재생 치아 유닛의 제조방법

재생 치아 유닛의 제조방법{Methods for manufacturing a regenerated tooth unit}

본 발명은 크기 및 형상을 제어 가능한 재생 치아 유닛의 제조방법 등에 관한 것이다.

치아는 최외층에 에나멜질, 그 내층에 상아질이라는 경조직을 가지며, 또한 그 내측에 상아질을 생산하는 상아아세포(odontoblast), 중심부에 치수(dental pulp)를 갖는 기관이다. 치아는 우식이나 치주병에 의해 상실되는 경우가 있는데, 치아의 유무는 외관이나 음식물의 미각에 크게 영향을 미치고, 또한, 건강 유지나 질 높은 생활을 유지하기 위해, 치아의 재생기술에 대한 관심이 높아져 있다.

치아는 태아기의 발생과정의 유도에 의해 형성되고, 복수의 세포종에 의해 구축된 기능 단위이다. 이 때문에, 치아는 성체 내의 조혈 줄기세포나 간엽계 줄기세포와 같은 줄기세포로부터 세포종이 발생하는 줄기세포 시스템에 의해 발생하는 것이 아니라서, 현재, 재생의료에 의해 진행되고 있는 줄기세포의 이입(줄기세포 이입요법)만으로는 치아를 재생하는 것은 불가능하다. 치아의 발생과정에서 특이적으로 발현하는 유전자를 동정하여, 치배(tooth germ)를 인위적으로 유도하는 것에 의한 치아의 재생도 검토되고 있으나, 유전자를 특정한 것만으로는 치아의 재생을 완전히 유도하는 것은 불가능하다.

이에, 최근 들어, 단리된 치배 유래의 조직이나 세포를 사용하여 치배를 재구성하고, 이것을 배양하여 치아와 치주 조직으로 되는 재생 치아 유닛을 얻고, 당해 재생 치아 유닛을 이식함으로써 구강 내에 재생 치아를 얻는 방법이 검토되고 있다.

본 발명자들은, 지금까지, 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용하여, 이들 세포 중 적어도 어느 한쪽을 치배 유래의 세포로 하고, 콜라겐 겔 등으로 되는 지지 담체의 내부에, 실질적으로 간엽계 세포로 되는 제1 세포 응집괴와, 실질적으로 상피계 세포로 되는 제2 세포 응집괴를 접촉시켜서 배치하고, 제1 및 제2 세포 응집괴를 지지 담체의 내부에서 배양함으로써, 세포의 분화가 효과적으로 유도되어, 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 재생 치배나 재생 치아 유닛을 제작할 수 있는 것을 발견하였다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).

또한, 구강 내 상피 세포나 그의 초대 배양세포를 상피계 세포로서 이용한 경우(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 양막(amnion) 유래 세포를 간엽계 세포로서 이용한 경우(예를 들면, 특허문헌 3 참조), 전능성 줄기세포를 분화 유도한 세포를 간엽계 세포로서 이용한 경우(예를 들면, 특허문헌 4 참조)에도, 동일하게 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 재생 치배나 재생 치아가 얻어지는 것을 나타내었다.

또한, 재생 치배 제작시에, 재생 치배에 포함되는 에나멜 결절의 수를 조정함으로써, 형성되는 재생 치아의 수를 제어할 수 있는 것(예를 들면, 특허문헌 5 참조)을 나타내었다.

치아는 부위나 개인차에 따라 크기나 형태가 상이하기 때문에, 재생 치배나 재생 치아 유닛을 제작할 때에는 크기나 형태를 제어하는 것이 중요하다. 특히 상실된 치아의 부위에 적합한 치아를 재생하는 경우, 상실된 치아와 동등한 크기 및 형태를 갖는 치아를 제작하지 않으면, 필요로 해지는 기능을 발휘할 수 없다.

