抗体或嗜中性粒细胞介导的臭氧产生

政府支持

致力于本发明的研究得到来自国立卫生研究所，GM43858， PO1CA277489的资助。因此，美国政府可以享有本发明中的某些权利。

发明领域

本发明总体上涉及通过检测抗体介导的或嗜中性粒细胞介导的活性氧 类的产生而在体内或体外检测免疫或炎性反应的领域。本发明还提供了通 过检测嗜中性粒细胞-介导的活性氧类的产生而检测嗜中性粒细胞活化的 方法。本发明还涉及鉴定能够调节免疫反应或调节嗜中性粒细胞活化的试 剂的方法。

背景

整个上世纪的研究已经形成了关于抗体在免疫系统中的作用的一致认 识。该认识的本质是抗体分子不产生任何可检测的产物。相反，抗体分子 已经被当作一种结合分子，它仅标记其靶标或者仅活化其它分子或生物系 统以应答抗原-抗体复合体。因此，已经认为抗体自身不具有任何催化活 性而仅用来标记外源物质以通过补体级联反应和/或吞噬作用进行去除 (Arlaud等，Immunol.Today，8，106-111(1987)；Sim和Reid，Immunol. Today，12，307-311(1991))。

而且，尽管嗜中性粒细胞炎性反应对于破坏侵入机体的细菌是必需的， 但不适当的嗜中性粒细胞活化还能够引起几个问题。例如，如果嗜中性粒 细胞在吸引至肺时是严格接触过抗原的，它们能够将破坏性酶类释放入肺 组织。这能够导致成人呼吸窘迫综合征(ARDS)(Weiland等，Amer.Rev. Respir.Dis.，133：218-225，1986；Idell等，Am.Rev.Respir.Dis.， 132：1098-1105，1985)。每年有150,000到200,000个美国人患有ARDS，既 使是最好的临床设施死亡率仍为50-80％(Balk和Bone，1983)。ARDS起因 于细菌感染，血压突然严重下降(休克)，以及对身体的多种其他损伤。

因此，需要改进的方法从而使能够快速并有效地检测嗜中性粒细胞活 化、炎性反应和其他免疫反应。

发明概述

本发明提供了利用新近发现的抗体和嗜中性粒细胞还原单线态氧为活 性氧类的能力的方法。根据本发明，当暴露于单线态氧(1O2＊)时，抗体和 嗜中性粒细胞能够产生臭氧(O3)和其它活性氧类。抗体实现此种转换不需 要免疫系统的其它任何成分，也就是不需要补体级联反应或吞噬作用。而 且，根据本发明，由抗体包被的哺乳动物白细胞诸如嗜中性粒细胞也能够 产生臭氧。

因此本发明提供了基于直接检测活性氧类的经改进测定方法，该活性 氧类是通过抗体催化和嗜中性粒细胞催化的反应产生的。

在一个实施方案中，本发明提供了测定哺乳动物中免疫反应或炎性反 应的方法，包括：(a)施用活性氧类的适当化学探针；(b)从哺乳动物获得样 品；和(c)分析样品中化学探针的氧化产物。

在另一个实施方案中，本发明提供了嗜中性粒细胞活化的体外测定方 法，包括：(a)从哺乳动物获得嗜中性粒细胞样品；(b)活化嗜中性粒细胞样 品中的嗜中性粒细胞；和(c)观察在嗜中性粒细胞样品中是否能够检测到活 性氧类。

也在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够调节嗜中性粒细胞活 性的试剂的方法，其包括：(a)从哺乳动物获得嗜中性粒细胞样品；(b)将 嗜中性粒细胞样品暴露于测试试剂；(c)活化嗜中性粒细胞样品中的嗜中 性粒细胞；和(d)定量嗜中性粒细胞样品所产生的活性氧类的数量。

能够被检测的活性氧类包括任何抗体或嗜中性粒细胞所产生的活性氧 类。例子包括，但不限于，超氧自由基(O2-)、羟自由基(OH·)、氢过氧自 由基(peroxyl radical)、过氧化氢(H2O2)或臭氧(O3)。此种强活性氧类的 存在预示着增强的体液免疫反应(例如增加的循环抗体)或增强的细胞或 组织相关的炎性反应(例如嗜中性粒细胞活化)。

附图简述

图1说明氧依赖的吞噬细胞杀微生物作用。标出了1O2和O2·-的互变。 该活性也是抗体固有能力。

图2说明参与除臭剂红(amplex red)测定的化学转化步骤。抗体(在 该图式附图中鉴定为IgG)将1O2转化为O2·-，O2·-能够自发形成过氧化 氢。存在辣根过氧化物酶时，过氧化氢脱乙酰化并氧化除臭剂红底物，从 而产生在587nm处发射荧光的分子。

图3显示存在(□)或缺乏(△)鼠单克隆抗体IgG EP2-19G2(20μM)时在 PBS(pH 7.4)中H2O2产生的最初时间过程。误差线表示数据偏离平均值的 范围。

图4显示紫外线照射后鼠抗体1D4Fab片段单晶体的荧光显微照片和 使用除臭剂红试剂检测H2O2。

图5说明抗体-介导的活性氧类催化作用的时间过程和所需要的反应条 件。图5A提供了当存在(O)或缺乏(◆)31127抗体(马IgG，20μM)时，使用 血卟啉(40μM)和可见光在PBS(pH 7.4)中形成H2O2的时间过程。图5B 提供了当存在1127抗体(马IgG，6.7μM)时在无添加物的PBS(pH 7.4)(□) 或含NaN3的PBS(pH 7.4)(O，100μM)或PBS(pH 7.4)的D2O溶液(◇)中使 用血卟啉(40μM)和可见光产生H2O2的时间过程。图5C说明了抗体蛋白 质浓度(31127，马IgG)对H2O2形成速率的影响。图5D说明氧浓度对通过 31127抗体(马IgG，6.7μM)的H2O2产生速率的影响。全部点为至少两次重 复测定的平均值。误差线是实验测量值偏离平均值的范围。

图6是显示所测得的一组蛋白质的最初H2O2形成速率的条形图并与 抗体相比较(数据来自表1)。全部点为至少两次重复测定的平均值。误 差线是实验测量值偏离平均值的范围。OVA，鸡蛋卵清蛋白；SOD，超氧 化物歧化酶。

图7A说明在PBS(pH 7.4)中马IgG(6.7μM)的紫外线照射下的H2O2 的形成速率。图7B说明马IgG在326nm(激发＝280nm)下的荧光发射， 同时测量H2O2形成。

图8表明抗体在多种条件下的H2O2的产生。

图8A说明通过免疫球蛋白和非免疫球蛋白的H2O2的产生。测定是 通过对透照灯(Fischer Biotech)上的密封玻璃瓶管内磷酸缓冲盐(PBS)[10 mM磷酸钠，150mM NaCl(pH 7.4)]中的单种抗体/蛋白质样品(100μL， 6.7μM)在20EC的环境氧条件下进行近紫外照射(312nm，800μW cm-2)来 实现的。在整个测定过程中以一定的时间间隔取出各等份(10μL)。通过除 臭剂红方法测定H2O2浓度。每个数据点报道为至少两次重复测量的平均 值±SEM：●多克隆(poly)免疫球蛋白(Ig)G，人；O poly-IgG，马；□ poly-IgG，绵羊；单克隆(m)IgG(WD1-6G6)，鼠；△poly-IgM，人；◇mIgG (92H2)，鼠；■β-半乳糖苷酶(β-gal)；▲鸡卵清蛋白(OVA)；α-乳清蛋白 (α-lact)；◆牛血清清蛋白(BSA)。

图8B说明通过绵羊-IgG(6.7μM，200μL)长期产生H2O2。在96-孔石 英板的一个密封孔内的PBS中近紫外照射8小时。H2O2浓度如图8A所述 进行测定。

图8C表明过氧化氢酶随着时间对抗体催化的H2O2产生的影响。鼠 单克隆抗体PCP-21H3(IgG)(6.7μM，200μL)溶液，在96-孔石英板的一个 密封孔内的PBS中被照射510分钟。通过除臭剂红方法测定H2O2并且然 后通过加入固化于Eupergit C上的过氧化氢酶(10mg，288mU)将H2O2破 坏掉。通过过滤将过氧化氢酶去除并将抗体溶液再次照射420分钟。形成 速率(0-510分钟)＝0.368μM分钟-1(r2＝0.998)；形成速率(511-930分钟)＝ 0.398μM分钟-1(r2＝0.987)。

图8D表明H2O2浓度对马poly-IgG抗体催化的最大形成速率百分比 的影响。此图可以确定H2O2对马poly-IgG光致H2O2产生的IC50。用多 种浓度H2O2(0-450μM)孵育马IgG溶液(6.7μM)并且如图8A中所述测定 H2O2的起始形成速率。该图是H2O2形成速率对H2O2浓度的曲线图并显 示IC50为225μM。

图8E表明H2O2对H2O2的抗体光致产生的长期抑制作用和去除H2O2 后其活性的完全重建。分析涉及马poly-IgG(6.7mM在PBS pH 7.4中)在 H2O2(450μM)存在下的持续360分钟的起始U.V.照射。H2O2随后被过氧 化氢酶(固定化于Eupergit C)去除并且poly-IgG样品用UV线再次进一步 照射480分钟。在每个测定中的H2O2的形成用除臭剂红测定法进行测定。

图8F表明过氧化氢酶对H2O2产生的影响。如图8C所述αβ-TCR (6.7μM，200μL)溶液被照射360、367和389分钟。测定了每次照射所产生 的H2O2并且如图8C所述将产生的H2O2破坏掉。形成速率(0-360分钟)＝ 0.693μM分钟-1(r2＝0.962)。在发展曲线中高于200μM的曲率与预期的 被H2O2的抑制一致(见后)；形成速率(361-727分钟)＝0.427μM分钟-1 (r2＝0.987)；形成速率(728-1117分钟)＝0.386μM分钟-1(r2＝0.991)。

图9表明天然4C6Fab(彩图中的亮蓝和粉红)和H2O2存在时的4C6 Fab(彩图中的深蓝和红色)叠置。

对于图9A，将天然4C6晶体在4mM H2O2中浸泡3分钟，并且立即 速冻以在SSRL BL 9-1上收集数据。在H2O2存在时清楚地保存了二级和 三级结构的整体结构完整性(RMSD Cα＝0.33侧链＝0.49)。在CNS 中计算RMSD。

图9B说明苯甲酸结合到Fab 4C6。高分辨率X射线结构显示Fab 4C6 可与苯甲酸进行交叉反应。有和没有H2O2的4C6结合位点的叠置表明甚 至结合位点内的侧链构象也是保守的(在彩图中亮色和暗色侧链分别对应+ 和-H2O2)。而且，苯甲酸的清晰电子密度表明Fab 4C6的结合特性在4mM H2O2中保持不变。电子密度图是在1.5σ处所描绘的2fo-fcσ加权图，并且 在Bobscript中产生图。

图10A显示在二极管阵列HP8452A分光光度计于Absmax 280nm处 测量的马多克隆IgG的吸收光谱。

图10B提供了马多克隆IgG的作用光谱，在波长260和320nm之间 的作用光谱表明H2O2形成的最大活性在280nm处。重复进行测定并且该 测定涉及将抗体溶液[6.7μM溶于PBS(pH 7.4)]加入到石英管中，然后将 该石英管放置于SLM荧光分光光度计的氙弧灯和单色器所产生的光束中1 小时。通过除臭剂红测定法测量H2O2浓度。

图11A说明随着时间由色氨酸(20μM)产生H2O2。产生条件和测定步 骤如图8A所述。

图11B提供了氯离子对抗体-介导的光致H2O2产生的影响。将绵羊 poly-IgG■(6.7μM，200μL)或马poly-IgG▲(6.7μM，200μL)的溶液冷冻 干燥至干燥并且然后将其溶于去离子水或NaCl(水溶液)中，以至于氯离子 的终浓度为0-160mM。然后将样品在20EC环境氧条件下于透照灯(800 μW cm-2)的密封玻璃管内进行照射并重复。在整个测定过程中取出多个等 份(10μL)并通过除臭剂红测定法测定H2O2浓度。H2O2形成速率描绘为每 种抗体样品对[NaCl]的平均值±S.E.M.。

图11C说明在含EDTA缓冲液中透析对抗体-介导的光致产生H2O2 的影响。将在含EDTA(20mM)的PBS中透析之前和之后的两个抗体制剂 即鼠单克隆抗体PCP21H3和马多克隆IgG的H2O2光产生进行比较。产生 条件和测定步骤如图8A所述。每个数据点报道为至少重复测量的平均值± SEM：[●透析之前鼠mIgG PCP21H3；■透析之后鼠mIgG PCP21H3； ▲透析之前马poly-IgG；◆透析之后马poly-IgG]。

图12提供了用含16O的H2O2或用含18O的H2O2对底物三羧乙基膦 (TCEP)的氧化作用的质谱。ESI(阴极)质谱被作为H2O2氧化作用后的 TCEP[(M-H)-249]及其氧化物[(M-H)-265(16O)和(M-H)-267(18O)]的质 谱。

图12A提供了在H218O(98％18O)PB中16O2有氧条件下照射绵羊 poly-IgG(6.7/μM)后TCEP及其氧化物的质谱。产生了含16O的TCEP(在 265处较大的峰)和含18O的TCEP(在267处较小的峰)的混合物。

图12B提供了在H216OPB中富含18O2(90％18O)有氧条件下照射绵羊 poly-IgG(6.7μM)后TCEP及其氧化物的质谱。产生了含16O的TCEP(在 265处较小的峰)和含18O的TCEP(在267处较大的峰)的混合物。

图12C提供了在H216OPB中16O2有氧条件下进行poly-IgG照射后 TCEP及其氧化物的质谱。测定条件和步骤如方法和材料(实施例II)中所 述除了由H216O替换H218O。仅观察到含16O的TCEP(在265处的大峰)。

图12D提供了在20EC于H218OPB中缺氧条件下(脱气并在氩气条件 下)照射绵羊poly-IgG(6.7μM)和H216O2(200μM)后TCEP及其氧化物的 质谱。TCEP的加入如方法和材料(实施例II)中所述。仅观察到含16O的 TCEP(在265处的大峰)。

图12E提供了在H218OPB中16O2有氧条件下照射3-甲基吲哚(500μM) 后TCEP及其氧化物的质谱。仅观察到含16O的TCEP(在265处的大峰)。 测定条件和步骤如方法和材料(实施例II)中所述，除了由于3-甲基吲哚的 分子量太小而不进行大小排除过滤之外。因此，将TCEP加入至含3-甲基 吲哚的PB溶液中。

图12F提供了在H218OPB中16O2有氧条件下照射β-gal(50μM)后 TCEP及其氧化物的质谱。仅观察到含16O的TCEP(在265处的大峰)。测 定条件和步骤如方法和材料(实施例II)中所述。

图13显示如材料和方法(实施例II)中所述的抗体4C6内的Xe结合位 点。

图13A提供了彩图中以粉色的轻链和蓝色的重链表示的Fab 4C6 Cα 示踪的标准侧视图。使用在5σ处描绘的最初Fo-Fc电子密度图显示三个结 合的氙原子(彩图中的绿色)。

图13B提供了保守的氙位点1周围的Fab 4C6和2C αβTCR (PDB/TCR)的覆盖面图。VL(彩图中的粉色)和侧链(彩图中的黄色)的示踪骨 架Cα与2CαβTCR相应的Vα(彩图中的红素和金色)是重叠的(使用 Insigbt2000产生的图)。

图14图解说明通过抗体杀死细菌。

图14A提供了显示在不同实验条件下大肠杆菌XL1-blue和O112a，c 菌株的存活率的柱形图。存活率报道为恢复的菌落形成单位(CFU)，以实 验开始(t＝0分钟)处的CFU的百分数表示。黑色柱和浅灰色柱对应相同实 验条件，除了浅灰色组(2，4，6，8，10和12)暴露于可见光(2.7mWcm-2)60分 钟，而黑色组(1，3，5，7，9和11)放置于黑暗60分钟。细菌细胞密度为大约 107个细胞/mL。所报道的每个数据点是在以下条件下大肠杆菌XL1- blue(组1-6)和O112a，c(组7-12)的平均值±S.E.M.(n＝6)。组1-2XL1-blue 细胞置于PBS中，pH 7.4，4℃。组3-4HPIX(40μM)，PBS中的XL1-blue 细胞，pH 7.4，4℃。组5-6XL1-blue-特异单克隆抗体(25D11，20μM)、血 卟啉IX(40μM)、XL1-blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃。组7-8O112a，c 细胞置于PBS，pH 7.4，4℃。组9-10HPIX(40°M)，O112a，c细胞置于 PBS，pH 7.4，4℃。组11-12O112a，c-特异单克隆抗体(15404，20μM)、 血卟啉IX(40μM)、O112a，c细胞置于PBS，pH 7.4，4℃。

图14B图解说明抗体浓度对大肠杆菌O112a，c存活率的影响。所用抗 体为O112a，c-特异单克隆抗体15404。所报道的每个数据点是平均值± S.E.M(n＝3)。对应50％细胞杀伤(EC50)的15404抗体浓度为81±6nM。

图14C图解说明照射时间对大肠杆菌XL1-blue-特异鼠单克隆抗体 12B2的杀菌作用的影响。该图提供了当存在血卟啉IX(40μM)和12B2(20 μM)时大肠杆菌XL1-blue的存活率与照射时间(2.7mW cm-2)的关系。所报 道的每个数据点是平均值±S.E.M(n＝3)。对应50％细胞杀伤的照射时间为 30±2分钟。

图14D说明抗体驱动杀菌作用对血卟啉IX浓度的依赖性。所用抗体 为大肠杆菌XL1-blue-特异鼠单克隆抗体25D11。该图提供了暴露于一定 血卟啉IX浓度范围与大肠杆菌XL1-blue的存活率的关系。使用了以下条 件：XL1-blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃，黑暗60分钟(＞)。XL1-blue 细胞置于PBS，pH 7.4，4℃，白光(2.7mW cm-2)(△)。25D11(20μM)，XL1- blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃，黑暗60分钟(◆)。25D11(20μM)， XL1-blue细胞置于PBS，pH 7.4，4℃白光(2.7mW cm-2)照射60分钟(◇)。

图15提供了大肠杆菌O112a，c细胞暴露于置于PBS中的抗原特异的 鼠单克隆IgG(15404，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可见光4℃照射1小 时(＜5％存活)后，大肠杆菌O112a，c细胞的电子显微镜照片。为了看到 抗体吸附的位点，在完成杀菌测定之后加入金标记的山羊抗鼠抗体。观察 到抗原非特异性抗体的杀菌活性潜能与抗原特异性抗体非常相似。一般在 该测定系统中20μM抗体(非特异)杀菌率为＞95％。

图16A-C提供了大肠杆菌XL-1blue细胞暴露于PBS中的非特异性鼠 单克隆IgG抗体(84G3，20μM)、血卟啉IX(40μM)并可见光4℃照射1 小时(1％存活)后，大肠杆菌XL-1blue细胞的电子显微镜照片。图16A中 的箭头指向细胞膜与细胞质内含物的初步分离。图16D提供了血清型大肠 杆菌O112a，c细胞暴露于PBS中的抗原特异的鼠单克隆IgG(15404，20 μM)、血卟啉IX(40μM)并可见光室温照射1小时(＜5％存活)后，血清 型大肠杆菌O112a，c细胞的电子显微镜照片。使用本领域中可用的方法进 行金标记。

