化级联达到稳态平衡的指示说明可例如包括有关如上文就本发明方法所述的方法、试剂和/或条件的信息，例如关于温育持续时间和条件、样品稳定和/或分析的信息。相应地，所述指示说明可包括进一步的说明，例如在温育直至达到稳态平衡之前和/或期间不要加入任何蛋白酶抑制剂，和/或要灭活或除去可能已加入的任何蛋白酶抑制剂。特定的应用，象基于稳态肽测量值测量单一蛋白酶活性或衡量某些蛋白酶抑制剂(或各自相应的药物组合物)对处于稳态平衡的蛋白水解级联和肽水平的影响，可能需要在温育达到稳态平衡之前添加某些特定的蛋白酶抑制剂。因此，所述指示说明可包括加入某些特定蛋白酶抑制剂的说明。但是，如上所述，至少一种蛋白水解降解反应对于所述蛋白水解级联的至少一种肽必须是有活性的，其程度使得所述肽的实际总体降解率等于其实际总体形成率。 [0100] 这样的指示说明可例如以纸质格式(例如作为册页或手册)或电子形式提供。这类指示说明可直接或间接附随着试剂盒，例如由试剂盒的生产厂家和/或供应商提供且包含在试剂盒包装中或以其它方式与试剂盒一起提供(例如通过来自试剂盒的生产厂家和/或供应商的电子邮件或通过从试剂盒的生产厂家和/或供应商的网页下载)。 [0101] 本发明另一方面涉及所述试剂盒用于测量处于稳态平衡浓度的生物样品中蛋白水解级联的肽降解产物的应用。试剂盒的这类应用进一步如上就根据本发明的方法所述。在一个实施方案中，所述试剂盒的应用包括将样品温育直至对所述蛋白水解级联中涉及的至少一种肽降解产物达到稳态平衡的步骤。在另一个实施方案中，所述试剂盒的应用包括定量样品中处于稳态平衡浓度的所述至少一种肽降解产物的步骤。 [0102] 根据另一方面，本发明涉及对根据本发明方法的定量结果或根据本发明试剂盒的应用结果以物理或电子形式呈现，其中至少两种肽降解产物定量在物理或电子载体上，且其中所述至少两种降解产物定量的量以所述蛋白水解级联的顺序提供。在其它实施方案中，至少三种或至少四种肽降解产物定量在物理或电子载体上，且所述至少三种或四种降解产物定量的量以所述蛋白水解级联的顺序提供。 [0103] 在根据本发明以物理或电子形式呈现的一个实施方案中，包括血管紧张素I(Ang 1-10)、血管紧张素2-10(Ang 2-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素III(血管紧张素2-8或Ang2-8)、血管紧张素IV(血管紧张素3-8或Ang 3-8)、血管紧张素 1-9(Ang1-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)、血管紧张素2-7(Ang 2-7)、血管紧张素3-7(Ang 3-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)、胰激肽(KD或Lys-缓激肽)及其生物降解产物如缓激肽1- 9(BK 1-9)、缓激肽2-9(BK 2-9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)中至少两种或至少三种的定量结果且依据其相对量来提供。 [0104] 相应地，这一物理或电子形式的呈现可以这样的形式提供，其中包括血管紧张素I(Ang 1-10)、血管紧张素2-10(Ang 2-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素III(血管紧张素2-8或Ang 2-8)、血管紧张素IV(血管紧张素3-8或Ang 3-8)、血管紧张素1-9(Ang 1-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)、血管紧张素2-7(Ang 2-7)、血管紧张素3-7(Ang 3-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)的定量结果且依据其相对量来提供。根据另一个实施方案，这一物理或电子形式的呈现可以这样的形式提供，其中包括胰激肽(KD或Lys-缓激肽)及其生物降解产物如缓激肽1-9(BK 1-9)、缓激肽2-9(BK 2-9)、缓激肽1-8(BK1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)的定量结果且依据其相对量来提供。 [0105] 在一个实施方案中，这一物理或电子形式的呈现可以这样的形式提供，其中包括血管紧张素I(Ang 1-10)、血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)的定量结果且依据其相对量来提供。 [0106] 在另一个实施方案中，这一物理或电子形式的呈现可以这样的形式提供，其中包括血管紧张素II(血管紧张素1-8或Ang 1-8)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素1-5(Ang 1-5)的定量结果且依据其相对量来提供。 [0107] 在又一个实施方案中，这一物理或电子形式的呈现可以这样的形式提供，其中包括缓激肽1-9(BK 1-9)、缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)的定量结果且依据其相对量来提供。 [0108] 在又一个实施方案中，这一物理或电子形式的呈现可以这样的形式提供，其中包括缓激肽1-8(BK 1-8)、缓激肽1-7(BK 1-7)和缓激肽1-5(BK 1-5)的定量结果且依据其相对量来提供。 [0109] 根据本发明这一对肽降解产物的物理或电子形式的呈现对任何医师而言都是有价值的诊断工具，其可显著协助诊断障碍或疾病(例如与RAS有关联的障碍或疾病)。其允许以“指纹样”方式在健康与疾病状态间进行比较(或疾病的不同阶段或治疗的不同阶段的比较)，即通过多参数呈现所得到的定量结果(如根据本发明的附图中图示法(“RAS-指纹”)所示)。这些结果可以以电子形式提供。在电子格式中，来自相同患者或对于人群或患者组的这些模式随时间的比较和发展可容易地进行分析和监测。在图示中，蛋白水解级联可描绘为使得本发明方法的结果不仅是定量结果，而且还是在诊断疾病和/或治疗中具有很高价值的复杂并且相互依赖的“指纹样”结果，其描绘肽浓度潜在的生化关联。根据本发明的这一工具因此可进一步改进对用根据本发明的方法获得的结果的应用。 [0110] 本发明进一步通过以下实施例和附图来描述，当然不受其所限： [0111] 图1显示RAS稳态平衡(RSSE)。(A)肝素血采集自健康供体且于37℃温育。在指示时间段后，将蛋白酶抑制剂混合物加入小份肝素化血液样品中以保存稳态平衡。显示血管紧张素1-10(蓝色)和血管紧张素1-8(绿色)的浓度，并与采集自相同供体、在采集期间立即稳定(冰，t＝0)的小份血液样品相比较。(B)在缺乏(红色；对照)和存在指示RAS抑制剂(蓝色)条件下测定肝素化血中的稳态平衡血管紧张素浓度。通过立即(0小时)或于37℃温育2小时和4小时后向样品加入蛋白酶抑制剂混合物来冻结稳态平衡。(C)在缺乏(红色；对照)和存在EDTA和AEBSF(蓝色)条件下测定肝素化血中的血管紧张素浓度。通过立即(0小时)或于37℃温育2小时和4小时后向样品加入蛋白酶抑制剂混合物来冻结温育。显示血管紧张素1-10和血管紧张素1-8的浓度。 [0112] 图2显示对RAS稳态平衡的药理学操纵。在2小时的温育期之前加入指示试剂，然后进行基于LC-MS/MS的RSSE指纹分析。结果显示为指纹图解，血管紧张素肽浓度显示为不同大小的球，代谢酶由蓝色箭头和字母表示。球下方的注释由肽名称和肽浓度(pg/ml血液)构成。对低分子量RAS抑制剂(A)、外源加入的RAS酶(B)和两者组合(C)显示了RSSE-指纹。 [0113] 图3显示RSSE-指纹分析的基质依赖性。从相同供体制备肝素化血液、血浆和进行一个冻融循环的血浆，并进行RSSE-指纹分析(实施2小时-37℃温育，然后向样品加入蛋白酶抑制剂混合物来保存稳态平衡，和进行LC-MS/MS分析)。给出了无药理学操纵的对照样品的指纹图(A)，并与在温育期前加入阿吗他定(B)或ACE2联合赖诺普利(C)的样品作比较。 [0114] 图4显示健康志愿者中的RAS-以及RSSE-指纹分析。在存在蛋白酶抑制剂混合物以保存如体内存在(即在任何平衡之前)的血管紧张素肽水平(RAS-指纹或体内RAS-指纹)条件下从健康志愿者采集血液样品，并与并行的进行温育直至达到稳态平衡(RSSE-指纹或离体指纹)的肝素化血液和血浆作比较。显示了对于12名健康志愿者的肝素血液和血浆的平均RAS-指纹(保存的体内肽水平)和平均RSSE-指纹(保存的离体生成的稳态平衡肽水平)(A)。计算对ACE的摩尔SSE-比率[fmol/ml Ang1-8]/[fmol/ml Ang 1-10],并与各受试对象供体相应的血管紧张素1-10和血管紧张素1-8浓度(pg/ml和fmol/ml)一起呈现(B)。