목적하는 크기나 형상을 갖는 재생 치아의 제작방법으로서는, 치유두(dental bulb)나 상아질을 형성하는 치수 유래의 간엽계 세포와 에나멜 형성에 기여하는 상피계 세포를 포함하는 치배의 세포 혼합물을, 폴리글리콜산-폴리초산 공중합체 등으로 되는 생분해성 폴리머를 고화시킨 스캐폴드에 파종하고, 동물의 체내에 이식하여 치아를 형성하는 방법도 제안되어 있다. 이 방법에서는, 소정 형상의 스캐폴드를 사용함으로써, 치아의 형상을 제어하는 것이 시도되고 있다. 그러나, 재생 치아는, 상피 세포층과 간엽 세포층으로 되는 치배에 유래하고 있고, 치배는 상피 세포층과 간엽 세포층 간에서 일어나는 경시적인 상피·간엽 상호작용을 하면서 성장하는 바, 스캐폴드를 사용하면 충분한 세포간 상호작용이 얻어지지 않기 때문에, 스캐폴드의 사용이 바람직하지 않다는 의견도 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 또한, 스캐폴드가 분해되는 시간보다도, 치아가 형성되는 속도가 빠른 것으로부터, 스캐폴드가 섞인 치아가 형성될 가능성도 있어, 세포 배치나 치아 형상의 재현성이 반드시 높지는 않을 것이 예상된다.

그런데, 재생 치아 유닛을 제작할 때, 재생 치배를 동물의 생체 내에 이식하여 배양하는 방법도 사용된다. 생체 내에서 배양하면, 동물 세포로부터 각종 사이토카인 등의 작용을 받고, 또한 주위로부터 영양도 공급되기 때문에, 이식편이 조직학적으로 정상 조직을 형성하기 쉬워, 치아 및 치주 조직의 배양을 빠르게 하는 것도 가능하다. 생체 내의 이식으로서는, 예를 들면 신피막하 이식이 널리 사용되고 있다.

그러나, 재생 치배를, 예를 들면, 신피막하 등의 생체 내에서 배양하면, 피막의 압력이나 이식 스페이스의 관계로부터 재생 치아의 크기나 형태가 제한되는 경우가 있다. 구체적으로는, 재생 치배가 측면으로부터 압력을 받아, 치아의 교합면이 찌부러진 형상이 되기 쉽다.

또한, 생체 내에서의 배양의 경우는 치아 신장의 제어도 곤란하다. 특히, 필요로 하는 길이 이상으로 성장되어 버리면, 그대로 재생 치아를 악골(jaw bone)에 이식할 수 없다.

또한, 재생 치배를 동물의 생체 내에서 배양하는 방법의 경우는, 기계적인 자극이 적기 때문에, 치근막(periodontal ligament)의 발생과 발달이 불충분해질 것이 예측된다. 치근막은, 치근과 치조골을 잇는 기능이나, 치아로부터의 압력을 완화하는 기능, 씹는 감촉을 느끼게 하는 기능 등을 갖는 것으로, 재생 치아가 원래의 치아와 동등한 기능을 하기 위해 중요한 요소이다.

본 발명은, 재생 치배의 생체 내에서의 배양에 수반되는 문제점을 해결하는 것을 과제로 한다. 구체적으로는, 재생 치배를 생체 내에서 배양해도 압력이나 스페이스에 의해 치아의 형상이 제한되지 않으며, 또한, 치아의 신장도 제어할 수 있는 방법을 제공하는 것, 또한, 치근의 주위에 충분한 치근막이 형성되는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 치아의 결손부위가 대형인 경우에도 재생 치아의 이식을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 연구를 거듭한 결과, 재생 치배를 동물의 생체 내에서 배양할 때, 스페이서 내에 재생 치배를 배치함으로써, 당해 생체의 조직으로부터의 압력에 의한 변형을 방지할 수 있으며, 또한, 필요한 길이 이상으로 신장되지 않도록 치아의 길이를 제어할 수 있는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은, 재생 치배를 동물의 생체 내에서 배양할 때, 당해 동물의 외부로부터 기계적 자극을 부여함으로써, 치근의 주위에 치근막이 충분히 발달하는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은, 재생 치배를 동물의 생체 내에서 배양할 때, 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 정렬하고 배양함으로써, 복수의 재생 치배 내지 재생 치아를 포함하는 재생 치아 유닛을 얻을 수 있어, 분해 등을 하지 않고 그대로 치아의 대형 결손부위로 이식할 수 있는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명은, 포유동물의 생체 내에 있어서 재생 치배를 배양하는 재생 치아 유닛의 제조방법으로서, 하기 공정을 포함하며,