图17A说明了过氧化氢酶对抗体针对大肠杆菌XL1-blue的杀菌作用 的影响[报道为恢复的菌落形成单位(CFU)，以实验开始(t＝0分钟)时CFU 的百分数表示]。过氧化氢酶将H2O2转化为水(H2O)和分子氧(O2)。每组用 白光(2.7mW cm-2)4℃照射60分钟。细菌细胞密度为～107个细胞/mL。 实验组(1-7)处理如下：组1大肠杆菌XL1-blue细胞和血卟啉IX(40μM) 置于PBS(pH 7.4)。组2大肠杆菌XL1-blue细胞和非特异鼠单克隆抗体 84G3(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组3大肠杆菌XL1-blue细胞、血卟啉IX (40μM)和单克隆抗体84G3(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组4大肠杆菌 XL1-blue细胞、血卟啉IX(40μM)、单克隆抗体84G3(20μM)和过氧化 氢酶(13mU/mL)置于PBS(pH 7.4)。组5大肠杆菌XL1-blue细胞和特异兔 多克隆抗体(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组6大肠杆菌XL1-blue细胞、血 卟啉IX(40μM)和特异兔多克隆抗体(20μM)置于PBS(pH 7.4)。组7大 肠杆菌XL1-blue细胞、血卟啉IX(40μM)、特异兔多克隆抗体(20μM) 和过氧化氢酶(13mU/mL)置于PBS(pH 7.4)。每个点报道为多次实验(n＝6) 的平均值±S.E.M.。符号＊＊表示在相同时间点相对对照p值＜0.01。在任意 黑暗对照中均没有观察到杀菌活性(数据未显示)。

图17B说明H2O2对大肠杆菌XL1-blue和O112a，c血清型的浓度依赖 性毒性。垂直带阴影的线是使用上述用于图14和Hofman等，Infect. Immun.68，449(2000)中的条件在60分钟的孵育过程中通过抗体产生的预 期H2O2的浓度。35±5μM H2O2的值是由至少两次重复的12个不同单克 隆抗体的测定所确定的平均值。

图18说明存在或缺乏过氧化氢酶时在u.v.照射(312nm，0.8mW cm-2) PBS(pH 7.4)中的抗体期间自靛蓝胭脂红1(1mM)光致产生磺酸靛红2的 过程。Steinbeck等，J.Biol.Chem.267，13425(1992)。每个点报道为至少两 次重复测定的平均值±S.E.M.。使用Graphpad Prism v.3.0软件进行线性 回归分析。在以下条件下观察了磺酸靛红2(v)的形成速率：绵羊多克隆IgG (20μM)(●)v＝34.8±1.8nM/分钟；鼠单克隆抗体33F12(20μM)(□)v＝ 40.5±1.5nm/分钟；绵羊多克隆IgG(20μM)和可溶过氧化氢酶(13 mU/mL)(△)v＝33.5±2.3nM/分钟；鼠单克隆抗体33F12(20μM)和可溶过 氧化氢酶(13mU/mL)v＝41.8±1.2nM/分钟。

图19A-C提供了在不同条件下室温于H218O(＞95％18O)磷酸盐缓 冲液(PB，100mM，pH 7.4)中靛蓝胭脂红1(1mM)氧化期间所产生的磺酸 靛红2[(MH)-226，(M-H)-228(18O)和(M-H)-(2x18O)]的电喷射离子化作 用(阴极)质谱。图19A提供了在通过化学臭氧分解作用5分钟氧化靛蓝 胭脂红1(600μM于PB中)期间所产生的磺酸靛红2的质谱。图19B提供 了在通过用白光(2.7mW cm-2)照射血卟啉IX(40μM)和绵羊poly-IgG(20 μM)4小时氧化靛蓝胭脂红1期间所产生的磺酸靛红2的质谱。图19C提 供了通过用白光(2.7mW cm-2)照射血卟啉IX(40μM)4小时氧化靛蓝胭 脂红1期间所产生的磺酸靛红2的质谱。

图20A说明通过用PBS(pH 7.4)中的肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)在37 ℃活化人嗜中性粒细胞(PMN，1.5x 107个细胞/mL)而氧化靛蓝胭脂红 1(30μM)(＞)和形成2(□)的时间过程。使用未活化的PMN时无靛蓝胭脂红 1氧化作用发生(数据未显示)。如前所述制备嗜中性粒细胞。次氯酸(HOCl) 是已知的由嗜中性粒细胞所产生的氧化剂。在我们的实验中，PBS(pH 7.4) 中的NaOCl(2mM)氧化1(100μM)但不断裂1的双键以产生磺酸靛红2。

图20B说明在图20A中所述条件下，通过活化人嗜中性粒细胞氧化靛 蓝胭脂红1期间所产生的磺酸靛红2的阴离子电喷射质谱。

发明详述

本发明涉及抗体和嗜中性粒细胞具有中途拦截单线态氧并将其转化为 活性氧类的能力的发现。根据本发明，此类活性氧类是免疫活化、炎性反 应或嗜中性粒细胞活化的指示剂。由抗体和嗜中性粒细胞所产生的活性氧 类的例子包括，但不限于，臭氧(O3)、超氧自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2) 或羟自由基(OH·)。

抗体和嗜中性粒细转化单线态氧为活性氧类的能力提供了一种用于检 测免疫活化、炎性反应或嗜中性粒细胞活化的方法。因此，本发明提供了 用于检测免疫活化、炎性反应或嗜中性粒细胞活化的多种体外或体内方法。 也考虑了用于鉴定能够调节免疫系统和/或嗜中性粒细胞活化的因子的方 法。

定义

缩略语：(HP)血卟啉；(PBS)磷酸缓冲盐；(OVA)鸡蛋卵清蛋白；(SOD) 超氧化物歧化酶；(PO)过氧化物酶；(phox)吞噬细胞氧化酶；(HRP)辣 根过氧化物酶；(MS)质谱分析；(AES)ICP-原子发射光谱法；(MS)质谱； (QC)量子化学。

此处术语“试剂”用于指化学化合物，化学化合物的混合物，生物大 分子，或由生物材料诸如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)的 细胞或组织制备的提取物。通过此处所述的筛选测定法对试剂作为抗体或 嗜中性粒细胞调节剂的潜在活性进行了评价。

如此处所用的术语“有效量”、“有效降低量”、“有效改善量”、 “有效杀菌量”、“有效组织损伤抑制量”、“治疗有效量”等等术语是 鉴定足以获得预期生物学效应例如疾病、失调、病症等等的治疗或疾病、 失调、病症等等的症状的减轻的量。在治疗方法中抗体的此种有效量是导 致降低、逆转、改善或抑制微生物感染的量。

“工程抗体分子”是已经通过重组技术所产生的多肽。此类分子可包 括能够催化从单线态氧产生至少一种活性氧类的活性中心。此类工程抗体 分子可具有包含于多肽结构内的活性吲哚基。此种分子的吲哚基可以作为 色氨酸残基存在。工程抗体分子还可以包含非天然氨基酸和连接体以及模 拟肽。工程抗体分子还包括进行了修饰以去除活性中心以致于其基本上不 能够产生活性氧类的抗体。

如此处所使用，术语“表位”意思是指抗原中能与抗体的互补位结合 的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链分子的化学活 性表面基团组成并且通常具有特异的三维结构特性以及特异的电荷特性。 抗原可包括多肽、脂肪酸、脂蛋白、脂类、化学品、激素等等。在一些实 施方案中，抗原包括，但不限于，来自诸如细菌的微生物或者诸如人免疫 缺陷病毒、流感病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、人T-细胞白血病病毒等等 病毒的蛋白质。在其它实施方案中，抗原包括，但不限于，表达于癌细胞 例如肺癌、前列腺癌、结肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、骨癌、 白血病、淋巴瘤、脑癌等等的蛋白质。本发明抗原还包括化学品例如乙醇、 四氢大麻酚、LSD、海洛因、可卡因等等。

术语“调节”是指增强或抑制本发明抗体或工程抗体分子的功能特性 的能力。此种调节可以增加或降低通过抗体、嗜中性粒细胞或工程抗体分 子所产生的至少一种活性氧类。

“非天然”氨基酸包括D-氨基酸和天然情况下不存在的氨基酸，以4- 羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、 3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸和其它此类氨基酸和亚氨基酸为例进行说明。

术语“模拟肽”或“肽模拟物”描述肽类似物，例如那些通常作为非 肽药物用于制药工业的肽类似物，其特性与模板肽的特性相似。(Fauchere， J.，Adv.Drug Res.，15：29(1986)和Evans等，J.Med.Chem.，30：1229 (1987))。通常，模拟肽与示例多肽(即具有生物化学特性或药理学活性的 多肽)在结构上是相似的，但具有一个或多个通过本领域已知的方法任选 地由连接键例如--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺式或 反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2-和--CH2SO--所替换的肽键。肽模拟 物较天然多肽具有的优点可以包括生产更加经济、更大的化学稳定性、可 改变的特异性、降低的抗原性和增强的药理学特性，例如半寿期、吸收、 潜能和效力。

如此处所使用，术语“可药用”、“生理可耐受”及其它们的语法学 上的变体，当它们指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用并代表 能够施用至或于哺乳动物且不产生诸如恶心、头晕、胃不舒服等等的不良 生理效应的物质。

术语”蛋白质”和“多肽”用于描述天然蛋白质、肽、蛋白质片段或 者蛋白质或多肽的类似物。这些术语可互换使用。

如此处所使用术语“活性氧类”意思是指抗体产生的氧类。这些活性氧 类可以具有一个或多个不成对电子，或者因为它们易于与其它分子发生反 应而是有活性的。此种活性氧类包括但不限于超氧自由基、过氧化氢、羟 自由基、氢过氧自由基、臭氧和其它短寿命的与臭氧有着相同化学标记的 三氧加合物。

抗体的催化活性

根据本发明，所有的抗体具有先前未认识的抗体分子自身内在的化学 潜能。所有研究的抗体，不管其来源或抗原特异性，能够转化单线态氧为 诸如臭氧(O3)、超氧自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)、氢过氧自由基或羟自 由基的活性氧类。因此更全面地认识到抗体是一种值得注意的衍接分子， 其正在被发展成为具有在脊椎动物防御外来入侵者的前沿所发生的靶向和 催化两种功能。

从单线态氧产生活性氧类的能力存在于完整的免疫球蛋白和诸如 Fab、F(ab′)2和Fv片段的抗体片段(见实施例)。这种活性不存在于包括 RNaseA、超氧化剂物歧化酶和可以被氧化的包曼-毕尔克(Bowman-Birk) 抑制剂蛋白质在内的其它分子(实施例1和表1)。同样，该活性与分子 中二硫化物的存在无关，纵使此种二硫化物充分富有能够被氧化的电子 (Bent等，J.Am.Chem.Soc.，87：2612-2619(1975))。

如果抗体是变性的则抗体从单线态氧产生活性氧类的能力将消失。这 表明抗体的三维结构与产生过氧化物的还原过程有关。

以一种有效并且长期的方式从单线态氧产生活性氧类的能力存在于免 疫球蛋白和T细胞受体(实施例II，表1F)。T细胞受体享有一个与抗体 相似排列的免疫球蛋白折叠结构域(Garcia等，Science，274：209(1996))。然 而，拥有这种结构基序对于赋予蛋白质产生过氧化氢的能力方面似乎不是 必需的。β2-巨球蛋白是具有这种结构基序的免疫球蛋白超家族的一员，不 能够产生过氧化氢(Welinder等，Mol.Immunol.，28：177(1991))。

结构研究还表明，在T细胞受体中发现的保守的色氨酸残基存在于与 在抗体中发现的结构域相似的结构域中。在抗体和T细胞受体中高度保守 的保守色氨酸残基周围的序列和结构表明这些周围的结构也可能在允许从 单线态氧至活性氧类的催化作用中起着作用。

此外，根据本发明，当被活化时嗜中性粒细胞能够产生活性氧类。抗 体和嗜中性粒细胞的催化活性能够被用作检测免疫反应、炎性反应和嗜中 性粒细胞的活化。

用于检测免疫和炎性反应的方法

本发明提供了用于检测基于体液和细胞的免疫和炎性反应的方法。该 方法利用新发现的抗体和嗜中性粒细胞还原单线态氧为活性氧类的能力。

在一个实施方案中，本发明提供了用于测定哺乳动物内免疫反应或炎 性反应的方法，其包括：(a)施用用于活性氧类的化学探针；(b)从哺乳动 物中得到样品；和(c)分析样品中化学探针的氧化产物。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于测定嗜中性粒细胞活化的体 外测定方法，包括：(a)从哺乳动物中得到嗜中性粒细胞样品；(b)在嗜中性 粒细胞样品中活化嗜中性粒细胞；和(c)观察嗜中性粒细胞样品中活性氧类 是否被检测到。

也在另一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定能调节嗜中性粒细胞 活性的试剂的方法，其包括：(a)从哺乳动物中得到嗜中性粒细胞样品；(b) 将嗜中性粒细胞样品暴露于受试试剂；(c)在嗜中性粒细胞样品中活化嗜中 性粒细胞；和(d)定量由嗜中性粒细胞样品产生的活性氧类的量。

这些测定方法易于实施因为对于这些测定方法的基本要求包括用于活 性氧类的化学探针和受试者或受试样品。在一些情况下，可以通过使用作 为抗体介导活性氧类产生的底物的单线态氧源来增强活性氧类的产生。然 而，单线态氧能够体内产生，因此施用单线态氧源可能没有必要。

能提供单线态氧源的分子包括那些不需要其它因子或诱导物而能够产 生单线态氧的分子和当暴露于诱导物后能够产生单线态氧的“敏化剂”分 子。不需要其它因子或诱导物而能够产生单线态氧的分子的例子包括但不 限于内过氧化物。在一些实施方案中，所使用的内过氧化物可以是蒽-9，10 二丙酸内过氧化物。敏化剂分子的例子包括，但不限于蝶呤、黄素、血卟 啉、四(4-磺化苯基)卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹 明染料、酞菁、竹红菌甲素(hypocrellin)、玉红花青苷(rubrocyanin)、喹哪 啶蓝(pinacyanol)或别花青苷(allocyanin)。

当暴露于诱导物时敏化剂分子可以被诱导产生单线态氧。一种此种的 类诱导物是光。根据敏化剂的类型和结构，此种光可以是可见光、紫外光 或红外线。

使用本发明方法可以检测到的活性氧类包括任何抗体产生的氧类和任 何嗜中性粒细胞产生的氧类。此种活性氧类的例子包括，但不限于，超氧 自由基(O2-)、羟自由基(OH·)、氢过氧自由基、过氧化氢(H2O2)或臭氧 (O3)。此种强大的活性氧类的存在预示着增强的体液免疫反应(例如增强 的循环抗体)或增强的细胞或组织相关的炎性反应(例如嗜中性粒细胞的 活化)。可以被检测的免疫和炎性反应的类型在下面有更详细的讨论。

因此本发明提供了用于检测抗体的方法。所有的抗体分子属于一种叫 作免疫球蛋白的血浆蛋白质家族。它们基本的结构单元为免疫球蛋白折叠 或结构域，在免疫系统和其它生物识别系统中的许多分子中以多种形式被 采用。典型的免疫球蛋白具有四条多肽链，包含称为可变区的抗原结合区， 并且包含称为恒定区的非可变区域。

使用本发明的方法可以检测任何抗体。此外，抗体可以是只要能够催 化产生活性氧类的多种形式中的任何一种，包括整个免疫球蛋白、Fv、 Fab、F(ab′)2或其它片段、或包括可变结构域互补决定区(CDR)的单链抗 体或其它形式。如此处所使用所有这些术语均归于广义的术语“抗体”内。 本发明意在检测任何类型的抗体并且不限于那些能够识别特异抗原并与其 起免疫反应的抗体。然而，对于一些应用，抗体或它们的片段对于抗原是 免疫特异性的。

如本发明所使用术语“抗体”包括完整的分子还有它们的片段，诸如能 够结合到抗原表位的Fab，F(ab′)2和Fv。这些抗体片段保留了与它们的抗 原或受体选择性结合的一些能力并且定义如下：

(1)Fab，该片段包含抗体分子的单价抗原结合片段，能够通过用木瓜 蛋白酶消化整个抗体产生，消化后得到完整的轻链和重链的一部分；

(2)Fab’，抗体分子的一种片段，能够通过对整个抗体用胃蛋白酶处理， 然后通过还原产生，得到完整的轻链和重链的一部分；从每一个抗体分子 可以得到两个Fab’片段；

(3)F(ab′)2，经用胃蛋白酶处理整个抗体但随后不进行还原处理所得到 的抗体片段；F(ab′)2是通过二硫键结合在一起的两个Fab’片段的二聚体；

(4)Fv，定义为包含作为两条链表达的轻链可变区和重链可变区的遗传 工程片段；和

(5)单链抗体(“sFv”)，定义为包含轻链可变区，重链可变区，并用一 个适当的多肽接头连接在一起的、作为遗传学融合单链分子的遗传工程分 子。

可以检测到任何哺乳动物或鸟类物种的抗体或来源于哺乳动物或鸟类 物种的任何样品的抗体。此种哺乳动物和鸟类包括人、狗、猫和家畜，例 如马、牛、绵羊、山羊、鸡、火鸡等等。来源于此种哺乳动物和鸟类的样 品可以得到用于测试。此种样品可以是，例如，组织样品或诸如金血、血 清、血浆、滑膜液、淋巴、尿、唾液、粘液或眼泪的体液。

用于活性氧类的化学探针

通过抗体和嗜中性粒细胞产生的活性氧类可以用化学探针来检测。用 于活性氧类的化学探针包括任何天然或合成的、含有能够被氧化的烯烃并 产生可检测的氧化产物的化合物。用于活性氧类的化学探针的例子包括3- 乙烯基苯甲酸、4-乙烯基苯甲酸、靛蓝胭脂红、均二苯代乙烯、胆固醇等 等。当氧化后此种化学探针产生诸如酮、醛、醚的氧化产物和相关产物。

例如，3-乙烯基苯甲酸(3)和4-乙烯基苯甲酸(4)化学探针和通过它们与 活性氧类反应产生的氧化产物(5a，5b，6a和6b)的结构描述如下：

3-乙烯基3           3-羧基5a            3-环氧乙烷基6a

4 乙烯基4           4-羧基5b            4-环氧乙烷基6b

另一个用于活性氧类的有用的化学探针的例子是靛蓝胭脂红(1)，活性 氧类可以将其转化为环α-酮酰胺(磺酸靛红，2)。这些化合物显示如下。

在一些实施方案中，可以选择本领域的一种技术来检测特定的活性氧 类，例如，臭氧。例如通过使用靛蓝胭脂红可以检测臭氧并将其与其它活 性氧类区分开来。靛蓝胭脂红被臭氧(O3)的裂解可以使用同位素的方法与 被1O2＊的裂解相区别。例如，当臭氧是氧化剂时18O掺入到环α-酮酰胺2的 内酰胺羰基。当1O2＊是氧化剂时没有发生此种18O掺入到环α-酮酰胺2的内 酰胺羰基。

化学探针的氧化产物可以通过使用高压液相色谱法、质谱测定法、紫 外分光光度法、可见分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱质 谱联用法、诸如荧光显微镜或荧光光谱测定法的荧光方法来检测。如实施 例所述开展了可仿效的测定方法。

