[0001] 发明的领域和背景

[0002] 本发明在其一些实施方案中涉及监测和分析代谢活性分布的方法及其诊断或治疗用途，或具体地涉及通过血液样品的代谢活性监测作出癌症诊断。

[0003] 疾病治疗中的主要问题在于早期检测和分期。早期检测使得能够从疾病的发作治疗性处理，在许多情况下导致成功的治疗。疾病的分期可以表明对于最佳治疗可能是决定性的药物疗法的适当方案。例如现今，数百万人患有癌症或已患过癌症。在美国，癌症是第二种最常见的死亡原因，其仅次于心脏病。在美国，每四例死亡中癌症几乎占1例。癌症得到诊断和治疗的越快，存活机会就越好。

[0004] 用于检测癌症的所有已知的方法集中在主要鉴定恶性组织和/或分泌进入循环的其病理癌症生物标志物。然而，遗憾地是，这些诊断方法仅在疾病的相对晚期阶段有效。

[0005] 瓦博格效应是下面的观察结果：大部分癌细胞主要通过高的糖酵解速率和之后的细胞溶质中的乳酸生产n产生能量，而不是通过与大部分正常细胞一样的比较低的糖酵解速率和之后的在线粒体中的丙酮酸的氧化来产生能量[Kim JW,Dang CV(2006).″Cancer′s molecular sweet tooth and the Warburg effect″.Cancer Res.66(18):8927–30]。其次，在20世纪20年代，Otto Warburg发现与正常的分化细胞不同，癌细胞19,20主要依赖于有氧糖酵解而不是依赖于线粒体氧化磷酸化来产生ATP作为细胞过程所需的能量的燃料。这个历史上的现象被称为“瓦博格效应”21。Otto Warburg假设代谢中的这种变化是癌症的根本原因[Warburg O(1956).″On the origin of cancer cells″.Science 123(3191):309–14]，现在这个陈述被称作瓦博格假说。大约50年之后，也在体外的活化淋巴细胞中观察到瓦博格效应，参见例如，Maclver等人2008 J.Leukocyte Biology 84:1-9；以及
DeBerardinis Cell Metabolism 7:11-20。还在免疫系统中发现瓦博格效应，在免疫系统中，活化T细胞22,23快速地超诱导糖酵解，例如通过葡萄糖转运蛋白（GLUT）的过表达24。

[0006] 瓦博格效应具有重要的医学应用，如临床上利用恶性肿瘤的高有氧糖酵解以通过使用正电子发射断层显像（PET）对2-18F-2-脱氧葡萄糖（FDG）（放射性的且修饰的己糖激酶底物）的吸收进行成像来诊断和监测癌症的治疗反应。还参见WO2007/102146。然而，这些方法由于需要高科技设施或原位组织活检而是繁琐且昂贵的。

[0007] 因此，需要用于早期和简单诊断的非侵入性方法。

[0008] 发明概述

[0009] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种测量细胞的代谢活性（MA）的方法，该方法包括独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布（acidification profile）：

[0010] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0011] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；

[0012] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0013] 其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性。

[0014] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种在有此需要的受试者中诊断与改变的代谢活性相关的疾病的方法，该方法包括：

[0015] （a）提供包括细胞的受试者的生物样品；

[0016] （b）独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：

[0017] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0018] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及

[0019] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0020] 其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中与在相同条件下检测的正常的未受影响的细胞样品的代谢活性相比，所述代谢活性的转变指示与改变的代谢活性相关的疾病。

[0021] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种单独地优化疾病治疗的方法，该方法包括：

[0022] （a）使包括细胞的受试者的生物样品与至少一种药剂接触；

[0023] （b）独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：

[0024] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0025] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及

[0026] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0027] 其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中细胞的代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示用于疾病的有效药剂。

[0028] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种在受试者中监测疾病治疗的方法，该方法包括：

[0029] （a）对受试者施用至少一种针对所述疾病的药剂；

[0030] （b）在施用之后，取回包括受试者的细胞的生物样品；

[0031] （c）独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：

[0032] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0033] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及

[0034] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0035] 其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中细胞的代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示疾病的有效治疗。

[0036] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种在有此需要的受试者中的疾病治疗的方法，该方法包括：

[0037] （a）根据权利要求2所述的方法诊断受试者中的疾病的存在；

[0038] （b）根据诊断对受试者进行治疗。

[0039] 根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种鉴定能够改变细胞的代谢活性的试剂的方法，该方法包括：

[0040] （a）使细胞经受试剂；

[0041] （b）根据权利要求1所述的方法在（a）之后并任选地在（a）之前测量细胞的代谢活性，其中酸化分布的转变指示能够改变细胞的代谢活性的试剂。

[0042] 根据本发明的一些实施方案，细胞外环境包括具有校准的缓冲能力的限定的溶液。

[0043] 根据本发明的一些实施方案，缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水。

[0044] 根据本发明的一些实施方案，细胞包括白细胞。

[0045] 根据本发明的一些实施方案，细胞包括癌细胞。

[0046] 根据本发明的一些实施方案，细胞包括外周血单核细胞（PBMC）。

[0047] 根据本发明的一些实施方案，疾病包括癌症。

[0048] 根据本发明的一些实施方案，生物样品包括血液样品。

[0049] 根据本发明的一些实施方案，疾病选自由以下组成的组：癌症、病原感染和自身免疫疾病。

[0050] 根据本发明的一些实施方案，测量使用选自由以下组成的组的无毒膜不透性探针来实现：pH探针、CO2探针和NH3探针以及乳酸盐探针。

[0051] 根据本发明的一些实施方案，pH探针包括测比pH探针（ratiometric pH probe）。

[0052] 根据本发明的一些实施方案，pH探针包括HPTS。

[0053] 根据本发明的一些实施方案，非挥发性代谢物包括乳酸盐。

[0054] 根据本发明的一些实施方案，挥发性代谢物包括NH3和CO2。

[0055] 根据本发明的一些实施方案，测量（i）的酸化分布在暴露于空气的腔室中实现。

[0056] 根据本发明的一些实施方案，测量（ii）的酸化分布在气密性的腔室中实现。

[0057] 根据本发明的一些实施方案，测量酸化分布在恒温下实现。

[0058] 根据本发明的一些实施方案，恒温包括37℃。

[0059] 根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括在测量酸化分布之前或者与之同时使细胞经受刺激物或抑制物。

[0060] 根据本发明的一些实施方案，刺激物或抑制物包括细胞。

[0061] 根据本发明的一些实施方案，刺激物或抑制物包括无细胞抗原。

[0062] 根据本发明的一些实施方案，刺激性细胞包括淋巴细胞且细胞包括关于淋巴细胞的非同系淋巴细胞。

[0063] 根据本发明的一些实施方案，测量酸化分布在商业荧光多孔板扫描仪中实现。

[0064] 根据本发明的一些实施方案，MA测试背景测量值的信噪过滤通过k-均值聚类分析来进行。

[0065] 根据本发明的一些实施方案，对代谢活性的诊断决策进行至少两个决策树模型（decision tree model）。

[0066] 根据本发明的一些实施方案，决策树模型选自以下的组：C5、C&R Tree和CHAID。

[0067] 根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括将细胞与细胞外环境分离。

[0068] 根据本发明的一些实施方案，在离心作用下通过ficoll分离完成分离。

[0069] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属的领域的普通人员所通常理解的相同的含义。虽然与本文描述的内容类似或等同的方法和材料可以被用于本发明的实施方案的实施或测试中，但是下文描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而非旨在必然进行限制。

[0070] 附图简要说明

[0071] 在此仅以实例的方式参照附图描述本发明的一些实施方案。现在具体详细参照附图，要强调的是所示的具体内容是通过实例的方式且目的用于本发明的实施方案的示例性讨论。在这方面，结合附图的说明使得本领域的技术人员明了可以如何实施本发明的实施方案。

[0072] 在附图中：

[0073] 图1是氧化磷酸化、无氧糖酵解和有氧糖酵解（又称作“瓦博格效应”）之间的差异的示意图。

[0074] 图2是示出了8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）的pH相关的吸收光谱的图。

[0075] 图3A-D是示出了在2mM和10mM磷酸盐缓冲盐水和在1μM HPTS下的工作溶液的pH和酸度校准的图。打开：在37℃不密封下监测酸化步骤。关闭：在37℃下在多孔板被密封之后监测酸化步骤。

[0076] X轴：比率（：在Ex.403nm处的荧光强度）/（在Ex.455nm处的荧光强度）。

[0077] 右侧Y轴（三角形）：如通过连续添加1N HCl获得的HCl的累积量（μmol/ml）。

[0078] 左侧Y轴（圆形）：如通过pH玻璃电极测得的合适的pH值。图3A-B——具有2mM磷酸盐缓冲盐水的工作溶液。图3C-D——具有10mM磷酸盐缓冲盐水的工作溶液。

[0079] 图4A-B是示出了在10mM磷酸盐缓冲盐水下，在1μM和10μM的HPTS浓度下的校准曲线的图。

[0080] X轴：比率（：在Ex.403nm处的荧光强度）/（在Ex.455nm处的荧光强度）。

[0081] 右侧Y轴（三角形）：如通过连续添加1N HCl获得的HCl的累积量（μmol/ml）。

[0082] 左侧Y轴（圆形）：如通过pH玻璃电极测得的合适的pH值。（图4A）HPTS的最终浓度为1μM。（图4B）HPTS的最终浓度为10μM。

[0083] 图5A-D示出了HPTS参考速率值的k-均值聚类分析。图5A-C——x轴指从“打开”获取的探针的标准值，以及y轴指从“关闭”测量获取的探针的标准值。图5A——在聚类分析之前，来自所有测试供体（N=730个观察值）的所有值的检测。图5B——探针数据的k-均值聚类分析指示在用不同的颜色表示的26个聚类上。五个聚类被发现较小（观察值≤6），并因此被丢弃（异常值）。图5C-D——来自730个观察值的34个观察值（4.66%）被排除（红色）。剩余的696个观察值（95.34%）（蓝色）展示于图5B中的21个单独的聚类中。然后，对于每个供体重新计算“打开”状态的平均值和“关闭”状态的平均值。

[0084] 图6A-C是对于递增葡萄糖浓度，对典型的健康供体和癌症供体获得的MA分布，x轴：葡萄糖浓度（mM），y轴：图6B-C的y轴是单位为皮摩尔H+/μl/小时/2500PBMC的hPBMC的代谢活性速率，以及图6C的y轴是单位为皮摩尔H+/μl/小时的hPBMC的代谢活性速率。在37℃温育1小时期间测量酸化动力学。在30分钟期间的多孔板的“打开”状态循环。在这种状态下存在CO2和NH3的气体通风，从而使得只有乳酸生产（包括其他非挥发性有机酸）有助于每个孔内的等价酸性累积。在30分钟期间的相同多孔板的“关闭”状态循环。在这种气密地封闭状态下，CO2和NH3在平衡时与水反应形成碳酸和铵离子。酸度水平由乳酸和碳酸阴离子在pH+为7.3左右产生。此处评估NH4碱性阳离子以滴定酸度水平。“关闭”-“打开”=CO2+（-NH3））。
（图6A）MA测试的对照记录包括探针HPTS和葡萄糖，但不带有细胞。（图6B）代表典型的健康供体的45岁女性的MA分布（类似于针对不同年龄和性别所获得的分布）。（图6C）患有2期乳腺idc癌的37岁女性和治疗之前的MA分布。注意到，在健康样品和患病样品之间的所诱导的MA变化可能已经在基础状态（没有刺激物的对照样品）下被检测到。

[0085] 图7A-D是示出了对于递增葡萄糖，患有乳腺癌的65岁女性与69岁的健康男性相比所获得的MA分布的随访病例研究的图。黑色-“关闭”；红色-“打开”；蓝色-“C-O”=“关闭”-“打开”。图7A——69岁的健康男性的外周血单核细胞（PBMC）的MA分布。图7B-D示出了患有乳腺idc癌的65岁女性的外周血单核细胞（PBMC）的三个随访MA分布。X轴：葡萄糖浓度（mM）。Y轴：单位为皮摩尔/μl/小时/2500 PBMC的PBMC的代谢活性速率。（图7B）随访患者的第一MA测试，通过测试结果已经疑为患有癌症（时间=0）。（图7C）时间=+10.5个月——刚好在常规的乳房X线照相术由医生诊断患有3期乳腺idc癌之后的第二MA测试。（图7D）时间=+14.5个月——在外科手术切除左乳中2.2x2.4cm的肿瘤之后并在两个月的三次化疗治疗之后进行第六MA测试。