스페이서를 준비하는 공정,

상기 재생 치배를 상기 스페이서 내에 있어서 상기 포유동물의 생체 내에 배치하는 공정,

상기 재생 치배를 상기 포유동물의 생체 내에 있어서 배양하는 공정,

여기서,

상기 스페이서는, 상기 재생 치배가 최대 허용치 이상으로 신장되는 것을 방지 가능한 구성이며, 또한, 내부에 배치된 재생 치배가 스페이서 외부와 연통 가능한 구성인,

제조방법에 관한 것이다.

여기서, 본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 일실시태양에 있어서는, 상기 포유동물이 비인간 포유동물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 일실시태양에 있어서는, 상기 스페이서는, 또한, 상기 포유동물의 생체 내의 조직으로부터 상기 재생 치배에 과잉 압력이 가해지는 것을 방지 가능한 구성인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 일실시태양에 있어서는,

상기 재생 치배를 상기 스페이서 내에 있어서 상기 포유동물의 생체 내에 배치하는 공정은,

재생 치배의 장래 교합면이 되는 부위가 상기 스페이서의 내벽 부근에 면하도록 배치하고, 또한 장래 근첨(root apex)이 되는 부위가 상기 스페이서의 당해 내벽과는 반대방향의 보다 넓은 공간을 향하여 신장되도록 배치하는 공정인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 일실시태양에 있어서는,

상기 재생 치배를 상기 스페이서 내에 있어서 상기 포유동물의 생체 내에 배치하는 공정은, 상기 스페이서 내를 채우는 지지 담체에 의해 상기 재생 치배가 지지되도록 배치되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 일실시태양에 있어서는, 상기 재생 치배는, 실질적으로 간엽계 세포로 구성되는 제1 세포 집합체와, 실질적으로 상피 세포로 구성되는 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지 담체 내부에 배치되어 배양·유지된 것으로, 간엽계 세포와 상피 세포 중 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 재생 치배를 배양할 때, 상기 포유동물의 외부로부터 기계적 자극을 부여하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 기계적 자극은 약 20000 Hz~약 40000 Hz의 진동인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 일실시태양에 있어서는, 상기 스페이서는, 목적하는 재생 치아 유닛의 사이즈를 갖는 재생 치아 유닛을 발생시킬 수 있는 내부공간을 갖는 것인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 스페이서는 대략 통형상으로서, 그 통의 높이가 목적하는 재생 치아 유닛의 두께보다 크고, 그 통의 안지름이 재생 치아 유닛 길이의 대략 최대 허용치인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 스페이서가 원통형상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 재생 치배가 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 재생 치배가 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 포함하고, 상기 스페이서 내에 있어서 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 서로 인접시켜서 배치하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 재생 치배가 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 포함하고, 상기 스페이서 내에 있어서 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를, 각 재생 치배의 장래 교합면이 되는 부위의 중심과 장래 근첨이 되는 부위의 중심을 연결한 축선의 방향을 대략 나란히 정렬하여 배치하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 본 발명은, 포유동물의 생체 내에 있어서, 스페이서 내에 있어서 배치되고, 배양함으로써 재생 치아 유닛을 제조하기 위한 재생 치배 조성물로서, 상기 스페이서는 상기 재생 치배가 최대 허용치 이상으로 신장되는 것을 방지 가능한 구성이며, 또한, 내부에 배치된 재생 치배가 스페이서 외부와 연통 가능한 구성인 것을 특징으로 하는 재생 치배 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 재생 치배 조성물의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 재생 치배가 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 본 발명은, 포유동물의 생체 내에 있어서 재생 치배를 그 속에 넣고 배양함으로써 재생 치아 유닛을 제조하기 위한 스페이서로서, 상기 재생 치배가 최대 허용치 이상으로 신장되는 것을 방지 가능한 구성이며, 또한, 내부에 배치된 재생 치배가 스페이서 외부와 연통 가능한 구성인 것을 특징으로 하는 스페이서에 관한 것이다.

