一种结直肠癌早期肝转移动物模型及其构建方法和应用

申请号 CN201710001486.4 申请日 2017-01-03 公开(公告)号 CN106580512A 公开(公告)日 2017-04-26
申请人 哈尔滨医科大学; 发明人 姜慧杰; 闫林林; 姜昊; 徐海龙; 李鑫;
摘要 本 发明 公开了一种 结直肠癌 早期肝转移动物模型及其构建方法和应用,所述结直肠癌早期肝转移动物模型细胞悬液浓度为2.5×107/ml,经脾注入结肠癌细胞0.1ml不等,注射时间3分钟;同时采用Vetbond 3M组织 粘合剂 封闭切口,将脾脏放回原位。本发明创新地建立了高低不同转移特性的结直肠癌早期肝转移动物模型;证实了不同转移潜能癌细胞的体外核素摄取率存在差异;发现高低不同癌株及高低不同转移结节之间 生物 学特性指标表达有统计学差异;充分反映了早期肝转移瘤发生生物学特性,为早期肝转移的发现及诊断提供新方法。
权利要求

1.一种结直肠癌早期肝转移动物模型,其特征在于,所述结直肠癌早期肝转移动物模型细胞悬液浓度为2.5×107/ml,经脾注入结肠癌细胞0.1ml不等,注射时间3分钟;同时采用Vetbond 3M组织粘合剂封闭切口,将脾脏放回原位。
2.一种如权利要求1所述结直肠癌早期肝转移动物模型的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括以下步骤:
步骤一,分别选取人结直肠癌细胞株,确定细胞悬液浓度为2.5×107/ml,经脾缓慢注入结肠癌细胞0.1ml不等,注射时间3分钟;
步骤二,同时采用Vetbond 3M组织粘合剂封闭切口,将脾脏放回原位。
3.一种利用权利要求1所述结直肠癌早期肝转移动物模型的结直肠癌株多种核素摄取方法,其特征在于,所述结直肠癌株多种核素摄取方法包括:
选取高低不同转移能的Lovo,HT29,SW620,SW480,L02结直肠癌细胞,进行多种核素
18 18 18
摄取实验 F-FDG, F-FLT, F-FMISO;
细胞摄取率公式:%ID/105=(样本计数-本底计数)/总计数×100%/细胞计数;其中本底计数是指没有铺细胞的空孔非特异吸附计数,总计数是指每孔中加入的总的放射性计数。
4.如权利要求3所述的结直肠癌株多种核素摄取方法,其特征在于,所述结直肠癌株多种核素摄取方法中Lovo细胞对18F-FDG的摄取明显低于HT-29细胞,且不受总剂量的影响;而HT-29细胞随着18F-FDG剂量的增加而摄取增加,摄取率则下降,证实不同转移潜能癌细胞的体外核素摄取率存在差异。
5.一种利用权利要求1所述结直肠癌早期肝转移动物模型的结直肠癌株及肝转移瘤生物学特性对比分析方法,其特征在于,所述结直肠癌株及肝转移瘤生物学特性对比分析方法采用SABC法对生物学特性指标VEGF、CD82、HIF-1α、nm23染色分析;显微镜下观察并采集图像,分析阳性表达差异,按染色强度及阳性细胞数来计算评分;测定高、低转移潜能结直肠癌细胞的分子生物学指标的变化规律;10%甲固定早期肝转移结节及脾原位肿瘤结节,石蜡切片,HE染色观察肝转移瘤形态,免疫组化染色测定检测生物学特性指标VEGF、HIF-1α表达量的差异。
6.一种利用权利要求1所述结直肠癌早期肝转移动物模型的结直肠癌早期肝转移进行多种单一模态的影像检测方法,其特征在于,所述结直肠癌早期肝转移进行多种单一模态的影像检测方法包括:
(1)对结直肠癌肝转移的动物模型进行超声探查所用探头为L15-7io浅表探头,对肝脏异常回声记录,并测量大小后采集图像;
(2)对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型进行Micro CT增强扫描,Micro CT采用的造影剂为Fenestra LC,造影剂用量为0.4ml/20g,每次扫描采取的增强方式:注入造影剂后3小时进行扫描;
(3)对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型行磁共振肝脏横断位及冠状位扫查,扫描序列:
T2WI横断面及冠状位。
7.一种利用权利要求1所述结直肠癌早期肝转移动物模型的早期肝转移瘤发生生物学特性检测方法,其特征在于,所述早期肝转移瘤发生生物学特性检测方法包括:
对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型进行Micro PET成像;麻醉好的裸鼠模型通过尾静脉注射100μci的放射性分子探针0.2ml,俯卧位头先进的体位固定于扫描床上,于注射药物的一小时后行扫描18F-FDG,20分钟后18F-FB-NGA;均静态扫描10分钟;
扫描结束后,将扫描的图像用OSEM 3D迭代重建,迭代2次,重建后利用医学分析软件PMOD勾画感兴趣区域,并得到相应感兴趣区域上放射性物质摄取的平均值。