[0086] 图8A-D是示出了对于递增PSA浓度，典型的健康供体、乳腺癌患者和乳腺癌恢复的供体所获得的MA分布的图。

[0087] 图8A——包括探针HPTS和PSA的MA测试的对照记录，但不带有细胞。（图8B-D）三个不同供体的外周血单核细胞（PBMC）的MA分布。X轴：PSA浓度（μg/ml）。Y轴：图9B-D的Y轴是单位为皮摩尔H+/μl/小时/2500 PBMC的PBMC的代谢活性速率以及图8A的Y轴是单位为皮摩尔H+/μl/小时的PBMC的代谢活性速率。在37℃温育1小时期间测量酸化动力学。黑色-“关闭”；红色-“打开”；蓝色-“C-O”=“关闭”-“打开”。（图8A）表示典型的健康供体的59岁女性的MA分布。（图8B）患有2期乳腺idc癌的37岁女性和任何治疗之前的MA分布。（图8C）在MA测试之前的18年从乳腺癌恢复的50岁女性的MA分布。

[0088] 图9A-D示出了用于MA测试结果的模型构建和分类评估。

[0089] 图9A-B——年龄在40岁以上（n=42）的第一组供体。图9C-D——年龄在22至81岁之间的第二组供体。图9A、C——两个表呈现了具有最佳分类的最佳切割点的最佳模型。“O”指的是“打开”状态，“C”指的是“关闭”状态以及“C-O”指的是“关闭-打开”状态。TP指的是真阳性，FN指的是假阴性，TN指的是真阴性以及FP指的是假阳性。图9B、D——通过累积增益图表评估和比较模型性能的两幅图。y轴示出了通过患有癌症的模型进行分类的供体的百分比。这是全部供体（健康供体和癌症患者）的百分比。x轴示出了分类为患有癌症的患者的百分比，其是用于第一组的42个全部供体以及用于第二组的67个全部供体的比例。呈现的是能够以高精确度对健康供体和癌症患者进行分类的四个最佳模型。第四个模型是来自回归模型族的逻辑回归模型。黑线指的是随机响应率（如果随机分类X%供体，那么获得X%癌症患者）。天蓝色线指的是理论最佳模型。红线指的是CHAID模型，绿线指的是C5算法，黄线指的是C&R tree模型以及蓝线指的是逻辑模型。

[0090] 图10A-D呈现了使用30%的供体的验证集的MA测试的评估模型结果。图10A-B——年龄在40岁以上（n=42）的第一组供体。图10C-D——年龄在22至81岁之间的第二组供体。（a，c）使用Clementine软件V13.0将图9中所述的数据划分成“训练”和“测试”两组。图
10A——包括用于第一组的70%的供体的验证集。图10C——包括用于第二组的70%的供体的验证集。图10A、C——在随机数据划分之后通过累积增益图表制成的评估和比较模型性能的两幅图。y轴示出了通过患有癌症的模型进行分类的供体的百分比。这是全部供体（健康供体和癌症患者）的百分比。x轴示出了分类为患有癌症的患者的百分比。“训练”组用于在
70%的供体上构建数据挖掘模型。剩余的30%供体在之后被用于使用在训练组中产生的模型（CHAID、Logistic、C5、C&R tree）评估在“测试”组上的分类结果。如图9中所描述的，天蓝色线指的是理论最佳模型，红线指的是CHAID模型，绿线指的是C5算法，黄线指的是C&R tree模型，蓝线指的是逻辑模型以及黑线指的是随机模型。图10B、D——两个表呈现了在随机数据划分之后的具有最佳分类的最佳切割点的最佳模型。“O”指的是“打开”状态，“C”指的是“关闭”状态以及“C-O”指的是“关闭-打开”状态。TP指的是真阳性，FN指的是假阴性，TN指的是真阴性以及FP指的是假阳性。在“测试”组中，两组供体C5的性能最佳，而在“训练”组中，C&R tree的性能最佳。

[0091] 图11描述了工作假设：类似肿瘤发展的镜像的hPBMC的代谢活性分布。癌症发展被认为与可能反映在hPBMC的不同的代谢活性（MA）分布中的免疫系统的生理功能的变化相关。Y轴呈现代谢途径的两个臂，即氧化磷酸化对有氧糖酵解。X轴呈现肿瘤发展从健康到转移癌症的阶段。静止细胞（Q）具有氧化磷酸化的主要基本速率。在肿瘤发展的初始阶段下，存在Q的相关组织特异性子群（Qi）“克隆扩增”成抗肿瘤效应子杀伤细胞（Eki），其在后续阶段可能转变成促肿瘤效应子喂养细胞（Efi）。伴随地，免疫耐受和无反应性屈服于转移阶段，其中组织特异性效应子子群可以被耗竭，包括其各自的静止子群（Qi）。本结果揭示了从健康供体的hPBMC优先的主要氧化磷酸化到在局部肿瘤发展阶段（1-3期）的各个癌症患者的hPBMC优先的主要有氧糖酵解（“瓦博格效应”）的代谢转变。朝向有氧糖酵解的转变可能与主要的Efi子群相关以及也可能与Eki子群相关。癌症的组织特异性早期检测（0期）的能力将通过随访的方案进行检验。预期将揭示与健康供体所获得的代谢活化进行比较，在组织特异性抗原的刺激下增强的/降低的代谢活化。在早期的转移癌症（4期）中，朝向主要氧化磷酸化的逐渐向后转变是所期望的，产生用于适当治疗的诊断工具。特征性的代谢活性分布的以上示意性描述由条纹的橙色线呈现，其与MA测试的差异“关闭-打开”结果相关，这表明hPBMC的瓦博格效应转变。

[0092] 图12是MA测试方案和分析框架的流程图。MA测试框架的顺序阶段A-E符合以下的实施例部分的实施例1中所详细描述的。

[0093] 图13A-I是对于递增葡萄糖浓度，对典型的健康、癌症和自身免疫性狼疮供体所获得的MA分布。X轴：葡萄糖浓度（mM）。Y轴：单位为皮摩尔H+/ul/小时/2500细胞的PBMC的代谢活性速率。在37℃温育1小时期间测量酸化动力学。

[0094] 图13A、D、G——“关闭”；图13B、E、H——“打开”；图13C、F、I——“C-O”=“关闭”-“打开”。图13A-C——典型的健康供体的代表性MA分布。图13D-F——典型的癌症患者的代表性MA分布。图13G-I——患有系统性狼疮（自身免疫疾病）的患者的MA分布。

[0095] 发明的具体实施方案的说明

[0096] 本发明在其一些实施方案中涉及监测和分析代谢活性分布的方法及其诊断或治疗用途，或具体地涉及通过血液样品的代谢活性监测作出癌症诊断。

[0097] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是本发明在其应用中并不必需限于以下说明中阐述的细节或实施例所示例的细节。本发明能够具有其它实施方案或能够以各种方式实施或进行。

[0098] 如今，迫切需要高通量方法用于各种疾病的早期检测和分期。例如，癌症被发现和治疗的越快，存活机会就越好。此外，鉴定疾病的阶段确保适当的治疗。

[0099] 本发明人已经认识到，与分析与疾病相关的各种原位参数或相关的循环标志物允许在相对晚期阶段的疾病检测的用于疾病检测的标准方法不同，免疫系统可能在疾病发作时已经反映疾病状态。由于免疫系统天然负责对抗已经在早期阶段的疾病发展，鉴定相关的免疫反应的特性分布将会是有益的。免疫系统的代谢活性的这种分布连同疾病发展的变化可能也对疾病分期有用。例如，在体内稳态中，免疫系统活性应该得到很好控制；活动过度与自身免疫疾病相关，而癌症发展可能与免疫系统的活动过少相关。这些相反的路径可以由响应于各种营养物和刺激物的一般的和更专门的MA分布来指示。

[0100] 因此，本发明人设计了一种用于定量测量相关细胞群的代谢活性的独创的、面向临床的方法，作为疾病的指示剂。通过使用pH敏感的不透性荧光探针监测细胞外酸化，该试验测量微升细胞样品的代谢活性的速率。

[0101] 正如以下实施例部分所阐明的，使用代谢活性（MA）分析，本发明人揭示了在从癌症患者和健康供体获得的PBMC上监测到的不同的代谢途径之间的显著转变。可以采用该转变作为诊断工具，用于通过监测PBMC的代谢活性的特征性变化来明确区分健康和癌症患者（图6-10、13）。这些显著的初步发现是通过比较“打开”对“关闭”（气密性的）孔中的MA测试结果而获得的。两种记录使得能够测量可溶性对挥发性代谢产物（乳酸对于CO2和NH3）的累积，从而区别开三种代谢途径——氧化磷酸化、无氧糖酵解以及有氧糖酵解，如以下所解释的。

[0102] 非活化T细胞（原初T细胞），像大多数正常分化细胞一样，主要依赖于线粒体氧化磷酸化来有效地产生用于细胞过程所需的能量的ATP，以及挥发性的CO2产物。在氧气不存在时，它们必须依赖于ATP生产的更加低效的代谢途径，其与称为无氧糖酵解的乳酸生产相关。相反，大部分癌症细胞18被发现依赖于有氧糖酵解，这类似于无氧糖酵解，尽管氧气存在。Otto Warburg最初发现这一现象与癌细胞相关，并称为“瓦博格效应”。本发明人揭示“瓦博格效应”在癌症患者的新鲜PBMC中的存在。不限于理论，“瓦博格效应”的免疫代谢合理性，即癌症患者的新鲜PBMC中的原初淋巴细胞和活化淋巴细胞之间的转变，可能与肿瘤细胞附近的活化T细胞的积极而有效的生理机能的需要相关，其中在血管生成之前的早期阶段可能缺氧。这种想法与以下事实一致：肿瘤细胞通过“瓦博格效应”最初适于缺氧。

[0103] 按照上述代谢途径，终产物即CO2和乳酸直接导致MA测试检查到的酸化。

[0104] 此外，被认为在MA测试中扮演重要角色的另一种终产物是氨（NH3）。细胞能量的主要来源之一是蛋白质分解代谢，其是将蛋白质分解为氨基酸的过程。氨基被从氨基酸上去除并被转化为氨。细胞的NH3生产的另一来源是通过构成两组含氮碱基的嘌呤和嘧啶的代谢途径。在本测量系统中，如在体内，活细胞必须通过代谢酸性和碱性产物如乳酸、碳酸和铵碱的分泌将细胞质保持在约为7.2-7.4的恒定pH。

[0105] 这些发现已经确保，通过与免疫系统进行通信，面向生理的MA分析对于开发新的途径来检测、诊断和治疗癌症以及其他疾病可以具有重要的意义。

[0106] 因此，根据本发明的一方面，提供了一种测量细胞的代谢活性（MA）的方法。该方法包括独立地（即，单独地）测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：

[0107] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0108] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；

[0109] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0110] 其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性途径。

[0111] 如本文所使用的“代谢活性途径”是指线粒体氧化磷酸化、无氧糖酵解、有氧糖酵解以及NH3+生产对能量生产的相对贡献。

[0112] 该分布可以具有尖峰构形或单调的饱和性态。

[0113] 尖峰分布通常反映代谢活性的受体介导的刺激，其被预期与浓度相关的营养反应相比更具体。后一反应通常是单调的饱和分布。

[0114] 如本文所使用的“细胞”是指可以测量上述代谢活性的原核或真核细胞。细胞可以是细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。根据具体的实施方案，细胞是人类细胞。将意识到的是，细胞可以指单个细胞，但也可以指多个细胞。细胞可以是分离的细胞（没有组织结构）或在组织或组织碎片中的细胞。根据具体的实施方案，当细胞是PBMC时，对103-1010个细6 7
胞完成试验。根据具体的实施方案，细胞的数量是10-10。

[0115] 细胞可以是分化细胞、未分化细胞（例如，干细胞）或去分化细胞。

[0116] 根据具体的实施方案，细胞是免疫系统的细胞，即是白血细胞（即，白血球）。实例包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞（T细胞或B细胞）、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