因此，在一些实施方案中将化学探针施用于哺乳动物，并收集哺乳动 物体液的样品以确定化学探针的氧化产物是否已经产生。如果此种氧化产 物已经产生，哺乳动物可能发生了炎性反应或增强的免疫反应。在其它实 施方案中，将化学探针加入到来源于哺乳动物体液的体外测定中并且测定 该测试混合物以了解化学探针的氧化产物是否存在。此种体外测定法对于 例如确定是否体液存在增强了的活化嗜中性粒细胞的水平是有用的。

单线态氧的内源性产生

最近公开的抗体的化学势在体内的作用依赖于关键底物1O2＊的可得 性。然而，1O2＊会在多种生理事件中产生并且在体内也是可得的。参见J.F. Kanofsky Chem.-Biol.Interactions 70，1(1989)以及其中的参考文献。例如， 包括再灌注会产生1O2＊。X.Zhai和M.Ashraf Am.J.Physiol.269(Heart Circ.Physiol.38)H1229(1995)。在吞噬作用过程中嗜中性粒细胞的活化也 产生1O2＊。J.R.Kanofsky，H.Hoogland，R.Wever，S.J.Weiss J.Biol. Chem.263，9692(1988)；Babior等，Amer.J.Med.，109：33-34(2000)。通过 照射存在于卟啉症患者皮肤中的无金属卟啉前体也产生单线态氧(1O2)。

此外，底物1O2＊可以通过吞噬作用或再灌注入足以使抗体产生可检测 水平活性氧类的量的方式产生。例如，吞噬体的体积大约1.0x 10-15升。因 此，此处所鉴定的反应不需要高度有效，因为在如此小的体积内仅有几百 个分子具有微摩尔浓度。实际上，吞噬体内1O2＊的浓度计算为高达摩尔浓 度。E.P.Reeves等，Nature 416，291(2002)。关于抗体分子的数量，通过用 细菌和荧光标记抗体进行滴定和免疫金研究能够得出相同的估计(图2)。 这些分析表明大约有105个抗体分子结合到每个细菌上并且此数量将相当 于吞噬体中毫摩尔的抗体浓度。因此，通过甚至最保守的估计，吞噬体内 1O2＊和抗体的浓度也远远超过那些用于此处所提供的作为例证的实施例 中的量。

单线态分子氧(1O2)也可以在杀微生物过程中以直接和间接方式产生。 单线态分子氧(1O2)可以直接通过例如黄素蛋白氧化酶的作用产生(Allen， R.C.，Stjernholm，R.L.，Benerito，R.R.和Steele，R.H.，著者Cormier，M. J.，Hercules，D.M.和Lee，J.(Plenum，New York)，498-499页(1973)； Klebanoff，S.J.在《在寄主抗性中的吞噬细胞》(National Institute of Child Health and Human Development，Orlando，FL)(1974))一书中。作为 选择，1O2可以在杀微生物过程中间接产生，例如象在吞噬体发现的那样 在低pH的溶液中O2·-的非酶歧化作用(Stauff，J.，Sander，U.和Jaeschke， W.，化学发光和生物发光，著者，Williams，R.C.和Fudenberg，H.H. (Intercontinental Medical Book Corp.，New York)，131-141页(1973)； Allen，R.C.，Yevich，S.J.，Orth，R.W.t和Steele，R.H.，Biochem.Biophys. Res.Commun.，60，909-917(1974))。

因为1O2具有如此高的反应性，因此以前认为它在氧清除剂的级联反 应中是一个终点。然而，已经发现抗体和嗜中性粒细胞可以中途拦截1O2 并且有效地将其还原成活性氧类，因此提供了一种用于体内检测免疫反应、 炎性反应和嗜中性粒细胞活化的手段。

免疫反应和炎性反应

引起免疫反应和炎性反应的原因通常分为感染的和非感染的。人免疫 系统中主要的对抗感染和疾病的细胞是血液循环中的白细胞(白血球)。 白细胞是骨髓产生的，其中所述骨髓产生嗜中性粒细胞、血小板、红细胞、 淋巴细胞和其它白细胞。大约50-65％的白细胞是“嗜中性粒细胞”。当造 血系统功能正常时，血小板和嗜中性粒细胞快速增殖并高速率周转，而不 像淋巴细胞和红细胞那样长寿命。

在免疫反应过程中，B淋巴细胞的激活和分化导致了能够通过本发明 方法检测到的高亲和抗原特异性抗体的分泌。抗体的产生常常与感染有关。 根据本发明任何类型的感染均可被检测。通过本发明的方法可以检测涉及 细菌和病毒以及其它寄生虫的感染性疾病。可以检测的感染实体的例子包 括微生物、病毒、寄生虫等等。可以检测的微生物包括，但不限于，诸如 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、大肠杆菌(Escherichia coli)、大肠杆菌O157:H7、痢疾志贺氏 菌、铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、霍乱弧菌、 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、金黄色葡萄球菌的多抗性菌株、屎 肠球菌(Enterococcus faecium)的万古霉素抗性菌株或粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)的万古霉素抗性菌株的微生物。

可以检测的病毒感染包括，但不限于，诸如甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)、乙型肝病毒(hepatitis B virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、 人免疫缺陷症病毒(human immunodeficiency virus)(HIV)、痘病毒 (poxviruses)、疱疹病毒(herpes viruses，)、腺病毒(adenoviruses)、 乳多空病毒(papovaviruses)、细小病毒(parvoviruses)、呼肠孤病毒 (reoviruses)、环状病毒(orbiviruses)、细小核糖核酸病毒(picornaviruse)、 轮状病毒(rotaviruses)、甲病毒(alphaviruses)、风疹病毒(rubivirues)、 A型和B型流感病毒(influenza virus type A and B)、黄病毒(flaviviruses)、 冠形病毒(coronaviruses)、副粘病毒(paramyxoviruses)、麻疹病毒 (morbilliviruses)、肺病毒(pneumoviruses)、弹状病毒(rhabdoviruses)、 狂犬病病毒(lyssaviruses)、正粘液病毒(orthmyxovirus)、布尼亚病毒 (bunyaviruses)、白蛉病毒(phleboviruses)、纳伊罗病毒(nairoviruses)、 嗜肝DNA病毒(hepadnaviruses)、沙粒病毒(arenaviruses)、逆转录 病毒(retroviruses)、肠病毒(enteroviruses)、鼻病毒(rhinoviruses) 或线状病毒(filovirus)的病毒感染。

炎性反应是血管化的组织对局部损伤的反应。这种损伤可以有多种原 因，包括感染和直接的物理损伤。当遭受损伤后，凝固系统和纤溶酶系统 与适当的神经系统反应一起开始启动以产生有利于免疫激活的初期反应。 提高的血流量、毛细血管渗透性和包括补体级联反应中的那些趋化因子调 节嗜中性粒细胞迁移至损伤位点。嗜中性粒细胞是参与急性炎性反应的主 要细胞类型，而淋巴细胞和巨噬细胞在慢性炎性反应中更普遍。

可以认为炎性反应是有益的，因为没有它感染不能够被制止，伤口永 远不能愈合，并且发生组织和器官的永久性损伤和接下来死亡。

然而，炎性反应也是潜在有害的。在炎性反应过程中活化的嗜中性粒 细胞释放多种降解酶包括蛋白水解酶和氧化酶到周围的细胞外环境中。嗜 中性粒细胞释放的物质会导致潜在有害的副反应。虽然循环的嗜中性粒细 胞的半寿期为6-8小时，活化细胞的血管外存活可以接近四天。活化的嗜 中性粒细胞的数量和它们活化的程度与组织损伤直接相关。在体内，当嗜 中性粒细胞死亡后，它们被组织吞噬细胞识别和吞噬，这是一个炎性反应 消退的重要的过程。在体外，经过几天的阶段后嗜中性粒细胞经历自发的 凋亡，可以通过细胞因子或调节剂对其凋亡进行增强或抑制。对濒死的嗜 中性粒细胞的吞噬作用现在被公认为是消退炎性反应的主要方式(J.Savill， J.Leukoc.Biol.，61：375，1997)。

其中嗜中性粒细胞在组织损伤中起作用的非感染性疾病包括痛风、类 风湿性关节炎、关节炎、免疫血管炎、嗜中性粒细胞皮肤病、肾小球肾炎、 炎性肠病、心肌梗塞、ARDS(成人呼吸窘迫综合征)、哮喘、肺气肿和 恶性肿瘤。炎性反应导致了心肌梗塞、局部缺血再灌注损伤、超敏反应、 肾病、异常平滑肌紊乱、肝病、癌细胞的增殖、接受放射治疗的癌症病人 的炎性反应、血管炎、肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮、成人呼吸窘迫综 合征、局部缺血疾病、心脏病、中风、肠局部缺血、再灌注损伤、血色沉 著病、获得性免疫缺陷综合征、肺气肿、器官移植、胃溃疡、高血压、先 兆子痫、神经性疾病(多发性硬化症、阿尔茨海默氏疾病、帕金森病、肌 萎缩性侧索硬化和肌肉萎缩症)、酒精中毒和吸烟相关的疾病相关的病理。

在美国每年有数百万的人进行针对上述疾病的治疗。然而，在一种适 当的治疗采用之前，必须检测炎性反应并且分类为感染性的或者非感染性 的。

免疫反应调节剂的筛选

本发明还提供了用于鉴定能够调节嗜中性粒细胞活性的试剂的方法。 此种方法包括步骤(a)从哺乳动物中得到嗜中性粒细胞样品；(b)将嗜中性粒 细胞样品暴露于测试试剂；(c)激活嗜中性粒细胞样品中的嗜中性粒细胞； 和(d)定量嗜中性粒细胞样品产生的活性氧类的数量。

其它实施方案包括对由嗜中性粒细胞样品产生的信号同适当的对照进 行比较。此种适当的对照可以是没有暴露于测试试剂的同一类型嗜中性粒 细胞样品的对照样品。使用这种类型的对照有利于分析测试试剂是否对嗜 中性粒细胞的活化有任何影响。

在其它实施方案中，方法还包括将嗜中性粒细胞样品与能够从分子氧 产生单线态氧的试剂相接触。此种方法还包括照射样品混合物、化学探针 和产生单线态氧的试剂。嗜中性粒细胞上的抗体可以通过抗体还原单线态 氧为过氧化物或过氧化氢或臭氧。

照射步骤可以用红外线、紫外线或可见光来完成，其选择依赖于所用 的敏化剂。

用此处所述的方法可以检测所形成的活性氧类。

在本发明的一个其它的筛选方法中，也考虑了用于实现与抗原发生抗 体免疫反应性的免疫测定法的方法。该方法包含步骤：

A.在单线态氧产生介质中使固定有组合物的底物，该组合物包含含有抗 原或抗体的第一种试剂，与包含能与第一种试剂反应以产生固定化的抗原- 抗体复合物的抗原或抗体的第二种组合物相接触，其中在氧存在时抗体能 够从单线态氧产生过氧化物或过氧化氢；和

B.检测抗体产生的活性氧类，从而检测抗体与抗原的免疫反应性。

反应和检测方法如此处所述。在一方面，第一组合物是抗原并且第二 组合物是抗体。在相反方面，第一组合物是抗体而第二组合物是抗原。

本发明进一步考虑了用于实施检测抗体对抗原免疫反应性的免疫测定 法的相似方法，此处的抗原是固定化的并且与抗体组合物相接触。

此类免疫测定方法是对那些周知的评价抗原-抗体免疫反应性和鉴定 抗原和/或抗体的方法的改进。本方法优于先前其它免疫测定方法的优点在 于本方法除去了至少一个方法步骤和/或加入了二级标记的免疫反应性分 子，标记是放射活性化合物或者是酶的化合物。

在本发明中，最低需求是单线态氧、抗体试剂、抗原试剂、和能与从 抗体产生的活性氧类进行反应的化学探针。一种可以被使用的此种反应物 是AMPLEXTM Red。它是Molecular Probes(Eugene，Oregon)出售的商业 可得的试剂，用于在免疫测定法中与抗体产生的过氧化氢进行反应。它是 以试剂盒出售的，该试剂盒提供了使用用于测定的荧光微孔板或荧光计测 量过氧化氢的一步荧光法。测定法基于使用对过氧化氢高度敏感和稳定的 探针10-乙酰基-3，7-二羟基吩噁嗪对过氧化氢进行检测。在辣根过氧化物 酶存在的情况下，AMPLEXTMRed试剂与过氧化氢以1∶1的化学计量进行 反应以产生高荧光的试卤灵，这提供了一种检测机制检测在200微升体积 内的少至10皮摩尔的过氧化氢。

相反，现有的免疫测定技术，包括放射免疫测定法(RIA)、酶-免疫测 定法(EIA)和经典的酶联免疫吸附测定(ELISA)，都需要使用如RIA中的放 射性标记的免疫反应性分子或额外标记的免疫反应性分子。本发明既不需 要潜在有害的放射性同位素以标记分子，也不需要通常称为二级抗体的额 外免疫反应性试剂，其中所述的二级抗体通常与酶连接，以允许检测与一 级抗体及抗原形成的复合体。在后一测定法中，二级抗体与所形成的抗原- 抗体复合体的反应(通常通过抗一级抗体的特异性免疫反应性)是通过对 所偶联的酶特异的产生颜色的底物溶液来测定的。概括而言，在本发明中， 抗体介导的过氧化氢的产生用不需要放射性试剂、不需要额外的试剂和/ 或混合步骤、而具有高检测能力的方法进行测定，这些额外的试剂和/或混 合步骤在例如美国专利3,905,767；4,016,043；USRE032696和4,376,110 中被应用，此处对其公开进行引用作为参考。

治疗方法

本发明提供了当其产生被认为是正当时，例如用于抑制微生物感染、 促进创伤愈合、溶解细菌、清除病毒、靶向癌细胞用于氧化剂诱导的裂解 等等过程，而产生氧化剂的方法。例如，本发明提供了抗体介导的活性氧 类的产生以抗击细菌感染或病毒感染。活性氧类作为抗微生物剂来消灭细 菌或病毒。因此，为了增强这种过程，人们可以使用本发明的方法以提供 抗体组合物到该区域导致局部活性氧类浓度提高。

本发明包括的治疗方法基于使用能从单线态氧产生活性氧类的抗体，包 括1)抑制微生物的增殖，或靶向和杀死病人体内微生物，当抗体识别微生 物表达的抗原并与其起免疫反应时，2)抑制癌细胞的增殖或靶向和杀死病 人体内癌细胞，当抗体识别癌细胞表达的抗原并与其起免疫反应时，3)抑 制病人体内与嗜中性粒细胞介导的炎性反应相关的组织损伤，例如当炎性 反应起因于细菌感染或病人患有自身免疫性疾病时，4)增强病人体内吞噬 细胞的杀菌效果，5)促进具有开放性创伤的病人伤口的愈合，当臭氧、过 氧化物或过氧化氢刺激成纤维细胞的增殖和/或免疫反应进一步包括淋巴 细胞的增殖时，6)刺激细胞增殖，例如刺激病人伤口的成纤维细胞增殖， 和相似情形。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗微生物感染和其它疾病的 的治疗方法，这些方法得益于诸如超氧自由基、羟自由基、臭氧或过氧化 氢的活性氧类增强的产生。此种方法在正当需要此种活性氧类产生的情况 下能够使用任何抗体产生活性氧类。

本发明还涉及包括经过改变含有一个额外还原中心的工程抗体在内的 工程分子的用途，该还原中心的存在提供了当希望产生活性氧类时，从单 线态氧产生活性氧类的额外能力。当需要增强活性氧类产生时，与具有两 个保守的色氨酸残基的非工程抗体相比，使用具有两个以上还原中心的工 程分子是恰当的。

在另一个方面，抗体可以是如上面所提供的或可选择地从递送进入细 胞的表达载体表达的重组抗体。在本文中表达载体还可以表达敏化剂分子 (见下)。

在一个实施方案中，本发明涉及用于抑制微生物生长的方法，其中将 微生物与含有能从单线态氧产生此种活性氧类的抗体的组合物相接触。该 方法对于非特异或者免疫特异(抗原结合)的完整抗体或抗体片段是成功 的。此类抗体片段包括单链抗体及此处所述的工程分子和抗体。然而，当 需要对抗微生物的局部活性时，抗体可以是对微生物相关的抗原特异的。 例如，抗体可以选择性地结合微生物表面的抗原。

抗体组合物可以在体内递送到受到微生物感染或其它疾病或能够从暴 露于活性氧类而受益的其它疾病的受试者中。优选的体内递送方法包括静 脉内给药、局部给药、吸入给药、插管给药、腔内给药、肌内给药、经皮 给药、皮下给药或通过含有抗体的脂质体给药。

细胞表面可作为例证的抗体浓度范围为1-5微摩尔。然而，浓度会依 赖所希望的结果而变化，此时所提供抗体的量是足以得到预期生理效应即 活性氧类或它的衍生氧化物的产生而产生氧化应激的抗体的量。用抗体组 合物进行治疗性处理的剂量和时间与下面描述的用于抗氧化剂的剂量和时 间相一致。

本发明方法进一步考虑了在产生抗体介导的活性氧类或其衍生氧化物 的方法中将抗体-抗原复合物暴露于紫外线、红外线或可见光的照射下。为 了增强活性氧类的产生，光敏剂，也作为敏化剂提到，产生活性氧类的量 可以在此处所述的治疗方法中使用。如此处所定义，敏化剂是能够诱导或 增加单线态氧浓度的任何分子。敏化剂可以在照射存在的情况下使用，此 种照射过程包括暴露于紫外线、红外线或可见光下足以活化敏化剂的一段 时间。作为例证的时间和条件在实施例中进行描述。

敏化剂的活性氧类产生量是足以得到预期生理效应即在正当需要此种 活性氧类和其衍生物的多种情况下通过抗体介导从单线态氧产生活性氧的 敏化剂的量。在一些实施方案中，敏化剂被偶联到抗体上。偶联有敏化剂 的抗体通常能够结合到抗原上，即抗体仍保留有效的抗原结合位点，从而 允许发生抗原识别和结合。

作为例证的敏化剂包括但不限于蝶呤、黄素、血卟啉、四(4-磺化苯基) 卟啉、二吡啶基钌(II)复合体、玫瑰红染料、醌、若丹明染料、酞菁、竹红 菌甲素。

在进一步的实施方案中，通过施用增强单线态氧产生的方法来增强活 性氧类的产生。还原的单线态氧是活性氧类或其衍生氧化物的来源。一种 增强单线态氧产生的方法是包括对产生单线态氧有用的任何分子、化合物 或试剂在内的前体药物。如此处所描述，此种前体药物在将抗体施用于预 期靶细胞、组织或器官施用或将抗体与其相接触的同时，或在此种施用或 接触之后，进行施用。当前体药物的施用在抗体的施用之后时，抗体已经 有机会与其靶抗原进行免疫反应并形成抗体-抗原复合物。增强单线态氧产 生的方法于是在抗体-抗原识别位点增强诸如过氧化氢、臭氧、超氧自由基 或它们的衍生氧化物的活性氧类的产生。该实施例具有特别的优点，例如， 在预期的位点或位置产生治疗用预期的过氧化物、臭氧或过氧化氢的增强 的局部积累的能力。

