碱性肽的检测方法及碱性肽检测用试剂 |
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| 申请号 | CN201080053485.0 | 申请日 | 2010-12-10 | 公开(公告)号 | CN102667487B | 公开(公告)日 | 2014-10-29 |
| 申请人 | 希森美康株式会社; 国立大学法人鹿儿岛大学; | 发明人 | 加烟博幸; 高桥英树; 丸山征郎; 鹤冈礼奈; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种 碱 性肽的检测方法，在该方法中，将疑似含有碱性肽的试样、以及含有变性 白蛋白 的 试剂 进行混合，检测出碱性肽与变性白蛋白的复合物所产生的浑浊，以此检测出碱性肽。 | ||||||
| 权利要求 | 1.热变性白蛋白在制备用于检测碱性肽的试剂中的应用，所述热变性白蛋白与试样中的碱性肽形成复合物并在所述试剂与试样混合形成的混合液中产生可被检测的浑浊。 |
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| 说明书全文 | 碱性肽的检测方法及碱性肽检测用试剂[0001] 技术领域： [0002] 本发明涉及一种碱性肽的检测方法。更详细地，本发明涉及的方法如下：将疑似含有碱性肽的试样和含有变性的白蛋白的试剂混合，检测出因碱性肽与变性的白蛋白的复合物而产生的浑浊，以此检测出碱性肽。此外，本发明还涉及一种用于该检测方法的碱性肽检测用试剂。 [0003] 背景技术： [0004] 人们已知，在患有特定病的生物中，特定的碱性肽的血中浓度与健康时不同。这种碱性肽如有生长素释放肽（ghrelin）、脑尿钠肽（BNP）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、心房利钠肽（ANP）、以及缓激肽等，在临床检查领域，这些碱性肽被视为疾病的标志物。比如，已知在患有重症心力衰竭的患者、以及患有严重胃癌的患者中，作为碱性肽之一的生长素释放肽在血浆中的浓度下降。此外，BNP的血中浓度是心力衰竭的重要临床指标，BNP也被用作检查标志物。 [0005] 现在都是用酶免疫分析法、电化学发光免疫测定法等免疫学方法测定这些碱性肽。在这种免疫学方法当中，使用特异性地识别上述碱性肽并与其结合的抗体进行测定。用此方法，要检测出抗体与碱性肽的复合物，需要进行使标记物与该复合物结合的步骤，因此操作繁琐。 [0006] 另一方面，Dennis和Lowenthal等人公开了一种碱性肽的检测方法，与免疫测定法不同，该方法可以省略标记物结合步骤。然而，该方法需要高价的、大型的质量分析仪、表面等离子体共振分析仪等，因此很难说是一种能够通用普及的方法。 [0007] 此外，Dennis和Lowenthal等人为了发现病情指标、探明药理作用、以及开发药物传输系统等，还对天然存在的白蛋白（未变性的白蛋白）与碱性肽之间的结合进行了研究。 [0008] 所谓白蛋白是指蛋清、血清或乳汁等物质中天然含有的蛋白质。以血清白蛋白为例，已知其生理机能是调节血液的渗透压，与脂肪酸、血素色、胆红素等血液中的代谢产物、药剂等化合物、以及特殊肽等结合，并在血液中循环。 [0009] 比如Baczynskyj等人暗示了已知的血中荷尔蒙，即缓激肽与BSA (牛血清白蛋白)结合的可能性。Muramoto等人报告称，血中肽激素ACTH会与牛血清白蛋白（BSA）结合。 [0010] 在先技术文献 [0012] 非专利文献1：Muramoto K.等，《生物化学》（Biochemistry）, vol. 20，3380-3385（1981） [0013] 非专利文献2：Baczynskyj L.等，《质谱快报》（Rapid Commun. Mass Spectrom.）, vol. 8，280-286（1994） [0014] 非专利文献3：Dennis MS等，《生物化学期刊》（J. Biol. Chem.）, vol. 277，35035-35043（2002） [0015] 非专利文献4：Lowenthal MS等，《临床化学》（Clin. Chem.）, vol. 51，1933-1945 (2005)。 [0016] 发明内容： [0017] 发明要解决的课题 [0018] 本发明人从热力学平衡理论的角度出发，对碱性肽和未变性白蛋白的结合、特别是二者通过结合相互造成的分子结构变化的机制进行了研究。在此，所谓热力学平衡理论是指：用表示结合强弱（亲和性）的解离常数（Kd值）、以及反映结合所伴随的别构性结构变化的协同性（希尔系数）这些明确的数值，描述溶液中实际发生的分子间结合。 [0019] 在这一研究过程中，本发明人承认，如上述Lowenthal等人的报告所记载的，碱性肽会和未变性白蛋白结合。Lowenthal等人的检测方法是依赖于质量分析仪的机械物理学方法。在该检测方法中，先将碱性肽和未变性白蛋白的混合物固定在质量分析仪的试样固定用高分子基板上，然后将其展开。即，在该检测方法中，碱性肽和未变性白蛋白两者均处于脱离实际的溶液平衡的状态下，仅有一部分分子团可以被检测出。 [0020] 相对而言，本发明人则是将碱性肽和未变性白蛋白始终静置于溶液中，并对他们自身的自然结合，即实际的溶液平衡进行追踪。与上述在先技术不同，本发明人探讨的方法是利用此溶液平衡，检测出碱性肽、或碱性肽与未变性白蛋白的复合物。 [0021] 然而，在上述探讨过程中，本发明人发现了在先技术中未报告的现象，即碱性肽与未变性白蛋白的结合的亲和性很弱。因此，在此检测方法中，其检测灵敏度无法令人满意。 [0022] 因此，要检测出上述复合物，需要另行使用标记物检测步骤，或是想办法促进上述溶液平衡中的结合亲和性。 [0023] 本发明的特征之一在于其符合上述需求。因此，本发明的目的是提供一种检测方法，在该方法中，无需进行标记物的结合等繁琐的操作，即可简便、快捷地检测出碱性肽。本发明的目的还在于提供一种用于该检测方法的碱性肽检测用试剂。 [0024] 解决课题的手段 [0025] 本发明人发现，将含有碱性肽的试样、以及变性牛血清白蛋白溶液混合后，变性白蛋白与碱性肽结合，形成了复合物，并在混合液中产生浑浊，而且，此浑浊的程度随着试样中碱性肽的浓度而升高，本发明人据此完成了本项发明。 [0026] 因此，本发明提供一种碱性肽的检测方法，包括以下步骤： [0027] （1）将疑似含有碱性肽的试样、以及含有变性白蛋白的试剂进行混合，以此形成碱性肽与变性白蛋白的复合物， [0028] （2）检测步骤（1）生成的混合液中的浑浊。 [0029] 本发明还提供一种含有变性白蛋白的碱性肽检测用试剂。 [0030] 发明效果 [0031] 用本发明提供的方法和该方法所使用的试剂，不必进行标记物结合等繁琐的操作，即可简便、快捷地检测出碱性肽。 [0033] 图1是使用未变性BSA溶液、以及含有热变性BSA的本发明的试剂检测ACTH部分肽时，OD测定值-肽浓度的示图； [0034] 图2是将0分钟、5分钟、15分钟、60分钟、以及120分钟热变性的BSA溶液作为试剂，检测ACTH部分肽时，OD测定值-肽浓度的示图； [0035] 图3是使用含有热变性BSA的本发明试剂检测含有核酸的试样、以及不含核酸的试样中的ACTH部分肽时，OD测定值-肽浓度的示图； [0036] 图4-1为使用含有热变性BSA的本发明的试剂，尝试着检测α-内啡肽时，OD测定值-肽浓度的示图； [0037] 图4-2为使用含有热变性BSA的本发明的试剂，检测强啡肽A部分肽时，OD测定值-肽浓度的示图； [0038] 图5-1为使用含有热变性BSA的本发明的试剂，检测激肽原的片段时，OD测定值-肽浓度的示图； [0039] 图5-2为使用含有热变性BSA的本发明的试剂，检测ITIH4的片段时，OD测定值-肽浓度的示图； [0040] 图6为使用含有热变性的人血清白蛋白（HSA）的本发明的试剂、以及含有热变性的卵白蛋白（OA）的本发明的试剂，检测ACTH部分肽时，OD测定值-肽浓度的示图； [0042] 图7-2为使用含有热变性BSA的本发明的试剂，尝试着检测C3f时，OD测定值-肽浓度的示图； [0043] 图7-3为使用含有热变性BSA的本发明的试剂，尝试着检测因子XIII时，OD测定值-肽浓度的示图； [0044] 图7-4是将图1的示图和图7-1至7-3的示图重叠后，OD测定值-肽浓度的示图； [0045] 图8为含有热变性BSA的本发明的试剂、以及含有ACTH部分肽的试样的混合液的荧光强度-肽浓度的示图； [0046] 图9中，关于含有热变性BSA的本发明的试剂、以及含有ACTH部分肽的试样的混合液，显示了该混合液中凝集物数量-肽浓度的示图； [0047] 图10为使用含有热变性BSA的本发明的试剂，检测含血清的试样、以及不含血清的试样中的ACTH部分肽时，OD测定值-肽浓度的示图。 [0048] 具体实施方式： [0049] 本发明的方法为包含以下步骤的碱性肽的检测方法。 [0050] （1）将疑似含有碱性肽的试样、以及含有变性白蛋白的试剂混合，以形成碱性肽和变性白蛋白的复合物， [0051] （2）检测步骤（1）形成的混合液中的浑浊。 [0052] 在本说明书中，所谓“碱性肽”是指等电点（pl）在碱性范围内，且其链为短链的肽。这种肽最好是pl在8.0以上，pl在8.5以上更佳，且其长度以10–100个氨基酸为宜，10–60个氨基酸更好，最好是10–40个氨基酸。 [0053] 肽的pl可以用本领域通用的方法测定，但当已知肽的氨基酸序列时，比如可以通过ExPASy（专业蛋白质分析系统）蛋白组学服务器蛋白质参数工具（可使用http://expasy.ch/tools/protparam.html中的内容）等的运算法则或程序，得出肽的理论上的pl。 [0054] 在本发明的方法中，作为检测对象的碱性肽无特别限定，只要符合上述碱性肽的定义即可，既可以是来源于天然的碱性肽，也可以是合成肽。此外，作为检测对象的碱性肽还包括以下肽：从处于特定病情的生物中获取的、样本中的浓度与健康时的浓度不同的碱性肽（如ACTH、ANP、BNP、生长素释放肽、以及以下蛋白质的片段：L-myc-1原癌基因蛋白质、转录因子SOX-3、纤维蛋白原α、间-α-胰蛋白酶抑制剂-重链亚组4（ITIH4）、α2-HS-糖蛋白、凝血酶原及激肽原。 [0055] 在本说明书中，所谓“疑似含有检测对象的碱性肽的试样”是指可能含有上述检测对象碱性肽的试样。这种试样包括采自生物的样本，如血液（包含全血、血浆、血清）、尿液、唾液、生物组织抽取物、脊髓液、胸腔积液、淋巴液等。 [0056] 在用本发明的方法检测的试样中，除检测对象的碱性肽以外，也可以包含杂质（如蛋白质和核酸等），但是，为了提高检测灵敏度，最好使用预先去除了这些杂质的试样，或者是使用预先提纯和/或浓缩检测对象的碱性肽的试样。去除杂质、以及提纯和浓缩碱性肽时，可采用本行业人员通用的方法。 [0057] 在本发明的实施方式中，当检测高盐浓度的试样中的碱性肽时，最好预先除去该试样中的盐类。可以采用本行业人员通用的去除盐类方法。在本发明的实施方式中，将试样中的盐浓度换算成电导率时，以相当于0–2 mS/cm的盐浓度（如10mM以下的磷酸钾缓冲液、或10mM以下的Tris-HCL）为宜，将试样中的盐浓度换算成电导率时，最好是相当于0–160μS/cm的盐浓度（如900μM以下的磷酸钾缓冲液）。 [0058] 在本说明书中，“白蛋白”的意思与生物学领域中通常使用的词语的意思相同，是动物、植物的细胞和体液中包含的一组可溶性蛋白质的总称。 [0059] 已知的源于动物的白蛋白包括血清中所含的血清白蛋白、蛋清中所含的卵白蛋白、乳汁中所含的乳白蛋白等。已知的源于植物的白蛋白有小麦和大麦等中所含的麦白蛋白、豌豆和大豆等的种子中所含的豆白蛋白、蓖麻种子中所含的蓖麻毒蛋白等。 [0060] 在本发明的实施方式中，所用试剂以含有源于动物的白蛋白为宜，使用含血清白蛋白、卵白蛋白或乳白蛋白的试剂更好，最好使用含有从血清白蛋白获得的变性的白蛋白的试剂。 [0061] 在本说明书中，所谓“变性的白蛋白”（以下也称“变性白蛋白”）是指在物理性或化学性因素的作用下，其生理条件中的固有高级结构被破坏了的白蛋白。上述物理性因素如有加热、增压、冷冻、超声波粉碎等处理。化学性因素如有用变性剂、SDS等表面活性剂、尿素、盐酸胍等进行的处理。 [0062] 在本发明的实施方式中，最好使用含有经上述处理而变性的白蛋白的试剂，更为理想的是使用含有热变性白蛋白的试剂。 [0063] 在本发明方法的步骤（1）中，将疑似含有检测对象的碱性肽的试样、以及含有变性白蛋白的试剂进行混合，以形成碱性肽和变性白蛋白的复合物。 [0064] 具体而言，混合试剂和试样，使含有变性白蛋白的试剂和上述试样的混合液中，变性白蛋白的最终浓度达到0.2–0.6 w/v％，最好为0.2 w/v％。此混合步骤在４–50℃条件下进行较为适宜，最好在10–40℃进行。 [0065] 上述试剂和试样混合后，变性白蛋白和碱性肽就结合并形成复合物。此外，因为该复合物之间相互凝集，在混合液中生成浑浊。 [0066] 在本发明方法的步骤（2）中，对上述步骤（1）获得的混合液中的浑浊进行检测。 [0067] 在本说明书中，所谓的“检测浑浊”包括检测混合液中有无浑浊、以及测定浑浊的程度（以下称“浊度”）。判断有无浑浊时，可以通过肉眼和显微镜目测，或用浊度测定装置进行检测。浊度可以用浊度测定装置测定。 [0068] 在本发明的方法中， 通过变性白蛋白和碱性肽的复合物生成的浑浊来进行检测，因此不需要像传统方法那样使用标记物和抗体，仅用含有变性白蛋白的试剂即可检测出碱性肽。 [0069] 可以用光照射上述混合液，并获取光学信息，以此来对浊度进行测定。上述光学信息如有吸光度、散射光强度、反射光强度、衍射光强度、荧光强度、磷光强度、偏振态 、折射率、旋光性等。其中，从可以用简便的装置进行测定的角度来看，以吸光度为宜。测定吸光度的装置如有分光测光仪UV-2500PC（岛津制作所）。浊度的测定最好在可见光波长400–700nm进行为宜，在500–600nm波长进行则更佳。 [0070] 此外，在本发明的方法中，可以从浊度的测定值来定量试样中的检测对象碱性肽的浓度。该浓度通过已知浓度的检测对象碱性肽的溶液制作的校准曲线进行定量。 [0071] 上述校准曲线可以如下制作。首先，制备各种浓度的检测对象碱性肽的溶液（以下称“校准曲线制作用试样”）。再将校准曲线制作用试样和含有变性白蛋白的试剂混合，并测定获得的混合液的浊度。以纵坐标为浊度的测定值，以横坐标为碱性肽的浓度，标绘各校准曲线制作用试样的测定值。另外，上述校准曲线制作用试样的溶液浓度制备如下：从不含检测对象碱性肽的溶液（空白溶液）起逐渐提高浓度，直至确认待测浊度已达到平稳水平为止。 [0072] 在此，我们发现，标绘的浊度的测定值和碱性肽的浓度之间的关系符合下式（I）的希尔方程式(Hill equation)。因此，取式（I）或该式两边的对数，得出下式（II）的直线方程式，就可以制作校准曲线。 [0073] 希尔方程式：θ＝Cn／（Cn＋Kdn） （I） [0074] 直线方程式：log｛θ／（1－θ）｝＝nlogC－nlogKd （II）[0075] （式中，θ表示浊度的测定值，C表示碱性肽的浓度，Kd表示解离常数，n表示希尔系数(Hill coefficient)。） [0076] 在本说明书中，所谓解离常数是指变性白蛋白在检测对象碱性肽中50%饱和时，该肽的浓度。 [0077] 在本说明书中，希尔系数是检测对象碱性肽与变性白蛋白在结合（形成复合物）中的协同性的指标。即希尔系数大于1时，表示二者的结合具有正协同性（别构效应），碱性肽的浓度越高，越能促进该肽和变性白蛋白的结合。 [0078] 另外，Kd和n的值可从上述校准曲线制作用试样的碱性肽浓度、以及浊度测定值计算得出。 [0079] 上述式（I）和式（II）是浊度测定值和碱性肽浓度的函数，因此，使用所制作的校准曲线，通过疑似含有检测对象的碱性肽的试样的浊度的测定值，就可以获取该试样中检测对象的碱性肽的浓度。 [0080] 在本发明的方法中，混合上述变性白蛋白和碱性肽会产生浑浊，其原因尚未完全弄清，但可以考虑到如下原因。首先，在静电的相互作用下，变性白蛋白与带正电荷的碱性肽结合，形成复合物。然后，该复合物之间相互凝集在一起，从而生成浑浊。 [0081] 上述结合的方式可以看作是离子结合。在本发明的方法中， 在低盐浓度的条件下，碱性肽的检测灵敏度有所提高，从这一点上也可印证该结合方式为离子结合。这是因为在低盐浓度的条件下，存在的离子很少，所以促进了变性白蛋白和碱性肽之间的离子结合。 [0082] 当上述结合方式为离子结合时，可以认为变性白蛋白和检测对象碱性肽的结合不依赖于该肽的氨基酸序列和立体结构。 [0083] 因此，本发明的方法可以广泛用于各种碱性肽的检测。 [0084] 本发明的方法所具有的一大优点是：从混合含有变性白蛋白的试剂、以及含有碱性肽的试样起，到变性白蛋白和碱性肽的复合物产生浑浊止的这一时间段很短（如20秒以下，较为理想的是瞬间）。 [0085] 因此，本发明的方法可以迅速检测出试样中含有的碱性肽。 [0086] 本发明的方法还可以检测出生物样本中所含的疾病标志物，即碱性肽，因此，本发明的方法还可以用所判断特定疾病的方法。