[0117] 根据另一个实施方案，细胞是任何组织的病原或病变细胞如癌细胞。下面提供了根据本教导可被检测到的其他疾病和医学病症。

[0118] 可以根据本教导进行分析的其他细胞包括但不限于胚胎细胞（如用于IVF鉴定）、红血细胞、血小板、受细菌感染的细胞、受真菌感染的细胞以及受病毒感染的细胞。

[0119] 因此，细胞可以指分离的细胞群，该分离的细胞群包括高度纯化的特定细胞亚群，即，同质的细胞群（例如，>80%纯度），例如，T细胞，或非同质细胞群，该非同质细胞群包括各种类型的免疫细胞，如外周血白细胞（PBL）或单核细胞。

[0120] 细胞可以是未培养的、培养的原代细胞或克隆细胞（例如，细胞系）。

[0121] 细胞可以是贴壁细胞或悬浮的细胞。

[0122] 根据另一个实施方案，细胞可以是未遗传修饰的或遗传修饰的。

[0123] 如本文所使用的“独立测量”是指条目（ⅰ）、（ⅱ）以及可能（ⅲ）的单独的测量。尽管将意识到的是，根据具体的实施方案，（iii）是从（ⅱ）减去（ⅰ）的结果。这些单独的测量可以在相同的但单独的细胞样品上并行地、同时执行，或依次地在单个细胞样品上执行（如下面的实施例部分中所描述的）。

[0124] 因此，通过校准的酸化曲线（表1）执行测量细胞外酸化分布。

[0125] 通过计算“打开”和“关闭”状态下在细胞的细胞外环境（例如，pmol/ul/小时/2500细胞）中的与荧光测量的pH变化相关的累积酸化来执行代谢活性的测量。将意识到的是，根据具体的实施方案，只在细胞的细胞外环境而不是细胞内执行该测量。细胞外pH测量是有利的，因为在细胞外环境中存在持久性的酸性累积，而由于体内平衡的生理调节瞬态的细胞内反应中存在相对小的平均变化；细胞外探针对细胞内过程没有生理干扰；存在细胞外的测比荧光探针的比较高的信噪比；相对于细胞操作，荧光介质（校准的缓冲能力）制备的简单；与细胞内探针的严重泄漏相比，不存在背景荧光；不需要渗透化过程进行动力学测量，从而允许活细胞的实时分析；存在与猝灭和氧化作用相关的问题最少；并且，最后实现同时高通量动力学测量，而没有上述问题。

[0126] 如本文所使用的细胞的“细胞外环境”是指自然环境，例如，血液或血浆，或者人工环境如培养基。

[0127] 根据具体的实施方案，MA测试在具有校准的缓冲能力的限定的溶液（所有组分是已知的）中实现。

[0128] 将意识到的是，缓冲能力应该确保生理pH的较小变化。

[0129] 根据具体的实施方案，缓冲液为磷酸盐缓冲液（例如，磷酸盐缓冲盐水1-10mM或10mM磷酸盐缓冲液）。将意识到的是，在低细胞浓度下的酸化测量要求低缓冲液浓度。根据具体的实施方案，对2.5x106细胞/ml使用10mM磷酸盐缓冲盐水。

[0130] 因此，在培养期间通过HPTS荧光校准的缓冲能力的较小酸化方法监测代谢活性的动力学。

[0131] 图3A-D和4A-D分别描述了工作溶液校准和探针校准。

[0132] 根据具体的实施方案，在恒定温度例如20-40℃下或具体地在最佳生长温度下如对于哺乳动物细胞为37℃，执行测量酸化分布。

[0133] 如本文以上所述，细胞外酸化分布指示细胞分泌的各种代谢产物的身份。

[0134] 如图1所示，肿瘤或增生性组织（例如，活化T细胞）优先地使用有氧糖酵解，其特征主要是乳酸盐分泌到介质中。相反，分别取决于氧气的可获得性，分化组织将采用氧化磷酸化或无氧糖酵解，并因此将分泌CO2或乳酸盐。

[0135] 根据具体的实施方案，时间相关的酸化分布由于非挥发性可溶代谢产物主要为乳酸盐的分泌而在暴露于空气的腔室中执行。在这种状态（“打开”）下，存在CO2和NH3的气体通风，使得只有乳酸生产（包括其他非挥发性有机酸）有助于每个孔内的等效酸性累积。

[0136] 根据具体的实施方案，时间相关的酸化分布由于非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物的分泌而在气密性腔室中实现。在气密地封闭状态（“关闭”）下，CO2和NH3在平衡时与水反应形成碳酸和碱性铵离子。然而，在这种状态下，NH4+碱性阳离子将乳酸和碳酸阴离子产生的酸度水平滴定为pH7左右。

[0137] 根据具体的实施方案，在多孔板的空气“打开”和“关闭”状态的30分钟顺序内测量酸化动力学。

[0138] 通过酸化（+）和碱性滴定（-）的适当速率（V），在打开状态（Vopen）和关闭状态（Vclosed）下的酸化的总测量速率由耦合方程来描述：

[0139] Vopen=V（乳酸）。

[0140] Vclose=V（乳酸）+V（碳酸）-V（铵碱）。

[0141] 使用这种配置，时间相关的酸化分布由于挥发性可溶代谢产物的分泌而通过（ii）-（i）的分布的减法来计算。

[0142] 使用无毒膜不透性探针执行测量细胞外酸化的动力学。实例包括但不限于测比pH探针、CO2探针、NH3探针、乳酸盐探针以及它们的组合。根据具体的实施方案，在pH缓冲条件下，高灵敏度要求测比技术。

[0143] 根据本教导可以使用的具体探针的实例包括但不限于HPTS、CFDA和羧基荧光素。这些探针是商业上可获得的，如购自Molecular Probes。

[0144] 根据具体的实施方案，使用测比pH探针8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）实现测量酸化。

[0145] HPTS是在含水缓冲液中pKa为～7.3的低成本、无毒性、高水溶性不可透膜的pH指示剂。HPTS表现出pH相关的吸收转变，允许测比pH测量作为在455nm和403nm处的激发下随后测量的513nm处的荧光强度之间的比率的函数。该方法是pH为7左右的生理范围内的较小pH变化的本灵敏测量的关键。

[0146] 根据具体的实施方案，荧光探针被附接到纳米颗粒如纳米传感器，以便扩大各种代谢产物的比例度量的特定光学监测：CO2、NH3、乳酸等。细胞内的荧光测量在刺激的生理机制的基础研究中非常有用，例如，对于钙动员和膜去极化。然而，在体内稳态的细胞反应下，这些细胞内的刺激信号变得短暂。因此，它们被认为与记录在MA测试中的持续累积的细胞外酸化相比，较不适合PBL刺激的灵敏监测。这种细胞外监测可以通过将测比分子光学探针附接到纳米颗粒来更好地帮助。细胞外监测是生物相容的，将细胞内的探针测量共有的负面影响最小化，指向细胞外的方法的优点不仅用于基础研究，而且用于不同的细胞类型中的各种临床应用。

[0147] 酸化分布由H2O-H+等价物的分泌速率来呈现，单位为皮摩尔/μl/小时/2500细胞（参见图6-8、13）。

[0148] 以上酸化分布中的任一个可被用作细胞的代谢活性的指示剂。可替换地，所测量的分布中只有一个指示细胞的代谢活性。

[0149] 如所提到的，可以在暴露于不同浓度的刺激物或抑制物的原初细胞或活化/效应子细胞中测量细胞的代谢活性。

[0150] 如本文所使用的“刺激物”或“抑制物”是指增加、降低或改变响应于其的细胞的代谢途径的实体。

[0151] 例如，如果细胞是淋巴细胞，那么刺激物是被TCR或BCR识别并导致克隆扩增或抗体产生的抗原。具体的刺激物或抑制物列于下表1中。

[0152] 表1

[0153]

[0154]

[0155] 下文提供了被提供的其它实例。

[0156] 刺激物或抑制物可以是细胞或细胞相关的刺激物或抑制物。刺激性细胞的实例包括但不限于白细胞、干细胞、血小板、红血细胞、细菌和真菌。这样的细胞刺激物或抑制物可以指完整的细胞或细胞碎片，例如，细胞膜。

[0157] 细胞刺激物的使用在用于移植应用的混合淋巴细胞反应（MLR）中特别有利，如用于移植物排斥（组织匹配）的预测、预防或治疗移植物抗宿主病或移植物排斥。在这样的情况下，刺激物是对于细胞非同系的淋巴细胞。

[0158] 可替换地，刺激物或抑制物可以是无细胞的，如无细胞抗原（例如，可溶性抗原、病毒、细胞生物流体）。无细胞的刺激物或抑制物的具体实例包括但不限于代谢物、营养物（例如，葡萄糖）、有丝分裂原、肽、细胞因子、激素、维生素、药物、抗体、神经递质、癌症特异性抗原以及各种疾病相关的组织特异性正常抗原（TNA）。

[0159] MHC-限制的抗原（肽）的具体实例包括但不限于CEA（癌胚抗原）、MUC-1、HER2、CD340、MAGE和催乳素（其他的列于Renkvist等人，2001的“A listing of human tumor antigens recognized by T cells”.Cancer Immunol.Immunotherapy 50:3-15中）。

[0160] 刺激物或抑制物在各种浓度下与细胞接触。

[0161] 根据可疑病理选择刺激物或抑制物。例如，在体外受精应用中，检查胚胎分泌物到其细胞外流体的正在进行的MA。可替换地或额外地，通过胚胎分泌物的刺激检查母PBL的MA刺激分布。

[0162] 在筛选测试中，将细胞与多个刺激物或抑制物接触，并且对于每个这样的反应伴随地监测酸化分布。

[0163] 因此，如上所述的MA测试可以在有限数量的样品上（例如，使用组织培养皿）或在多个样品上执行，筛选对多个刺激物/抑制物的响应或从不同的患者筛选多个样品或它们的组合。可以使用多孔板、多孔板读取器（用于检测荧光信号）、CCD照相机施加影像分析或纤维光学矩阵执行高通量筛选。

[0164] 根据本发明的实施方案，将得到的酸化分布记录和存储在数据库中，如在计算机可读介质上，从而使得能够对计算模型的数据操作和构造。如本文所使用的，“计算机可读介质”是指计算机可以直接阅读和存取的任何介质。这种介质包括但不限于磁存储介质，如软盘、硬盘存储介质以及磁带；光存储介质，如光盘或CD-ROM；电存储介质，如RAM和ROM；以及这些类别的混合，如磁/光存储介质。合适的存储介质的选择和使用充分地在本领域的普通技术人员的能力范围之内。

[0165] 如本文所使用的，“记录”是指将信息存储在计算机可读介质上的过程。

[0166] 本方法的稳固性和准确性提出其在许多临床应用中的使用。

[0167] 因此，根据本发明的一方面，提供了一种在有此需要的受试者中诊断与改变的代谢活性相关的疾病的方法，该方法包括：

[0168] （a）提供包括细胞的受试者的生物样品；

[0169] （b）独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：

[0170] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0171] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及

[0172] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0173] 其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中与在相同条件下检测的正常的未受影响的细胞样品的代谢活性相比，该代谢活性的转变指示与改变的代谢活性相关的疾病。

[0174] 受试者可以是正在进行常规健康检查的健康动物或人类受试者。可替换地，受试者可以处在患有与改变的代谢活性相关的疾病如癌症的风险中（例如，遗传上易患病的受试者、具有医学和/或癌症家族史的受试者、暴露于致癌物质、职业危害、环境危害的受试者）和/或表现出癌症的可疑临床症状的受试者[例如，便血或黑便、原因不明的疼痛、发汗、原因不明的发热、原因不明的体重减轻直至食欲不振、肠排便习惯的改变（便秘和/或腹泻）、里急后重（不完全排便的感觉，特别是对于直肠癌）、贫血和/或全身无力]。

[0175] 如本文所使用的，“与改变的代谢活性相关的疾病”是指一种与取自正常的健康人（未受疾病影响的）的相同细胞群相比完成了代谢活性的转变的细胞群为特征的疾病。已经完成代谢活性转变的细胞群可以是致病细胞群（即，致病细胞，例如癌细胞）或者非致病细胞群（例如，疾病对抗细胞如免疫细胞，如在实体瘤情况下）。例如，如上文所述，在肿瘤学中，以大多数癌细胞为主以及一些经历克隆扩增的免疫系统的群体通过高的糖酵解速率随后在细胞质中产生乳酸来产生能量，而不是在像大多数正常细胞一样的通过相对低的糖酵解速率之后在线粒体中氧化丙酮酸来产生能量（参见图1）。