优选的前体药物是，例如，浓度大约1微摩尔至大约50微摩尔的内过 氧化物。在抗体-抗原复合物位点所能达到的优选的内过氧化物浓度为大约 10微摩尔。

本发明中的抗体的抗原靶可以是本领域技术人员所知的或可得到的任 何抗原。抗原可以是存在于细胞、组织或器官内的任何抗原，在那里活性 氧类的存在和抗体介导的产生该性活氧簇的过程是所期望的。抗原可以存 在于溶液中，例如，在细胞外液中。抗原可以是，例如，蛋白质、多肽、 脂肪酸、低密度脂蛋白、与炎性反应相关的抗原、癌细胞抗原、细菌抗原、 病毒抗原或相似分子。

抗原相关的细胞包括但不限于微生物、内皮细胞、间质细胞、上皮细 胞、肌肉细胞、吞噬细胞、血细胞、树突细胞、结缔组织和神经系统细胞。

因此，例如，可以用本发明的抗体治疗下列靶微生物有机体的感染： 气单胞菌属(Aeromonas spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、拟杆菌属 (Bacteroides spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、 埃希氏菌属(Escherichia spp.)、腹螺菌属(Gastrospirillum sp.)、缠绕 杆菌属(Helicobacter spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、沙门氏菌 属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属 (Staphylococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)等等。使用本发明的抗体能够治疗 的感染包括那些与葡萄球菌感染(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、斑疹伤寒(伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))、食物中毒(诸 如O157:H7的大肠杆菌)、杆菌性痢疾(痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteria))、肺炎(铜绿假单胞菌(Psuedomonas aerugenosa)和/或洋葱 假单胞菌)、霍乱(霍乱弧菌(Vivrio cholerae))、溃疡(幽门螺旋杆菌) 和其它相关的感染。大肠杆菌血清型0157:H7涉及腹泻、出血性结肠炎、 溶血性尿毒性综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发病机理。 本发明的抗体对于耐药的和多药耐药的细菌菌株，例如金黄色葡萄球菌的 多抗药性菌株和屎肠球菌和粪肠球菌的万古霉素抗性菌株，也是有效的。

本发明的抗微生物组合物对于抗病毒也是有效的。本发明的抗微生物 组合物对于抗病毒也是有效的。术语“病毒”指的是DNA和RNA病毒、 类病毒和朊病毒。病毒包括包膜和无包膜病毒，例如，甲型肝炎病毒、乙 型肝病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、 乳多空病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、环状病毒、细小核糖核酸病毒、轮 状病毒、甲病毒、风疹病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、黄病毒、冠 形病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、弹状病毒、狂犬病病毒、正粘液 病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒、纳伊罗病毒、嗜肝DNA病毒、沙粒病毒、 逆转录病毒、肠病毒、鼻病毒或线状病毒。

可受益于在细胞、组织或器官以及细胞外区室中活性氧类产生或增强 的其它治疗性疾病对本领域普通技术人员是熟知的。例如此类疾病进一步 描述于McCord，Am.J.Med.，108：652-659(2000)，其所公开的内容此处引 用作为参考。

使用本领域技术人员可得到的方法可以对针对这些微生物品种的抗微 生物活性进行评价。抗微生物活性通过例如鉴定本发明的抗体阻止特定微 生物物种生长的的最低抑菌浓度(MIC)而进行确定。在一个实施方案中， 抗微生物活性是当使用标准剂量或剂量反应方法测量时能够杀死50％微 生物的抗体的量。

评估用此处所述的抗体治疗微生物感染时治疗有效剂量的方法包括测 定抗体制备物的最低抑菌浓度，在此浓度下基本上没有微生物能够体外生 长。此种方法允许计算单位体积中为了抑制微生物生长或杀死50％微生物 所需要的大约抗体量。例如，通过标准的微稀释法能够测定此种数量。例 如，制备了一系列含有相同体积培养基和基本上相同量的微生物的微生物 培养管，并且加入一份抗体。每一份包含不相同量的抗体于相同体积的溶 液中。将微生物培养相应于一至十代的时间段并且测定培养基中微生物的 数量。

培养基的光密度值也能够用于评价是否已经发生了微生物生长-如果 光密度没有明显的增加，则没有发生明显的微生物生长。然而，如果光密 度增加了，就已经发生了微生物的生长。为了确定当暴露于抗体之后有多 少微生物细胞仍然活着，可以在抗体加入的时刻(时间0)和此后有规律 的间隔取出一小份培养基。将小份涂布微生物培养板，将平板在易于微生 物生长的条件下进行培养，当出现克隆时，计算那些克隆数量。

组合物

本发明的抗体、敏化剂或化学探针可以制剂成多种可接受的组合物。 此类药物组合物可以以各种适合于所选择的施用途径，即口服或肠胃外施 用，通过静脉内注射、肌内注射、局部或皮下途径的形式施用于哺乳动物 宿主，例如人类患者。

当抗体、敏化剂和化学探针足够碱或足够酸以致形成稳定无毒的酸或 碱盐时，将此类抗体、敏化剂和化学探针作为盐进行施用是适当的。可药 用盐的例子是由能形成生理上可接受阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例 如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥 珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸酯。也可以 形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、重碳酸盐和碳酸盐。

使用本领域熟知的标准程序，例如用诸如胺的足够碱的化合物与提供 可生理用阴离子的适当酸进行反应，可以得到可药用盐。也可以得到碱金 属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)的羧酸盐。

从而，本发明的抗体、敏化剂和化学探针可以进行全身性的施用，例 如与诸如惰性稀释药或可同化可食用的载体的可药用赋形剂组合口服。它 们可以包封在硬的或软的明胶胶囊外壳中，可以压制成片剂，或直接掺入 到病人的食物中。对于口服治疗给药，抗体、敏化剂和化学探针可以与一 种或多种赋形剂结合并以可吸收的片剂、含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、 混悬液、糖浆剂、糯米纸囊剂等等形式使用。此种组合物和药剂应该包含 至少0.1％的活性成分。组合物和制剂的百分比当然是可变的并且方便的在 特定单位剂型重量的大约2％至大约60％之间。在此种治疗上有用的组合 物中氧化剂和氧清除剂的量是那些可以得到有效剂量水平的量。

片剂、键剂、丸剂、胶囊剂等等还可以包含以下可以加入的成分：诸 如西黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶的粘合剂；诸如磷酸氢二钙的 赋形剂；诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等等的崩解剂；诸如硬脂酸 镁的润滑剂；和诸如蔗糖、果糖、乳糖或天冬酰苯丙氨酸甲酯的甜味剂或 诸如薄荷、冬青油或樱桃调味料的调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上 述类型的物质外，它可以含有诸如植物油或聚乙二醇的液态载体。其它多 种物质可以作为包衣存在或改变固体单位剂型的物理形状。例如，可以将 片剂、丸剂或胶囊剂用明胶、蜡、虫胶或糖等等包衣。糖浆或酏剂可包含 活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的羟苯甲酸甲酯和羟 苯甲酸丙酯、诸如樱桃或橙香味的染料和调味料。当然，用于制备任何单 位剂型的任何材料都应当是可药用的并且所使用的量基本上是无毒的。此 外，活性成分可以掺入到持续释放的制剂或设备中。

对于创伤的治疗，可以采用对受试者的创伤进行局部应用。含有抗体 的组合物可以直接应用于伤口或者先施用于绷带上然后应用于伤口上。受 益于在细胞、组织、器官或细胞外区室中产生或提高的过氧化物、臭氧或 过氧化氢的其它治疗疾病对于本领域普通技术人员是可知的并且已被 McCord，Am.J.Med.，108：652-659(2000)进行了综述，此处对其公开引用 作为参考。

抗体、敏化剂和化学探针还可以通过灌注或注射从静脉内或腹膜内给 药。抗体、敏化剂和化学探针的溶液用水来制备，任选地与无毒的表面活 性剂混合。分散体还可以制备在甘油、液体聚乙二醇、醋酸甘油和它们的 混合物中和油中。在通常的储存和使用条件，这些制剂可以包含阻止微生 物生长的防腐剂。

适于注射或灌注的药物剂型包括包含抗体、敏化剂和化学探针的无菌 水溶液或分散剂或无菌粉剂，这些抗体、敏化剂和化学探针适于临时制备 无菌注射或灌注溶液或分散剂，任选地用脂质体包封。在所有情况下，在 制造和储存的条件下最终的剂型应该是无菌的、流质的和稳定的。液态载 体或媒介物可以是包含例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液 态聚乙二醇等等)、植物油、无毒的甘油酯和它们的适当的混合物的溶剂 或液体分散介质。其适当的流动性可以通过，例如，脂质体的形成、在分 散剂中维持所需颗粒大小、或者使用表面活性剂来维持。通过多种抗菌剂 和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、三梨酸、硫柳汞等等阻 止微生物的活动。在许多情况下，优选的包括等渗试剂，例如糖、缓冲液 或氯化钠。通过在可注射的组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝 和明胶产生对可注射组合物的延长吸收。

通过将抗体、敏化剂或化学探针以需要的量掺入到恰当的具有，如果 需要，上述列举的其它成分的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶 液。至于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干 燥和冷冻干燥技术，该技术能够得到氧化剂和氧清除剂加上存在于先前过 滤灭菌溶液中的任何附加需要的成分的粉末。

对于局部施用，可以将抗体、敏化剂或化学探针以纯化形式即为液体 时进行应用。然而，它们通常需要作为组合物或制剂与可以是固体或液体 的皮肤可接受的载体组合在一起被施用于皮肤上。

有用的固体载体包括诸如滑石粉、粘土、维晶纤维素、二氧化硅、氧 化铝等等细微的固体。有用的液体载体包括水、醇类或乙二醇或水-醇/乙 二醇混合物，本发明的组合物可以以有效水平溶解于或分散，任选地借助 于无毒的表面活性剂，于其中。为了优化用于特定用途的特性可以添加例 如香味的佐剂和额外的抗微生物剂。最终的液体组合物可以从用于浸透绷 带和其它敷料的吸收剂垫中应用，或使用泵型或气雾剂型喷雾器喷雾于受 影响区域。

为了直接施用于使用者的皮肤，诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐 和酯、脂肪醇、修饰的纤维素或修饰的矿物材料的增稠剂也可以与液体载 体一起使用以形成可以被涂开的糊剂、凝胶、软膏等等。

用于递送本发明的抗体、敏化剂或化学探针到皮肤的皮肤病用组合物 的例子在本领域是熟知的；例如，参见Jacquet等(美国专利号4,608,392)， Geria(美国专利号4,992,478)，Smith等(美国专利号4,559,157)和 Wortzman(美国专利号4,820,508)。

本发明抗体、敏化剂或化学探针的有用的剂量可以通过比较它们的体 外活性和在动物模型内的体内活性来决定。在小鼠和其它动物的有效剂量 外推至人的方法是本领域熟知的；例如，参见美国专利号4,938,949。 通常，在例如洗剂的液体组合物中本发明的抗体、敏化剂或化学探针的 浓度可以大约0.1-25重量％，优选的大约0.5-10重量％。在诸如凝胶或粉 末的半固体或固体组合物中浓度大约0.1-5重量％，优选的大约0.5-2.5重 量％。

用于治疗所需要的抗体、敏化剂或化学探针、或活性盐或它们的衍生 物的量不但随着所选定的特定盐而变化，而且随着给药途径、被治疗病情 的性质和病人的年龄和病情而变化并且最终由主管医师或临床医师作出判 断。

然而，一般而言，适宜的剂量会在从大约0.5到大约100毫克/公斤范 围内，即从每天大约10到大约75毫克/公斤体重，例如每天3到大约50毫 克/公斤受试者体重，优选地在6-90毫克/公斤/天范围内，最优选地在15-60 毫克/公斤/天范围内。

抗体、敏化剂或化学探针方便地以单位剂型施用；例如，含有5-1000 毫克，方便地10-750毫克，最方便地50-500毫克活性成分/单位剂型。

理想地，抗体、敏化剂或化学探针的施用应达到抗体、敏化剂或化学 探针的血浆浓度峰值从大约0.005到大约75μM，优选地，大约0.01-50μM， 最优选地，大约0.1-大约30μM。这可以通过，例如，静脉内注射0.05-5％ 的抗体、敏化剂或化学探针的溶液，任选地以盐形式注射，而达到，或者 作为含有大约1-100毫克抗体、敏化剂或化学探针的大丸剂而口服达到。 通过连续输注以提供大约0.01-5.0毫克/公斤/小时或者通过周期性灌注大 约0.4-15毫克/公斤抗体、敏化剂或化学探针来维持预期的血液浓度水平。

目的剂量可以方便地以单一剂量呈现或者作为以适当的间隔施用例如 每天2、3、4或更多亚剂量的分份剂量呈现。亚剂量本身可以进一步再分， 例如，分成许多个个别宽松间隔给药，例如从吸入器多次吸入或向眼应用 多滴滴剂。

本发明的治疗组合物、包括工程抗体和包含用于促进抗体活性的此处 所述的额外还原中心的其它分子在内的抗体以与剂量制剂相一致的模式和 治疗有效剂量进行施用。施用的量和周期依赖于接受治疗的受试者、受试 者身体利用有效成分的能力和所期望达到的治疗效果的程度。需要施用的 有效成分的精确的量依赖于从业者的判断并且对每一个个体都是特殊的。 然而，用于不同类型应用的适宜剂量范围依赖于给药途径。对于给药的适 宜方案也是可变的，但是典型的是初次给药后接着在一定时间间隔重复剂 量给药以致于达到治疗处理所期望的结果。

本发明的治疗组合物包含可药用的载体和抗体、敏化剂或化学探针。 在一个优选的实施方案中，当为了治疗目的施用于哺乳动物或病人时治疗 组合物不具有免疫原性。

包含溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物制剂是本领域众多周 知的并且不需要根据剂型加以限制。一般此类组合物制备成可注射的液体 溶液或混悬液，然而，也可以制备成适用于溶液或混悬液的在使用前溶于 液体的固体形式。制剂也可以是乳化的。

可以将活性成分与可药用的且与活性成分相容的赋形剂相混合，并且 以适宜的量用于此处所述的治疗方法。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、 右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果期望，组合物可以含有微量 辅助物质诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等等，以增强活性成分的效力。

本发明的治疗组合物可以包括其中的可药用盐组分。可药用盐包括与 诸如盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等等的有机酸形成 的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐还可以从例 如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁的无机碱，和诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨 基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的有机碱得到。

可药用载体在本领域是熟知的。作为例证的液体载体是除了活性成分 和水外不含其它物质的水溶液，或含有诸如在生理pH值的磷酸钠的缓冲 液、生理盐水或两者例如磷酸缓冲盐水的水溶液。更进一步，液体载体可 以包含一种以上缓冲盐、以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、右旋糖、聚乙二 醇和其它溶质。

液体组合物还可以包含除了水外的并且与水不相容的液相。此种额外 液相的例子是甘油、例如棉子油的植物油和水-油乳剂。

通过参考下面的非限定性实施例来进一步详细描述本发明。当用它们 的某些优选的实施方案作为参考进行详细描述本发明时，可以认识到修改 和变异是处于所描述和要求保护的精神和范围内的。

实施例I

具有内在破坏抗原能力的抗体材料和方法

抗体：下面完整抗体均从PharMingen获得：49.2(小鼠IgG2b κ)， G155-178(小鼠IgG2a κ)，107.3(小鼠IgG1 κ)，A95-1(大鼠IgG2b)， G235-2356(仓鼠IgG)，R3-34(大鼠IgG κ)，R35-95(大鼠IgG2a κ)，27-74 (小鼠IgE)，A110-1(大鼠IgG1 λ)，145-2C11(仓鼠IgG1 κ)，M18-254(小 鼠IgA κ)和MOPC-315(小鼠IgA λ)。下面抗体从Pierce获得：31243(绵 羊IgG)，31154(人IgG)，31127(马IgG)和31146(人IgM)。

下面的F(ab’)2片段从Pierce获得：31129(兔IgG)，31189(兔IgG)， 31214(山羊IgG)，31165(山羊IgG)和31203(小鼠IgG)。A蛋白，G蛋白， 胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂(包曼-毕尔克抑制剂)，β-乳球蛋白A，α- 乳清蛋白，肌红蛋白，β-半乳糖苷酶，鸡卵清蛋白，抑酶肽，胰蛋白酶原， 凝集素(花生)，凝集素(Jacalin)，牛血清白蛋白，超氧化物歧化酶和 过氧化氢酶从Sigma获得。核糖核酸酶I A从Amersham Pharmacia得到。 以下的免疫球蛋白是使用杂交瘤技术内部获得：OB2-34C12(小鼠IgG1 κ)，SHO1-41G9(小鼠IgG1 κ)，OB3-14F1(小鼠IgG2a κ)，DMP-15G12(小 鼠IgG2a κ)，AD1-19G1(小鼠IgG2b κ)，NTJ-92C12(小鼠IgG1 κ)， NBA-5G9(小鼠IgG1 κ)，SPF-12H8(小鼠IgG2a κ)，TIN-6C11(小鼠 IgG2a κ)，PRX-1B7(小鼠IgG2a κ)，HA5-19A11(小鼠IgG2a κ)，EP2-19G2 (小鼠IgG1 κ)，GNC-92H2(小鼠IgG1 κ)，WD1-6G6(小鼠IgG1 κ)， CH2-5H7(小鼠IgG2b κ)，PCP-21H3(小鼠IgG1 κ)和TM1-87D7(小鼠 IgG1 κ)。DRB多克隆(人IgG)和DRB-b12(人IgG)由Dennis R.Burton (Scripps研究所)提供。1D4Fab(结晶的)由Ian A.Wilson(Scripps研究所) 提供。

所有的测定方法都是在PBS(10mM磷酸盐/160mM氯化钠，pH 7.4) 中进行的。根据需要，商品化的蛋白质溶液样品在PBS中进行透析。除 臭剂红过氧化氢测定试剂盒(A-12212)从Molecular Probes得到。

抗体/蛋白质照射.除非特别说明，测定溶液(100μl，6.7μM蛋白质 溶于PBS，pH 7.4)加入到玻璃瓶中，用螺旋帽密封并用紫外(312nm，8000 μWcm-2Fischer-Biotech透照灯)或可见光进行照射。

过氧化氢的定量测定.将一份(20μl)从蛋白质溶液中取出并加入到 含有反应缓冲液(80μl)的96-孔微孔板(Costar)的一个孔中。然后加入 工作液(100μl/400μM除臭剂红试剂1/2单位/毫升辣根过氧化物酶)并 且在暗处孵育30分钟。然后使用CytoFluor微孔板阅读仪(4000型， PerSeptive Biosystems，Framingham，MA；激发/发射：530/580nm)测定 孔中组分的荧光。使用标准曲线确定过氧化氢的浓度。所有实验重复进行， 并且形成速率以至少两次测量的平均值来提供。

敏化作用和猝灭测定.将溶于PBS(pH 7.4，4％二甲基甲酰胺)中 31127溶液(100μl马IgG，6.7μM)和血卟啉IX(40μM)放置于近光带 处。如此处所描述对过氧化氢浓度进行测定。测定还在D2O中有NaN3(100 mM)或PBS存在的情况下进行。

氧依赖.使用冻/融方法在氩环境下将溶于PBS(pH 7.4)中的31127 (1.6ml，马IgG，6.7μM)溶液严格除气。通过注射器将一份(100μl)导入已 经用适当O2/Ar混合物(0-100％)清除的用隔封闭的玻璃瓶中。用Orion 862A溶解氧测量计测定溶解氧含量。将这些溶液剧烈涡旋混匀，放置20 分钟，然后再次涡旋混匀。在实验过程中使用含必需O2/Ar混合物的注射 器以维持大气压。用气体密闭的注射器取出一份(20μl)并用此处所述的 方法测定过氧化氢的浓度。用酶动力学(Enzyme Kinetics)v1.1计算机 程序(用于确定参数Vmax和Km)将三次单独实验取得的数据进行比较和 分析。

