分枝杆菌的突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用

本发明涉及到分枝杆菌的新突变株及其在潜在抗生素载体筛选 中的应用。

分枝杆菌感染导致的问题在不断地增加。一些对化疗药物具广谱 抗性的菌株的出现更使这一问题加剧。因而，寻找新的活性物质和作 用机制势在必行。

分枝杆菌的细胞壁对化疗药物的透过率较低是限制药物抗分枝 杆菌效用的一个重要因素(Suzuki,A.E.,Inamine,J.M.:Res. Microbiol.145,1994,210-213；Jarlier,V.,Nikaido,H.:FEMS Microbiol.Lett.123,1994,11-28)。

克服这一障碍的一个概念性的方法是将抗生素同可被病原微生 物主动吸收的载体相耦联。

铁螯合试剂(铁载体)可被用于作这样的载体。在感染部位缺乏 铁离子的情况下，许多病原微生物可形成铁载体并将其分泌至外环 境。Fe3+-铁载体可通过特异的受体同细胞表面相结合，然后被依赖于 ATP的渗透酶转运进胞内。已知革兰氏阴性菌不仅可以吸收其自身产 生的铁载体，还可吸收其他种类有机体形成的铁载体(外源铁载体)。

对于分枝杆菌的摄铁系统目前所知较少(综述：Wheeler,P.R., Ratledge,C.:in Bloom,B.R.ed.:Tuberculosis,ASM Press, Washington,DC,1994)。迄今为止确认了两种类型的铁载体，即结 合与膜上的亲脂的分枝菌素(Snow,G.A.:Bacteriological Reviews 34,1970,99-125)以及胞外的疏脂的铁外螯合素(Macham,L.P.et al.:J.Gen.Microbiol.101,1977,41-49；Hall,R.,Ratledge, C.:J.Gen.Microbiol.133,1987,193-199)。耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatis)(Sharman et al.:Biochem.J.305, 1995,187-196),新金色分枝杆菌(M.neoaurum)(Sharman et al.: Chemistry & Biology 2,1995,553-561)和结核分枝杆菌(M. tuberculosis)(Gobin et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, 1995,5189-5193)所形成铁外螯合素的结构已被确认。许多种分枝菌 素的结构亦已阐明(Snow,G.A.:Bacteriol.Rev.34,1970, 99-125)。

从耻垢分枝杆菌，确定了第一个参与铁外螯合素的生物合成和可 能涉及Fe3+-铁外螯合素的吸收的基因(Fiss,E.H.et al.: Molecular Microbiology 14,1994,557-569)。有四个开放读码 框架中的三个(fxuA,fxuB,fxuC)所推测出的蛋白与大肠杆菌的一些 膜蛋白具同源性，这些大肠杆菌中的膜蛋白参与肠肝菌素的吸收。因 此，这些开放读码框架编码的蛋白估计为Fe3+-铁外螯合素渗透酶的亚 基，但迄今为止仍无证据。第四个开放读码框架(fxbA)编码一个参 与铁外螯合素的生物合成的蛋白。这已被一个生物合成突变体的互补 实验所证实。

通过铁外螯合素/分枝菌素的铁转运过程的细节仍属未知。分枝 杆菌对外源铁载体的吸收也同样所知较少。迄今为止仅仅表明耻垢分 枝杆菌可以利用不同的外源铁载体(Matzanke,B.F.et al.: BioMetals 10,1997,193-203)。是否这些外源铁载体通过特异的 摄取系统被吸收，是否它们因此是潜在的的抗生素载体，这些问题只 能通过昂贵的Mssbauer光谱法来阐明(Matzanke,B.F.:Hyperfine Interactions 112,1998,123-128)。由于这一方法需大量的底物 和非常昂贵的设备因此而不适于检测。它只限于少数几个高度专业的 实验室，且用于处理的样品只有很有限的产出。

本发明的主要目的在于提供一种非放射性的经济有效的方法用 于检测对天然或外源的铁载体以及化学类似物的吸收，这些物质可能 成为潜在的抗生素载体。

根据本发明，这一目的已经达到。这是由于一套分枝杆菌的突变 体已被生产出，各突变体分别被去除了铁外螯合素/分枝菌素转运体 系的不同组分。这套突变体构成了一个快速、经济的检测程序的基 础。