[0176] 根据本教导可以使用的细胞生物样品包括但不限于血液（例如，外周血白细胞、外周血单核细胞、全血、脐带血）、固体组织活检、脑脊液、尿、淋巴液和呼吸道的各种外分泌物、肠和泌尿生殖道、滑液、羊水和绒毛膜绒毛。

[0177] 活检包括但不限于包括切开或切除活检的外科活检，细针吸出物和类似物，完全切除术或体液。活检取回的方法在本领域中众所周知。

[0178] 如本文所使用的术语“诊断（diagnosis）”或“诊断（diagnosing）”是指确定病理（例如，疾病、障碍、病症或综合征）的存在或不存在、将病理或症状分类、确定病理的严重性、监测病理进展、预测病理的结果和/或对于特定疾病的受试者的恢复和筛选的前景。

[0179] 根据本教导，在用于监测受试者的细胞的相同的条件下确定相同的细胞组成的正常的、健康的（未受影响的）样品的酸化分布。

[0180] 获得酸化分布（例如，有或没有刺激物/抑制物）后，分布均被记录。受试者的细胞与对照的细胞（正常的、未受影响的）之间的代谢活性的转变（即，变化），如在相同条件下所获得的酸化分布所证明的，其指示与改变的代谢活性分布相关的疾病。

[0181] 可对代谢活性试验的结果进行决策树模型，所述决策树模型将结果进行分类并有助于最终诊断。根据优选的实施方案，组合至少两个模型（参见图9&10）。这些模型的实例包括但不限于CHAID、C5和C&R Tree。还可以应用逻辑模型。

[0182] 根据本教导可被诊断和治疗的医学病症的实例（如在下文中进一步描述的）包括但不限于癌症、病原性感染和自身免疫疾病。下文提供具体的实例。

[0183] 炎性疾病——包括但不限于慢性炎性疾病和急性炎性疾病。

[0184] 与超敏反应相关的炎性疾病

[0185] 超敏反应的实例包括但不限于Ⅰ型超敏反应、Ⅱ型超敏反应、Ⅲ型超敏反应、Ⅳ型超敏反应、速发型超敏反应、抗体介导的超敏反应、免疫复合物介导的超敏反应、T淋巴细胞介导的超敏反应和DTH。

[0186] Ⅰ型或速发型超敏反应，如哮喘。

[0187] Ⅱ型超敏反应包括但不限于类风湿性疾病、类风湿性自身免疫疾病、类风湿性关节炎（Krenn V.等人,Histol Histopathol 2000 Jul;15(3):791）、脊椎炎、强直性脊椎炎（Jan Voswinkel等人,Arthritis Res 2001;3(3):189）、系统性疾病、系统性自身免疫疾病、系统性红斑狼疮（Erikson J.等人,Immunol Res 1998;17(1-2):49）、硬化症、系统性硬化症（Renaudineau Y.等人,Clin Diagn Lab Immunol.1999 Mar;6(2):156)；Chan OT.等人,Immunol Rev 1999 Jun;169:107）、腺体疾病、腺体自身免疫性疾病、胰自身免疫性疾病、糖尿病、I型糖尿病（Zimmet P.Diabetes Res Clin Pract1996Oct;34 Suppl:S125）、甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病（Orgiazzi J.Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29(2):339）、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H.和Yu S,J Immunol 2000 Dec 15;165(12):7262）、桥本氏甲状腺炎（Toyoda N.等人,Nippon Rinsho 1999 Aug;57(8):1810）、粘液性水肿、特发性粘液性水肿（Mitsuma T.Nippon Rinsho.1999Aug;57(8):1759）；自身免疫性生殖系统疾病、卵巢疾病、卵巢自身免疫性（Garza KM.等人,J Reprod Immunol 1998 Feb;37(2):87）、自身免疫性抗精子不育症（Diekman AB.等人,Am J Reprod Immunol.2000 Mar;43(3):134）、习惯性流产（Tincani A.等人,Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9）、神经变性疾病、神经系统疾病、神经自身免疫性疾病、多发性硬化（Cross AH.等人,J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112(1-2):1）、阿尔茨海默病（Oron L.等人,J Neural Transm Suppl.1997;49:77）、重症肌无力（Infante AJ.和Kraig E,Int Rev Immunol 1999;18(1-2):83）、运动神经病（Kornberg AJ.J Clin Neurosci.2000 May;7(3):191）、格-巴二氏综合征、神经病和自身免疫性神经病（Kusunoki S.Am J Med Sci.2000 Apr;319(4):234）、肌无力疾病、莱-伊二氏肌无力综合征（Takamori M.Am J Med Sci.2000 Apr;319(4):204）、副肿瘤性神经性疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩、非副肿瘤性僵人综合征、小脑萎缩、渐进性小脑萎缩、脑炎、拉斯马森脑炎、肌萎缩性侧索硬化、西德纳姆舞蹈病、吉雷斯德拉图雷特综合征、多内分泌病、自身免疫性多内分泌病（Antoine JC.和Honnorat J.Rev Neurol(Paris)2000 Jan;156(1):23）；神经病、异常免疫性神经病（Nobile-Orazio E.等人,Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419）；神经性肌强直、获得性神经性肌强直、先天性多关节挛缩（Vincent A.等人,Ann N Y Acad Sci.1998 May 13;841:482）、心血管疾病、心血管自身免疫性疾病、动脉粥样硬化（Matsuura E.等人,Lupus.1998;7 Suppl 2:S135）、心肌梗塞（Vaarala 
O.Lupus.1998;7 Suppl 2:S132）、血栓症（Tincani A.等人,Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-
9）、肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿病、动脉炎、高安氏动脉炎和川崎氏综合征（Praprotnik S.等人,Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112(15-16):660）；抗VIII因子自身免疫性疾病（Lacroix-Desmazes S.等人,Semin Thromb Hemost.2000;26(2):157）；血管炎、坏死性小血管血管炎、显微镜下多血管炎、变应性肉芽肿性血管炎、肾小球肾炎、少免疫局灶性坏死性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎（Noel LH.Ann Med Interne(Paris).2000 May;151(3):178）；抗磷脂综合征（Flamholz R.等人,J Clin Apheresis 1999;14(4):171）；心力衰竭、心力衰竭中的类激动剂的β-肾上腺素受体抗体（Wallukat G.等人,Am J Cardiol.1999 Jun 17;83(12A):75H）、血小板减少性紫癜（Moccia F.Ann Ital Med Int.1999 Apr-Jun;
14(2):114）；溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血（Efremov DG.等人,Leuk Lymphoma 1998 Jan;28(3-4):285）、胃肠疾病、胃肠道自身免疫性疾病、肠疾病、慢性炎性肠疾病（Garcia Herola A.等人,Gastroenterol Hepatol.2000 Jan;23(1):16）、乳糜泻病（Landau YE.和Shoenfeld Y.Harefuah 2000 Jan 16;138(2):122）、肌肉组织的自身免疫性疾病、肌炎、自身免疫性肌炎、干燥综合征（Feist E.等人,Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123(1):92）；平滑肌自身免疫性疾病（Zauli D.等人,Biomed Pharmacother 1999 Jun;53(5-
6):234）、肝疾病、肝自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎（Manns MP.J Hepatol 2000 Aug;33(2):326）以及原发性胆汁性肝硬化（Strassburg CP.等人,Eur J Gastroenterol 
Hepatol.1999Jun;11(6):595）。

[0188] Ⅳ型或T细胞介导的超敏反应包括但不限于类风湿性疾病、类风湿性关节炎（Tisch R,McDevitt HO.Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Jan 18;91(2):437）、系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮（Datta SK.,Lupus 1998;7(9):591）、腺体疾病、腺体自身免疫性疾病、胰腺疾病、胰自身免疫性疾病、Ⅰ型糖尿病（Castano L.和Eisenbarth GS.Ann.Rev.Immunol.8:647）；甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病（Sakata S.等人,Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92(1):77）；卵巢疾病（Garza KM.等人,J Reprod Immunol 1998 Feb;37(2):87）、前列腺炎、自身免疫性前列腺炎（Alexander RB.等人,Urology 1997 Dec;50(6):893）、多腺体综合征、自身免疫性多腺体综合征、I型自身免疫性多腺体综合征（Hara T.等人,Blood.1991 Mar 1;77(5):1127）、神经系统疾病、自体免疫性神经系统疾病、多发性硬化、神经炎、视神经炎（Soderstrom M.等人,J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57(5):544）、重症肌无力（Oshima M.等人,Eur J Immunol 1990 Dec;20(12):2563）、僵人综合征（Hiemstra HS.等人,Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Mar 27;98(7):3988）、心血管疾病、恰加斯病中的心脏自身免疫病（Cunha-Neto E.等人,J Clin Invest 1996 Oct 15;98(8):1709）、自身免疫性血小板减少性紫癜（Semple JW.等人,Blood 1996 May 15;87(10):4245）、抗辅助T淋巴细胞自身免疫病（Caporossi AP.等人,Viral Immunol 1998;11(1):9）、溶血性贫血（Sallah S.等人,Ann Hematol 1997 Mar;74(3):139）、肝疾病、肝自身免疫性疾病、肝炎、慢性活动性肝炎（Franco A.等人,Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54(3):382）、胆汁性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化（Jones DE.Clin Sci(Colch)1996 Nov;91(5):551）、肾疾病、肾自身免疫性疾病、肾炎、间质性肾炎（Kelly CJ.J Am Soc Nephrol1990 Aug;1(2):140）、结缔组织疾病、耳病、自身免疫性结缔组织疾病、自身免疫性耳病（Yoo TJ.等人,Cell Immunol 1994 Aug;157(1):249）、内耳疾病（Gloddek B.等人,Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:
266）、皮肤疾病（skin diseases）、皮肤疾病（cutaneous diseases）、皮肤疾病（dermal diseases）、大疱性皮肤疾病、寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮以及落叶状天疱疮。

[0189] 迟发型超敏反应的实例包括但不限于接触性皮炎和药疹。

[0190] T淋巴细胞介导的超敏反应类型的实例包括但不限于辅助T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞。

[0191] 辅助T淋巴细胞介导的超敏反应的实例包括但不限于Th1淋巴细胞介导的超敏反应和Th2淋巴细胞介导的超敏反应。

[0192] 自身免疫性疾病

[0193] 包括但不限于心血管疾病、类风湿性疾病、腺体疾病、胃肠疾病、皮肤疾病、肝疾病、神经疾病、肌肉疾病、肾疾病、与生殖有关的疾病、结缔组织疾病和系统性疾病。

[0194] 自身免疫性心血管疾病的实例包括但不限于动脉粥样硬化（Matsuura E.等人,Lupus.1998;7 Suppl 2:S135）、心肌梗塞（Vaarala O.Lupus.1998;7 Suppl 2:S132）、血栓（Tincani A.等人，Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9）、韦格纳氏肉芽肿、高安氏动脉炎、川崎氏综合症（Praprotnik S.等人，Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112(15-16):660）、抗VIII因子自身免疫性疾病（Lacroix-Desmazes S.等人，Semin Thromb Hemost.2000;26(2):157）、坏死性小血管炎、显微多血管炎、变应性肉芽肿性血管炎、少免疫局灶性坏死性和新月形肾小球肾炎（Noel LH.Ann Med Interne(Paris).2000 May;151(3):178）、抗磷脂综合征（Flamholz R.等人，J Clin Apheresis 1999;14(4):171）、抗体诱导的心力衰竭（Wallukat G.等人，Am J Cardiol.1999Jun 17;83(12A):75H）、血小板减少性紫癜（Moccia F.Ann Ital Med Int.1999 Apr-Jun;14(2):114;Semple JW.等人，Blood 1996 May 15;87(10):4245）、自身免疫性溶血性贫血（Efremov DG.等人，Leuk Lymphoma 1998 Jan;28(3-4):285;Sallah S.等人，Ann Hematol 1997 Mar;74(3):139）、恰加斯病中的心脏自身免疫病（Cunha-Neto E.等人，J Clin Invest 1996 Oct 15;98(8):1709）和抗辅助T淋巴细胞自身免疫病（Caporossi AP.等人，Viral Immunol 1998;11(1):9）。