比如，当用采自受检者的血液作为样本时，先从该血液中提纯和/或浓缩特定疾病标志物，即检测对象碱性肽，再用本发明的方法定量该肽的浓度，将获得的值与健康时的值进行比较，即可判断该受检者是否患有该疾病。 [0087] 上述本发明的方法中所使用的“含有变性白蛋白的试剂”也是本发明的一部分。即，本发明的试剂是含有变性白蛋白的碱性肽检测用试剂。 [0088] 本发明的试剂可以如下获得。首先，将来源于动物的白蛋白、更为适宜的血清白蛋白、卵白蛋白或乳白蛋白、或这些蛋白的混合物，最适合的是将血清白蛋白溶于适当的溶剂中，制备出白蛋白溶液。该溶液的白蛋白浓度为0.2–5.0 w/v％，最好为0.2–0.6 w/v％。 [0089] 溶剂只要不妨碍变性白蛋白和碱性肽形成复合物即可，无特别限定，如超纯水、10mM Tris-HCl（pH 5.5–7.5）、10mM磷酸钾缓冲液（pH5.5–7.5）等的缓冲液。其中尤以超纯水为宜。在本说明书中，所谓“超纯水”是指在25℃的比阻值为18MΩ·cm以上的水。 这种超纯水以Milli-Q（注册商标）较为理想。 [0090] 然后，对获得的白蛋白溶液实施物理性变性处理或化学性变性处理。物理性变性处理如有加热、增压、冷冻、超声波粉碎等。化学性变性处理如有用SDS等表面活性剂、尿素、盐酸胍、或其混合物等变性剂进行的处理。 [0092] 用SDS和尿素的混合物进行变性处理的方法比如可以是：在上述白蛋白溶液中添加SDS（最终浓度为1–30 w/v％）和尿素（最终浓度为500mM–５M），并进行混合等。 [0093] 本发明的试剂以含有热变性白蛋白、或用SDS和尿素的混合物变性的白蛋白为宜，含有热变性白蛋白的试剂更为适宜。本发明的试剂最好为溶液形态。 [0094] 将如此获得的本发明的试剂与含有碱性肽的试样混合，可以想到，变性白蛋白与碱性肽会通过离子结合形成复合物。已知该复合物产生的浊度和碱性肽的浓度的关系如上述式（I）的希尔方程式所示。 [0095] 因此，本发明的试剂中所含的变性白蛋白的详细构造虽不明确，但可以认为其是有数个与碱性肽静电结合的位点，且与碱性肽的结合中具有正协同性的别构蛋白质。 [0096] 本发明的试剂所包含的变性白蛋白最好以5–220μM解离常数与有序列号1所描述的氨基酸序列的碱性肽结合。 [0097] 本发明的试剂所包含的变性白蛋白最好以大于1小于11的希尔系数与具有序列号1所描述的氨基酸序列的碱性肽结合。 [0098] 在已知浊度的测定值和碱性肽的浓度的情况下，解离常数和希尔系数可以通过上述式（I）的希尔方程式决定。序列号1所描述的氨基酸序列是ACTH的N末端的1位–24位的序列。 [0099] 下面通过实施例详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例所限定。实施例 [0100] （实施例1）用变性BSA和未变性BSA检测碱性肽 [0101] 1. 实验方法 [0102] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液和未变性BSA溶液 [0103] 将BSA（Sigma-Aldrich公司）溶解于Milli-Q（注册商标）水（Millipore公司）中，制得BSA溶液（1.0 w/v％）。将此BSA溶液二等分，一份作为未变性BSA溶液，另一份用高压处理器在110℃下加热15分钟，作为热变性的BSA（以下称“热变性BSA”）的溶液。 [0104] （2）制备含有检测对象的碱性肽的试样 [0105] 作为检测对象的碱性肽是由ACTH的1位–24位的氨基酸构成的ACTH部分肽（株式会社肽研究所）。将此肽溶解于超纯水中，制得含有检测对象的碱性肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0106] （3）制备检测用试剂和试样的混合液 [0107] 将上述（1）制备的热变性BSA溶液50μl与上述（2）制备的试样混合后，加入超纯水，制得总量为250μl的混合液（热变性BSA的最终浓度：0.2 w/v%）。在此制备过程中，混合时所使用的上述试样的量要使混合液中的ACTH部分肽的最终浓度达到0–150μM。在此混合液的制备过程中，还用未变性BSA溶液取代热变性BSA溶液，制得比较用混合液。 [0108] （4）测定混合液的吸光度 [0109] 用分光测光仪UV-2500PC（岛津制作所）测定所制备的上述各混合液在波长550nm时的吸光度（OD550）。结果见图1。对于所得到的结果，用KaleidaGraph（产品名称，HULINKS公司）进行希尔标绘法（Hill plot）分析，以此计算出热变性BSA和未变性BSA的Kd值和希尔系数。各数值见表1。 [0110] [表1] [0111]试剂 Kd（μM） 希尔系数n 热变性BSA 30 8 未变性BSA 290 1 [0112] 2. 结果 [0113] 在图1中，当使用未变性BSA溶液时，看不到OD550有显著变化。这可以理解为，即使未变性BSA与ACTH结合了也很快就解离，或是两者即使结合也不产生浑浊。 [0114] 另一方面，使用热变性BSA溶液时，可以看到碱性肽的浓度依赖型OD550上升。另外，使用热变性BSA溶液时，可知吸光度和碱性肽的浓度之间的关系符合以下希尔方程式。 [0115] OD＝（碱性肽浓度）n／｛（碱性肽浓度）n + Kdn｝ [0116] 比较热变性BSA和未变性BSA的Kd值，热变性BSA的值较低。由此可知，对于碱性肽，即ACTH而言，热变性BSA的亲和性远远高于未变性BSA的亲和性。 [0117] 再比较热变性BSA和未变性BSA的希尔系数，未变性BSA为1，而热变性BSA为8。在此，当希尔系数大于1时，表示有正协同性（别构效应），当该系数为1时，表示没有协同性。即，未变性BSA与ACTH之间无协同性，因此未变性BSA和ACTH的结合与混合液中的ACTH浓度无关。 [0118] 另一方面，热变性BSA和ACTH之间的结合具有正协同性，因此，试样中的ACTH浓度越高，越能够促进热变性BSA和ACTH的结合。 [0119] 因此，热变性白蛋白可以通过吸光度的变化来显示出碱性肽的微小的浓度变化，从而得知，本发明的方法可以用于检测碱性肽的存在、并可以定量其浓度。 [0120] （实施例2）探讨BSA的热变性时间 [0121] 1. 实验方法 [0122] （1）制备不同热变性时间的变性BSA溶液 [0123] 将BSA（Sigma-Aldrich公司）溶解于Milli-Q（注册商标）水（Millipore公司）中，制得BSA溶液（1.0 w/v％）。将此BSA溶液五等分，一份作为未变性BSA溶液（热变性时间为0分钟），其余四份用高压处理器在110℃条件下分别加热5分钟、15分钟、60分钟、以及120分钟，作为热变性BSA溶液。 [0124] （2）制备含检测对象的碱性肽的试样 [0125] 作为检测对象的碱性肽是由ACTH的1位–24位的氨基酸构成的ACTH部分肽（株式会社肽研究所）。将此肽溶解于超纯水中，制得含有检测对象的碱性肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0126] （3）制备各热变性时间的变性BSA溶液与试样的混合液 [0127] 用上述（1）制备的各热变性时间的变性BSA溶液、以及上述（2）制备的试样，与实施例1相同地制备混合液。 [0128] （4）测定混合液的吸光度 [0129] 与实施例1同样地测定以上制备的各混合液的OD550。结果见图2。计算出各热变性时间的BSA的Kd值和希尔系数。各数值见表2。 [0130] [表2] [0131]热变性时间（分钟） Kd（μM） 希尔系数n 0 290 1 5 33 5 15 30 8 60 28 6 120 33 4 [0132] 2. 结果 [0133] 在图2中，当使用的是热变性时间为0分钟的BSA溶液时，OD550看不到变化，但使用热变性时间为5分钟、15分钟、60分钟、120分钟的BSA溶液时，可以看到碱性肽的浓度依赖型OD550均有所上升。 [0134] 在表2中，热变性时间为0分钟的BSA溶液显示出较高的Kd值，而热变性时间为5分钟、15分钟、60分钟、120分钟的BSA溶液均显示出较低的Kd值。希尔系数也是如此，在热变性时间为0分钟的BSA溶液中希尔系数为1，而热变性时间为5分钟、15分钟、60分钟、120分钟的BSA溶液中的希尔系数为4–8之间。 [0135] 另一方面，在热变性时间为5分钟、15分钟、60分钟、120分钟的BSA溶液之间，Kd值和希尔系数没有显著差异。由此得知，无论在上述哪个热变性时间中，热变性BSA溶液对于ACTH部分肽均具有同样的亲和性和正协同性。 [0136] （实施例3）探讨核酸在碱性肽的检测中的影响 [0137] 1. 实验方法 [0138] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液 [0139] 与上述实施例1同样地制备热变性BSA溶液。 [0140] （2）制备含有检测对象的碱性肽的试样 [0141] 作为检测对象的碱性肽是由ACTH的1位–24位的氨基酸构成的ACTH部分肽（株式会社肽研究所）。将此肽溶解于超纯水中，制得含有检测对象的碱性肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0142] （3）制备检测用试剂和试样的混合液 [0143] 使用上述（1）制备的各热变性时间的变性BSA溶液、以及上述（2）制备的试样，与实施例1同样地制备混合液。同时，还在混合液中加入作为核酸的鲑鱼精DNA[商品名：(超)声波降解标本鲑鱼精DNA（Sonicated Salmon Sperm DNA），BioDynamics Laboratory公司），以此制得比较用混合液（核酸的最终浓度为10μＭ）。 [0144] （4）测定混合液的吸光度 [0145] 与实施例1同样地，测定以上制备的各混合液的OD550。结果见图3。计算出各混合液的Kd值和希尔系数。各数值见表3。 [0146] [表3] [0147]核酸 Kd（μM） 希尔系数n 无 30 8 有 40 11 [0148] 2. 结果 [0149] 在图3中，混合液中含有核酸与不含核酸时，都可看到碱性肽的浓度依赖型OD550上升。从表3得知，混合液中含有核酸时与不含核酸时，Kd值和希尔系数没有显著差异。 [0150] 因此可以知道，在本发明的方法中，即使所使用的试样中含有核酸，碱性肽的检测也几乎不受影响。 [0151] （实施例4）检测碱性肽和中性肽 [0152] 1. 实验方法 [0153] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液 [0154] 与上述实施例1同样地，制得热变性BSA溶液。 [0155] （2）制备含有检测对象的肽的试样 [0156] 作为检测对象的碱性肽是由强啡肽A的1位–13位的氨基酸构成的强啡肽A部分肽（序列号2；株式会社肽研究所）。比较用检测对象使用的是中性肽，即α-内啡肽（序列号3：株式会社肽研究所）。将这些肽溶解于超纯水，制得含有各种肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0157] （3）制备检测用试剂与各试样的混合液 [0158] 将上述（1）制备的变性BSA溶液50μl与上述（2）制备的各试样混合后，分别加入超纯水，制得总量为250μl的、含有各种肽的混合液。在此制备过程中，混合上述试样时，上述试样的量要使得各混合液中的肽的最终浓度达到0–150μM。 [0159] （4）测定混合液的吸光度 [0160] 与实施例1同样地，测定以上制备的各混合液的OD550。