因此，本发明涉及到一种检测分枝杆菌潜在的抗生素载体的方 法。本方法的特征在于突变体中编码铁载体相关的铁摄取系统的基因 被去除活性，这些突变体被用于适当的检测程序而检出在转运过程中 不依赖铁外螯合素/分枝菌素转运体系的铁载体。

一个适于本发明的检测程序是固体培养基上的生长刺激实验。为 这个目的，突变体在缺乏铁的培养基上培养，待测的铁载体被加在培 养基上界定的区域内。在该区域内突变体生长变活跃表明是否所加物 质中的铁可被突变体利用。

令人惊奇的是，通过这一快速简单高产出的检测方法可以确认出 转运入胞过程中不依赖铁外螯合素/分枝菌素转运系统的铁载体。使 用不同的突变体，本方法可以用于检测不与铁外螯合素或分枝菌素进 行配体交换的铁载体。只有这样的铁载体才可能成为抗生素载体，因 为其他的铁载体将不能被转运入细胞。根据本发明的检测方法并不限 于固体培养基上的生长刺激实验。该实验也可在液体培养基上进行。

在本方法中，利用铁外螯合素/分枝菌素转运系统中特定单个组 分被阻断所形成的不同突变体，还可以获得在转运体系中各组分参与 外源铁载体吸收的程度的信息。迄今为止，通过以前的Mossbauer光 谱法(用Fe57)或用以检测细菌细胞的铁吸收的Fe55放射转运法还不 能获得这种信息。本发明进一步的优点是不需要放射性的或富集的稳 定同位素。

本发明的检测方法所用的分枝杆菌突变体是通过使编码铁载体 依赖的摄铁体系组分的基因失活而产生的。突变的产生使用了本领域 的几种方法之一：a)通过化学或物理突变原产生突变，b)通过基因 替换，即以一标记基因，如抗生素抗性基因替换整个或部分基因，c) 通过插入失活(插入一标记基因，如抗生素抗性基因，使之失活)或 删除失活(删除整个或部分基因使之失活)，d)综合使用以上方法。

为了使产生的突变体尽可能地包括铁外螯合素/分枝菌素转运体 系的各重要组分，了解整个Fe+-铁外螯合素摄取基因簇是十分有益 的。因此，Mycobacterium smegmatis菌株mc2155(Snapper et al.: Mol Microbiol 4,1990,1911-1919)上与fxuC相邻的染色体片断 已被克隆出来，在本发明范围内的一个新的开放读码框架(fxuD)已 被确认，它很有可能属于Fe3+-铁外螯合素摄取基因簇。图一显示的是 由四个Fe3+-铁外螯合素摄取基因组成的基因簇的限制性内切图谱，这 些基因已被确认。图二显示的是与fxuC毗邻的染色体片断的核苷酸 序列以及依此推导出的FxuD氨基酸序列。

本发明的检测方法以耻垢分枝杆菌的突变体为例说明。除此之 外，其他快速生长的分枝杆菌如草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、金色分枝杆菌(M.aurum)、 偶发分枝杆菌(M.for tuitum)或龟分枝杆菌(M.chelonae)，其 相对应突变体可类似地使用。而且，使用快速生长的分枝杆菌如牛分 枝杆菌(M.bovis)、鸟分枝杆菌(M.avium)或结核分枝杆菌(M. tuberculosis)也是可能的。

下文的耻垢分枝杆菌菌株于1998年2月4日保存于Deutsche Sammlung von Mikroorgnismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B,D-38124 Braunschweig(DSMZ)：保藏号： 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)M24(DSM 12084), 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)B1(DSM 12085)and 大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10F’pGS4(DSM 12083)。

本发明还进一步涉及到一些分枝杆菌的突变体，其特征在于参与 分枝菌素生物合成的基因失活，或/和编码铁外螯合素依赖的摄铁体 系中的组分的基因被以基因替换、删除或插入的方法去除。

在一个优选的方案中，本发明涉及到一些分枝杆菌的突变体，其 参与分枝菌素生物合成的一些基因已被失活。

在一个更优选的方案中，本发明涉及到的分枝杆菌突变体有一个 或更多选自fxbA、fxuA、fxuc和fxuD编码铁外螯合素依赖的摄铁体 系中组分的基因被除去。还可视需要除去参与分枝菌素合成的基因。