[0195] 自身免疫性类风湿性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎（Krenn V.等人，Histol Histopathol 2000 Jul;15(3):791；Tisch R,McDevitt HO.Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91(2):437）和强直性脊柱炎（Jan Voswinkel等人，Arthritis Res 2001;3(3):189）。

[0196] 自身免疫性腺体疾病的实例包括但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、特发性粘液水肿、卵巢自身免疫性、自身免疫性抗精子不育症、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺体综合征。疾病包括但不限于胰腺的自身免疫性疾病、I型糖尿病（Castano L.和Eisenbarth GS.Ann.Rev.Immunol.8:647；Zimmet P.Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125）、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病（Orgiazzi J.Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29(2):339；Sakata S.等人，Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92(1):77）、自发性自身免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H.和Yu S,J Immunol 2000 Dec 15;165(12):
7262）、桥本氏甲状腺炎（Toyoda N.等人，Nippon Rinsho 1999 Aug;57(8):1810）、特发性粘液水肿（Mitsuma T.Nippon Rinsho.1999 Aug;57(8):1759）、卵巢自身免疫性（Garza KM.等人，J Reprod Immunol 1998 Feb;37(2):87）、自身免疫性抗精子不育症（Diekman AB.等人，Am J Reprod Immunol.2000 Mar;43(3):134）、自身免疫性前列腺炎（Alexander RB.等人，Urology 1997 Dec;50(6):893）和I型自身免疫性多腺体综合征（Hara T.等人，Blood.1991 Mar 1;77(5):1127）。

[0197] 自身免疫性胃肠疾病的实例包括但不限于慢性炎性肠病（Garcia Herola A.等人，Gastroenterol Hepatol.2000 Jan;23(1):16）、乳糜泻（Landau YE.和Shoenfeld Y.Harefuah 2000 Jan 16;138(2):122）、结肠炎、回肠炎和克罗恩病。

[0198] 自身免疫性皮肤病的实例包括但不限于自身免疫性大疱性皮肤病，如但不限于寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶状天疱疮。

[0199] 自身免疫性肝脏疾病的实例包括但不限于肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎（Franco A.等人，Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54(3):382）、原发性胆汁性肝硬变（Jones DE.Clin Sci(Colch)1996 Nov;91(5):551；Strassburg CP.等人，Eur J Gastroenterol Hepatol.1999 Jun;11(6):595）和自身免疫性肝炎（Manns MP.J Hepatol 2000 Aug;33(2):326）。

[0200] 自体免疫性神经病的实例包括但不限于多发性硬化（Cross AH.等人，J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112(1-2):1）、阿尔茨海默病（Oron L.等人，J Neural Transm Suppl.1997;49:77）、重症肌无力（Infante AJ.和Kraig E,Int Rev Immunol 1999;18(1-
2):83；Oshima M.等人，Eur J Immunol 1990 Dec;20(12):2563）、神经病、运动神经病（Kornberg AJ.J Clin Neurosci.2000May;7(3):191）；格-巴二氏综合征和自身免疫性神经病（Kusunoki S.Am J Med Sci.2000 Apr;319(4):234）、肌无力、莱-伊二氏肌无力综合征（Takamori M.Am J Med Sci.2000 Apr;319(4):204）；副肿瘤性神经疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合症（Hiemstra HS.等人，Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27;98(7):3988）；非副肿瘤性僵人综合症、渐进性小脑萎缩、脑炎、拉斯马森脑炎、肌萎缩性侧索硬化、西德纳姆舞蹈病、吉雷斯德拉图雷特综合征和自身免疫性多内分泌病（Antoine JC.和Honnorat J.Rev Neurol (Paris)2000 Jan;156(1):23）；异常免疫神经病变（Nobile-Orazio E.等人，Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:
419）；获得性神经性肌强直、先天性多关节挛缩（Vincent A.等人，Ann N Y Acad Sci.1998 May 13;841:482）、神经炎、视神经炎（Soderstrom M.等人，J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57(5):544）和神经变性疾病。

[0201] 自身免疫性肌肉疾病的实例包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原发干燥综合征（Feist E.等人，Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123(1):92）和平滑肌自身免疫性疾病（Zauli D.等人，Biomed Pharmacother 1999 Jun;53(5-6):234）。

[0202] 自身免疫性肾疾病的实例包括但不限于肾炎和自身免疫性间质性肾炎（Kelly CJ.J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1(2):140）。

[0203] 涉及生殖的自身免疫性疾病的实例包括但不限于习惯性流产（Tincani A.等人，Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9）。

[0204] 自身免疫性结缔组织疾病的实例包括但不限于耳部疾患、自身免疫性耳部疾病（Yoo TJ.等人，Cell Immunol 1994 Aug;157(1):249）和内耳的自身免疫性疾病（Gloddek B.等人，Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266）。

[0205] 自身免疫性系统性疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮（Erikson J.等人，Immunol Res 1998;17(1-2):49）和系统性硬化病（Renaudineau Y.等人，Clin Diagn Lab Immunol.1999 Mar;6(2):156)；Chan OT.等人，Immunol Rev 1999 Jun;169:107）。

[0206] 传染病

[0207] 传染病的实例包括但不限于慢性传染病、亚急性传染病、急性传染病、病毒性疾病、细菌性疾病、原生动物疾病、寄生虫病、真菌疾病、支原体疾病和朊病毒疾病。

[0208] 移植物排斥疾病

[0209] 与移植物的移植相关的疾病的实例包括但不限于移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、超急性移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主疾病。

[0210] 过敏性疾病

[0211] 过敏性疾病的实例包括但不限于哮喘、荨麻疹、风疹、花粉过敏、尘螨过敏、毒液过敏、化妆品过敏、胶乳过敏、化学品过敏、药物过敏、虫咬过敏、动物皮屑过敏、刺植物过敏、毒藤过敏和食物过敏。

[0212] 根据具体的实施方案，所述疾病是癌症。

[0213] 癌性疾病

[0214] 癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。癌性疾病的具体实例包括但不限于：骨髓性白血病，如慢性髓性白血病。急性成熟骨髓性白血病。急性早幼粒细胞性白血病、具有增加的嗜碱性粒细胞的急性非淋巴细胞白血病、急性单核细胞性白血病。嗜酸性粒细胞过多的急性骨髓单核细胞性白血病；恶性淋巴瘤，如伯基特非霍奇金氏病；淋巴样白血病，如急性淋巴母细胞白血病。慢性淋巴细胞性白血病；骨髓增生性疾病，如实体瘤良性脑膜瘤、唾液腺混合肿瘤、结肠腺瘤；腺癌，如小细胞肺癌、肾、子宫、前列腺、膀胱、卵巢、结肠、肉瘤、脂肪肉瘤、粘液样、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤（腺泡型）、外骨骼粘液样软骨肉瘤、尤文氏肉瘤；其它的包括睾丸和卵巢无性细胞瘤、成视网膜细胞瘤、维耳姆斯瘤、神经母细胞瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌、子宫颈癌、前列腺癌和卵巢癌。

[0215] 因此，本教导可以用于疾病检测。以下是涉及早期癌症检测的非限制性实施方案。

[0216] 本教导提供了一种基于免疫系统的方法作为用于癌症的早期检测和分期的非侵入性诊断工具。传统的诊断方法主要集中在恶性组织的病理及癌症特异性抗原和基因上。相反，本教导集中于免疫系统的正常反应对异常反应作为用于癌症（以及其它疾病）的早期检测和分期的天然可用的工具。因此，本教导通过测量免疫系统响应在不同的浓度的广范围的刺激物/抑制物（代谢物、营养物、促分裂原、天然的和合成的肽、细胞因子、激素、维生素、药物、抗体、神经递质、癌症特异性抗原以及各种疾病相关的组织特异性的正常抗原（TNA））的PBL代谢活性刺激分布（MASP），提供了一种高通量的功能性生理血液测试。用传统的免疫反应观点来看，甚至在PBL的效应子亚群的“克隆扩增”下预见相对小的效果。然而，依据“系统生物学”，可以遍及网络刺激放大较小的子群反应。提出在检测异常高水平的TNA时免疫系统通过其一般功能来对抗癌症。PBL代谢活性也可用于诊断癌症发展的晚期阶段。
在局部肿瘤阶段，免疫系统的有效杀死响应已受限，即使观察到特异性的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）也不能摧毁肿瘤组织。但在该阶段，这样的循环T淋巴细胞可能仍然负责杀死单独的循环癌细胞。从局部肿瘤到转移期的转变指向免疫系统的完全具体的失效，且这个转变在MA刺激分布中可由特征性的变化测得。

[0217] 根据本教导进行疾病诊断，随后使用黄金标准方法证实筛选结果。一旦确诊，或者依赖于本教导或者使用黄金标准方法得到证实，根据需要告知受试者诊断和治疗。

[0218] 将意识到的是，本发明具有多种应用，所述应用涉及单独地优化疾病治疗、监测受试者的疾病治疗、确定受试者的疗法和鉴定能够治疗与异常代谢活性相关的疾病的试剂。

[0219] 因此，根据本发明的一方面，提供了一种在有此需要的受试者中的疾病治疗的方法，该方法包括：

[0220] (a)根据上述方法，诊断受试者中的疾病的存在；以及

[0221] (b)根据诊断对受试者进行治疗。

[0222] 如本文所使用的术语“治疗”是指消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或者基本上防止病症的临床或美学症状出现。

[0223] 根据本发明的另一个方面，提供了一种单独优化疾病治疗的方法，该方法包括：

[0224] （a）使包括细胞的受试者的生物样品与至少一种药剂接触；

[0225] （b）独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：

[0226] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0227] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及

[0228] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0229] 其中时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中所述细胞的代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示用于疾病的有效药剂。

[0230] 如本文所使用的“单独优化治疗”是指一种定制治疗方案（例如，药剂的类型、剂量）的离体方法。

[0231] 如本文所使用的“药剂”是指药品、药用药或药物的制剂，如在本文中可互换使用的。药剂的实例包括但不限于化疗剂、抗生素、抗寄生虫药物、抗病毒剂和类似物。

[0232] 如本文所使用的，术语“接触”是指在使得药剂接触细胞膜并且如果需要内化到细胞膜的条件下将药剂带入细胞的附近。因此，例如，所述接触应该在足以使药剂影响细胞表型（例如，细胞毒性或细胞抑制效应）的温度和时间下在缓冲液的条件下实现。所述接触可在体外、离体或在体内中实现。所述接触可以在容器中实现，该容器还能够检测酶反应（即，在电化学电池中）的产物，使得即时地检测电信号。下面本文将进一步描述此类容器。可替换地，所述接触可以在单独的容器中实现，检测从该单独的容器中发生使得能够在特定时间点连续地收回样品和放置此类样品在电化学电池中。因此，所述接触可在试管、烧瓶、组织培养、芯片、阵列、平板、微板、毛细管等类似物中实现。在加入基质后，可将细胞放置在振动板上用于连续彻底地混合细胞的内含物。

[0233] 根据具体的实施方案，“细胞的代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变”是指优选地将100%特性朝向对照的正常健康的细胞样品至少10%局部或全局（整个分布的）的转变。

[0234] 如将由熟练的技术人员来确定的，超过预定阈值的转变指示有效的治疗。

[0235] 同样地，提供了一种在受试者中监测疾病治疗的方法，该方法包括：

[0236] （a）对受试者施用至少一种针对所述疾病的药剂；

[0237] （b）在施用之后，取回包括受试者的细胞的生物样品；

[0238] （c）独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：

[0239] （i）非挥发性可溶代谢产物；

[0240] （ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及

[0241] （iii）挥发性可溶代谢产物；

[0242] 其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中所述细胞的代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示疾病的有效治疗。例如，提出在转移期，MA分布可以回归接近正常分布。

[0243] 同样地，提供了一种鉴定能够改变细胞的代谢活性的试剂的方法，该方法包括：

[0244] （a）使细胞经受试剂；

[0245] （b）根据权利要求1所述的方法在（a）之后并任选地在（a）之前测量细胞的代谢活性，其中酸化分布的转变指示能够改变细胞的代谢活性的试剂。

[0246] 如本文所使用的术语“试剂”是指一种包括生物试剂或化学试剂的测试组合物。

[0247] 根据本发明的方法可作为代谢活性的潜在调节剂被测试的生物试剂的实例包括但不限于核酸例如多核苷酸、核酶、siRNA和反义分子（包括但不限于RNA、DNA、RNA/DNA混合物、肽核酸和具有改变的主链结构或其它化学修饰的多核苷酸类似物）；蛋白质、多肽（例如肽）、碳水化合物、脂类和“小分子”候选药物。例如，“小分子”可以是天然存在的化合物（例如，来源于植物提取物、微生物发酵液等等的化合物）或合成的有机或有机金属化合物，具有小于约10,000道尔顿，优选地小于约5,000道尔顿，以及最优选地小于约1,500道尔顿的分子量。