表格显示对所有供体构成以下指纹的肽水平的值以及经计算的均值和SEM：RAS-指纹(图4B1；表1)，来自血液的RSSE-指纹(图4B2；表2)和来自血浆的RSSE-指纹(图4B3；表3)。显示了12名健康供体中2名的RAS-和RSSE-指纹，以及下面对摩尔SSE-比率的相应值(C；4C1：供体3， 4C2：供体6)。 [0115] 图5显示缓激肽体系的主要肽降解步骤的概观，即主要的缓激肽肽类和形成和/或降解那些肽的各种酶。 [0116] 图6显示肽水平的表格，这些肽水平是对RAS(A)和缓激肽体系(B)在相同血浆样品中测量的，所述血浆样品在温育了指示时间段后用GTC稳定。 [0117] 图7显示各相应的柱状图。实施例： [0118] 材料： [0119] C18滤筒(Cartridges):Sep-Pak Vac 3cc(500mg),Waters [0120] 质谱仪:Q TRAP4000-Applied Biosystems [0121] HPLC系统:1100系列,Agilent [0122] C18 RP-HPLC柱:Luna 3u C18(2)100A,100x2.00mm, [0123] (Phenomenex,Cat.no.00D-4251-B0) [0124] 试剂: [0125] 乙醇,无水(Merck,Cat.no.100983) [0126] 甲醇(Fluka,Cat.no.14262) [0127] 水,LiChrosolv(Merck,Cat.no.115333) [0128] 乙腈,LiChrosolv(Merck,Cat.no.114291) [0129] 甲酸,>98％,(Fluka,Cat.no.06440) [0130] Z-Arg,作为肾素抑制剂(Bachem,C-3195) [0131] 胃酶抑素A(Bachem(N-1125) [0132] 对羟基汞基苯甲酸，钠盐(Fluka,55540) [0133] 1,10-二氮杂菲一水合物(Sigma,P9375) [0134] 赖诺普利(Sigma,L6394) [0135] 卡托普利(Sigma,C4043) [0136] 阿吗他定·HCl,(Bachem,N-1410) [0137] ACE,NEP和APN购自R&D Systems. [0138] rhACE2(重组可溶性人ACE2)由Apeiron Biologic产生 [0139] EDTA(Sigma) [0140] GTC(Sigma,Cat.no.G9277) [0141] 三氟乙酸(TFA)(Sigma-Aldrich,Cat.no.302031) [0142] 内标: [0143] 用于生物样品中肽的绝对定量的内标是合成肽，其序列与肽分析物相同，并用质量标记作标记，使得在LC-MS/MS分析中可区分内源肽和标准肽。这些合成肽的相同物理化学特性使它们成为低丰度肽定量的理想内标，与其相对应的肽分析物相比，在样品加工处理期间显示出相同的行为和回收。在采血期间或之后直接将内标应用于样品，考虑所有操作诱导的变异。使用肽特异性内标是值得推荐的，因为肽回收可在不同肽和各样品间有差异。 [0144] 此外，内源肽和标准肽的MS/MS-断裂(fragmentation)特征是相同的，允许以高准确度和精确性测定绝对肽水平。 [0145] 实施例I：根据本发明对血液样品中的蛋白水解级联降解产物的分析(RSSE指纹)[0146] RSSE-指纹分析： [0147] 用标准化肝素管(BD)采集血液样品并抗凝。如图3所示，在温育达到稳态平衡之前对各样品进行了血浆分离。在37℃水浴中将血液或血浆样品温育了图1所示的时间段后，或者对图2、3和4温育2小时后，将样品在冰上冷却，然后立即加入保存稳态平衡的蛋白酶抑制剂混合物(其含有胃酶抑素A、1,10-二氮杂菲、EDTA、对羟基汞基苯甲酸和Z-Arg)以及内标。 [0148] LC-MS/MS样品制备和分析： [0149] 在通过于4℃以3000rcf离心10分钟进行血浆分离后，将0.2-2ml血浆上样到经活化和平衡的Sep-Pak C18滤筒上。样品基质组分通过用1ml水洗3次而除去。然后用1ml甲醇洗脱结合的分析物。将洗脱物蒸发至干，在补充0.1％甲酸的10％乙腈/90％水中复原，然后进行LC-MS/MS分析。 [0150] 固相提取: [0151] 多头抽真空装置用于样品加工处理。 [0152] [0153] 定量和信号整合 [0154] 使用Applied Biosystems提供的Analyst 1.5.1软件整合MRM色谱图。定量限阈值设定在信噪比为10。未达到该比值的整合信号设为0。将分析物信号与内标信号相关联并从初始掺入的内标量计算浓度。 [0155] 结果 [0156] 就血管紧张素肽浓度对RAS的评价关键取决于用于样品采集和样品保存的条件。开发了一种分析系统，其能够有效地保存血液中的体内以及离体稳态平衡血管紧张素肽水平，之后进行高灵敏度的LC-MS/MS分析以及绝对定量。 [0157] 总体而言，RAS是从激素原AGT不断产生新肽的肽激素体系，而产生率主要取决于肾素活性。存在于循环中的肽水平取决于可溶性蛋白酶、血细胞结合的蛋白酶以及内皮关联的蛋白酶(其由于器官特异性表达模式而可在空间上不同)。血管的内表面覆盖有众多不同的血管紧张素受体，因此在建立循环中的血管紧张素肽浓度中起到中枢作用。作为器官特异性表达血管紧张素代谢蛋白酶诸如ACE或ACE2的结果，显然血液肽水平在整个机体内可在空间上不同。尽管如此，有充足的RAS酶组分以游离可溶形式或血细胞关联形式存在于血液中，其显著影响循环肽水平。将先前的考虑结合在一起，RAS构成这样一种体系，其具有在时间上恒定的肽激素分子生成量，但在不同组织和器官中在肽浓度方面存在局部差异。 [0158] 在本发明中描述了一种方法，其考虑到所有影响象RAS这样的肽激素体系的血液关联因素，通过将血液或血浆样品温育直至对一种或多种肽水平达到稳态平衡，然后对肽进行定量。如图1A所示，通过臂静脉穿刺采集并立即通过加入蛋白酶抑制剂混合物而进行样品稳定的血液样品中代表体内循环血管紧张素肽浓度的RAS-指纹，显著区别于当将血液于37℃温育而不加入蛋白酶抑制剂时观察到的离体RAS-指纹(或RSSE-指纹)。有趣的是，在这些条件下实现的血管紧张素肽浓度达到据发现在显著时间段内保持恒定的水平。这表明样品达到了平衡的状态，其特征在于对于个体肽相等同的形成和降解率，即稳态平衡。从温育开始，稳态平衡肽水平在30分钟内达到，并保持稳定至少6小时(图1A)。稳定期终止于样品中Ang 1-10浓度强烈增加，表明样品内酶活性的变化。最后，在温育24小时后，Ang 1-10浓度陡降。除了Ang 1-10和Ang 1-8以外，在所述时间进程期间样品中没有检测到显著量的其它血管紧张素代谢物。发现所谓的RSSE-指纹(RAS稳态平衡指纹)受到干扰RAS的药理学试剂的显著影响(图1B，图2A)。进一步测试添加影响RAS的试剂是否可将样品的稳态平衡迁移到不同但稳定的稳态平衡条件。将ACE抑制剂(卡托普利)和氨肽酶抑制剂(阿吗他定)或两者的组合在于37℃温育2或4小时之前加入血液。如温育2和4小时后相当水平的Ang 1-10和Ang 1-8所表明的，所有处理都达到对所述抑制剂特征性的稳态平衡(图1B)。与对照水平相比，ACE抑制剂赖诺普利或卡托普利增加Ang 1-10并降低Ang 1-8稳态平衡水平。肾素抑制剂阻断血管紧张素产生的初始步骤，发现其完全关停RAS。阿吗他定是某些氨肽酶的抑制剂，发现其大量增加Ang 1-8水平，指向氨肽酶在体内Ang 1-8水平调节中的重要作用。 [0159] 图1C比较了在缺乏(红色柱)和存在EDTA和AEBSF(蓝色柱)条件下于37℃温育2小时和4小时后(然后通过在指示的时间点加入抑制剂混合物来保存肽浓度)达到的肽浓度。EDTA与AEBSF的组合用在现有技术测量血浆肾素活性(PRA)的方法中(Bystrom et al.； Clin.Chem.56(2010),1561-1569)。对照样品中血管紧张素1-10(上图)和血管紧张素1-8(下图)的浓度达到稳态平衡，如于37℃温育2小时和4小时之间很小的变化所表明(比较图 1B)。相比之下，在EDTA和AEBSF存在下，于37℃温育2小时和4小时之间Ang 1-10和Ang 1-8水平均有显著变化。Ang 1-10在经EDTA/AEBSF处理的样品中随时间强烈累积清楚显示出这些样品中缺乏稳态平衡。 [0160] 此外，通过在温育期之前向样品中加入5μg/ml ACE、ACE2、NEP或APN，测试重组RAS酶对RSSE指纹的影响。在这些样品(图2B)以及加入酶与不同药理学抑制剂组合的样品(图2C)中RSSE-指纹如预期地发生迁移。