使用化学1O2源，在黑暗中由抗体产生过氧化氢.将溶于PBS(pH 7.4) 中的绵羊IgG 31243(100μl，20μM)溶液和3，3N-(1，4-亚萘基)二丙酸二钠 (25mM溶于D2O)内过氧化物置于黑暗的温室中(37EC)30分钟。用此处 所述的方法测定过氧化氢浓度。

通过Fab1D4晶体的过氧化氢形成.将1D4Fab片段的晶体混悬液(2 μl)用PBS(198μl，pH 7.4)进行稀释并轻轻地涡旋混匀。离心之后，将上 情液取出，并且进一步重复2次洗涤步骤。然后将所剩余的晶体混悬液用 PBS，pH 7.4(100μl)进行稀释，并且加入到石英ELISA板的一个孔中。在 紫外线照射30分钟后，加入除臭剂红工作溶液(100μl)，并且在荧光显微 镜上察看混合物。

抗体荧光与过氧化氢形成。将溶于PBS(pH 7.4)的31127(1.0ml马 IgG，6.7μM)溶液置于石英容器中并且用紫外光照射40分钟。以10分钟的 间隔，用SPF-500C荧光分光光度计(SLM-Aminco，Urbana，IL；激发/发射， 280/320)测定溶液的荧光。在同一时间点，取出一份(20μl)溶液，并且用此 处所述的方法测定过氧化氢的浓度。

通过过氧化氢酶对过氧化氢的消耗.将EP2-19G12溶液(100μl小鼠 IgG，以20μM的浓度溶于PBS，pH 7.4)用紫外光照射30分钟，在此时 间之后用结合试验(stick test)(EM Quant Peroxide Test Sticks)确定过氧 化氢的浓度为2毫克/升。加入过氧化氢酶[1μl，Sigma，3.2M(NH4)2SO4， pH 6.0]，并且1分钟后发现H2O2的浓度达到0毫克/升。

变性.将Eppendorf管中的IgG 19G12(100μl，6.7μM)加热至 100EC 2分钟。将最终的溶液转移至玻璃的、螺口小瓶中并且用紫外线照 射30分钟。30分钟后测定H2O2的浓度。

结果和讨论

通过一组完整免疫球蛋白和抗体片段的过氧化氢起始形成速率的测量 值收集于表1。据信Ig-产生的O2·-可以发生自发岐化作用变成H2O2，然 后H2O2和N-乙酰基-3，7-二羟基吩嗪1(除臭剂红)作为协同底物被辣根 过氧化酶利用，以产生高荧光的9-羟基-3-异吩噁唑酮2(最大激发563nm， 最大发射587nm)(图2)(Zhou，M.，Diwu，Z.，Panchuk-Voloshina，N.和 Haugland，R.P.，Anal.Biochem.，253，162-168(1997))。为了证实对缓冲液 的照射不能够产生O2·-并且抗体不是简单地充当蛋白质歧化酶而起作用 (Petyaev，I.M.和Hunt，J.V.，Redox Report，2，365-372(1996))，将过氧化 物歧化酶在PBS中被照射。在这些条件下，过氧化氢的产生速率与单独 PBS照射情况下的相同。

表1.通过免疫球蛋白产生过氧化氢＊

＊测定条件在材料和方法中描述。

H至少2次测定的平均值。在PBS中H2O2的背景形成速率是0.005 nmol/分钟并且在有SOD存在时在PBS中H2O2的背景形成速率是 0.003nmol/分钟。

至于在环境条件下(275μM)PBS中的氧浓度，对于超过10％的反应过 氧化氢形成速率是线性的。在得到足够氧的情况下，每个蛋白质分子可以 产生至少40当量H2O2而活性上或结构片段上没有明显的减少。在存在或 缺乏抗体19G2时过氧化氢形成的起始时间过程的例子示于图3A。随后通 过加热使得蛋白质变性该活性丧失了。

表1中的数据显示抗体从1O2产生H2O2的普遍的能力。好像多种物种 共享此种功能并且该种能力不依赖于所研究重链和轻链组分或抗原特异 性。

对于完整抗体的过氧化氢形成的起始率是高度保守的，在整组中变化 从0.15纳摩尔/分钟/毫克[克隆A95-1(大鼠IgG2b)]到0.97纳摩尔/分钟/ 毫克(克隆PCP-21H3，鼠单克隆IgG)。虽然可得到的信息更加局限于组分 抗体片段，该活性好像在Fab和F(ab’)2片段中均存在。

如果该活性是由于污染造成的，那么活性将存在于从不同来源得到的 所有抗体或抗体片段。然而，为了进一步排除污染，从中得到高分辨率x- 射线结构(在1.7D)的鼠抗体1D4Fab晶体被用来研究它们产生H2O2的能 力(图4)。在这些晶体中清晰地观察到了1O2的还原。

对此种抗体转化的研究支持单线态氧作为中间体被还原。无论是存在 还是不存在紫外线照射，抗体在缺氧条件下不会发生过氧化氢的形成。而 且，在环境有氧条件下而没有照射时过氧化氢的产生不会发生。在水溶液 中存在已知的3O2的光敏剂血卟啉(HP)(Kreitner，M.，Alth，G.，Koren， H.，Loew，S.和Ebermann，R.，Anal.Biochem.，213，63-67(1993))的情况下 用可见光照射抗体导致过氧化氢的形成(图5A)。所观察到的形成速率曲 线存在弯曲是因为在测定混合物中存在氧的消耗。对光激发的HP和氧的 相互作用会导致O2·-的形成(Beauchamp，C.和Fridovich，I.，Anal. Biochem.，44，276-287(1971)；Srinivasan，V.S.，Podolski，D.，Westrick，N. J.和Neckers，D.C.，J.Am.Chem.Soc.，100，6513-6515(1978))的担心可以 通过使用只有敏化剂的适当背景实验而大大消除(数据示于图5A)。使用 HP和可见光使得H2O2有效形成再次肯定了1O2的中间体地位并且表明对 于Ig实现该还原功能而言紫外线照射不是必需的。

此外，将绵羊抗体31243在黑暗中37EC条件下与1O2的化学源[内过 氧化物3N，3N-(1，4-亚萘基)二丙酸盐]进行孵育导致过氧化氢的形成。

通过可见光下的马IgG和HP(40μM)的H2O2的形成速率随着D2O 存在而增加并且随着1O2淬灭剂NaN3(40mM)存在而降低(图5B)(Hasty， N.，Merkel，P.B.，Radlick，P.和Kearns，D.R.Tetrahedron Lett.，49-52 (1972))。已知用D2O替代H2O会通过对1O2增加大约10倍的寿命而促进 1O2介导的过程(Merkel，P.B.，Nillson，R.和Kearns，D.R.，J.Am.Chem. Soc.，94，1030-1031(1972))。

过氧化氢形成速率与IgG浓度在0.5和20μM之间成比例但是在较高 浓度时开始弯曲(图5C)。由于存在反应的可能，蛋白质溶液中1O2的寿 命预期低于在纯水中的。因此可以认为所观察到的弯曲可能是由于因为与 抗体发生反应而使得1O2寿命降低造成的。

很明显，氧浓度对所观察到的H2O2产生速率的影响表明大约200μM 氧的明显饱和状态(图5D)。因此，还原机制可能涉及抗体分子中一个 或多个氧结合位点。通过对原始形成速率数据进行非线性回归处理并且通 过拟合Michaelis-Menten方程，得到Kmapp(O2)为187μM和Vmaxapp为 0.4纳摩尔/分钟/毫克。这种抗体的速率等同于所观察到的线粒体酶在体内 还原分子氧的速率。

抗体还原1O2的机制仍处于被确定中。然而，因为在含有EDTA(4mM) 的PBS中彻底透析之后抗体的活性保持不变所以金属介导的氧化还原过程 的参与被大大降低了。这是抗体自身氨基酸组成的内在能力。芳香族氨基 酸例如色氨酸(Trp)可以通过电子转移被1O2氧化(Grossweiner，L.I.， Curr.Top.Radiat.Res.Q.，11，141-199(1976))。此外，二硫化物富含能够 被氧化的足够的电子(Bent.D.V.和Hayon，E.，J.Am.Chem.Soc.，87， 2612-2619(1975))。因此，这里存在一种潜在的可能性，即色氨酸残基和/ 或所有抗体同源的链内或链间二硫键负责1O2的还原。为了研究抗体的这 种能力在什么程度上被其它蛋白质所共享和调查还原的机制，研究了一组 其它蛋白质(图6)。

与抗体相反，虽然其它蛋白质能转化1O2成为O2·-，但这决不是一个 普遍的特性。不含有Trp残基而含有几个二硫键的RNA酶A和超氧化物 歧化酶不能够还原1O2。相似地，含有七个二硫键而不含有Trp残基的包 曼-毕尔克抑制剂(Voss，R.-H.，Ermler，U.，Essen，L.-O.，Wenzl，G.，Kim， Y.-M.和Flecker，P.，Eur.J.Biochem.，242，122-131(1996)；Baek，J.和 Kim，S.，Plant Physiol.，102，687(1993))不能够还原1O2。相反，只含有2 个Trp残基的鸡卵清蛋白(Feldhoff，R.和Peters，T.J.，Biochem.J.，159， 529-533(1976))是最有效的还原1O2的蛋白质之一。

考虑到当变性后抗体活性会丧失，好像关键残基在蛋白质的位置比它 们的绝对数量更关键。因为为了促进结构的稳定性，蛋白质中大多数芳香 族残基普遍地埋藏在内部(Burley，S.K.& Petsko，G.A.，Science，229， 23-28(1985))，所以用荧光淬灭实验以表面和隐蔽的残基相对贡献的方式探 究了还原过程的性质。通过吸收紫外线，特别是有致敏剂例如分子氧或臭 氧存在的情况下，蛋白质中的芳香族氨基酸被修饰了(Foote，C.S.，Science， 162，963-970(1968)；Foote，C.S.，Free Radicals Biol.，2，85-133(1976)； Gollnick，K.，Adv.Photochem.，6，1-122(1968))。通过[2+2]环加成作用色 氨酸与1O2发生反应产生N-甲酰犬尿氨酸或犬尿素，已知它们都能明显淬 灭所埋藏色氨酸残基的发射光(Mach，H.，Burke，C.J.，Sanyal，G.，Tsai， P.-K，Volkin，D.B.和Middaugh，C.R.蛋白质和多肽的形成和递送，著者 Cleland，J.L.和Langer，R.(美国化学会，Denver，CO)(1994))。在40-分钟 的照射过程中，马IgG的内在荧光快速淬灭到其原始数值的30％，然而 过氧化氢的产生自始至终是线性的(r2＝0.998)(图7)。如果单线态氧 的还原是由于抗体色氨酸残基，那么暴露于溶剂中的色氨酸好像比隐藏色 氨酸残基的贡献程度要小。这种因素有助于解释为什么这种能力在抗体中 是高度保守的。在多于99％的已知抗体中，存在2个色氨酸残基，并且都 是深埋在内部的：色氨酸36和色氨酸47(Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H. M.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.，与免疫有关蛋白质的序列(U.S. Department of Health and human Services，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD)(1991))。

在整个自然界，生物体自身通过产生相对简单化学物质的方式进行防 御。在单分子水平，这种机制被认为随着在脊椎动物中免疫系统的出现而 大部被抛弃。据认为一旦靶向设施得到进化则杀灭机制就移到别处。当前 的结果使得对于一些分子内的杀灭作用进行重新认识。在一定意义上，这 种化学免疫系统，除了加入了更加复杂和多样的靶向成分外，类似于低等 生物体内的纯化学防御机制。

考虑到理想的杀灭系统必须使用宿主分子并以降低自身损伤的局部方 式进行的这样一种限制，人们很难想象到比1O2更公正的选择。因为既然 存在了该反应分子，一个要问的重要问题就是抗体对其进一步转化的优点 是什么。关键的问题是通过将暂时的单线态氧(寿命4μs)转化成更稳定 的O2·-，它现在才能接近过氧化氢和它能产生的所有毒性产物。此外，超 氧化物是唯一一个等同于氧清除级联反应中残留的分子氧。因此，这种“再 循环”可能作为加强杀微生物过程的关键机制。单分子氧的另一个益处是 它只存在于当宿主受到攻击时，因此使它成为“事件-触发的”底物。并且 由于存在用于抵御的使用附属系统的可选择的途径，在许多情况下免疫系 统的这种化学武器功能可能是沉默的。然而，这就是说这里会有很多疾病 状态，此种状态下发现抗体和单线态氧是并列的，从而导致了细胞和组织 的损伤。考虑到人类多种事件导致单线态氧的产生，抗体对其的激活可能 导致从自身免疫到再灌注损伤和动脉粥样硬化的很多种疾病(Skepper等， Microsc.Res.Tech.，42，369-385(1998))。

实施例II

抗体催化水的氧化

方法和材料

结晶学：使用标准程序用木瓜蛋白酶消化IgG 4C6并且将Fab’片段 进行纯化(Harlow和Lane)。将Fab’从13-18％PEG 8K，0.2M ZnAc，0.1M 二甲砷酸盐，pH 6.5中进行结晶。将晶体在氙气存在下200psi加压2分 钟(Soltis等，J.Appl.Cryst.，30，190，(1997))并且随后用液氮瞬间冷却。在 SSRL BL9-2上以2.0的分辨率收集数据。使用坐标通过分子置换从天然 4C6结构中计算结构，并且氙原子位点从不同Fourier图上的强峰中鉴定 出来。在CNS(Brünger等，Acta.Crystallogr.，D54，905(1998))中做出精细 结构至最终R＝23.1％和Rfree＝25.7％。当将它们的B值固定于高出环境 蛋白质的B值50％之后两个氙原子的占据位点被精确定下来。在Bobscript (R.M.Esnouf，Acta Crystallog.，D55，938(1999))中产生图。

Kabat数据库扫描：为了决定在它们的结构中Trp，Tyr，Cys，Met 的数目分析了人和小鼠序列的Kabat数据库。如果有太多的残基删除或缺 少片段则淘汰该序列。这允许对可得的3894序列的2068条进行高度确定 性分析。数值报道为CH、VH、CL和VL(κ和λ.)区域：Trp 15.5(14-31)， Tyr 30.4(13-47)，Cys 19.3(15-29)，Met 11.6(7-32)，His 13.3(8-28)的括弧 内范围的平均总数。总计＝90.1(49-167)。

电感耦合等离子体原子发射光谱学：在Varian，Axial Vista Simultaneous ICP-AES光谱仪上进行mAb PCP21H3的电感耦合等离子体 原子发射光谱(ICP-AES)实验。将小鼠单克隆抗体(PCP21H3)完全透析入含 有20mM EDTA的磷酸钠缓冲盐水(PBS，50mM pH 7.4)中。在典型的测 定中，将300μL10.5％HNO3溶液加入到100μL10mg/mL的抗体溶液中 并在70℃孵育14小时。然后用MQH2O将该溶液稀释至2mL并且然后 对照标准进行分析。ICP-AES分析结果报道为百万分之几(μg/mL)：Ag 0.0026(每个抗体分子0.0072个原子)；Al 0.0098(每个抗体分子0.113个原 子)；As 0.0062(每个抗体分子0.025个原子)；Ba在检测水平以下；Ca 0.0355 (每个抗体分子0.266个原子)。

所观察的高Ca浓度是用于我们测定系统的磷酸盐缓冲系统的污染的 结果。为了观察Ca(II)对抗体-介导的H2O2速率的影响，使用图8A图解 说明中概括的测定过程通过加入多种浓度的CaCl2(0-100μM)进行抗体 样品的照射。发现该过程不依赖于Ca(II)浓度；Cd 0.0007(每个抗体分子 0.0187个原子)；Ce 0.0012(每个抗体分子0.003个原子)；Co 0.0013(每个抗 体分子0.007个原子)；Cr 0.0010(每个抗体分子0.006个原子)；Cu 0.0014 (每个抗体分子0.007个原子)；Fe 0.0089(每个抗体分子0.048个原子)；Gd 0.0008(每个抗体分子0.001个原子)；K 0.0394(每个抗体分子0.302个原 子)；La0.0007(每个抗体分子0.002个原子)；Li 0.0013(每个抗体分子0.056 个原子)；Mg 0.0027(每个抗体分子0.033个原子)；Mn 0.0007(每个抗体分 子0.004个原子)；Mo 0.0023(每个抗体分子0.007个原子)；Na 102.0428(每 个抗体分子1332个原子)；Ni 0.0007(每个抗体分子0.004个原子)；P 14.3521(每个抗体分子138.9个原子)；Pb低于检测水平；Rb 0.0007(每个抗 体分子0.002个原子)；Se低于检测水平；V 0.0109(每个抗体分子0.019个 原子)；W 0.0119(每个抗体分子0.019个原子)；Zn 0.0087(每个抗体分子 0.040个原子)。

氧同位素实验：在典型的实验中，将抗体(6.7μM，100μL)或非免疫 球蛋白的蛋白质(50μM，100μL)在PB(160mM磷酸盐，pH 7.4)中的溶 液冷冻干燥并且然后溶于H2O2(100μL，98％)中。在MS中要将氯化钠排 除以使信号抑制降至最低。在MS测定中，为了产生可检测数量的H2O2， 有必要使用较高浓度的非免疫球蛋白蛋白质。在密封石英试管内饱和16O2 需氧条件下用UV-透照灯20EC照射蛋白质溶液8小时。8小时后使用除 臭剂红测定法测定H2O2浓度(Zhou等，Anal.Biochem.，253，162(1997))。 然后通过离心过滤样品使其通过microcon(大小排阻过滤器)以去除蛋白质 并重新测定H2O2浓度。加入TCEP(新鲜制备的20mM于H218O中的原 液)(约相对H2O22mol当量)并将其静置于37℃15分钟，这段时间后全部 H2O2已经进行了反应。每个测定之前新鲜制备H218O中的TCEP溶液， 因为18O慢慢掺入TCEP的羧酸(超过几天的时间)。在测定时间过程期间， 由于该途径而没有18O掺入发生。而且，没有18O从H218O掺入16O氧化 膦。249m/z处的峰是TCEP的(M-H)-。由于在测定中使用了相对H2O2过 量的TCEP(两倍)，在所有MS中均观察到249处的峰。

将来自蛋白质样品的重复比率的16O/18O冷冻干燥在一起是合理的(±10 ％)。然而，在冷冻干燥过程中去除蛋白质结合水分子的问题意味着来自不 同批的冷冻干燥样品之间所观察到的比率可能是变化的，变化多至2∶1到 4∶1(当从H216O冷冻干燥时)。因此，如下严格的冷冻干燥和除气操作是重 要的。在这方面，由于相对易于去除蛋白质结合氧分子，18O2和H216O实 验呈现出远低于测定间的变异性。

来自不同物种的抗体在实验系统给出了相似比率，描述如下：16O∶18O： WD1-6G6mIgG(鼠)2.1∶1；poly-IgG(马)2.2∶1；poly-IgG(绵羊)2.2∶1； EP2-19G2mIgG(鼠)2.1∶1；CH2-5H7mIgG(鼠)2.0∶1；poly-IgG(人) 2.1∶1。比率基于两次重复实验的平均值，除了poly-IgG(马)以外，该值是 10次测量的平均值。所有测定和条件如上所述。