本发明特别涉及到实施例中讲述的分枝杆菌的突变体，尤其是耻 垢分杆杆菌的突变体。

联系随后的例子本发明将被非常详细的解释，以下的图用于对例 子进一步的说明：

图1：是铁外螯合素基因簇的限制性内切图

图2：显示包括有侧翼序列的fxuD基因的核苷酸序列

图3：显示fxbA的删除的构建物

图4：显示fxuA的删除的构建物

图5：是质粒pGS52的限制性内切图

图6：显示pGS41和pGS56的插入

图8：是质粒pGS57的限制性内切图

例一

耻垢分枝杆菌M24突变体的产生

为产生分枝菌素生物合成的重要功能封阻的突变体，用N- nitrosomethyl-N-硝基-胍对Mycobacterium smegmatis mc2155 (Snapper et al.:Mol Microbiol 4,1990,1911-1919)进行化 学诱变。突变体Mycobacterium smegmatis M24(DSM 12084)由于 其缺乏紫外荧光而从存活细胞中被分离出。可以通过高压液相色谱和 电喷射质谱学方法获得其缺乏分枝菌素积累的证据。铁外螯合素的生 物合成不受产生突变的影响。

例二

耻垢分枝杆菌B1和B2突变体的产生

FxbA基因以基因替换的方法删除。该过程中全基因被来自pUC4K 的卡那霉素抗性基因(Pharmacia Biotech Europe GmbH)所取代。 为达到这一目的，质粒pGS31(图3)是必需的，其构建如下：

通过PCR方法获得了染色体上紧邻M24中被删除基因的片断，即 长507bp的片断B7/8和758bp的片断B5/6。以下的寡聚核苷酸被用 作PCR的引物：

片断B7/8:CAGGATCCATTGGTAAGCCTTACC  序列号No.1

         GATCTAGAGCTGGTTCAGGGCGATG 序列号No.2

片段B5/6:ACGAATTCACACGCCAGAGAACGC  序列号No.3

         CAGGATCCTGATCTGGCAATTCCAG 序列号No.4

在这一步人工引入了限制性内切位点，这些位点可使两片断以与 其在染色体上相同的方向引入载体pUC118(Boehringer Ingelheim Bioproducts)上卡那霉素抗性基因的相邻处。这样便构建完成质粒 pGS31(图3)。

以质粒pGS31转化菌株Mycobacterium smegmatis mc2155和 M24，并使用含卡那霉素的培养基选出卡那霉素抗性转化子。这些克 隆被用以检测其铁外螯合素的生物合成能力。克隆耻垢分枝杆菌B1 (DSM12985)由mc2155菌株分离出，克隆耻垢分枝杆菌B3从M24 分离出，这些克隆均不分泌铁外螯合素。通过PCR的方法获得的证据 表明其铁外螯合素阴性表现型是基于fxbA被卡那霉素抗性基因替换 而成。这一替换是由克隆入pGS31上的染色体片断和其在染色体上的 同源序列发生同源重组而造成。

克隆B1不同于Fiss等人发表的fxbA突变体，后者是通过非特 征化的化学诱变而获得，同时，一个特定的基因替换确保了B1突变 的稳定。

例三

耻垢分枝杆菌U1突变体的产生

与例二相似，fxuA的删除是通过“基因替换”完成的。为此目的 而必需的质粒pGS22的构建如下：

通过PCR方法获得了M24中染色体上紧邻的fxuA基因的片断， 即长768bp的片断U1/5和755bp的片断U6/7。以下的寡聚核苷酸被 用作PCR的引物：

片断U1/5:ACGAATTCGAGATCCTCGGCATCAAC    序列号No.5

         CAGGATCCTGGCGCTTCCCGAAATC     序列号No.6

片断U6/7:GAGGATCCTGAAAGAACATATGACTC    序列号No.7

         TATCTAGACAAGATCGGCCGACATC     序列号No.8

在这一步人工引入了限制性内切位点，这些位点可使两片断以与 其在染色体上相同的方向引入载体pUC118(Boehringer Ingelheim Bioproducts)上卡那霉素抗性基因的相邻处。这样便构建完成质粒 pGS22(图4)。以质粒pGS22转化菌株Mycobacterium smegmatis M24，并使用相应的营养基选出卡那霉素抗性转化子。根据它的表现 型，删除突变体Mycobacterium smegmatis U1被从克隆中选出。为 此目的，用所述检测方法检测卡那霉素抗性转化子以检出生长不为铁 外螯合素所刺激的克隆。突变体U1中fuxA的删除导致其不能吸收 Fe3+-铁外螯合素。通过PCR方法，确认了造成所检出表型的原因是卡 那霉素抗性基因通过同源重组替换了fuxA。