值得注意的是，比较用ACE抑制剂赖诺普利处理和用ACE2与赖诺普利组合处理的样品显示，在原始样品基质中在生理浓度下Ang 1-10是ACE2的底物，有效生成Ang 1-9(图2A1,2C1)。尽管加入ACE2后Ang1-10的稳态水平保持高水平，存在显著的向Ang 1-9方向的肽流动，其可能是在临床应用中ACE抑制剂的重要作用机制。此外，这一ACE2介导的Ang 1-9产生在阿吗他定存在下的显现令人印象深刻，阿吗他定通过抑制其N末端蛋白水解降解而进一步增加稳态平衡Ang 1-10水平(图2C3)。发现ACE抑制是检测显著稳态平衡Ang 1-9水平的先决条件，这指向Ang 1-10对ACE比对ACE2显著更高的亲和性。这一Ang 1-10对ACE比对ACE2更高的亲和性还可通过比较加入ACE和ACE2观察到较低的稳态平衡Ang 1-10浓度来证实(图2B1)。 [0161] 从这些试验获得的结果清楚证明了RSSE-指纹与样品中所含的综合RAS酶活性的直接关联。 [0162] 基于这些发现，研究使用新鲜或冷冻血浆取代血液的影响，因为就大规模分析更容易操作，已知在这些条件下血细胞关联的RAS组分会丢失。对对照样品(图3A)、掺入阿吗他定的样品(图3B)和掺入ACE2和赖诺普利的样品(图3C)，对来自相同供体的血液、血浆和冻融血浆比较了RSSE-指纹。选择了抑制剂和组合以实现稳态平衡的清晰可见的迁移，而使用酶或者低分子量抑制剂来证明该方法适于临床分析问题。发现对血浆的冻融引起极小的RSSE-指纹变异，而使用血液取代血浆导致显著的差异，特别是关于Ang 1-10、Ang 1-8和Ang 1-7，这指向血细胞关联NEP(CD10)和ACE(CD143)的存在。 [0163] 最后，在12名健康志愿者中研究了RAS-指纹和RSSE-指纹的变异性，并在来自每一供体的立即稳定的血液、平衡的血液和平衡的血浆中进行分析。所测量血管紧张素浓度的均值在图4A中作为指纹图给出。对于RAS-指纹(4B1-表1)、血液中的RSSE-指纹(4B2-表2)以及血浆中的RSSE-指纹(4B3-表3)，给出关于Ang 1-10和Ang 1-8(这些是健康志愿者中存在的主要肽)的供体特异性数据。除了以pg/ml计的肽浓度外，计算以fmol/ml计的浓度，并用于通过将Ang 1-8浓度除以(divide through)Ang 1-10浓度来构成ACE的摩尔稳态活性比。与测量的RAS-指纹相比，RSSE-指纹显示出供体间更大的变异，这反映不同供体间可溶性RAS组分构成的潜在多样性。图4C中显示了两名代表性供体。供体3(图4C1)具有血液中ACE摩尔SSE-比(1-8/1-10)为4.5，而供体6(图4C2)显示出20.5的ACE-SSE-比，指向该供体中ACE在Ang 1-8产生中更突出的作用。ACE的RAS-比也存在差异(0.35相对于0.79)，但基于RSSE-指纹的差异要鲜明得多。 [0164] 作为结论，本发明提供了评价生物样品中RAS或其组分的强大方法。本发明基于高度灵敏的LC-MS/MS的血管紧张素肽定量方法与创新性的在稳定前样品的稳态平衡化的组合，代表了评价可溶性和血细胞关联的RAS酶活性的高度可重复工具。对该新技术的应用具有发现生物标记的巨大潜能，因为RAS在多种病理性状况中涉及。此外，可溶性和血细胞关联的RAS酶活性代表几种抗高血压药物的药理学活性的主要位点。对所述体系的个体性的理解可能为对RAS相关疾病的治疗中的患者特异性途径铺平道路。根据本发明的技术通过提供对生物样品中肾素-血管紧张素体系的深入全面洞悉，将推动该发展进一步向前。 [0165] 实施例II：根据本发明对血液样品中肾素-血管紧张素体系以及缓激肽体系的蛋白水解级联降解产物的分析 [0166] 所有方法如实施例I中所述进行，除了立即或在37℃水浴中温育1或3小时后通过加入4M GTC/1％TFA来稳定血浆样品。 [0167] 结果 [0168] 图6和7显示，根据本发明的方法不仅可应用于RAS，而且还可应用于其它蛋白水解级联，如缓激肽体系。此外，这些图显示，稳态平衡不仅可通过加入蛋白酶抑制剂混合物，而且还可由离散剂如GTC来有效地稳定。在1小时的温育期后，对RAS和缓激肽体系达到了稳态平衡并保持稳定，如由比较温育1小时和3小时时间的肽水平可以看出。 |
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