说明书全文

一种结直肠癌早期肝转移动物模型及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于结直肠癌技术领域,尤其涉及一种结直肠癌早期肝转移动物模型及其构建方法和应用。

背景技术

[0002] 目前结直肠癌肝转移瘤种植模型肠道梗阻发病率高、模型生存时间短、不能适应长时间实验、未能模拟肿瘤转移的全过程、不符合临床肝转移瘤的发生机制特征、诱导周期较长等缺陷

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种结直肠癌早期肝转移动物模型及其构建方法和应用,旨在解决目前结直肠癌肝转移瘤种植模型肠道梗阻发病率高、模型生存时间短、不能适应长时间实验的缺陷的问题。
[0004] 本发明是这样实现的,一种结直肠癌早期肝转移动物模型,其特征在于,所述结直肠癌早期肝转移动物模型细胞悬液浓度为2.5×107/ml,经脾注入结肠癌细胞0.1ml不等,注射时间3分钟;同时采用Vetbond 3M组织粘合剂封闭切口,将脾脏放回原位。防止切口出血及癌细胞液外溢,提高模型成活率,保证早期肝转移的模型效果,保证进一步早期肝转移转移机制的实验和临床应用研究。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种所述结直肠癌早期肝转移动物模型的构建方法,所述构建方法包括以下步骤:
[0006] 步骤一,分别选取人结直肠癌细胞株,确定细胞悬液浓度为2.5×107/ml,经脾缓慢注入结肠癌细胞0.1ml不等,注射时间3分钟;
[0007] 步骤二,同时采用Vetbond 3M组织粘合剂封闭切口,将脾脏放回原位。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述结直肠癌早期肝转移动物模型的结直肠癌株多种核素摄取方法,所述结直肠癌株多种核素摄取方法包括:
[0009] 选取高低不同转移能的Lovo,HT29,SW620,SW480,L02结直肠癌细胞,进行多种核素摄取实验18F-FDG,18F-FLT,18F-FMISO;
[0010] 细胞摄取率公式:%ID/105=(样本计数-本底计数)/总计数×100%/细胞计数;其中本底计数是指没有铺细胞的空孔非特异吸附计数,总计数是指每孔中加入的总的放射性计数。
[0011] 进一步,所述结直肠癌株多种核素摄取方法中Lovo细胞对18F-FDG的摄取明显低于HT-29细胞,且不受总剂量的影响;而HT-29细胞随着18F-FDG剂量的增加而摄取增加,摄取率则下降,证实不同转移潜能癌细胞的体外核素摄取率存在差异。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述结直肠癌早期肝转移动物模型的结直肠癌株及肝转移瘤生物学特性对比分析方法,所述结直肠癌株及肝转移瘤生物学特性对比分析方法采用SABC法对生物学特性指标VEGF、CD82、HIF-1α、nm23染色分析;显微镜下观察并采集图像,分析阳性表达差异,按染色强度及阳性细胞数来计算评分;测定高、低转移潜能结直肠癌细胞的分子生物学指标的变化规律;10%甲固定早期肝转移结节及脾原位肿瘤结节,石蜡切片,HE染色观察肝转移瘤形态,免疫组化染色测定检测生物学特性指标VEGF、HIF-1α表达量的差异。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述结直肠癌早期肝转移动物模型的结直肠癌早期肝转移进行多种单一模态的影像检测方法,所述结直肠癌早期肝转移进行多种单一模态的影像检测方法包括:
[0014] (1)对结直肠癌肝转移的动物模型进行超声探查所用探头为L15-7io浅表探头,对肝脏异常回声记录,并测量大小后采集图像;