例四

耻垢分枝杆菌U5突变体的产生

通过在基因内部整合卡那霉素抗性使fxuC基因失活。在这一步 中，通过选择使卡那霉素基因的的转录方向与fxuC相反，这样可尽 可能地避免fxuA和fxuB的极性影响。为这一目的，725bp的KpnⅠ- PstⅠ片断(图1，片断1)被亚克隆入pUC118。片断1产自pGS4， pGS4可从E.coli TOP10F’pGS4(DSM 12083)中获得。pGS4使pUC118 的一个衍生质粒，包括有片断1和2的插入片段，见图1。卡那霉素 抗性基因以相应方向克隆入BamHⅠ限制性切点内。这就形成了pGS52 (图5)。以质粒pGS52转化菌株耻垢分枝杆菌M24，并使用相应的 营养基选出卡那霉素抗性转化子。根据它的表现型，删除突变体耻垢 分枝杆菌U5被从克隆中选出。为此目的，用所述检测方法检测卡那 霉素抗性转化子以检出生长不为铁外螯合素所刺激的克隆。在这一突 变体中，染色体上的fxuC基因通过同源重组而被克隆入pGS52且被 卡那霉素抗性基因插入失活的fxuC所取代。卡那霉素抗性基因的插 入导致了突变体U5不再吸收Fe3+-外铁螯合素。整合造成该表现型的 推测为PCR所证实。

例五

耻垢分枝杆菌U7突变体的产生

为尽可能地避免fxuA、fxuB和fxuC的极性影响并免于影响 fxuD-fxuA簇的表达调控，fxuD通过删除距基因5’端69bp处的一个 325bp的片断而失活。

为这一目的，来自pGS4的一个1737bp(图1，片断2)的片断被 亚克隆入pUC118，这便形成了pGS41(图6)。用BspMⅡ切开pGS41 并重新连接而形成pGS56(图7)。将卡那霉素抗性基因克隆入pGS56 的BglⅡ位点形成了pGS57(图8)。用pGS57转化菌株M24并用相 应培养基选择出卡那霉素抗性转化子。以PCR方法选择出 Mycobacterium smegmatis插入突变体U7，其fxuD已通过同源重组 被经删除过的拷贝替换。在该突变体中，卡那霉素抗性基因被整合入 fxuD-fxuB簇启动子之前的位置。因此可排除fxu簇的表达的极性影 响。

例六

用来检测可能的抗生素载体的方法

本发明中的突变体于35～37℃下在营养琼脂(12g Oxoid No.1 培养基/升)上培养48小时，随后以极限培养基(50ml甘油、8.5gNacl/ 升，pH7.2)悬浮。悬浮的细胞密度约3×108/ml。用1.5ml的悬浮液 加入99ml的生物测试琼脂(20ml甘油、5gL-天冬酰胺/升，用双蒸 水配制；pH7.5；加入2％的alumina后，在121℃下灭菌15分钟；随 后过滤并调pH至6.8；加入12克琼脂No.1(Oxiod)，在121℃下灭 菌；接种前加入0.46μg/ml Zn2+,0.1μg/ml Mn2+,0.05mg/ml Mg2+,1μg/ml CaCl2×2H2O,0.2μg/ml Na2MoO4×2H2O,0.2μg/ml CuSO4×5H2O, 0.4μg/ml CoCl2×2H2O,0.2μg/ml和10μM ethylenediamine-di-(o- hydroxyphenyl-acetic acid))。将悬浮液加入培养皿。琼脂凝固后， 用一个被待侧底物浸透的圆形滤纸(直径5mm)置于琼脂表面。接种 后35～37℃培养两天，测量滤纸周围的生长区域。

突变体U1至U7的生长区域表明受测的外源铁载体的吸收不依赖 于任何外铁螯合素/分枝菌素转运体系中的已知组分。突变体B1的生 长区域表明了同分枝菌素的配基交换，同时突变体M24的生长区域显 示了在缺乏突变体U1的供给下同外铁螯合素的配基交换。