结果见图4。另外，含有强啡肽A的部分肽的试样的Kd值为30，希尔系数为8。 [0161] 2. 结果 [0162] 当使用中性肽、即α-内啡肽时，观察不到OD550变化（参照图4-1）。可以认为是因为热变性BSA与α-内啡肽没有结合，或两者结合后立刻解离了。 [0163] 另一方面，当使用碱性肽，即强啡肽A的部分肽时，可以看出该肽的浓度依赖型OD550出现了上升（参照图4-2）。 [0164] 从所得到的Kd值可以知道，热变性BSA对于碱性肽、即强啡肽A具有非常高的亲和性。此外，热变性BSA的希尔系数为8，从这一点可以知道，热变性BSA和强啡肽A的结合具有正协同性。 [0165] 从以上可以得知，本发明的方法可以特异性地用于检测碱性肽的存在、并用于定量其浓度。 [0166] （实施例5）检测用作癌转移标志物的碱性肽 [0167] 1. 实验方法 [0168] （1）制备作为检测用试剂的变性BSA溶液 [0169] 与上述实施例1同样地，制得热变性BSA溶液。 [0170] （2）制备含有检测对象的碱性肽的试样 [0171] 作为检测对象的碱性肽是已知的癌转移标志物，即激肽原的片段（439位–457位（序列号4）；由Biologica株式会社合成）、以及ITIH4的片段（611–642位（序列号5）；由Biologica株式会社合成）。将这些肽溶解于超纯水，分别制得含有各种肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0172] （3）制备检测用试剂与各试样的混合液 [0173] 将上述（1）制备的变性BSA溶液50μl与上述（2）制备的各试样混合后，分别加入超纯水，将总量调整为250μl，以此制得含有各种肽的混合液。在此制备过程中，混合的上述试样的量要使得各混合液中的肽的最终浓度达到0–80μM。 [0174] （4）测定混合液的吸光度 [0175] 与实施例1同样地，测定以上制备的混合液的OD550。结果见图5-1和图5-2。计算出各试样的Kd值和希尔系数。各数值见表4。 [0176] [表4] [0177]碱性肽 Kd（μM） 希尔系数n 激肽原（439–457） 45 8 ITIH4（611–642） 70 9 [0178] 2. 结果 [0179] 当试样含有激肽原的片段时，可以看到其片段浓度依赖型OD550的上升（参照图5-1）。从Kd值和希尔系数可以知道，热变性BSA对于激肽原的片段具有高亲和性，热变性BSA和激肽原的片段的结合具有正协同性。 [0180] 同样，当试样含有ITIH4的片段时，也可以看到其片段的浓度依赖型OD550的上升（参照图5-2）。从Kd值和希尔系数可以知道，热变性BSA对于ITIH4的片段具有高亲和性，热变性BSA和ITIH4的片段的结合具有正协同性。 [0181] 从以上得知，本发明的方法可以用于检测作为癌标志物的碱性肽的存在，并且可以定量其浓度。 [0182] （实施例6）使用热变性人血清白蛋白（HSA）和热变性卵白蛋白（OA）检测碱性肽[0183] 1. 实验方法 [0184] （1）制备用作检测用试剂的变性HSA溶液和变性OA溶液 [0185] 将HSA（Wako公司）溶解于超纯水，制得HSA溶液（1.0 w/v％）。将此HSA溶液用高压处理器在115℃加热15分钟，获得热变性的HSA（以下也称“热变性HSA”）溶液。然后，将OA（Worthington公司）溶解于超纯水，制得OA溶液（1.0 w/v％）。用氢氧化钠将此OA溶液的pH调整到5–7，用高压处理器在115℃加热15分钟，获得热变性的OA（以下也称“热变性OA”）溶液。 [0186] （2）制备含有检测对象的碱性肽的试样 [0187] 作为检测对象的碱性肽是由ACTH的1位–24位的氨基酸构成的ACTH部分肽（Biologica株式会社）。将此肽溶解于超纯水，制得含有检测对象的碱性肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0188] （3）制备各检测用试剂和试样的混合液 [0189] 将上述（1）制备的热变性HSA溶液50μl与上述（2）制备的试样混合后，加入超纯水，制得总量为250μl的混合液（热变性HSA的最终浓度：0.2 w/v%）。在此制备过程中，混合的上述试样的量要使得混合液中ACTH部分肽的最终浓度达到0–80μM。同时，在上述混合液的制备中，还用热变性OA溶液取代热变性HSA溶液并制备了混合液（热变性OA的最终浓度：0.2 w/v%）。 [0190] （4）测定混合液的吸光度 [0191] 用分光测光仪UV-2500PC（岛津制作所）测定以上制备的各混合液在波长550nm时的吸光度（OD550）。结果见图6。对于所得到的结果，用KaleidaGraph（产品名称，HULINKS公司）进行希尔标绘法分析，算出热变性HSA和热变性OA的Kd值和希尔系数。各数值见表5。 [0192] [表5] [0193]试剂 Kd（μM） 希尔系数n 热变性HSA 46 11 热变性OA 67 3 [0194] 结果 [0195] 从图6可以看出，当使用热变性HSA和热变性OA溶液时，碱性肽的浓度依赖型OD550上升。另外，从表5得知，Kd值显示出较低值。希尔系数也是3或11。因此，无论是上述HSA和OA中的哪种试剂，使其热变性，就可以使其对ACTH部分肽具有亲和性和正协同性。 [0196] 从以上得知，使用了变性HSA和变性OA的试剂也能检测碱性肽的存在，并且能定量其浓度。 [0197] （实施例7）探讨在肽检测中的检测用试剂的浓度 [0198] 1. 实验方法 [0199] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液 [0200] 将BSA（Sigma-Aldrich公司）溶解于超纯水中，制备BSA溶液（5.0 w/v％）。