[0015] (2)对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型进行Micro CT增强扫描,Micro CT采用的造影剂为Fenestra LC,造影剂用量为0.4ml/20g,每次扫描采取的增强方式:注入造影剂后3小时进行扫描;
[0016] (3)对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型行磁共振肝脏横断位及冠状位扫查,扫描序列:T2WI横断面及冠状位。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述结直肠癌早期肝转移动物模型的早期肝转移瘤发生生物学特性检测方法,所述早期肝转移瘤发生生物学特性检测方法包括:
[0018] 对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型进行Micro PET成像;麻醉好的裸鼠模型通过尾静脉注射100μci的放射性分子探针0.2ml,俯卧位头先进的体位固定于扫描床上,于注射药物的一小时后行扫描18F-FDG,20分钟后18F-FB-NGA;均静态扫描10分钟;
[0019] 扫描结束后,将扫描的图像用OSEM 3D迭代重建,迭代2次,重建后利用医学分析软件PMOD勾画感兴趣区域,并得到相应感兴趣区域上放射性物质摄取的平均值。
[0020] 本发明提供的结直肠癌早期肝转移动物模型及其构建方法和应用,首次对4种结直肠癌株进行高、低转移能力的筛选,分出高、低转移潜能的癌株,并且创新地建立了高低不同转移特性的结直肠癌早期肝转移动物模型;首次进行了高、低不同转移潜能的结直肠癌株的多种核素摄取实验,证实了不同转移潜能癌细胞的体外核素摄取率存在差异;首次对不同高、低转移潜能结直肠癌株及肝转移瘤生物学特性进行对比分析,发现高低不同癌株及高低不同转移结节之间生物学特性指标表达有统计学差异;首次对高、低不同转移特性的结直肠癌早期肝转移进行多种单一模态的影像研究;首次对多种PET成像进行最佳组合,充分反映了早期肝转移瘤发生生物学特性,为早期肝转移的发现及诊断提供新方法。
[0021] 本发明提供的用于多模态成像研究的结直肠癌肝转移动物模型构建方法,克服了原有结直肠癌肝转移瘤种植模型肠道梗阻发病率高、模型生存时间短、不能适应长时间实验的缺陷。本发明的目的在于克服现有技术的不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、提供一种人结肠癌细胞经脾种植通过静脉循环向肝转移的裸鼠结直肠癌肝转移模型构建方法,此种构建方法提供模拟结直肠癌肝转移在人体内的发生发展过程,获得组织病理与人肝转移瘤相似,不发生消化道梗阻,宿主存活率高、尤其是适合临床常见的超声、CT、MRI和PET等多种影像技术成像研究,而且操作简单,费用低。为临床早期肝转移的诊断提供先进的影像诊断技术。附图说明
[0022] 图1是本发明实施例提供的结直肠癌早期肝转移动物模型的构建方法流程图
[0023] 图2是本发明实施例提供的不同转移潜能癌细胞的体外核素摄取率存在差异示意图;
[0024] 图中:A:高低不同转移潜能结直肠癌细胞18F-FDG摄取率比较;B:高低不同转移潜能结直肠癌细胞18F-FMISO摄取率比较。
[0025] 图3是本发明实施例提供的采用SABC法对生物学特性指标(VEGF、CD82、HIF-1α、nm23)染色分析示意图;
[0026] 图中A:结直肠癌细胞HT29、SW480(VEGF、CD82、HIF-1α、nm23)染色图;B:结直肠癌HT29种植的肝转移结节和脾肿瘤结节的VEGF、HE及HIF-1α图像(10×10)。