                              序列表 <110> Grnenthal GmbH <120>分枝杆菌的突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用 <130>Grnenthal HKI 2806 <140> <141> <160>10 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>24 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <400>1 caggatccat tggtaagcct tacc                                           24 <210>2 <211>25 <212>DNA <2l3>耻垢分枝杆菌 <400>2 gatctagagc tggttcaggg cgatg                               25 <210>3 <211>24 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <400>3 acgaattcac acgccagaga acgc                                24 <210>4 <211>25 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <400>4 caggatcctg atctggcaat tccag                               25 <210>5 <211>26 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <400>5 acgaattcga gatcctcggc atcaac                              26 <210>6 <211>25 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <400>6 caggatcctg gcgcttcccg aaatc                               25 <210>7 <211>26 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <400>7 gaggatcctg aaagaacata tgactc                              26 <210>8 <211>25 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <400>8 tatctagaca agatcggccg acatc                               25 <210>9 <211>1482 <212>DNA <213>耻垢分枝杆菌 <220> <221>CDS <222>(446)..(1480) <400>9 gatctcgtcg ggggtatcga agtgacgttg gcggatcggg attgaaccgt tttggagaac 60 cgcccctcag tggggtaatc tcgctgctcg gttgatccac tattcgggcc tatagctcag 120 gcggttagag cgcttcgctg ataacgaaga ggtcggaggt tcgagtcctc ctaggcccac 180 gacgccggtc tgccggtgat caccgaaagg gtgtgccatg cggtttgtgg tgttggctgt 240 tgtggcggct gtggcggtga tcgtctggcg atcacgacac ggccaagagg tttggcatcg 300 ggcgggttga accgacctga cagctagggc cttagctcag ttggtagaag cagctgcctt 360 tgcaaggcag atgtcaggag ttcgaatctc ctaggctcca caatcaagag aatctcccaa 420 agttggttag gttaccctca gctgt gtg agc ttc tcg tat gcg tcc gtc atc   472

                        Val Ser Phe Ser Tyr Ala Ser Val Ile

                          1               5 gag acc aag gcg ctc aac ccc cgg atg gtc cgg atc acc ctt cag gtc   520 Glu Thr Lys Ala Leu Asn Pro Arg Met Val Arg Ile Thr Leu Gln Val  10                  15                  20                  25 gag gac ccc gct tcc ctc gac gtg cag cag gcc gcc gac tcg gca gtc   568 Glu Asp Pro Ala Ser Leu Asp Val Gln Gln Ala Ala Asp Ser Ala Va1

             30                  35                   40 gcg gtc ttc atg ccc ggc acc gac gag ggc cgc aac tac tcc gta cgc   616 Ala Val Phe Met Pro Gly Thr Asp Glu Gly Arg Asn Tyr Ser Val Arg

         45                  50                  55 cgc cag cgc ggc gat ctg ctc gac ctc gac gtg gtg ctg cac gcc cgc   664 Arg Gln Arg Gly Asp Leu Leu Asp Leu Asp Val Val Leu His Ala Arg

     60                  65                  70 ggt gtg ggg acc gac tgg gcg gcg cga acc cgg ccc ggt gac cgc gtc   712 Gly Val Gly Thr Asp Trp Ala Ala Arg Thr Arg Pro Gly Asp Arg Val

 75                  80                  85 ggc ctc gac cac gca cgc tcg tgg tac cgc ccg gac ccg gcc gcg cag   760 Gly Leu Asp His Ala Arg Ser Trp Tyr Arg Pro Asp Pro Ala Ala Gln  90                  95                  100                105 tgg cag ctg ttg arc acc gac ctg tcc ggg ctg ccg gcc acc gcg cgc 808 Trp Gln Leu Leu Ile Thr Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ala Thr Ala Arg

            110                  115                120 atc ctc gaa gag gtg tct ccg gaa gtc ccc gtg acg gtg atc gcc gag 856 Ile Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Val Pro val Thr Val Ile Ala Glu

       125                  130                 135 gtc gcc gaa gcg cag gat ctc gac tac ctg ccg gcg cat ccg cag gcg 904 Val Ala Glu Ala Gln Asp Leu Asp Tyr Leu Pro Ala His Pro Gln Ala

    140                 145                 150 Cgg ttg gtc acg tcg atc ggg acg ggt aac ggc aac gcg ccg agc gaa 952 Arg Leu Val Thr Ser Ile Gly Thr Gly Asn Gly Asn Ala Pro Ser Glu

155                 160                 165 ctg gcc acg ctg gtg cgt gag ctg gcc ctg ccg cgg gat cgc ggc tac 1000 Leu Ala Thr Leu Val Arg Glu Leu Ala Leu Pro Arg Asp Arg Gly Tyr 170                 175                 180                 185 tgc tgg ttc gcg ggt gaa gcc gca gag tcg cgc gcg gtc agg aag tat 1048 Cys Trp Phe Ala Gly Glu Ala Ala Glu Ser Arg Ala Val Arg Lys Tyr