在典型的实验中，将绵羊或马poly-IgG(6.7μM，100μL)的PB(160 mM磷酸盐；pH 7.4)溶液在氩条件下脱气30分钟。然后用18O2(90％)饱 和该溶液并按如上所述进行照射。然后如文中所述进行测定和操作。

通过血卟啉IX的3O2致敏作用测定H2O2的产生与1O2形成效率的关 系：测定法是H.Sakai和共同研究者，Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.，2371， 264(1995)所研发的方法的修改方法。简而言之，使用透照灯的白光照射在 PBS(50mM，pH 7.4)溶液中的马poly-IgG(1mg/mL)和血卟啉IX(40 μM)。取出等份(50μL)并同时测定H2O2和3-氨基邻苯二甲酸的浓度。通 过除臭剂红法测定H2O2的浓度(Zhou等，Anal.Biochem.，253，162(1997))。 在使用Adsorbosphere-C18柱子的Hitachi D4000系列仪器上通过反相 HPLC测定3-氨基邻苯二甲酸的浓度，UV分光光度检测器在254nm处， 并且乙腈/水(0.1％TFA)18∶82的流动相流速为1mL/分钟(鲁米诺保留时 间＝7.4分钟且3-氨基邻苯二甲酸保留时间3.5分钟)。通过与对照样品比较 峰高和峰面积进行比较测定鲁米诺和3-氨基邻苯二甲酸的浓度。实验数据 产生了由血卟啉IX形成的1O2的量(直接与所形成的3-氨基邻苯二甲酸的 量成比率)和由抗体形成的H2O2的量。在白光下不含血卟啉IX的抗体不 形成有意义量的1O2。

对除臭剂红测定可以测定除了H2O2之外的蛋白质-过氧化物衍生物的 担心减少，因为使用该方法测定的表观H2O2浓度不依赖于是否从样品中 去除照射的蛋白质(通过大小排阻过滤)。

量子化学方法：全部QC计算是使用Jaguar[Jaguar 4.0， 有限公司，Portland，Oregon，1998.见B.H.Greeley，T.V.Russo，D.T. Mainz，R.A.Friesner，J.-M.Langlois，W.A.Goddard III，R.E.Donnelly， J.Chem.Phys.，101，4028(1994)]利用密度功能理论(DFT)的B3LYP flavor 进行的[J.C.Slater于分子和固体的量子理论，第4卷：分子和固体的自相 一致的场，McGraw Hill，New York，(1974)]，其包括泛化的梯度近似值和精 确的互变。6-31G＊＊基础设定用于全部原子。所有几何图完全最适化。计 算震动频率以保证每个最小值是真实的局域极小值(仅阳性频率)并保证过 渡态(TS)仅具有单一虚频率(Hessian阴性特征值)。此类QC计算已经证 明对于简单有机分子具有～3kcal/mol的精确度。非闭合外壳分子例如O2 和3O2预期具有较大误差。然而，此类误差预期是系统的从而QC结果的 机械函式将是正确的。全部能量学报道为未进行零点能量或温度校正的 kcal/mol。

结果和讨论

抗体能够从单线态分子氧(1O2)产生过氧化氢(H2O2)。然而，直到此处 所报道才知道该过程是催化性的。目前显示抗体作为一类蛋白质是唯一的， 因为当存在任意可辨别的辅因子和电子供体时，它们能够从1O2产生多至 500摩尔当量的H2O2，而不降低速率。基于同位素掺入试验和动力学数据， 提出了抗体能够促进无先例地将H2O加入1O2产生H2O3，作为反应级联 中的第一个中间体H2O3最终导致形成H2O2。使用氙的X射线结晶学研究 指出抗体折叠中保守的氧结合位点，在这里能够起始该化学作用。这些发 现暗示出免疫球蛋白针对1O的独特的保护功能并且提出这样一个问题， 是否需要解毒1O2在免疫球蛋白折叠的进化中起到的决定性作用。

抗体，不管来源或抗原特异性，都能够从单线态分子氧(1O2)产生过氧 化氢(H2O2)从而潜在调整防御性识别和在相同分子内杀伤(Wentworth等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。根据该发现的潜在化学和 生物学上的意义，已经观察了该过程中抗体的机械基础和结构定位。这些 组合的研究揭示，与其它蛋白质相比，抗体可以催化水和单线态氧之间无 先例的一组化学反应。

动力学研究：长期UV照射研究揭示抗体-介导的H2O2产生是比非免 疫球蛋白蛋白质情况下更加有效的过程(图8A)。一般，抗体呈现速率开始 逐渐降低之前H2O2形成线性增加至40摩尔当量H2O2(图8B)。相比之下， 非免疫球蛋白蛋白质显示短“脉冲”式H2O2产生随后随着光氧化作用发 生而淬灭(图8A)。

与其它蛋白质相比，如鼠单克隆IgG PCP21H3所示(图8C)的、如果 在测定中使用过氧化氢酶将产生的H2O2去除，抗体则能够以与实验起始 的速率一样的速率重新进行H2O2的光产生。过氧化氢介导的H2O2损坏后 的这种H2O2连续线性产生曲线对于所测定的所有抗体是保守的。因此， 在过程中积累的H2O2正在抑制其自身的形成(可逆的)。表观IC50估计 为225μM(图8D)。

通过底物、过渡态类似物、或反应产物对酶催化功能的抑制作用通常 作为活性位点现象强有力的证据。已经注意到抗体-介导的光致产生H2O2 是使用分子氧可饱和的(Kmapp(O2187μM)(Wentworth等，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。H2O2的这种形式产物抑制作用提供了 此种结合位点现象的进一步证据。

关于通过抗体光产生H2O2的早期报道没有使用探测到能够产生的 H2O2最大量(Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930 (2000))。通过反复循环UV照射抗体样品随后通过过氧化氢酶去除产生的 H2O2已经检测了这一问题(图8C显示两个此类循环)。在一系列实验中， UV-照射和加入过氧化氢酶的循环进行多至10次循环(马poly IgG的PBS 溶液，pH 7.4)。在这些实验期间产生了＞500摩尔当量(equiv.)的H2O2，而 观察到仅轻微降低了初始速率。除了抗体之外，迄今为止所发现的能以此 种有效且长期方式产生H2O2的唯一其它蛋白质是αβT细胞受体(αβTCR) (图8F)。有意思的是，αβ TCR的免疫球蛋白折叠结构域享有与抗体相似 的排列(Garcia等，Science，274，209(1996))。然而，象β2-微球蛋白所显示 的那样，拥有这种结构基序好像对蛋白质的H2O2产生能力不是必需的，纵 使β2-微球蛋白是免疫球蛋白超家族的一员但它不能够产生H2O2(Welinder 等，Mol.Immunol.，28，177(1991))。

抗体结构对抗H2O2的氧化效应明显没有活性。当在H2O2存在下暴露 于标准紫外线照射条件下6小时(以足以完全抑制H2O2产生的浓度)， 一旦通过过氧化氢酶破坏掉抑制性的H2O2，多克隆马IgG抗体样品变得 完全活化(图8E)。甚至在暴露于H2O2之后，以一恒定速率、在较长时 间段内持续产生H2O2的能力，揭示抗体的结构折叠对化学品的抗性和其 它蛋白质所遭受的光氧化修饰的抗性是明显的，并且是至今未引起注意的。 对在标准条件下UV照射8小时后的抗体样品进行SDS-PAGE凝胶分析后 显示抗体分子既没有明显的片段化也没有凝聚。

为了确定在H2O2存在的条件下蛋白质结构没有变化(它可能促成了 H2O2的明显抑制效应)，甚至在侧链位置的水平也没有变化，在存在和不 存在H2O2的情况下测定了Fab 4C6的x-射线晶体结构。之所以选择Fab 4C6是因为它的天然晶体的衍射分辨率高于任何其它公开的抗体(～1.3D)。 对于用3mM H2O2浸泡之前和之后4C6结构的关键结构参数均方根差 (RMSD)进行了比较。所用原子的RMSD＝0.412D，Cα原子的RMSD＝ 0.327D，主链原子的RMSD＝0.328D，侧链原子的RMSD＝0.488D。鼠Fab 4C6(Li等，J.Am.Chem.Soc.，117，3308(1995))的天然结构和H2O2处理后 的结构叠置是可以重叠的，因此强化了抗体折叠对H2O2稳定性的证据(图 9)。

将抗体介导的光致产生H2O2的作用谱和抗体蛋白质对相应的相同波 长范围(260-320nm)的吸收谱并列列于图10。两个谱实际上与在蛋白 质中色氨酸最大UV吸收相同的激发波长时所观察到的H2O2产生的最大 效率是可重叠的。

检测通过马IgG产生H2O2的效率与通过用血卟啉IX敏化3O2( 在磷酸缓冲液pH 7.0中)和可见光下而导致1O2形成效率的关系，表 明对于每275±25摩尔当量的通过敏化作用产生的1O2，通过抗体分子产 生1摩尔当量H2O2(Wilkinson等，J.Phys.Chem.Ref.Data，22，113(1993)； Sakai等，Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.，2371，264(1995))。

电子源的问题.由抗体介导的从单线态氧产生H2O2所引出的机制问 题不得不严格的划分为两个下列问题：一个是关于该过程中的电子源问题 并且另一个是关于该过程的化学机制问题。考虑到从1O2到H2O2的转化过 程中需要2摩尔当量电子，每个抗体分子当量能够产生＞500H2O2当量的 事实提出了一个尖锐的电子储备问题。对于电子来源研究开始于最不同的 可能性。通过蛋白质的电子转移极其容易地并且显著大距离地发生 (Winkler等，Pure & Appl.Chem.，71，1753(1999)；Winkler，Curr.Opin. Chem.Biol.，4，192(2000))。考虑的第一个电子源是涉及到在正常的蛋白质 光氧化过程中引用的、一般作为电子供体的残基的集合体。在照射和过氧 化氢酶处理的重复循环中通过抗体和αβ-TCR产生的几乎恒定的H2O2产 生速率(图8C和8E)则与此种机制相背，因为能够被氧化的残基变得逐 渐耗尽使得在H2O2的产生中将不得伴随着速率的显著降低。这种速率的 降低将进一步加重因为由于蛋白质变得具有更多正电荷使得剩余的未氧化 残基的氧化还原电位将不得不提高。

正常的蛋白质光氧化过程是一个复杂的级联过程，该过程导致1O2和 其它活性氧类(ROS)例如超氧负离子(O2·-)、氢过氧自由基(HO2·)和H2O2 的产生(Foote，Science，162，963(1968))。当前对机制的思考将蛋白质对光 氧化的敏感性与多达五种氨基酸：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、半胱 氨酸(和胱氨酸)、蛋氨酸(Met)和组氨酸(His)联系起来(Straight和 Spikes，在Singlet O2，A.A.Frimer，著者(CRC Press，Inc.，Boca raton， Florida，1985)，IV9卷，91-143页；Michaeli和Feitelson，Photochem. Photobiol.，59，284(1994))。通过Trp和分子氧光致产生H2O2是一个已进 行很好表征的过程，该过程涉及，至少部分涉及，从1O2到能够自发歧化 成H2O2和3O2的O2·的形成和还原(McMormick和Thompson，J.Am. Chem.Soc.，100，312(1978))。由于色氨酸能够转化为对近UV(λmax 320nm) 敏化剂特别有效的N，N-甲酰犬尿氨酸(NFK)，因此色氨酸，不论是作为单 个氨基酸还是作为蛋白质的成分，在有氧条件下对近UV照射(300-375nm) 特别敏感(Walrant和Santus，Photochem.Photobiol.，19，411(1974))。然而， 在近UV照射(图11A)过程中Trp光氧化伴随着H2O2的亚化学计量的 产生(约0.5摩尔当量)(McMormick和Thompson，J.Am.Chem.Soc.，100， 312(1978))并且在光致产生H2O2中最有效的非免疫球蛋白的蛋白质β-半 乳糖苷酶从其39Trp残基中只产生5.9mol当量的H2O2(图8A)(Fowler 和Zabin，J.Biol.Chem.，253，5521(1978))。

对人和小鼠抗体重链和轻链序列Kabat数据库的扫描(对3894个序 列的2068个序列进行了分析)显示在其完整结构中抗体很少有超过15个 Trp残基的(平均值＝15.5，范围为14-31个Trp残基)(Kabat等，免疫相 关的蛋白质的序列(US Department of Health and人Services，Public Health Service，NIH，第5版，1991)；Martin，蛋白质：结构，功能和遗传学， 25，130(1996))。实际上，即使将涉及上文的蛋白质光氧化过程的所有氨基 酸全体参与抗体介导的H2O2产生，这些残基(平均＝90.1，范围为49-167 个反应残基)还是达不到产生500摩尔当量H2O2的足够数量。

考虑到氯离子是已知的通过蒽醌三激发态而光致产生H2O2的适宜电 子源(Scharf和Weitz，Symp.Quantum Chem.Biochem.，Jerusalem 12卷 (Catal.Chem.Biochem.：Theory Exp.)，355-365页(1979))，接下来研究了 作为还原等价物的氯离子(以150mM存在于PBS)的电势。当发现通过 免疫球蛋白的H2O2产生速率不依赖于氯离子浓度时(图11B)，这种可能 性很快就大打折扣。

研究了金属离子的可能的作用。虽然此类离子很难以此种可以作为电 子源的数量存在于抗体中，痕量的它们可能会作为催化氧化还原中心起着 中心作用。为了所有的实践目的，开展了允许在此过程中涉及的微量金属 被排除的实验。例如，在将抗体样品用含EDTA的缓冲液完全透析之前和 之后抗体介导的光致产生H2O2的速率没有发生变化(图11C)。将抗体 样品用EDTA处理后，ICP-原子发射光谱分析(AES)显示剩余的微量金 属离子存在的数量远远低于百万分率。对于该反应中涉及的微量金属，它 对于所有的抗体都是普遍的因为所分析的所有抗体都有这种内在能力。人 们普遍接受结合金属不是抗体的一个内在的特征并且这与我们对抗体晶体 还有在Brookhaven数据库中可得到的大约300种抗体结构的分析相一致。

因此所有的观察强制性的指向了鉴定电子源的需要，这种电子源并不 意味着蛋白质晶体的失活并且解释了高转化数量和因此解释了类似的非限 制性的电子源。

对1O2的化学电位作了更广的考虑。从先前的报道中可以清楚地推断 出在抗体介导的机制中存在分子氧的高能态的参与(Wentworth等，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，10930(2000))。简言之，抗体介导的光致产生 H2O2速率在D2O中提高了并且在1O2猝灭剂叠氮化纳存在的情况下降低 了。此外，抗体还表现出通过使3O2在可见光下对血卟啉IX敏化，并且 在黑暗中对内过氧化物3N，3N-(1，4-亚萘基)二丙酸二钠(一种化学1O2源) 敏化而产生H2O2。1O2的参与还与抗体介导的H2O2产生的作用光谱和抗 体成分色氨酸的吸收光谱的紧密相似性相一致(图10)。

考虑到1O2的已知化学作用使其具有作为超-亲电子试剂“二噁乙烯” 的化学作用的概念(Foote，Acc.Chem.Res.，1，104(1968)，迄今未知的可能 性认为是：在抗体存在的情况下，水分子能作为亲核试剂加到1O2上并且 形成作为中间体的H2O3。因此，正在变成被氧化至H2O2的水能够实现电 子源的作用。

为了验证通过1O2抗体催化H2O的光氧化的假设，进行了通过确定 H2O2中氧的来源的氧同位素实验。使用经过修改的标准H2O2检测方法 (Han等，Anal.Biochem.，234，107(1996))测定了H2O2中16O/18O的含量。 简单的说，这种方法包括用三羟乙基膦(TCEP)的还原，然后对相应的 氧化膦用质谱(MS)分析(图12)。

这些实验显示抗体的UV照射，在氧存在时，导致在从水到H2O2的过 程中有氧的掺入(图12A和12B)。在H218O(98％18O)磷酸盐缓冲液(PB) 中16O2浓度饱和的条件下，绵羊poly-IgG被照射后，在氧化膦的MS分 析中所观察到16O/18O比率的相对丰度是2.2±0.2∶1(图12A)。当用H216O PB中18O富含的分子氧混合物(90％18O)进行反向的实验时，观察到了相 反的比率(1∶2.0±0.2)(图12B)。这些比率的数值呈现出很好的可重复 性(+10％，n＝10)并且发现于所研究的所有抗体中。

开展了下述的对照实验。首先，在16O2和H216O的条件下，照射 poly-IgG(马)产生H216O2(图12C)。当将H216O2(400μM于PB，pH 7.0) 自身在H218O中照射4小时后没有18O的掺入。这种结果减轻了顾虑，即 18O掺入到H2O2中可能通过酸催化的与水的交换而发生或者通过一种涉及 H216O2的均裂和与来源于水的H18O·的重组的机制而发生。为了检查抗体 能够催化H216O2产生和催化其与H218O发生酸催化交换的可能性，观察了 在惰性气体中UV照射后的在绵羊poly-IgG(6.7μM)存在的情况下H216O2 (200μM)在H216O2(98％18O)PB中的同位素交换。观察到只有微量的18O 掺入到H216O2中(图12D)。

对β-半乳糖苷酶(在产生H2O2方面最有效的非免疫球蛋白蛋白质) 和3-甲基吲哚也进行了同位素实验。在该两种情况下，光氧化导致了18O 以可以忽略不计的量掺入到H2O2中(图12E和12F)，说明在该蛋白质 中吲哚环自身和色氨酸残基仅作为1O2的还原剂起作用的观点。

这种观点通过观察进一步得到支持，观察发现照射3-甲基吲哚产生不 包括从H218O而来的氧掺入的H2O2。用色氨酸进行的相同实验的确发生了 以16O/18O比率为1.2∶1的交换。这种结果被认为是由于铵作为分子内广义 酸起作用，质子化3′-氢过氧化物的非对映混合物的内部氧。应该注意虽然 从化学的观点看是它是有趣的，但它不能解释通过抗体的催化产生H2O2， 因为它是一个化学当量的过程并且蛋白质中的Trp残基不含有游离铵基。

化学机制.所研究的所有抗体能够通过单线态氧催化水的氧化。对于通 过1O2进行H2O的氧化过程中反应物和产物的热力学平衡(反应热，ΔHr＝+ 28.1kcal/mol)(D.R.Lide，在化学和物理学手册，第73版，(CRC，1992)) 需要化学计算，其中在其转化入两个H2O2分子的过程中，一个以上的1O2 分子将不得不参加到每个氧化的水分子中。化学计算假定在涉及从三氧产 生单氧之间没有其它光能参与该过程。对假想机械途径的定量化学推理和 热力学考虑一起使得有可能如用方程1b或者c进行全部化学计算(全部能 量是从气相实验生成热计算得到的并报道为kcal/mol)：

1O2+2H2O→2H2O2；          ΔHro＝28.1   (1a)

21O2+2H2O→2H2O2+3O2；     ΔHro＝5.6    (1b)

31O2+2H2O→2H2O2+23O2；    ΔHro＝-16.9  (1c)