본 발명의 스페이서의 다른 일실시태양에 있어서는, 상기 스페이서의 내부에 배치된 재생 치배가, 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 본 발명은, 포유동물의 생체 내에서 재생 치배를 배양하는 공정을 포함하는 재생 치아 유닛의 제조방법으로서,

상기 재생 치배를 배양할 때, 상기 포유동물의 외부로부터 기계적 자극을 부여하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서, 상기 기계적 자극은 약 20000 Hz~약 40000 Hz의 진동인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서, 상기 재생 치배는, 실질적으로 간엽계 세포로 구성되는 제1 세포 집합체와, 실질적으로 상피 세포로 구성되는 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 지지 담체 내부에 배치되어 배양·유지된 것으로, 간엽계 세포와 상피 세포 중 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법의 다른 일실시태양에 있어서, 상기 재생 치배가 개별적으로 조제된 복수의 재생 치배를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

또한, 본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 본 발명은, 동물의 결손된 치아의 수복방법으로서,

상기 재생 치아 유닛의 제조방법으로 제조된 재생 치아 유닛을, 상기 결손부에 이식하는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 동물의 결손된 치아의 수복방법의 일실시태양에 있어서, 상기 동물이 비인간 포유동물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 동물의 결손된 치아의 수복방법의 일실시태양에 있어서, 상기 재생 치아 유닛이, 치관(tooth crown)-치근(tooth root)방향이 대략 나란히 정렬된 복수의 치아를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 본 발명은, 상기 재생 치아 유닛의 제조방법으로 제조된 재생 치아 유닛에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 본 발명은, 동물의 구강 내의 결손된 치아를 수복하기 위해 결손부에 이식하기 위한, 상기 재생 치아 유닛의 제조방법으로 제조된 재생 치아 유닛에 관한 것이다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 다른 일실시태양에 있어서, 상기 재생 치아 유닛은, 치관-치근방향이 대략 나란히 정렬된 복수의 치아를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 다른 일실시태양에 있어서, 상기 재생 치아 유닛은, 치관-치근방향이 대략 나란히 정렬된 복수의 치아를 포함하고, 치주 조직이 일체로 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 재생 치배를 동물의 생체 내에서 배양하더라도, 당해 동물의 조직 등으로부터 과잉 압력을 받지 않고, 자연스로운 모양으로 치아를 성장시킬 수 있다. 또한, 치아가 필요 이상으로 신장되는 것도 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 재생 치배를 동물의 생체 내에서 배양하더라도, 충분한 치근막 조직을 갖는 재생 치아를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 일태양에 의하면, 뼈의 대형 결손부위에 대해, 개별의 재생 치아 유닛을 하나씩 이식하지 않고, 복수의 재생 치아를 포함하는 재생 치아 유닛을 한번에 이식할 수 있다. 또한, 본 발명의 일태양에 의하면, 복수의 재생 치아의 치조골이 일체로 형성되기 때문에, 이식시 내지 이식 후에 복수의 재생 치아의 방향이 불규칙하게 분포하는 경우 없이, 일체의 치조골에 의해 강고하게 지지된 일체의 것으로서 이식할 수 있다.