[0248] 根据本发明的该方面的优选实施方案，试剂是抗癌试剂、抗病毒试剂或抗生素试剂。

[0249] 根据本发明的方法可作为潜在抗癌试剂被测试的病症的实例包括但不限于辐射照射（如伽马辐射、UV辐射、X-辐射）。

[0250] 将意识到的是，如本文所使用的转变还可以是同一分布中的不同水平（例如，更高水平）的MA；可以是基础状态的变化和/或诱导最大MA效果的试剂浓度的转变。

[0251] 根据上述教导鉴定出能够改变细胞的代谢活性的试剂后，本发明进一步包括合成所述试剂或由自然来源纯化它。

[0252] 如本文所使用的术语“约”是指±10%。

[0253] 术语“包含（comprises）”、“包含（compriseing）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”及其变化形式表示“包括但不限于”。

[0254] 术语“由......组成”是指“包括且限于”。

[0255] 术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但只是当所述另外的成分、步骤和/或部分不会在本质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新型特征的时候。

[0256] 如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代对象，除非上下文另外清楚地指出。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

[0257] 贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以是以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅为了方便以及简短起见，并且不应解释为是对本发明的范围的死板的限制。因此，范围的描述应该被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在那个范围内的单个数值。例如，如从1到6的范围的描述应该被认为具体地公开了子范围，如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在那个范围内的单个数字，诸如1、2、3、4、5、6。不论所述范围的宽度为多少，此都适用。

[0258] 无论本文何时指示数值范围，那么是指包括在指示范围内的任何提及的数值（分数或整数）。短语在第一指示数字和第二指示数字“之间的范围”以及“范围从”第一指示数字“到”第二指示数字在本文中可互换地被使用，且是指包括第一指定数字和第二指定数字以及其间的所有分数和整数。

[0259] 如本文所使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，其包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的技术人员已知的或者容易地由已知的方式、手段、技术和过程开发的那些方式、手段、技术和过程。

[0260] 将意识到的是，为了清晰起见，在独立的实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特征也可以组合在单个实施方案中被提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中所描述的本发明的各种特征也可分离地或以任何合适的副组合或适宜地在本发明的任何其他所述的实施方案中被提供。在各个实施方案的上下文中所描述的某些特征不被认为是那些实施方案的必要特征，除非没有那些元件所述实施方案是不起作用的。

[0261] 上文所描述的和下面权利要求部分要求保护的本发明的各个实施方案和方面的实验支持见于下面的实施例。实施例

[0262] 现在参考下面的实施例，其与上述描述一起以非限定性的方式阐述了本发明的一些实施方案。

[0263] 通常，本文所使用的命名法和本发明中所利用的实验方法包括分子技术、生物化学技术、微生物学技术和重组DNA技术。在文献中详细地解释了这些技术。参见，例如，“Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”卷Ⅰ-Ⅲ Ausubel,R.M.编著.(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人(编著)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”卷1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,
531、5,192,659和5,272,057中所阐述的方法；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”，卷Ⅰ-Ⅲ Cellis,J.E.编著.(1994)；“Current Protocols in Immunology”卷Ⅰ-Ⅲ Coligan J.E.,编著.(1994)；Stites等人(编著)，“Basic and Clinical Immunology”（第8版），Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；在专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定，参见，例如，美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,
850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,
345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.编著.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.和Higgins S.J.编著.(1985)；“Transcription and Translation”Hames,B.D.和Higgins S.J.编著.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney,R.I.编著.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.(1984)和“Methods in Enzymology”卷1-317，Academic Press；″PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications″,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等人“,Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有上述文献都通过引用并入，如同在本文中完整阐述一样。其它一般参考文献已贯穿于整个文件中提供。相信其中的方法在本领域内是所熟知的，且为方便读者而提供。其中包含的所有信息都通过引用并入于本文中。

[0264] 实施例1

[0265] 实验方法

[0266] A.医学专家的血液供体要求和血液采集

[0267] 将血液样品收集在带EDTA的9毫升真空试管（Greiner Bio-One 455036）中。本研究得到Sheba Medical Center的机构审查委员会（Ramat Gan Israel）和以色列卫生部的批准（赫尔辛基批准号为7780-10-SMC）。

[0268] B.对供体的人口统计和临床信息的采集

[0269] 为了机密性的保护，标记所有采集的血液样品，并立即对其进行编码以用于数据库记录和诊断分析中。

[0270] 从22岁到80岁的42个健康供体和25个癌症患者采集MA测试结果（表2）。健康供体是包括高血压、高胆固醇水平、轻微流感和炎症的被治疗病例的混合人群。

[0271] 表2-癌症患者的临床特征：

[0272] ac-腺癌，idc-浸润性导管癌，

[0273] gej-胃食管结合部癌，

[0274] NSCLC-非小细胞肺癌

[0275]肿瘤阶段 肿瘤类型 性别 年龄 患者编号
1 乳腺idc 女 53 1
1 乳腺idc 女 64 2
2 乳腺idc 男 63 3
2 乳腺idc 女 37 4
2 乳腺idc 女 61 5
2 乳腺idc 女 38 6
2 乳腺idc 女 65 7
3 乳腺idc 女 32 8
3 乳腺idc 女 42 9
3 NSCLC ac 男 46 10
4 NSCLC ac 男 61 11
4 NSCLC ac 女 60 12
4 NSCLC ac 男 81 13
4 结肠ac 女 70 14
4 结肠 女 49 15
2 结肠ac 女 56 16
2 直肠ac 女 52 17
4 直肠ac 男 74 18
3 胃ac 男 47 19
4 胃gej 男 64 20
3 胰腺 女 57 21
4 胰腺 男 58 22
4 前列腺 男 77 23
1 甲状腺 女 54 24

[0276]2 宫颈 女 35 25

[0277] C.血液样品转运

[0278] 采取措施以保持血液细胞在热态条件（热电式冷却（低至10℃-18℃））下的活力，并轻摇直至PBMC分离。

[0279] D1.外周血单核细胞（PBMC）的分离

[0280] 通过Ficoll-Paque（UNI-SEP，Novamed）和梯度离心来分离新鲜的外周血单核细胞（PBMC）。以最终浓度为5×106个细胞/毫升将小团（pellet）重新悬浮在包括荧光探针（HPTS）的工作溶液（WS）（具有钙和镁的PBS)中。

[0281] D2.MA测试的高通量并行测量

[0282] 在黑色非结合性的、低容量的384多孔板（Greiner Bio-One）中的每个孔装入10μl的PBMC溶液和10μl的工作溶液加包括8倍递增浓度的十分之一试剂的HPTS。因此每个孔中的探针的最终浓度是1μM，且在含有10mM磷酸盐缓冲液、pH约为7.3的20μl生理工作溶液中PBMC的最终浓度为2.5×106个细胞/毫升。考虑到成人外周血中的平均PBMC浓度，选择2.56
×10个细胞/毫升的工作浓度。PBMC的该浓度被认为可保证两个方面：第一，确保在至少一小时期间由于产物累积得到合理的信噪比，以及第二，确保允许细胞间的相互作用。首先对PBMC样品，且然后对试剂至少一式三份地执行10μl装载的相同方案，从而在每个孔中精确地获得所需浓度的最终20μl的体积。此外，在每个测试中，包括了两种类型的对照：一种对照是在8个孔中仅包括探针（1μM），而没有细胞且没有刺激物；另一种对照是在8个孔中仅包括细胞，而没有刺激物，即基础状态。由商业荧光扫描仪（TECAN Infinite M200）在37℃在1小时温育期间每5分钟监测酸化过程。首先，扫描仪在30分钟（6个循环）期间监测没有密封（“打开”模式）的酸化过程，且然后为了避免来自每个孔的CO2和NH3的通风，气密地密封所述多孔板（ThermalSeal RTTM,EXCEL Scientific,Inc.）（“关闭”模式）。接着，在30分钟（6个循环）期间再次监测酸化过程。为了提高信噪比，连续地测量每个孔在455nm和403nm处的激发下在513nm处的荧光强度。

[0283] D3.试剂的类型、频谱和制备

[0284] 在每个测试中，在基础状态中和在8种不同浓度的工作溶液中被稀释的以下10种试剂的影响下监测PBMC的代谢活性分布：PHA、CONA、PMA、LSP、MBP(28)、MelanA、PSA(29)、葡萄糖（24）、L-谷氨酰胺和雷帕霉素（Strauss L，Czystowska M，Szajnik M，Mandapathil M，&Whiteside TL(2009)Differential responses of human regulatory T cells(Treg)and effector T cells to rapamycin.PLoS One4(6):e5994.）。由它们与免疫系统的关系作出这些试剂的选择（表1，如上所述，注意，浓度并不限于表中的那些，浓度=0至无毒的剂量）。

[0285] 应当提到的是，其它试剂在进行校准，例如（：激素如雌二醇，癌症特异性抗原如癌胚抗原（CEA），细胞因子和趋化因子如白细胞介素-2、维生素、激素、药物、免疫系统的抗体，神经递质，不同癌症的肽和特定的病毒或其片段如人乳头瘤病毒（HPV）（数据未显示）。

[0286] D4.pH敏感的荧光探针的测比测量和WS酸度校准

[0287] 该试验中所用的探针为8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）。

[0288] HPTS是在含水缓冲液中pKa为～7.3的低成本、无毒性、高水溶性不可透膜的pH指示剂。HPTS表现出pH相关的吸收转变，允许测比pH测量作为在455nm和403nm处的激发下连续测量的513nm处的荧光强度之间的比率的函数。该方法是pH为7左右的生理学范围内的较小pH变化的本敏感测量的关键。

[0289] 为了量化探头的灵敏度，将HPTS的储备溶液在水中稀释至100μM的浓度，然后稀释至1μM和10μM的最终浓度。对两种缓冲液浓度进行WS酸度校准，这两种缓冲液浓度是：WS（10mM磷酸盐缓冲液）和用生理盐水稀释5倍的WS（2mM磷酸盐缓冲液）（图3A-D，图4A-B）。

[0290] 通过WS（包括2μM的HPTS）的顺序滴定的pH玻璃电极测量实现用于MA测试的最终校准曲线。在37℃实现滴定样品的pH测量和荧光测量。将样品加载到多孔板中，并使用荧光扫描仪在513nm处测量EX403nm和EX455nm下的荧光强度。

[0291] 对于“打开”和“关闭”状态，构建一条校准多项式曲线（图3C-D），允许测量pH值和累积的酸化等价物作为分别在403nm和455nm处的激发下在513nm处所测量的荧光强度之间的比率的函数。

[0292] 所获得的方程用于分析每个新供体（表3，如下所示）。

[0293]

[0294] E.数据分析

[0295] 通过使用以下统计软件包，完成计算、分析和数据挖掘（Nisbet R,IV JE,& Miner G(2009)Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications）；EXCEL2007、OriginPro8、SAS 9.2版本、PASW模块客户端13.0（正式称为Clementine，部分的SPSS）。在图6A-C-图8A-D、图13中的结果表示为平均值±平均值的标准误差。使用卡方检验计算用于不同模型的健康者和癌症患者之间的统计显著性。当P<0.05时认为结果具有统计差异性。

[0296] 供体的数据分析（总结在MA测试框架的流程图中-图12）

[0297] 数据准备-

[0298] 步骤0：处理和归一化供体数据

[0299] 处理每个记录（供体）的原始数据以在代谢活性的酸化速率方面产生单位为pmole H+/μl/小时/2500PBMC的结果。

[0300] 预先处理-步骤1a：探针分析及供体数据归一化

[0301] 为了提高信噪比，通过对从所有供体采集的所有观察值（n=730）进行k-均值聚类分析完成探针的分析（图5A-D）。通过在除去探针的异常值（除去至多5%的结果）之后从HPTS平均值减去供体值来使这些加工的结果归一化。