            190                 195                 200 ctc agg ggg ctg ggg tac cag aac gaa caa ctc gac atc acg ggt tac 1096 Leu Arg Gly Leu Gly Tyr Gln Asn Glu Gln Leu Asp Ile Thr Gly Tyr

        205                 210                  215 tgg agg ttc gac tcc gag acc tgg gat gcc gca ttc gct ctg gtg gaa 1144 Trp Arg phe Asp Ser Glu Thr Trp Asp Ala Ala Phe Ala Leu Val Glu

    220                 225                 230 tcg gat gtg ttg gcg gtg tac gag cgt gca ctc gcc gaa ggc aag ggg 1192 Ser Asp Val Leu Ala Val Tyr Glu Arg Ala Leu Ala Glu Gly Lys Gly

235                 240                 245 gac aaa gtg gct ttc gag gag ttc gac gag gcc tgc gag cga atc ggt 1240 Asp Lys Val Ala Phe Glu Glu Phe Asp Glu Ala Cys Glu Arg Ile Gly 250                 255                 260                 265 ctg tga tag gtg atc acg cag gca ccg ctc gca ccg ccg cgc gcc gcg 1288 Leu         Val Ile Thr Gln Ala Pro Leu Ala Pro Pro Arg Ala Ala

            270                 275                 280 cgt aac cac cgg gct gtc gga ctg gcc gtc gcg aca gtc gtt ctg gtc 1336 Arg Asn His Arg Ala Val Gly Leu Ala Val Ala Thr Val Val Leu Val

        285                 290                 295 gcg atg tgc atc gcg agc ctc gcg atc ggc acg cag aac gtc tcg ttg 1384 Ala Met Cys Ile Ala Ser Leu Ala Ile Gly Thr Gln Asn Val Ser Leu

    300                 305                 310 tcc acg gtc tgg cag gcc gtc acc gac tac cgc gac arc ggc gac cag 1432 Ser Thr Val Trp Gln Ala Val Thr Asp Tyr Arg Asp Ile Gly Asp Gln

315                 320                 325 tgg atc gtc cac gac ctg cgg atc ctc tag agt cga cct gca ggc atg 1480 Trp Ile Val His Asp Leu Arg Ile Leu     Ser Arg Pro Ala Gly Met 330                 335                 340                 345 ca                                                              1482 <210>10 <211>205 <212>PRT <213>耻垢分枝杆菌 <400>10 Ala Gln Asp Leu Asp Tyr Leu Pro Ala His Pro Gln Ala Arg Leu Val   1               5                 10                   15 Thr Ser Ile Gly Thr Gly Asn Gly Asn Ala Pro Ser Glu Leu Ala Thr

         20                  25                  30 Leu Val Arg Glu Leu Ala Leu Pro Arg Asp Arg Gly Tyr Cys Trp Phe

     35                  40                  45 Ala Gly Glu Ala Ala Glu Ser Arg Ala val Arg Lys Tyr Leu Arg Gly 

 50                  55                  60 Leu Gly Tyr Gln Asn Glu Gln Leu Asp Ile Thr Gly Tyr Trp Arg Phe  65                 70                  75                   80 Asp Ser Glu Thr Trp Asp Ala Ala Phe Ala Leu Val Glu Ser Asp Val

             85                  90                  95 Leu Ala Val Tyr Glu Arg Ala Leu Ala Glu Gly Lys Gly Asp Lys Val

        100                 105                 110 Ala Phe Glu Glu Phe Asp Glu Ala Cys Glu Arg Ile Gly Leu

    115                 120                 125 Val Ile Thr Gln Ala Pro Leu Ala Pro Pro Arg Ala Ala Arg Asn His

130                 135                 140 Arg Ala Val Gly Leu Ala Val Ala Thr Val Val Leu Val Ala Met Cys 145                 150                 155                 160 Ile Ala Ser Leu Ala Ile Gly Thr Gln Asn Val Ser Leu Ser Thr Val

            165                 170                 175 Trp Gln Ala Val Thr Asp Tyr Arg Asp Ile Gly Asp Gln Trp Ile Val

        180                 185                 190 His Asp Leu Arg Ile Leu     Ser Arg Pro Ala Gly Met

    195                 200                 205