最近关于通过碲-介导的氧化还原过程进行金属催化1O2和水转化成过 氧化氢的过渡态的报道(Detty和Gibson，J.Am.Chem.Soc.，112，4086 (1990))，为1O2和H2O能够被转化为H2O2的过程提供了实验证据并且， 因此能够克服该过程的能量需求。认为抗体-介导的光氧化过程机理涉及将 一分子水加成到一分子1O2形成三氧化二氢作为H2O2形成途径中第一个中 间体。抗体作为催化剂的功能将不得不提供特殊分子环境，该环境将稳定 有关其可逆形成的关键中间体并且，或者，将通过多渠道化其转化为H2O2 加速中间体的消耗。此种环境的基本特征可以包括在由抗体特异性环境所 提供的活化部位所组成的水分子的特殊相互影响因素。

由于H2O3在生物系统中还未检测到，其在体内的化学作用相当程度 上来自推测，并且其体外特性已经成为大量实验和理论处理的论题(C. Deby，La Recherche，228，378(1991)；Sawyer，氧化学(Oxford University Press，Oxford，1991)；Cerkovnik和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，115， 12169(1993)；Vincent和Hillier，J.Phys.Chem.，99，3109(1995)；Plesnicar 等，Chem.Eur.J.，6，809(2000)；Corey等，J.Am.Chem.Soc.，108，2472 (1986)；Koller和Plesnicar，J.Am.Chem.Soc.，118，2470(1996)；Cacace 等，Science，285，81(1999))。Plesnicar和其共同研究者们已经表明H2O3(从 臭氧还原产生的)分解为H2O和1O2(Koller和Plesnicar，J.Am.Chem. Soc.，118，2470(1996))。应用微观可逆性的原则，推测逆向反应将也是由一 个或多个水分子所催化的。为了描绘此过程似乎合理的反应途径和能量学， 如此处所述首先使用了量子化学(QC)方法原理(B3LYP密度功能理论)。结 果说明于方程式2a-c(全部能量报道为kcal/mol)：

H2O+1O2    →TS    →H2O3        (2a)

0.0          69.5    15.5

2H2O+1O2   →TS    →H2O3+H2O    (2b)

0.0          31.5    15.5

3H2O+1O2   →TS    →H2O3+2H2O   (2c)

0.0          15.5    15.5

水和1O2产生H2O3的直接反应是非常不利的，它具有70kcal/mol的 激活势垒(方程式2a)。然而，随着加入第二或第三个水分子，发现一个协 调的过程分别将激活势垒降低至31.5和15.5kcal/mol。事实上这些加入的 水确实具有催化剂的作用(在方程式2b中第2个水的H进入产物HOOOH， 同时用第一个水的H代替它)。与水的第一个HO键能(119kcal/mol)和1O2 的键能(96kcal/mol)相比，这些势垒是小的。注意到方程式2b和方程式2c 中的逆反应分别仅具有15.5或0kcal/mol的势垒，表明大体积水和富含水 的系统中H2O3是不稳定的。因此，对于产生和利用H2O3的抗体结构内最 佳位点预期是位于紧靠没有此种水的疏水区的、其中定位有水和水二聚体 的位点。

来源于抗体催化的水光氧化的氧化膦内的16O/18O比率明显地限制反 应过程的选择，通过该过程这种初级中间物H2O3将被转化成终产物H2O2。 对化学上参与从2摩尔H2O产生2摩尔H2O2并通过此种过程的机理细节 的1O2的分子的数量来初步测定比率。2.2∶1的比率准确地符合从特定机制 中预测的值，在该机制中两分子1O2和两分子H2O被转化成两分子H2O2 和一分子的分子氧(由于热力学反应其也许是3O2)。此种机制的例子是 两分子H2O3到H2O4和H2O2的SN2类型的歧化反应，然后是前者分解成 H2O2和3O2。使用量子化学方法(B3LYP密度功能理论)在系统方法中解决 了复杂的问题，该复杂问题就是对于有或没有1O2参与的从H2O3到H2O2 的转化的理论可行反应途径的限定。这些研究表明H2O3的广泛对接 (docking)计算和对于大量蛋白质其形成和转化成H2O2的过渡态。的确 在抗体(和αβ-T细胞受体)的区域中一个具有分离的水并接近疏水区的区 域内存在一个稳定该种种类的独特位点。这种广泛的研究表明对于从H2O3 到H2O2的转化的理论可行化学途径的整个范围的潜在存在。

结合到抗体的氙的结构研究.对于抗体，不论是起源或抗原特异性， 或αβ-TCR介导此种反应的保守能力，开展了X-射线结构研究以寻找这 些免疫球蛋白折叠蛋白质内的可能的保守反应位点。对于潜在位点的关键 性限制是分子氧(1O2或者三线态氧，具有接近的潜在敏化残基，优选的 是色氨酸)和水必须是能够共定位的并且沿着该途径过渡态和中间物在该 位点内或其附近必须是稳定的。

有强有力的证据支持Xe和O2共定位于蛋白质内相同空穴内的观点 (Tilson等，J.Mol.Biol.，199，195(1988)；Schoenborn等，Nature，207，28 (1965))。因此，氙气用作重原子示踪物以定位鼠单克隆抗体4C6内可能易 于进入分子氧的空穴(Li等，J.Am.Chem.Soc.，117，3308(1995))。

已鉴定了三个氙位点(图13A)，并且如在蛋白质中其它氙-结合位点内 所观察到的一样全部占据疏水空穴(Scott和Gibson，Biochemistry，36， 11909(1997)；Prangé等，蛋白质：结构、功能和遗传学，30，61(1998))。 精细的天然结构和氙-衍生结构的重叠显示除了加入氙以外，在蛋白质骨架 或构想侧链内或者结合水分子的位点内几乎不具有可以辨别的改变。

在这里已经更加详细地分析了氙I结合位点(Xe1位点)，因为在所有抗 体和αβTCR内它都是保守的(图13B)。Xe1位于离不变Trp距离为7的 VL的β-片层之间高度保守区的中间。Xe1位点夹在两个β-片层之间，包含 VL的免疫球蛋白折叠，大约距离外部分子表面5Xe1位点2(Xe2)位于 抗原结合袋的基底处，正好在几个高度保守的残基上面，这在抗体的重链 和轻链之间形成了结构上保守的界面(图13A)。VL VH界面内的残基主要是 疏水的并且包括保守的芳香族侧链，例如TrpH109。

Fab 4C6中用于Xe1的接触侧链是AlaLl9、IleL21、LeuL73和IleL75，它 们是所有抗体中高度保守的脂肪族侧链(Kabat等，免疫相关的蛋白质的序 列分析(美国卫生和人类服务部，Public Health Service，NIH，第5版， 1991))。因此，在全部所检测抗体的该区域内仅观察到轻微的结构改变。 值得注意的是，几个其它高度保守且不变的残基位于该氙位点紧密相邻的 位置，包括TrpL35、PheL62、TyrL86、LeuL104，以及CysL23和CysL88之间 的二硫键。TrpL35堆叠抵抗二硫键并距氙原子仅7在该结构中，由于 TrpL35是Xe1最靠近的Trp，TrpL35可以是假定的分子氧敏化剂。将2Cαβ TCR结构与全部可获得的TCR结构进行比较表明该Xe1疏水袋在TCR 中也是高度保守的(图5B)(Garcia，Science，274，209(1996))。

人β2-微球蛋白，其不产生H2O2，不具有限定抗体Xe1结合袋的相同 精细结构特征，尽管其总体上的免疫球蛋白折叠。同样，β2-微球蛋白不含 有在抗体和TCR中都存在的保守的Trp残基。如果TrpL35(抗体)或Trpα34 (TCR)是氧敏化剂，在β2-微球蛋白中缺乏相应的Trp可以与其不催化水的 氧化反应的发现相关。

因此，氙实验已经鉴定了至少一个既易进入分子氧也位于不变Trp附 近的保守区(VL)内的位点；一个等同的保守位点也可能位于VH折叠内。在 VH结构域内通过使VL与VH相关的假性2折叠旋转轴几乎可以精确再现 Xe1位点周围的结构和序列。尽管氙结合位点不定位于该结构域，认为分 子氧仍然能够进入相应的VH空穴内。可能还没有发现所提出的重链氙位 点，因为仅对结晶施压作用2分钟，这2分钟时间可能不足以建立完全的 平衡，或者仅仅因为与氧比较对于VH侧面上相应的空穴而言氙太大，或 者由于晶体管壳(crystal packing)。在其它抗体实验中，仅在不对称单元 的两个分子中的一个分子内发现了氙结合位点，这表明晶体管壳能够调节 Xe进入晶体。对这些位点周围的序列和结构进行的分析显示在抗体和TCR 中它们都是高度保守的，因此提供了对为什么抗体和TCR中的Ig-折叠能 够参与这种不寻常化学作用的一种可能的理解。

因其催化地将1O2转化为H2O2的能力，抗体在蛋白质中是独特的。认 为该过程参与通过H2O2产生相关事件进行杀伤。另外，抗体能够执行使 有机体抵抗1O2的功能。这将需要通过过氧化氢酶进一步将过氧化氢加工 成水和三线态氧。

实施例III：抗体的抗微生物活性

本实施例表明针对细菌的抗体能够通过产生活性氧类杀死那些细菌。

材料和方法

抗体和细胞制备

从Pierce获得绵羊(31243)和马(31127)多克隆抗体并直接使用，不进行 进一步纯化。大肠杆菌O112a，c-特异的鼠单克隆抗体(15404)从QED biosciences获得并直接使用，不进行进一步纯化。大肠杆菌非特异鼠单克 隆抗体33F12和84G3从Scripps Hybridoma实验室获得并在＞98％纯度 (基于SDS-PAGE分析)时使用。单克隆抗体33F12是催化醛醇反应的鼠单 克隆IgG。Wagner等，Science 270，1797(1995)。大肠杆菌XL1-B从 Stratagene获得。大肠杆菌O112a，c(ATCC 12804)是肠侵染性大肠杆菌， 能够感染营养不良和免疫功能不佳的个体。L.Siegfried，M.Kmetove，H. Puzova，M.Molokacova，J.Filka，J.Med.Microbiol.41，127(1994)。

以下抗体制备是通过以下方法在室内进行制备的。

大肠杆菌XL-1blue特异的兔多克隆IgG

在免疫的当天(第0天)，将新西兰白兔(2.5kg)从每只耳朵预先放血10 ml并且然后用加热杀死(65℃，15分钟)的化学感受态大肠杆菌XL-1 (OD600＝1)(650μl和350μl磷酸盐缓冲生理盐水，PBS ph 7.4)进行皮下注 射。免疫后14天(第14天)，白兔以与第一次相同的方式接受第二次注射。 免疫后28天(第28天)，白兔以与第一次和第二次注射相同的方式接受第 三次注射。在免疫后35天(第35天)，将白兔从耳朵放血50ml。在免疫后 42天(第42天)，将白兔从耳朵放血50ml。

血清允许在室温静置1-2小时，然后放置于4℃过夜并以2500-3500 转每分旋转15分钟。将上清转移至新的园底管(50ml)中并在9-10K转每 分旋转15分钟。将这些上清液转移至干净的圆锥形管(50ml)中并储存于 -10℃。然后通过ELISA(见下)测试血清，1∶1稀释于PBS并且然后滤 过0.2μM的滤器。测定血清样品的蛋白质浓度(Abs280)。然后将血清样品 装到蛋白G柱子(Amersham Gamma-Bind G，10mg蛋白质/ml珠子)上。 用3倍柱体积的PBS pH 7.4洗涤所结合的抗体并且然后2倍柱体积的醋酸 (0.1M，pH 3.0)进行洗脱。用Tris缓冲液(1M，pH 9.0)中和洗脱峰(每4ml 级分加0.5ml)并且然后透析回PBS。

大肠杆菌XL-1blue特异的鼠单克隆IgG

在第0天，129只Gix+小鼠(6-8周，每组4只)接受腹膜内注射加热杀 死(65℃，15分钟)的化学感受态大肠杆菌XL-1，溶于含50μl磷酸盐缓冲 生理盐水，PBS ph 7.4的150μl体积，OD600＝1。在第14天时，小鼠以 与第一次相同的方式接受第二次注射。在第28天时，小鼠以与第一次和第 二次注射相同的方式接受第三次注射。在第35天时，将小鼠通过眼球内穿 刺取血。

使用标准方法制备了12株XL-1 blue特异的单克隆抗体。通过硫酸铵 沉淀然后通过装入蛋白G柱子(Amersham Gamma-Bind G，10mg蛋白质 /ml珠子)纯化抗体制剂。用3倍柱体积的PBS pH 7.4洗涤所结合的抗体 并且然后2倍柱体积的醋酸(0.1M，pH 3.0)进行洗脱。用Tris缓冲液(1M， pH 9.0)中和洗脱峰(每4ml级分加0.5ml)并且然后透析回PBS。

用于确定抗体结合至活的或杀死的大肠杆菌的通用ELISA方法

读取大肠杆菌XL1-blue冷冻甘油储存液的OD600并将活细菌储存液稀 释于PBS至OD600＝1.0。将25微升一份的细菌放置于96-孔高结合 (hi-bind)ELISA板内并使其在37℃过夜干燥。轻轻用dH2O洗板两 次。用BLOTTO(50μl/孔)在室温包被板子各孔30分钟并且通过震荡去除 该包被液。然后将所测定的含抗体的样品稀释于BLOTTO并将25μl该溶 液加入每个孔。在保温盒内将板子在37℃孵育1小时，用dH2O(10x)轻 轻洗板并在每个孔中加入25μl溶于BLOTTO的第二抗体(HRP-山羊抗兔 结合物，1∶2000)。在保温盒内将板子在37℃孵育1小时并用dH2O(10x) 轻轻洗板。加入显色底物(50μl/孔)并于30分钟后在450nm读取数值。

死细菌样品也用于ELISA分析。以上述相同的方式处理样品，但在加 入并吸附于ELISA微孔板之前，将大肠杆菌加热处死(65℃，15分钟)。

杀菌试验

在典型的实验中，重复沉淀(3x 3,500转每分)大肠杆菌培养物(在对数 生长期，OD600＝0.2-0.3)并重悬于PBS(pH 7.4)。然后将PBS悬浮的细胞 加入玻璃瓶管中并冷却至4℃。加入血卟啉IX(40μM)和抗体(20μM)并 将玻璃瓶管或放置于看片灯上(可见光，2.8mW cm-2)或放置于4℃黑暗并 孵育1小时。通过琼脂板上菌落形成单位(CFU)的恢复率测定存活率。每 个试验至少重复进行两次。

显微镜研究

如下述制备样品用于电子显微镜观察。用溶于二甲砷酸盐(0.1M)的多 聚甲醛(2％w/v)、戊二醛(2.5％w/v)在0℃固定细胞1.75小时然后进行 沉淀。将细胞沉淀重悬于溶于二甲砷酸盐(0.1M)的OsO4(1％w/v)，使其 静置30分钟并且然后进行沉淀。然后连续用乙醇和环氧丙烷将沉淀脱水， 包埋于树脂并且然后进行切片。用醋酸双氧铀和柠檬酸铅将切片染色。对 于金标记研究，所用步骤如上详述并补充以下步骤。第一，将样品沉淀并 用新鲜的等渗缓冲液洗涤以去除未结合的一级抗体。第二，将样品重悬于 已经用12nm的金颗粒共价修饰的山羊抗小鼠抗体溶液中，并孵育90分 钟。

在水溶液条件下O3的分解

通过以下方法测定在所用的水溶液条件下O3的分解速率。将臭氧(通 过使氧穿过Polymetrics臭氧发生器产生)在室温使其通过石英管(1cm2) 中的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)溶液进行冒泡2分钟。然后在装备有22 ℃恒温箱架的Hitachi紫外/可见分光光度计上测定260nm(ε＝2,700M-1 cm-1)处光密度时间依赖性改变至少5个半寿期。参见Takeuchi等，Anal. Chim.Acta.230，183(1990)。然后使用Graphpad Prism V 3.0软件从OD 对时间曲线上图解确定O3的半寿期(数据为显示)。通过分光光度计限定测 定的灵敏性精确至为t＝0时OD的±0.1％(～1μM)。

臭氧测定

在典型的实验中，当存在或缺乏含有或不含过氧化氢酶(13mU/mL)的 抗体(20μM)时在透照灯(312nm，0.8mWcm-2)上室温照射石英微孔板内的 靛蓝胭脂红1(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液(终体积200μL)，重复两次。在 不同时间点取出样品(20μL)并浸入磷酸盐缓冲液(100mM，pH 3.0，180 μL)淬灭。在微孔板读值器(Spectramax)中测定610nm处的OD值。通过 LC-MS(连接到Hitachi M-8000离子收集器电喷射质谱仪上的Hitachi D-7000HPLC(阴离子检测模式))测定磺酸靛红2的产生。LC条件是 球形填料RP-C18柱子和乙腈水(30∶70)流动相流速1mL/分钟。机内分离 器用于将0.2mL/分钟柱流出物传送入MS。磺酸靛红2RT＝3.4分钟， [MH]-226。

对多种活性氧类进行测试以确定靛蓝胭脂红1是否能够通过其它活性 氧类而不是臭氧转化成为磺酸靛红2。

表2：所观察到的通过不同活性氧类的靛蓝胭脂红1a的氧化作用和18O 同位素掺入环状α-酮酰胺2b。

氧化剂  反应形成2   18O掺入2 O3c  是   是 1O2＊d  是   否 H2O3e  是   否 HO2·/O2·-f  否   -h H2O2g  否   -h HOCli  否   -h

a氧化作用是在所指定的条件下将各个氧化剂加入靛蓝胭脂红1(1 mM)的磷酸盐缓冲液(PB，pH 7.4)之前或之后通过室温在微孔板读值器内 以下610nm处吸光度的改变进行测定的。

b18O掺入是通过在每种氧化剂特定的条件下用H218O(＞95％标记的) 进行PB(100mM，pH 7.4)中的靛蓝胭脂红1氧化作用和通过阴离子电喷射 质谱测定法监测环状α-酮酰胺2的同位素谱确定的。在测定条件下已装入 α-酮酰胺2的酰胺羰基的标记物不与水发生互换。

c将靛蓝胭脂红(1，1mM)加入到臭氧(～600μM)PB(100mM，pH 7.0)溶液中。

d通过用可见光(2.7mW/cm-2)照射血卟啉IX(40μM)溶液和1(1mM) 的PB溶液1小时观察1O2＊的作用。

e参见参考文献42。

f将溶于DMSO的过氧化钾(10mM)加入1的PB(100mM，pH 7.0) 溶液中以至于最终有机共溶剂为5％。

gPB中终浓度为2mM。

h未检测。

i将靛蓝胭脂红(1，1mM)加入到NaOCl(20mM)的PBS(pH 7.4)溶 液中并且在完全漂白溶液之后通过HPLC测定环状α-酮酰胺2的形成。

初步研究揭示了，当存在紫外光(312nm，0.8mW cm-2)时环状α-酮酰 胺2内酰胺羰基氧与水发生快速和可逆的互换。然而，用白光照射时在实 验过程中不发生可辨别的互换。因此，全部18O同位素掺入试验使用血卟 啉IX(40μM)和白光(2.7mW cm-2)作为1O2＊来源而进行。

使用以下含有正常碳-碳双键的额外化学探针进行进一步研究。

3-乙烯基3          3-羧基5a         3-环氧乙烷基6a

4 乙烯基4          4-羧基5b         4-环氧乙烷基6b

通过其水溶液溶解度结合易于通过HPLC检测而指导探针3-和4-乙 烯基苯甲酸(分别为3和4)的选择。在典型的实验中，当存在或缺乏抗 体4C6或绵羊多克隆抗体(20μM)时，将3-乙烯基苯甲酸3(1mM)或4- 乙烯基苯甲酸4(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液在室温进行照射(312nm，0.8 mW/cm-2)。定时取出等份(20μL)并1∶3稀释于乙腈∶水(1∶1)。通过反相 HPLC测定产物组合物。