[0302] 预先处理-步骤1b：供体的数据中被排除的异常值

[0303] 通过供体、剂量和刺激物的每个组合的“打开”和“关闭”的平均值来归一化“打开”和“关闭”值。丢弃标准分数>|1.7|的观察值（结果的1.77%）。

[0304] 数据准备-步骤1c：供体代谢活性结果的表示

[0305] 在除去每个供体中的异常值之后，根据每个供体的每种剂量和每种试剂的至少三份的结果的平均值单独地计算每个供体的“打开”和“关闭”的平均值。这些结果将在随后用作表示每种试剂和剂量的供体代谢活性。所述结果被置入在2D图和3D图中，并将随每个供体自动更新。

[0306] 搜索分类模型-步骤2：数据挖掘算法

[0307] 由于所研究的大部分癌症患者年龄大于39岁并且为了尽可能地最小化年龄的影响，测试并分析了包括男性和女性的两个血液供体群组。第一群组包括年龄超过40的供体（n=42（21个健康供体和21个癌症患者）），以及第二群组包括从22岁到81岁的整组的供体（n=67（42个健康供体和25个癌症患者））。为了将步骤3的结果分类，使用来自决策树/规则归纳法家族的一组算法（C5、CART、CHAID、ASSOCIATION RULE）和对数线性模型（逻辑回归）。探索性分析方法被用来研究数据中的隐藏关联和未隐藏关联。

[0308] 模型评价-步骤3：模型构建和分类

[0309] 为了将供体分类成健康供体和癌症患者，应用SAS 9.3和Clementine软件（V13.0）使用了一组来自十个不同模型的家族，包括数据挖掘、机器学习和统计建模。为了评估和比较模型的性能，决定使用基于Clementine软件（V13.0）所产生的累积增益图表的图形法（图9A-D）。

[0310] 预测建模-步骤4：使用30%的血液的供体的验证组进行评估

[0311] 使用Clementine软件（V13.0）将步骤3中所述的数据随机地分成“训练”和“测试”两组。“训练组”用于建立数据挖掘模型且包括70%的供体。剩余30%的供体将被用于使用训练组中所产生的模型来评估在“测试”组上的分类结果（图10A-D）。

[0312] 在MA测试方案和分析框架的流程图中概述了整个数据分析过程（图12）。

[0313] 实施例2

[0314] MA测试设计及特征

[0315] 通过Ficoll-Paque和梯度离心从42个健康供体和25个癌症患者分离新鲜的外周血单核细胞（hPBMC）（表2，如上文）。对于每个血液样品，将384多孔板装载包含在pH为7.3左右的10mM缓冲液的20μl生理工作溶液、最终浓度为～2.5×106个细胞/毫升的hPBMC、1μM的pH探针（HPTS）和八个递增浓度的十种刺激性试剂之一（表3，如上文）。使用商业荧光扫描仪进行MA测试。或者在露天（“打开”）状态下或者在气密地封闭（“关闭”）状态下对细胞外的酸度动力学分布进行测量。这两种记录都使得能够测量“可溶性”对“挥发性”代谢产物（乳酸对CO2和NH3）的实时累积，从而区分氧化磷酸化、无氧糖酵解和有氧糖酵解（“瓦博格效应”）(Vander Heiden MG,Cantley LC,& Thompson CB(2009)Understanding the Warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation.Science 324(5930):1029-1033)。通过动态在线分析，包括数据挖掘工具，对MA速率分布进行计算和检测以用于癌症诊断（图12）。

[0316] 实施例3

[0317] 测比的荧光细胞外pH测量和酸度校准

[0318] 用在本MA测试中的无毒的、不可透膜的、测比分子的pH探针是在含水生理缓冲液中pKa为～7.3的8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）（Hakonen A & Hulth S(2008)A high-precision ratiometric fluorosensor for pH:implementing time-dependent non-linear calibration protocols for drift compensation.Anal Chim Acta606(1):63-71；Han J & Burgess K(Fluorescent indicators for intracellular pH.Chem Rev110(5):2709-2728）。它以其低毒性为人所熟知，来自在许多细胞类型中的细胞内的pH测量，甚至在2mM过夜温育下（Overly CC,Lee KD,Berthiaume E,& Hollenbeck PJ(1995)
Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.Proc Natl Acad Sci U S A 92(8):3156-3160）。这里，HPTS而是用于在低的1μM浓度下的细胞外pH测量，这进一步确保它的无毒性。为“打开”和“关闭”状态构建校准多项式曲线（，图3A-D），允许测量pH值和累积酸化等价物作为分别在403nm和455nm处的激发下在513nm处所测量的荧光强度之间的比率的函数。为工作溶液（WS）并为用生理盐水稀释5倍的WS（分别为10mM和2mM磷酸盐缓冲液）获得酸化校准曲线（图3A-D）。正如所预期的，该图验证了在pH变化的相同范围内，与2mM缓冲能力的酸化值相比，10mM缓冲能力允许五倍的酸化值。这些结果指示对6.5-
7.5的生理pH范围内的酸化的适当的灵敏度。进一步的结果指示测量方法不依赖1-10μM之间的荧光探针浓度。当HPTS的细胞外最终浓度仅为1μM时（图4A-B），系统足够灵敏以提供高的信噪比。

[0319] 由最终校准曲线（图3A-D，表4）得到的这些方程用于定量分析来自所有67个供体（42个健康供体和25个癌症患者）的PBMC代谢活性记录的显著测量变化。

[0320] 实施例4

[0321] 通过HPTS背景的动态K-均值聚类分析提高信噪比

[0322] 针对MA测试结果的动态临床评估，开发了一种可靠的方法，其将每个供体的任何MA测试与关于HPTS信号（n=730个观察值）的参考速率值的先前测试进行比较。通过该数据采集，可以通过过滤异常的参考结果来提高MA测试的信噪比。为此，对HPTS探针的积累归一化速率值应用k-均值聚类分析（Nisbet R,IV JE,& Miner G(2009)Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications）。在每个测试中，检查至少八个对照孔，包括在工作溶液中1μM的HPTS、没有细胞和没有刺激物。使用标准分数考虑到累计的观察值将每个值归一化。图5A呈现了对于所有MA测试的“打开”和“关闭”速率值的标准分数的分布。通过k-均值聚类分析得到26个聚类（图5B），其中每个观察值属于具有最接近平均值的聚类。在图5D中所报告的结果评估探针的稳定表现。所有HPTS的参考结果（n=730）中只有5个聚类（4.66％）被丢弃。其余的21个聚类（95.34％）最终被认为构成正常的参考范围。重新计算每个供体的“打开”状态的平均值和“关闭”状态的平均值。k-均值聚类分析使得我们能够从细胞的数据中提取探针背景速率信号，且从而得到正在进行的MA测试结果的实际速率值。

[0323] 实施例5

[0324] 对照样品的MA分布（：i）不存在细胞时以递增的试剂浓度；（ii）具有细胞但不具有试剂

[0325] （i）不存在细胞的对照实验证实了存在细胞时所获得的酸化分布确实测量细胞的代谢活性的速率。因此，与具有细胞的样品中的清楚的酸化变化相比，存在探针、缓冲液及递增浓度的每种试剂而不存在细胞（例如葡萄糖（图6A）和PSA（图8A））时应用的相同方案下，没有获得酸化。对于所有试剂得到相同的对照结果。（ii）不存在任何试剂包括葡萄糖时测量存在细胞时的酸化的基础水平。通常，这个基础水平随着葡萄糖浓度的增加而增加，验证了细胞的代谢活性的明确方面（图6B-C）。此外，基础状态处的MA分布已经揭示了从69％的健康供体的原初hPBMC所优先的主要氧化磷酸化向60%的各种癌症患者的活化hPBMC所优先的主要有氧糖酵解（“瓦博格效应”）的诊断转变的一般趋势。这些结果强调MA测试作为诊断工具已经在基础状态处的潜力，基础状态与体内状态的情形相近。然而，仅基础状态并不足以明确区分健康者和癌症患者（卡方检验，P=0.45）。通过响应试剂的网络（图10A-D）对所有MA测试分布的当前数据的挖掘，可以显著地指出95.24%的健康供体和88％的癌症患者（年龄≥40，卡方检验P<0.0001），及指出90.48％的健康供体和95.24％的癌症患者（22≤年龄≥81岁，卡方检验，P<0.0001）。

[0326] 实施例6

[0327] 比较在递增的葡萄糖浓度下，从典型的健康供体和乳腺癌患者获得的MA分布[0328] 首先，尽管年龄（45岁（图6B）对69岁（图7A））和性别显著不同，健康供体的MA分布（图6B、7A）惊人地相似。其次，图6A-C的结果揭示了代表典型的健康供体和乳腺原位癌患者（在2期，且在任何治疗之前）的两个供体之间的显著的MA分布差异。此外，在其中将MA测试应用到自身免疫性疾病和其它的非癌症相关的传染病的极少几个病例的初步实验中，已经揭示了与取自健康个体和癌症患者的代谢活性分布相比的不同的代谢活性分布（数据未显示）。这些差异指出癌症的3个临床诊断的指标（图4A-C）。指标1：在基础状态下，MA速率“打开”＞MA速率“关闭”（在没有试剂的工作溶液中的细胞）。指标2：对于所有葡萄糖浓度，MA速率“打开”＞MA速率“关闭”。指标3：癌症的MA速率“打开”＞健康的MA速率“打开”以及癌症的MA速率“关闭”＞健康的MA速率“关闭”。因此，与在癌症样品的新鲜PBMC中较高值的有氧糖酵解相比，在健康样品的新鲜PBMC中得到较高值的氧化磷酸化。如引言中所提及的（Vander Heiden MG,Cantley LC,& Thompson CB(2009)Understanding the Warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation.Science 324(5930):1029-1033.；Fox CJ,Hammerman PS,& Thompson CB(2005)Fuel feeds function:energy metabolism and the T-cell response.Nat Rev Immunol 5(11):844-852；Michalek RD & Rathmell JC(The metabolic life and times of a T-cell.Immunol Rev 236:190-202），这些结果大致表明在癌症患者的活化hPBMC中“瓦博格效应”的体内发展。取自癌症患者的MA测试结果上的更详细的观察值（图6C和图7B-D）揭示了在“关闭”状态下的总酸化速率小于“打开”状态下的总酸化速率。这些结果表明挥发性基本产物，挥发性基本产物由于乳酸和CO2负责酸度的部分滴定。在生理学上，该滴定可以要求代谢转变成非挥发性乳酸的生产。该作用涉及氨（NH3），其为蛋白质分解代谢及嘌呤和嘧啶的代谢途径的主要产物之一。在即时测量系统中，如在体内，活细胞必须通过如下所述的酸性和碱性产物两者的同步代谢分泌将细胞质维持在约7.2–7.4的恒定的pH。

[0329]

[0330]

[0331] 应当提到的是，在3个指标分析中，在各种癌症（例如结肠、乳腺、肺和胰腺）的不同阶段发现不同的组合（表2，如上）。因此，由这些变化相信对足够数据采集的检查和对个人供体的随访将提供可靠的和更有信息量的诊断分布，如下面的病例研究中所证明的（图7A-D）。

[0332] 实施例7

[0333] 在递增的葡萄糖浓度下，从65岁的女性乳腺癌患者获得的MA分布的病例研究随访[0334] 关于初步MA测试测量，应当提到的是本测试先于医师诊断出一例甲状腺癌和一例乳腺癌。对乳腺癌病例随访了两年作为MA测试与分期和治疗的典型分类相比的灵敏信息能力的证据。这是女性供体的2年随访研究的首次报告，该女性供体在MA测试揭示癌症的状态的一年后临床诊断为患有乳腺癌。作为对比，呈现了典型的健康69岁男性的MA分布（图7A）。时间为零的癌症患者的MA分布，在MA测试揭示癌症的状态的一年后患者被临床诊断为患有乳腺癌（即）（图7B）。三个癌症诊断指标表明从健康分布中所观察的氧化磷酸化（图7A）向癌症病例分布中所观察的有氧糖酵解（图7B）转变。即，健康分布的“关闭-打开”是正值（图7A）而从癌症分布获得的“关闭-打开”是负值（图7B）。在10.5个月后进行本研究病例所获得的下一个MA测试（图7C），刚好在2期的乳腺idc癌症的常规乳房X线照相术诊断之后。应该强调的是，在那时患者未报告任何生理的或可触知的症状。