将此BSA溶液用高压处理器在115℃下加热15分钟，获得热变性BSA溶液。 [0201] （2）制备含有检测对象的碱性肽的试样 [0202] 作为检测对象的碱性肽是由ACTH的1位–24位的氨基酸构成的ACTH部分肽（Biologica株式会社）。将此肽溶解于超纯水中，制得备含有检测对象的碱性肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0203] （3）制备各检测用试剂和试样的混合液 [0204] 将上述（1）制备的热变性BSA溶液与上述（2）制备的试样30μl和60μl混合后，加入超纯水，制得总量为250μl的混合液。在此制备过程中，混合检测用试剂（热变性BSA溶液）和上述各试样时，其量要使得混合液中的检测用试剂最终浓度为0.1–５%。 [0205] （4）评价混合液的浊度 [0206] 用分光测光仪UV-2500PC（岛津制作所）测定以上制备的各混合液在波长550nm时的吸光度（OD550）。将检测出浊度时的情况设为“Y”，将未检测出浊度时的情况设为“N”，结果见表6。 [0207] [表6] [0208] [0209] 2. 结果 [0210] 从表6得知，检测用试剂在混合液中的最终浓度在0.1–５%（变性BSA的最终浓度为0.005–0.25 w/v％）的范围内时，均可以检测出碱性肽。 [0211] （实施例8）评价使用了变性BSA溶液的中性肽和酸性肽的检测能力 [0212] 1. 实验方法 [0213] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液 [0214] 与上述实施例1同样地，制备热变性BSA溶液。 [0215] （2）制备含有检测对象的肽的试样 [0216] 作为碱性肽以外的比较用检测对象使用的是：中性肽纤维蛋白原α（序列号6；Biologica株式会社）、酸性肽C3f（序列号7；Biologica株式会社）、以及因子XIII（序列号 8；Biologica株式会社）。将这些肽溶解于超纯水中，制得含有各种肽的试样（1.0 mg/ml）。 [0217] （3）制备检测用试剂和各试样的混合液 [0218] 将上述（1）制备的变性BSA溶液50μl混入上述（2）制备的各试样后，分别加入超纯水，制得总量为250μl的含有各种肽的混合液。在此制备过程中，混合热变性BSA和上述试样时，其量要使得各混合液中的肽的最终浓度为0–80μM。 [0219] （4）测定混合液的吸光度 [0220] 与实施例1同样地，测定上述制备的各混合液的OD550。结果如图7-1至图7-4所示。 [0221] 2. 结果 [0222] 当使用中性肽，即使用纤维蛋白原α时，看不出OD550的变化（参照图7-1）。可以认为，这是因为热变性BSA与纤维蛋白原α没有结合，或者是两者结合后立刻解离了。 [0223] 当使用酸性肽C3f时，也看不出OD550的变化（参照图7-2）。当使用因子XIII时，也看不见OD550的变化（参照图7-3）。可以认为，这是因为在这些情况下，热变性BSA与C3f、热变性BSA与因子XIII没有结合，或者是它们结合后立刻解离了。 [0224] 在此，将上述结果、以及实施例1的碱性肽的检测结果合并显示为图7-4。可以看出，如此图所示，本发明的方法对于酸性肽和中性肽不具有检测能力，只对碱性肽具有特异性检测能力。 [0225] （实施例9）探讨热变性BSA溶液的肽在检测中的肽浓度界限（LoD）[0226] 1. 实验方法 [0227] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液 [0228] 与上述实施例1同样地，制备热变性BSA溶液。 [0229] （2）制备含有检测对象的碱性肽的试样 [0230] 与上述实施例6同样地，制得含有碱性肽的试样。 [0231] （3）制备各检测用试剂和试样的混合液 [0232] 将上述（1）制备的热变性BSA溶液600μl与上述（2）制备的试样混合后，加入超纯水，制得总量为3ml的混合液（热变性BSA的最终浓度：0.2 w/v%）。在此制备过程中，混合热变性BSA溶液和上述试样时，其量要使得混合液中的ACTH部分肽的最终浓度为0–1.6μM。 [0233] （4）测定混合液的荧光强度，通过显微镜观察统计凝集物的个数 [0234] 将上述制备的各混合液分为二份，用分光荧光测光仪F-7000（株式会社日立高新技术）测定其中一份的各混合液在激发光波长510nm时的520nm的荧光强度。结果见图8。对于所得结果，用KaleidaGraph（产品名称，HULINKS公司）进行希尔标绘法分析，以此评价肽浓度界限（LoD）。将另一份的各混合液滴入浮游生物计数板（松浪硝子工业株式会社），用显微镜（×400 奥林巴斯公司）对843μm×843μm内存在的凝集物进行计数。结果见图 9。对于所得结果，用KaleidaGraph（产品名称，HULINKS公司）进行希尔标绘法分析，以此评价肽浓度界限（LoD）。 [0235] 2. 结果 [0236] 从图8可以看出，在肽浓度为数百nM有序区（Order Region）中，可以看到碱性肽的浓度依赖型荧光强度有所上升。荧光强度和碱性肽浓度之间的关系符合希尔方程式。 [0237] 在图9中，用显微镜对凝集物进行计数时，也可看出碱性肽的浓度依赖型荧光强度上升。而且，计数数目和碱性肽浓度之间的关系也符合希尔方程式。 [0238] 以上说明，即使碱性肽浓度为数百nM，本发明的方法也可以用于检测该肽的存在，并定量其浓度。 [0239] （实施例10）评价对含有血清的样本中的碱性肽的检测能力 [0240] 1. 