具体实施方式

[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0028] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0029] 如图1所示,本发明实施例提供的结直肠癌早期肝转移动物模型的构建方法包括以下步骤:
[0030] S101:分别选取人结直肠癌细胞株,最后确定细胞悬液浓度约为2.5×107/ml,经脾缓慢注入结肠癌细胞0.1ml不等,注射时间约3分钟;
[0031] S102:同时采用Vetbond 3M组织粘合剂封闭切口,将脾脏放回原位。
[0032] 下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0033] 1、首次对4种结直肠癌株进行高、低转移能力的筛选,分出高、低转移潜能的癌株,并且创新地建立了高低不同转移特性的结直肠癌早期肝转移动物模型。为今后早期肝转移高低转移潜能判定的基础与临床试验研究奠定基础。
[0034] 将结直肠癌株迁徙细胞数由多到少排列:Lovo〉HT29,SW620〉SW480,即Lovo、SW620为高转移潜能癌细胞株,HT29、SW480为低转移潜能癌细胞株,所选结直肠癌株转移潜能有明显差别,能够反映结直肠癌株高、低转移特性,为进一步实验模型建立奠定基础。模型制作选用结直肠癌细胞株经脾种植且保留脾的方法,模型制作方法操作简单,转移成功率100%。分别选取人结直肠癌细胞株,最后确定细胞悬液浓度约为2.5×107/ml,经脾缓慢注入结肠癌细胞0.1ml不等,注射时间约3分钟。同时采用Vetbond 3M组织粘合剂封闭切口,将脾脏放回原位。种植后动物切口处恢复很快,无任何感染和切口撕开等问题。约3周后开始部分鼠内检测到肝内转移结节。同时对早期肝肿瘤进行单一CT成像方法及变化规律的总结摸索,为下一步的多模态分子影像研究奠定基础。
[0035] 2、首次进行了高、低不同转移潜能的结直肠癌株的多种核素摄取实验从细胞平对结直肠癌转移潜能高低的影像评价奠定基础,能够更好地运用影像手段在临床中达到肝转移的发现和诊断
[0036] 选取高低不同转移能力的结直肠癌细胞(Lovo,HT29,SW620,SW480,L02),进行多种核素摄取实验(18F-FDG,18F-FLT,18F-FMISO)。细胞摄取率公式:%ID/105=(样本计数-本底计数)/总计数×100%/细胞计数。其中本底计数是指没有铺细胞的空孔非特异吸附计数,总计数是指每孔中加入的总的放射性计数。实验结果:Lovo细胞对18F-FDG的摄取明显低于HT-29细胞,且不受总剂量的影响;而HT-29细胞随着18F-FDG剂量的增加而摄取增加,摄取率则下降,研究证实了不同转移潜能癌细胞的体外核素摄取率存在差异(见图2A和图2B)。
[0037] 3、首次对不同高、低转移潜能结直肠癌株及肝转移瘤生物学特性进行对比分析作为今后进一步进行早期肝转移的多模态影像技术评价的金标准,更好地运用影像技术手段达到早期肝转移的诊断和发现。
[0038] 在体外癌株HT29和SW480中,采用SABC法对生物学特性指标(VEGF、CD82、HIF-1α、nm23)染色分析(见图3A)。显微镜下观察并采集图像,分析阳性表达差异,按染色强度及阳性细胞数来计算评分。测定高、低转移潜能结直肠癌细胞的分子生物学指标的变化规律。10%甲醛固定早期肝转移结节及脾原位肿瘤结节,石蜡切片,HE染色观察肝转移瘤形态,免疫组化染色测定检测生物学特性指标(VEGF、HIF-1α)表达量的差异(见图3B)。研究结果发现高低不同癌株及高低不同转移结节之间生物学特性指标表达有统计学差异。