[0335] 从此点开始，每3周进行一次随访MA测试。一个月后，进行肿瘤手术切除。另一个月后，每3周给予一次化疗治疗。每次治疗的约20天后以及下次治疗之前2天进行每次MA测试。此处呈现的最后一次MA测试（图7D）是在第三次化疗治疗之后，即在开始化疗方案之后约2个月（时间=（+）14.5个月）进行的。应当注意，根据MA测试的三个指标，该最后的测试已经揭示健康供体（图7A）典型的MA分布（图7D）。显然MA测试连同正在进行的治疗验证了积极的趋势。由这些结果，为了揭示在化疗治疗期间和化疗治疗完成很久时与临床评估相比的MA测试分布的趋势行为，在随访方法中使用MA测试是重要的。通过简单的、非侵入性的和不昂贵的临床导向的MA测试可以进行该随访程序。

[0336] 实施例8

[0337] 在递增的PSA浓度下，从典型的健康者、乳腺癌患者和恢复的乳腺癌供体获得的MA分布的比较

[0338] 直到现在，在递增的葡萄糖浓度下对MA分布进行检测，清楚地发现递增的葡萄糖浓度作为癌症诊断的一般的非特异性临床工具。为了获得更具体的癌症分类，MA测试同时研究了各种试剂（表3）如组织特异性的正常抗原（例如PSA、MelanA）。

[0339] 前列腺特异性抗原（PSA）是前列腺的细胞产生的正常蛋白。PSA是癌症相关的组织特异性正常抗原。这种肽由细胞毒性的T淋巴细胞（CTL）所识别。临床上将这种肽在人外周血中的增加水平用作男性前列腺癌的生化诊断标志物（Greene KL,等人.(2009)Prostate specific antigen best practice statement:2009 update.J Urol 182(5):2232-2241）。但是，低水平的PSA被释放到女性循环中，且最新的临床PSA血液测试未用作女性的诊断因素。然而，众多研究显示PSA不是前列腺特异性的，而是出现在一些女性激素调节组织中，主要地为乳腺和其分泌物（Black MH & Diamandis EP(2000)The diagnostic and prognostic utility of prostate-specific antigen for diseases of the 
breast.Breast Cancer Res Treat 59(1):1-14；Black MH,等人.(2000)Serum total and free prostate-specific antigen for breast cancer diagnosis in women.Clin Cancer Res 6(2):467-473）。在女性中，在女性精液（female ejaculate）中发现的PSA浓度大致等于在男性精子中发现的浓度（Wimpissinger F,Stifter K,Grin W,& Stackl W(2007)The female prostate revisited:perineal ultrasound and biochemical 
studies of female ejaculate.J Sex Med 4(5):1388-1393;discussion 1393）。图8A-D中显示了三个MA分布，典型的健康女性（图8B）、患有2期乳腺癌idc和治疗前的女性（图8C）和18年前从2期乳腺癌恢复的女性（图8D）。观察到组织特异性的刺激物例如PSA，在癌症患者的MA测试分布中在最优浓度处引起标记的峰值（图8A-D）。这样的分布被认为反映疾病特异性的受体介导的刺激，并因此使得能够检测特定的肿瘤（例如由PSA检测乳腺，由melanA刺激检测黑素瘤）。结果揭示了几个重要的问题。首先，健康女性的MA分布指示更高水平的氧化磷酸化，其已经在上文葡萄糖MA分布（图6A-C和图7A-D）报道了。其次，图8C指向患有2期乳腺idc癌且在任何治疗前的女性对PSA的PBMC响应。这种分布表示已经从基础状态，在“打开”状态时高的代谢活性速率。这些分布表明高水平的有氧糖酵解，其是一种类似于从癌症患者的葡萄糖MA分布获得的活化T细胞的现象。揭示了18年前从乳腺癌恢复的50岁女性的MA测试的另一个独特的分布（图8D）。PSA刺激的这个分布表现得更像健康供体（图8B）。
此外，揭示了在“关闭”状态下较高的MA速率，其表明在递增的PSA浓度下主要的氧化磷酸化路径超过健康供体的特征性分布（图8B）。该分布可能与增加的抗乳腺癌记忆细胞群相关。
该关系与病原体清除后，存活的效应子细胞分化成长命的记忆细胞并恢复到氧化代谢状态的观察结果一致（Michalek RD & Rathmell JC(The metabolic life and times of a T-cell.Immunol Rev236:190-202）。

[0340] 实施例9

[0341] 通过数据挖掘工具对MA测试结果的模型构建和分类评估

[0342] 获得每个供体的包括大量的MA速率值的多个MA分布。为了开发一种随每个新供体更新的动态临床分析，并且为了从该大型数据库提取模式，开发了使用数据挖掘工具的计算机程序设计，计算机程序设计将来自统计和人工智能的方法与数据库管理相结合（Nisbet R,IV JE,&Miner G(2009)Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications）。分析了两个选定群组的男性和女性的MA测试结果。由于所研究的大多数癌症患者的年龄大于39岁，且为了尽可能地最小化年龄的影响，该分析集中于年龄超过40岁的42个供体的子群（21个健康供体和21个癌症患者）。在第二群组中，使用了年龄从22岁到81岁的整组的供体（n=67，42个健康供体和25个癌症患者）。为了将供体分类成健康和癌症个体，应用SAS9.3和Clementine软件（V13.0）使用了一组来自十种不同的模型的家族，包括数据挖掘、机器学习和统计建模。在这十个模型中，仅四个能够最高准确度地将健康供体和癌症患者进行分类。在这四种模型中，三个来自决策树的族（CHAID、C5、C&R TREE），且一个是对数线性模型（逻辑回归）。在图9A-D中显示了所有四个。由于这些模型不假设任何分布或任何假设，决策树模型被认为是最好的分类器。不如其它的模型完成得好的第四个模型是逻辑回归。当输入数据与模型的假设表现的一样时，这种类型的模型最合适，如关于分配和独立性的假设。为了尽可能多地最小化过度拟合，使用前述选择方法运行逻辑回归模型，这使我们能根据重要性对变量排序并尽可能多地最小化所选择的变量的数量。由于每个模型示出了不同的变量/特征作为各自不同浓度的不同的抗原的函数，有可能组合现有的预测作为一种以上模型的函数。当检测不同的浓度的全部试剂对模型的精度的影响时，被选择的变量的最大数量不超过五（图9A、9C），当样品尺寸不足以尽可能多地最小化过度拟合时推荐其。通过这些初始结果，可以根据在各种模型（图9A、9C）中其出现频率对作为预测剂的所述十种试剂排序。目前可以明确葡萄糖、MBP、雷帕霉素、PSA和PMA作为MA测试中且与免疫系统相关的关键成员（表3）。仍由偶然模型的选择揭示其它五种试剂的免疫学相关性（表3）。为了评估和比较模型的表现，本发明人决定使用基于由Clementine软件（V13.0）所产生的累积增益图表的图解法。增益图表（图9B、D）包含两条内置曲线、随机曲线（黑线）和最佳拟合曲线（天蓝色线）。所有模型都落在这两条曲线之间。在该方法中，给定的曲线和随机曲线（黑色曲线）之间的区域越大表示模型越好。血液的供体建模和分类结果指向具有与最佳模型类似表现的模型（图9A-D）。

[0343] 实施例10

[0344] 使用30%的血液供体的验证组评估MA测试的模型结果

[0345] 下述划分过程使得能够组合和比较模型，从而对MA测试结果的精确度获得更多置信度，以评估所述模型的牢固水平，并最小化由于小采样导致的过度拟合（n=67个血液样品供体）。使用Clementine软件V13.09将如图9A-D中所述的数据随机地分成“训练”和“测试”两组（图10A-D）。对于两个群组，验证组均包括70%的供体。第一群组包括年龄超过40岁的42个供体（图10A-B），以及第二群组包括整组的从22岁到81岁的供体（n=67）（图10C-D）。在“训练组”上描述了供体的前70%。“训练组”用于构建如图9A-D所述的数据挖掘模型。供体剩余的30%（“测试组”）使得能够使用“训练组”中所产生的模型（CHAID、Logistic、C5、C&R tree）评估“测试组”上的分类结果（图10A-C）。“训练”组和“测试”组使得能够以更大的置信度来评估模型结果并尽可能多地消除过度拟合的挑战。在两个群组中皆发现C5模型给出更牢固的结果，其中“测试”组曲线与“训练”组相似（图10B、D）。C5模型在“测试”组中表现得最好，而在“训练”组中C&R tree表现得最好。通过这些结果可以明确在MA测试中且与免疫系统相关（表3）的葡萄糖、MBP、PMA、PHA、CONA和L-谷氨酰胺为关键成员。类似于图9A-D中的最佳模型，这些结果（图10A-D）支持图9A-D的结果。

[0346] 通过依赖于从健康者和癌症患者的hPBMC获得的代谢活性分布的初步实验结果，本文给出一种癌症诊断的生理学方法。通过该方法，本发明人设计了一种使用从10-20毫升的血液样品中提取的新鲜hPBMC的简单高通量、短时和低成本的MA测试的光学方法。通过对两个临床组（42个健康个体和25个癌症患者）的初步检查，揭示了hPBMC指纹识别的MA模式的显著差异。尽管42个健康供体的hPBMC MA分布显示类似的优先氧化磷酸化途径，25个癌症患者的hPBMC具有宽范围的MA分布，优先与分期和治疗相关的有氧糖酵解。MA测试先于医师诊断出一例甲状腺癌和一个乳腺癌。通过MA测试对该乳腺癌病例随访两年作为MA测试关于分期和治疗的典型分类的灵敏信息能力的证据。

[0347] 这里报告的结果鼓励进一步探索hPBMC的代谢活性作为肿瘤发展的镜像（图9A-D）。在不同肿瘤的病理发展期间在免疫系统的癌症诱导逃脱下，初步结果清楚地反映了hPBMC代谢途径的共同的以及特定的特征。

[0348] 通过相对于从健康供体所观察到的那些MA速率的增大（或减小）在局部肿瘤发展的早期和晚期阶段的MA测试分布可以提供组织特异性的癌症诊断指标。应当为MA测试分布寻求组织特异性抗原的某些最优浓度。当预期到初始侵蚀性抗肿瘤免疫反应时，同样在肿瘤发展的早期阶段期待这样的组织特异性诊断分布。通过这种方法，可以假定：在健康状态下，免疫系统通过仔细检查所有身体组织对正在进行的早期检测及在其正常功能的情形中癌细胞的有效根除负责。因此，提出免疫系统通过其组织特异性正常抗原的过度表达来检测并消灭癌细胞。因此，在体内稳态中，有效免疫反应的平衡水平应当得到很好地控制，从而避免有效细胞溶解功能的衰退，或者避免可能反而促成自身免疫性疾病的对抗自身正常细胞的此类侵略性活动。因此，不幸的是在癌症晚期阶段，已知免疫系统被抑制或甚至被教导以通过肿瘤浸润淋巴细胞支持癌症的发展，所述肿瘤浸润淋巴细胞可能是循环的hPBMC的一部分。从这种观点看，不像在慢性炎症中，由于组织特异性免疫耐受性和无效性，还可以进一步预计在癌症的致命转移阶段，hPBMC的MA测试分布可能转变回来以反映表观的健康状态。可以通过耗尽相关的组织特异性的抗原刺激来显示这个表观的健康状态。

[0349] 实施例11

[0350] 对于递增的葡萄糖浓度，从典型的健康供体、癌症供体和自身免疫性狼疮供体获得的PBMC代谢活性分布

[0351] 在体内稳态中，免疫系统活性应当得到很好地控制；活动过度与自身免疫性疾病相关而癌症发展可能与免疫系统的活动不足有关。

[0352] 对于递增的葡萄糖浓度、从典型的健康供体、癌症供体和自身免疫性狼疮供体获得显著不同的MA分布（图13）。

[0353] 尽管结合其具体实施方案描述了本发明，但明显的是对于本领域技术人员而言许多改变、修改和变化是明显的。因此，旨在包含落入所附权利要求的精神和广阔范围内的所有这些改变、修改和变化。

[0354] 在该说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此将其全部内容并入该说明书中以供参考，其程度就如同每个单独出版物、专利或专利申请被具体地和单独地并入以供参考。另外，本申请中对任何参考文献的引用或确定不应当被解释为承认这种参考文献可以作为本发明的现有技术。对于使用部分标题来说，它们不应当被解释为必需进行限制。

[0355] 参考文献

[0356] （本申请中列出了其他参考文献）

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