实验方法 [0241] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液 [0242] 与上述实施例1同样地，制备热变性BSA溶液。 [0243] （2）制备含有检测对象的碱性肽的血清溶液 [0244] 作为检测对象的碱性肽使用的是由ACTH的1位–24位的氨基酸构成的ACTH部分肽（Biologica株式会社）。将此肽溶解于超纯水后，与美国健康人（女性，16岁）的血清（SUNFCO公司）混合，以此制得含有检测对象的碱性肽和血清的试样。在此试样中，ACTH部分肽的浓度和血清浓度分别调整为以下（3）所示的最终浓度。 [0245] （3）制备检测用试剂和试样的混合液 [0246] 将上述（1）制备的热变性BSA溶液50μl与上述（2）制备的试样混合后，加入超纯水，制得总量为250μl的含有血清的混合液（以下称“血清溶液”）。在此制备过程中，混合上述试样时，其量要使得混合液中ACTH部分肽的最终浓度为0–80μM，且血清的最终浓度为100倍稀释。此外，制备不含血清的混合液（以下称“对照液”），并将其作为比较实验用混合液。 [0247] （4）测定混合液的吸光度 [0248] 用分光测光仪UV-2500PC（岛津制作所）测定以上制备的各混合液在波长550nm时的吸光度（OD550）。结果见图10。对于所得结果，用KaleidaGraph（产品名称，HULINKS公司）进行希尔标绘法）分析，计算出热变性BSA的Kd值和希尔系数、HSA浓度（CHSA）、HSA和ACTH的解离常数（Ki值）。各数值见表7。 [0249] [表7] [0250] [0251] 2. 结果 [0252] 从图10可以看出，即使所使用样本是采自受检者的含有血清的实际样本，或者不是实施例1–9所示的仅含有检测对象碱性肽的纯样本，同样可以检测出碱性肽。 [0253] 在图10中，比较一定的OD值对应的血清溶液、以及对照液的ACTH部分肽的浓度，可以看出血清溶液的ACTH部分肽的量是对照液的约2倍。可以认为这是受到血清中HAS的竞争性抑制的影响。就血清溶液而言，需要考虑血清中HAS和ACTH部分肽的解离常数、吸光度和碱性肽浓度之间的关系符合以下希尔方程式。 [0254] OD＝（肽浓度）n／[（肽浓度）n +[ Kd×(1+CHSA／Ｋｉ)]n] [0255] （式中，Kd表示ACTH部分肽和热变性BSA的解离常数，CHSA表示HAS的浓度，Ki表示ACTH部分肽和HSA的解离常数，n表示希尔系数。） [0256] 从表7可以看出，在对照液和血清溶液之间，比较与检测用试剂自身的检测能力相关的因子Kd值和希尔系数n，可以看出两者的值基本相等，与此相反，CHSA在二者之间显示出不同的值。由此得知，并非检测用试剂本身的检测能力下降，而是血清中的HSA捕捉了一部分ACTH部分肽，因此溶液中实际存在的游离肽的数量减少了。 [0257] 从以上可以看出，本发明的方法能够从实际的样本中简便地检测出碱性肽，并能够定量其浓度。 [0258] 在此，为了提高碱性肽的检测灵敏度，也可以在本发明方法中追加浓缩肽这一前处理步骤。此步骤如以下实施例所示。 [0259] （实施例11）浓缩含有血清的样本中的碱性肽的过程，检测出浓缩碱性肽[0260] 1、实验方法 [0261] （1）制备用作检测用试剂的变性BSA溶液 [0262] 与上述实施例1同样地，制备热变性BSA溶液。 [0263] （2）制备含有检测对象的碱性肽的实际样本血清溶液 [0264] 作为检测对象的碱性肽使用的是由ACTH的1位–24位的氨基酸构成的ACTH部分肽（Biologica株式会社）。将此肽溶解于超纯水后，与美国健康者（女性，16岁）的血清（SUNFCO公司）混合，以此制备含有检测对象的碱性肽的实际血清试样。在此试样中，ACTH部分肽的浓度和血清浓度分别调整为以下（3）所示的浓度。 [0265] （3）制备浓缩了检测对象的碱性肽的试样溶液 [0266] 将丙三醇溶液（Agilent Technologies公司）6ml和OFFGEL（游离胶分馏器）缓冲液（Agilent Technologies公司）600μl混合后，加入超纯水，制得总量为50ml的pH为3-10的肽缓冲液（×1.25）。将此溶液与上述（2）的试样混合，制得ACTH部分肽的浓度为 20μM、且血清1000倍稀释的肽缓冲液（×1）。用此溶液和pH为3-10的分馏用高分辨IPG胶条，在OFFGEL分馏器（Agilent Technologies公司）中进行分馏操作。然后，回收含有ACTH部分肽的部分（fraction）（阴极部分所接触的溶液），添加超纯水100μl后，将此溶液作为碱性肽浓缩试样。 [0267] （4）制备检测用试剂和试样的混合液 [0268] 将上述（1）制备的热变性BSA溶液50μl、以及上述（3）制备的试样混合后，加入MES-HCl缓冲液（pH5.0）和超纯水，直至总量达到250μl（MES最终浓度为50μM），调整pH，以此制得混合液。此外，制备不含热变性BSA溶液的溶液，并将其作为比较用混合液。 [0269] （5）测定混合液的吸光度 [0270] 用分光测光仪UV-2500PC（岛津制作所）测定以上制备的各混合液在波长550nm时的吸光度（OD550）。结果见表8。 [0271] [表8] [0272]热变性BSA OD550值 无 0.03 有 4.36 [0273] 2. 结果 [0274] 确认含有热变性BSA的试样中的浊度上升，由此得知，即使是在OFFGEL分馏后的溶液中，用本发明的检测试剂也可以检测出ACTH部分肽。 [0275] 因此，在本发明的方法中，加入了用OFFGEL分馏器浓缩碱性肽这一前处理步骤，因此，可以检测出实际样本中的极微量的碱性肽。 |
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