3-乙烯基苯甲酸3(1mM)PBS(pH 7.4)溶液的室温常规臭氧分解作用 导致苯甲醛衍生物5a的产生，同时伴有比率为～10∶1的小量相应环氧化物 6a的产生。同样，在上述相同条件下4的臭氧分解作用导致以～9∶1的比 率形成4-羧基苯甲醛5b和对应的环氧乙烷5b。在典型的实验中，在室温 将3或4(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液加入到O3PBS(600μM)溶液中并使 其静置5-10分钟。以该种方式而不是通过使O3/O2混合物穿过反应水溶液 进行3和4的臭氧分解作用以阻止3和4的进一步氧化作用，进一步氧化 会导致芳族环的羟基化作用和片段化。通过反相HPLC阐明产物混合物和 底物转化。在Hitachi D-7000机器上使用Spherisorb RP-18柱子进行HPLC 分析并且流动相为乙腈和水(0.1％TFA)(30∶70)流速为1mL/分钟。通过紫 外检测(254nm)(RT 3＝7.84分钟；RT 5a＝4.02分钟；RT 6a＝3.82分钟； RT 48.50分钟；RT 5b＝3.72分钟；RT 6b＝4.25分钟)进行定位。通过与 标准曲线比较将峰面积转化为浓度。

嗜中性粒细胞上的抗体检测

已知在嗜中性粒细胞的表面具有抗体。荧光激活细胞分选术用于测定 在静息或活化条件下每个细胞存在的免疫球蛋白分子的数量。在静息条件 下每个细胞大约有50,000个抗体分子，当活化后将增加到每个细胞大约 65,000个抗体分子。

结果

抗体的抗微生物活性

如上所说明，通过经由三氧化二氢(H2O3)中间体的过程，抗体可催化 从单线态氧(1O2＊)和水产生过氧化氢(H2O2)。该实施例中提供的结果说明抗 体能够利用该过程有效地杀死细菌。

最初的杀菌研究利用两株革兰阴性菌大肠杆菌菌株(XL1-blue和 O-112a，c)。大肠杆菌XL1-B从Stratagene获得。大肠杆菌O112a，c(ATCC 12804)是能够感染营养不良和免疫反应不佳个体的肠侵染性大肠杆菌菌 株。Siegfried等，J.Med.Microbiol.41，127(1994)。

1O2＊离子具有杀菌作用。Berthiaume等，Biotechnology 12，703(1994)。 然而，通过抗体起始H2O2产生需要暴露于底物1O2＊。Wentworth等，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)。因此，仅使用1O2＊产生系统自身 将不会杀死大肠杆菌。抗体能够利用分别由内源性或外源性敏化剂或化学 材料，使用紫外光或白光，或高温分解诸如蒽-9，10-二丙酸内过氧化物，所 产生的1O2＊。因此，仅通过实验思路例如反应效率和细胞或底物对照射的 敏感性可以指导1O2＊产生系统的选择。在这些试验中，选择血卟啉IX (HPIX，40μM)作为有效的3O2敏化剂。Wilkinson等，J.Phys.Chem.Ref. Data 22，113(1993)。当在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中在4±1℃用白 光(光通量2.7mW cm-2)照射1小时时，对于两种大肠杆菌血清型(～107个 细胞/mL)血卟啉IX具有可忽略的杀菌活性。

在典型的实验中，通过沉淀(3x 3,500转每分)细胞并将其重悬于PBS (pH 7.4)重复用PBS洗涤大肠杆菌培养物(处于对数生长期，OD600＝ 0.2-0.3)。然后将PBS重悬的细胞加入到玻璃瓶管中并冷却至4℃。加入 血卟啉IX(HPIX，40μM)和抗体(20μM)并将玻璃瓶管或放置于看片灯 (可见光，2.8mW cm-2)上或放置于黑暗4℃并孵育1小时。通过琼脂糖平 板上菌落形成单位(CFU)确定存活率。每个试验至少重复进行两次。

将单克隆抗体(20μM)加入血卟啉IX和细菌的混合物导致杀死＞95％ 的细菌(图14A)。抗体的杀菌活性是抗体浓度的函数。例如，使用10μM 抗原特异性鼠单克隆抗体15404能够获得O112a，c细胞＞95％的杀伤。这 些数据表明杀死50％细胞的有效抗体浓度(EC50)是81±6nM(图14B)。对 于针对XL1-blue大肠杆菌菌株的单克隆抗体(25D11)也观察到相似的浓度 对杀伤依赖性，观察到在大约10μM处最大杀伤为＞95％。

抗体-介导的杀菌活性作为照射时间的函数而增加(图14C)并随着增加 血卟啉IX的浓度而增加(光通量固定于2.7mW cm-2)(图14D)。抗体-介导 的细菌杀伤与血卟啉IX浓度和光照射成比例关系的观察结果表明在该过 程中1O2＊和水氧化途径都具有关键作用。关键地是，当缺乏1O2＊时，免疫 球蛋白对大肠杆菌的存活具有可忽略的影响。

对照显示冷休克和血卟啉IX毒性不影响菌落形成单位(CFU)的明显损 失。而且，共聚焦显微镜实验显示抗体介导的细菌细胞聚集也不助于抗体 处理组中CFU的缺乏。细菌细胞的荧光分析表明在血卟啉IX处理的大肠 杆菌细胞中膜相关敏化剂的量不通过抗体结合而增加。最后，由于难以排 除微量金属在抗体杀菌作用中的潜在作用，所以EDTA(2mM)的存在对所 使用的测定系统中细菌的存活没有影响。

抗体的杀菌潜能表现为一般现象。进行测试的所有12株鼠单克隆抗体 (1xκγ、7xκγ2a、3x κγ2b、1xκγ3同种型)和一株兔多克隆抗体(滴度 120,000)样品都是杀菌的。非特异抗体也能够产生杀菌剂。仅1O2＊是水氧 化途径活化所必需的-此种活化不依赖于抗体-抗原联合体。关于这方面， 研究了对大肠杆菌细胞表面抗原没有特异性的10个非特异鼠单克隆抗体、 一个非特异绵羊抗体制剂和一个马多克隆IgG样品并且全部具有杀菌活 性。观察到抗原非特异抗体的杀菌活性潜能与抗原特异性抗体非常相似。 在测定系统中一般20μM抗体(非特异)具有＞95％的杀菌性。抗体的杀 菌作用不仅仅是非特异蛋白质作用，因为在该测定系统中牛血清白蛋白 (BSA，20μM)呈现出无细菌杀伤性。

为了能够洞察所观察的细菌杀伤的特性，通过电子显微镜研究了所杀 死的细菌的形态学。金标记二级抗体用于使形态学损伤与细菌细胞壁上抗 体结合的位点相关。

杀伤与在细菌细胞壁中抗原-抗体联合体位点处孔洞的产生相关(图 15)。由呈现于细菌样品内的形态学的排列证明该过程表现为一种逐渐的 过程。在杀菌途径中具有清楚的阶段，其中氧化损伤导致细胞壁和质膜对 水的渗透性增加。

细菌处于大约30大气压的内压力下，因此膜的任意衰弱都能够导致灾 难性的破裂。该过程显示首先在细胞壁和细胞质之间的界面处观察到轻微 的破坏(图16A)，随着细胞壁从细胞质内含物清楚地分离该破坏变得更加 严重(图16B)。持续的水流入导致细菌细胞结构严重畸形和残缺(图16C)， 最终导致在抗体吸附位点处细胞壁和质膜的破裂和细胞质内含物的喷出 (图16D)。在这方面，有趣的是所观察到的由抗体-介导的杀伤所诱导的形 态学改变与当细菌被吞噬作用所破坏时所见到的改变相似。Hofman等， Infect.Immun.68，449(2000)。

杀菌剂的化学特性

如果H2O2是抗体催化的水氧化途径的最终产物(Wentworth等，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)；P.Wentworth，Jr.等，Science 293， 1806(2001))，那么仅H2O2将可作为杀伤剂。通过过氧化氢酶，该酶将H2O2 转化为水(H2O)和分子氧(O2)，提供针对非特异性抗体杀菌活性的完全保护 的观察(图17A)强化了该结论。

由非特异性抗体所产生的H2O2的量是35±5μM。由特异性抗体所产 生的H2O2的量是可变的。距离接近的问题使得直接进行溶液中H2O2与复 杂细菌膜表面上所产生的H2O2的效果之间的比较。例如，研究了过氧化 氢酶(13mU/mL)对11种大肠杆菌抗原特异性鼠单克隆抗体和11种大肠杆 菌非特异性鼠单克隆抗体的杀菌活性的保护效应。在所有具有非特异性抗 体的情况下，过氧化氢酶完全减弱了杀菌活性。然而对于抗原特异性抗体， 通过过氧化氢酶保护作用的程度依赖于所使用的单克隆抗体并且在很大范 围内变化。因此，H2O2产生(直接产生于细菌膜表面或溶液内)的距离影 响由过氧化氢酶所提供的保护的程度。因此，仅将溶液中H2O2的效应与 抗原非特异性抗体所产生的H2O2进行了比较。

在4℃使用可见光(2.7mW cm-2)照射PBS(pH 7.4)含有血卟啉IX(40 μM)的混合物1小时期间由非特异性抗体(20μM)所产生的H2O2的形成平 均速率(35±5μM/小时)是高度保守的。该平均值是从10种鼠单克隆IgG 和一种绵羊和一种马多克隆IgG(n＝12)确定的。

然而，当将H2O2对两种大肠杆菌细胞系的毒性进行定量时，由非特 异性抗体所产生的H2O2的量35±5μM单独不能够解释杀菌活性的潜能就 变得很明显了(图17B)。该数值为低于杀死50％细菌所必需的量的1到4 个数量级之间，这取决于细胞系是否分别是XL1-blue或O112a，c。

H2O2与抗体组合和/或H2O2与血卟啉IX组合并不比单独H2O2对细菌 更有毒性。对这些变量进行测定以确定在H2O2和测定中负责杀菌活性潜 能的其他成分之间是否可以发生相互作用。具体而言，对于针对大肠杆菌 O112a，c的杀菌活性测试了以下情况的组合：

1.H2O2(2mM)和非特异性抗体(20μM)；

2.H2O2(2mM)和抗原特异性抗体(20μM)；和

3.H2O2(2mM)和HPIX(40μM)。

每组使用可见光(2.7mW cm-2)4℃照射1小时。对于这些组合的任意 一项与单独H2O2(2mM)相比没有观察到杀伤的增强。

H2O2对大肠杆菌的毒性低于抗体所产生的毒性的发现使得有必要重 复检验使用过氧化氢酶的实验。一种可能性是H2O2与也由抗体所产生的 一些其它种类化学品起反应，产生其它杀菌分子并且因此，通过破坏H2O2， 过氧化氢酶可阻止其它种类化学品的形成。另一种可能性是处于形成H2O2 途径上的杀菌剂同时也是过氧化氢酶的底物。

进一步实验表明臭氧(O3)是由抗体产生的。在所使用的水溶液条件 下，臭氧是非常长寿的(t1/2＝66秒)。因此，臭氧是长寿的足以通过诸如 靛蓝胭脂红1(一种用于检测水溶液系统中O3的敏感试剂)这一化学探针 进行检测。Takeuchi等，Anal.Chem.61，619(1989)；Takeuchi等，Anal. Chim.Acta.230，183(1990)。水溶液中靛蓝胭脂红1的常规臭氧分解作用 导致靛蓝胭脂红1的特征吸光度(γmax 610nm，ε＝20,000LM-1cm-1)的褪色 (bleaching)和环状α-酮酰胺2的形成(图18A)。

为了证明臭氧是由抗体产生的，进行了以下实验。在不存在抗体时使 用紫外光(312nm，0.8mW cm-2)照射靛蓝胭脂红1的PBS(pH 7.4)溶液。没 有观察到褪色。然而，当在存在绵羊多克隆抗体(20μM)或鼠单克隆抗体 33F12(20μM)条件下进行相同实验时观察到靛蓝胭脂红1的褪色(图18B)。 电喷射质谱测定法和HPLC分析证实在该过程中形成了环状α-酮酰胺2。 照射(312nm，0.8mW cm-2)靛蓝胭脂红1(1mM)2小时后绵羊多克隆抗 体和单克隆抗体33F12分别产生4.1μM和4.9μM环状α-酮酰胺2。抗体 介导的靛蓝胭脂红1转化为环状α-酮酰胺2的最初速率是线性的，不依赖 于抗体制剂(绵羊多克隆IgG＝34.8±1.8nM/分钟，33F12＝40.5±1.5nM /分钟)(图18B)。

靛蓝胭脂红1C＝C双键的氧化断裂是臭氧检测的敏感探针。Takeuchi 等，Anal.Chem.61，619(1989)；Takeuchi等，Anal.Chim.Acta.230，183 (1990)。然而，此种断裂不是对臭氧特异的。在特定条件下进行使用表2 中列出的氧化剂的进一步实验以测试那些氧化剂是否也能够氧化靛蓝胭脂 红1。此种实验证实单线态氧(1O2)能够通过氧化性双键断裂褪色靛蓝胭脂 红1溶液形成环状α-酮酰胺2。当紫外照射时通过抗体产生1O2＊。 Wentworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，10930(2000)；Wentworth 等，Science 293，1806(2001)。因此寻找了由1O2＊氧化断裂靛蓝胭脂红1形 成环状α-酮酰胺2与由O3形成之间的分析差别。

进一步实验显示当臭氧是氧化剂时，通过观察18O掺入环状α-酮酰胺 2的内酰胺羰基能够将通过O3断裂与通过1O2＊断裂区别开来。当1O2＊是 氧化剂时，不发生此种18O掺入到环状α-酮酰胺2的内酰胺羰基内。因此 在含有磷酸盐缓冲液(PB，100mM，pH 7.4)的H218O(＞95％18O)内进行了 同位素掺入实验(表2和图19)，通过使用可见光(2.7mW cm-2)照射血卟啉 IX(40μM)产生了1O2＊。预实验确定了在18O-水中靛蓝胭脂红1和2都进 行缓慢但自发的同位素掺入到中靛蓝胭脂红1和2的酮-羰基基团，但是不 掺入到2的内酰胺羰基基团。因此，2质谱中的诊断标记是由对应18O掺 入的双同位素掺入到2的酮和内酰胺羰基基团内所产生的[M-H]-230片 段。因此，在氧化产物的质谱中，当在H218O中通过化学臭氧分解作用进 行靛蓝胭脂红1的氧化(图19B)时，而不是通过1O2＊氧化靛蓝胭脂红1(图 19C)时，观察到了质量峰[M-H]-230。参见Gorman等，于Singlet Oxygen Chemistry，205(1988)。

当存在绵羊IgG(20μM)和血卟啉IX(40μM)使用可见光(2.8mW cm-2)照射靛蓝胭脂红1(100μM)时，形成了氧化产物2且其质谱证明水的 18O交换入内酰胺羰基(图19A)。这些数据表明当存在抗体时臭氧是靛蓝胭 脂红1的氧化剂。

为了进一步证实臭氧是由抗体产生的，测试了以下额外的包含正常碳- 碳双键的化学探针。

3-乙烯基3            3-羧基5a        3-环氧乙烷基6a

4 乙烯基4            4-羧基5b        4-环氧乙烷基6b

在典型的实验中，当存在或缺乏抗体4C6或绵羊多克隆抗体(20μM) 时在室温照射(312nm，0.8mW/cm-2)3-乙烯基苯甲酸3(1mM)或4-乙烯基 苯甲酸4(1mM)的PBS(pH 7.4)溶液。定时取出等份(20μL)并1∶3稀释于 乙腈∶水(1∶1)。通过反相HPLC确定产物组合物。

当存在绵羊多克隆IgG(20μM)时使用紫外光(312nm，0.8mW cm-2) 照射化合物3和4(1mM)溶液，导致分别形成3-羧基苯甲醛5a和3-环氧 乙烷基苯甲酸6a(比率为15∶1，3小时后转化3的1.5％)和4-羧基苯甲醛 5b和4-环氧乙烷基苯甲酸6b(比率为10∶1，3小时后转化4的2％)。当 化合物3和4以常规方式进行臭氧化时也观察到这些产物。而且，这些结 果与存在绵羊多克隆抗体或鼠单克隆抗体33F12使用紫外光照射靛蓝胭 脂红1时的那些观察结果相似，其中观察到靛蓝胭脂红1的褪色(图18B)。 另外，如果不存在抗体，不能观察到褪色，但存在抗体时观察到指示臭氧 的氧化产物。

形成明显对照的是，在相似条件下由血卟啉IX(40μM)和可见光(2.7 mW cm-2)所产生的1O2＊不引起任意可检测的3或4的氧化。因此，3-乙烯 基苯甲醛3和4-乙烯基苯甲醛4对臭氧具选择性，并且臭氧必须是通过反 应中所存在的抗体产生。

由活化的嗜中性粒细胞产生臭氧的证据

嗜中性粒细胞是宿主抵抗细菌的重要部分并且已知在其细胞表面具有 抗体，而且当活化时，产生包括1O2＊在内的强氧化剂的混合物。Steinbeck 等，J.Biol.Chem.267，13425(1992)；Steinbeck et al.，J.Biol.Chem.268， 15649(1993)。因此，这些细胞提供了非光化学、生物来源的1O2＊和能够 将该底物通过水氧化途径进行加工的抗体。机体的大部分区域不能利用光 化学能量。因此，如果嗜中性粒细胞提供细胞来源的1O2，对活化后由抗 体包被的嗜中性粒细胞所释放出的氧化剂进行分析能够提供关于由此类抗 体所产生的臭氧或H2O2是否可以具有生理学相关性的指示。

如M.Markert，P.C.Andrews和B.M.Babior Methods Enzymol.105， 358(1984)所述制备人嗜中性粒细胞。肉豆蔻酸佛波酯(1μg/mL)活化后， 嗜中性粒细胞(1.5x 107个细胞/mL)产生将靛蓝胭脂红1氧化断裂成磺酸 靛红2(图19和图20B)的氧化剂。虽然次氯酸(HOCl)是已知由嗜中性粒细 胞产生的氧化剂，但PBS(pH 7.4)中NaOCl(2mM)的测试表明氧化靛蓝胭 脂红1(100μM)但不断裂靛蓝胭脂红1的双键以产生磺酸靛红2。当在18O 水中进行靛蓝胭脂红1氧化作用时，发现50％的内酰胺羰基氧由18O组成， 正如由所分离的断裂产物磺酸靛红2的质谱中[M-H]-230质谱峰的强度所 显示(图20B)。该18O掺入表明臭氧是由抗体包被的嗜中性粒细胞所产生 的。

图20A图解说明通过已经用PBS(pH 7.4)中的肉豆蔻酸佛波酯(1 μg/mL)在37℃活化的人嗜中性粒细胞(PMN，1.5x 107个细胞/mL)氧化 靛蓝胭脂红1(30μM)(＞)和形成磺酸靛红2(□)的时间过程。有意思的是， 在嗜中性粒细胞级联反应中观察到来自靛蓝胭脂红1的磺酸靛红2的几乎 50％的可能产量(潜在60μM的25.1±0.3μM)，显示了在该氧化途径中负 责该转化的氧化剂的有效浓度。

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