[0039] 4、首次对高、低不同转移特性的结直肠癌早期肝转移进行多种单一模态的影像研究为今后将多种单一模态影像技术筛选出最佳多模态影像组合方式,更准确用于早期肝转移的诊断和发现。
[0040] 4.1首选超声探查作为早期肝转移的无创检测手段
[0041] 对结直肠癌肝转移的动物模型进行超声探查(设备型号:PHILIPS HD15,荷兰philips)所用探头为L15-7io浅表探头,对肝脏异常回声记录,并测量大小后采集图像。超声检查显示,肝内见强回声结节及肿,大小不等,边界清楚,部分周边可见声晕。
[0042] 4.2应用CT扫描对早期肝转移进行检测并总结了最佳扫描检测时间点[0043] 对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型进行Micro CT增强扫描,但因造影剂的注入也造成动物模型不必要的死亡,因此,在随后实验中计划采用超声检测作为筛查手段。Micro CT采用的造影剂为Fenestra LC,造影剂用量为0.4ml/20g,每次扫描采取的增强方式:注入造影剂后1小时、3小时、4小时和24小时进行扫描,研究发现注入造影剂后3小时内的Micro CT扫描是检测早期肝转移结节的重要时间段。
[0044] 4.3通过MRI多序列成像明确发现肝转移结节的存在,并明确了扫描序列内容[0045] 对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型行磁共振肝脏横断位及冠状位扫查,Micro MRI:型号BRUKER 7.0T Biospec70/20USR。扫描序列:T2WI横断面及冠状位。MRI扫描显示,肝脏可见多发异常信号,病灶边界尚清晰,T2WI序列呈略高混杂信号。
[0046] 5、首次对多种PET成像进行最佳组合,充分反映了早期肝转移瘤发生生物学特性,为早期肝转移的发现及诊断提供新方法为临床肝转移的早期发现提供新的影像技术手段。
[0047] 对构建的结直肠癌肝转移裸鼠模型进行Micro PET(德国西门子/Inveon Dedicate)成像。麻醉好的裸鼠模型通过尾静脉注射100μci的放射性分子探针0.2ml,俯卧位头先进的体位固定于扫描床上,于注射药物的一小时后行扫描(18F-FDG),20分钟后(18F-FB-NGA)。均静态扫描10分钟,扫描结束后,将扫描的图像用OSEM 3D迭代重建,迭代2次,重建后利用医学分析软件PMOD勾画感兴趣区域(ROI),并得到相应感兴趣区域上放射性物质18 18
摄取(SUV)的平均值。Micro PET扫描显示,F-FDG PET图像可见肝脏多发高摄取区域,F-FB-NGA PET图像可见肝脏内充盈缺损。
[0048] 6、临床应用研究中应用PET/CT成像同时获得了原发病灶和肝转移病灶的分子生物学特色的分子影像信息,为临床早期肝转移的发现、诊断和疗效评价提供新的影像依据。
[0049] PET/CT对肿瘤诊断的优势就在于其一次扫描能捕获全身各脏器糖代谢的分子影像和CT影像及二者融合的信息,对结直肠癌原发灶及肝转移灶诊断全面而准确。课题组依据SUVmax值,即大于2.5判断肝内病变的良恶性,其诊断肝转移瘤的准确性可达96%以上。PET/CT在探测肝转移瘤术后的肝内复发、肝外转移灶和结直肠癌原发部位术后复发明显优于增强CT。肝转移瘤18F-FDG PET/CT显像表现为高代谢的核素浓聚灶,对比平扫CT示肝内低密度灶或平扫CT显示正常。结合基础实验研究进展,将多种反映不同转移生物学特性的显像剂进行最佳组合。
[0050] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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