도 1은 본 발명의 재생 치아 유닛 제조방법에 따라, 마우스의 신피막하에 배치한 스페이서 내에서 재생 치배의 생체 내 배양을 행하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 2는 스페이서를 사용하여 제작한 재생 치아 유닛의 마이크로 CT 화상이다.
도 3은 스페이서를 사용하지 않고 제작한 재생 치아 유닛의 마이크로 CT 화상이다.
도 4는 스페이서를 사용하여 제작한 재생 치아 유닛(제어), 스페이서 없이 제작한 재생 치아 유닛(비제어), 및 천연 치아의 치관부의 장경/단경비를, CT 화상 상에서 측정·산출한 결과를 나타낸다.
도 5는 스페이서를 사용하여 제작한 재생 치아 유닛(제어), 및 스페이서 없이 제작한 재생 치아 유닛(비제어)의 길이를 CT 화상 상에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 기계적 자극을 부여하면서 재생 치배를 생체 내 배양하여 제작한 재생 치아 유닛과, 자극을 부여하지 않고 제작한 재생 치아 유닛의 HE 염색상이다.
도 7은 기계적 자극을 부여하면서 재생 치배를 생체 내 배양하여 제작한 재생 치아 유닛과, 자극을 부여하지 않고 제작한 재생 치아 유닛의 치근막의 폭을 CT 화상 상에서 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 방법으로 제조한 재생 치아 유닛을 악골 이식한 모습을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 방법으로 제조한 재생 치아 유닛을 악골 이식한 후, 0일, 14일, 30일째의 CT 화상이다.
도 10은 본 발명의 방법으로 제조한 재생 치아 유닛을 악골 이식한 후, 30일째의 HE 염색상이다.
도 11은 스페이서 내에 재생 치배를 배치한 상태를 모식적으로 나타낸 평면도 및 측면도이다.
도 12는 스페이서 내에 복수의 재생 치배를 배치한 상태의 모식도이다.
도 13은 스페이서 내에 복수의 재생 치배를 배치한 상태의 실체 사진이다.
도 14는 신피막하 이식 60일 후의 다수 치아 재생 치아 유닛의 실체 사진이다.
도 15는 신피막하 이식 60일 후의 다수 치아 재생 치아 유닛의 CT 화상이다. (a)는 CT 외관상을 나타내고, (b) 좌측은 치열방향의 CT 단면상이며, (b) 우측은 협설방향(buccolingual direction)의 CT 단면 화상이다.
도 16은 다수 치아 재생 치아 유닛을 구강 내에 이식 후 1일째의 CT 화상이다.

본 발명의 치아의 제조방법의 제1 태양은, 포유동물의 생체 내에서, 스페이서 내에 재생 치배를 배치하여 배양하는 공정을 포함하는 재생 치아 유닛의 제조방법으로서, 스페이서는, 비인간 포유동물의 생체 내의 조직으로부터 재생 치배에 과잉 압력이 가해지는 것과, 재생 치배가 최대 허용치 이상으로 신장되는 것을 방지 가능한 구성이며, 또한, 내부에 배치된 재생 치배가 스페이서 외부와 연통 가능한 구성인 것을 특징으로 한다. 또한, 여기서, 「연통 가능」이란, 스페이서의 내부와 외부 사이에서, 스페이서를 통해, 영양물질이나 사이토카인 등의 물질이 빠져나가기 가능한 것, 즉, 물질의 공급로를 갖는 것을 말한다.

본 발명에 있어서, 「치아(tooth)」란, 내측에 상아질 및 외측에 에나멜질의 층을 연속해서 구비한 조직을 말하고, 치관이나 치근을 갖는 방향성을 구비한 조직을 의미한다. 치아의 방향성은 치관이나 치근의 배치에 의해 특정할 수 있다. 치관이나 치근은, 형상이나 조직 염색 등을 토대로 육안으로 확인할 수 있다. 치관이란, 에나멜질과 상아질의 층구조를 갖는 부분을 말하고, 치근에는 에나멜질의 층은 존재하지 않는다.

상아질 및 에나멜질은, 당업자가 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하게 특정할 수 있다. 또한, 에나멜질은, 에나멜아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 에나멜아세포의 존재는, 아멜로게닌(amelogenin)의 유무에 의해 확인할 수 있다. 한편, 상아질은 상아아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 상아아세포의 존재는, 덴틴 시알로프로테인(dentin sialoprotein)의 유무에 의해 확인할 수 있다. 아멜로게닌 및 덴틴 시알로프로테인의 확인은, 이 분야에서 주지의 방법에 의해 용이하게 실시할 수 있고, 예를 들면, 인 시튜(in situ) 하이브리다이제이션, 항체 염색 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「치배(tooth germ)」란, 장래 치아가 되는 것이 결정된 치아의 초기 배로, 치아의 발생 스테이지에서 일반적으로 사용되는 뇌상기(bud stage)부터 종상기(bell stage)까지의 단계의 것을 가리키고, 특히 치아의 경조직으로서의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 확인되지 않는 조직이다. 한편, 본 명세서에 있어서 「치아의 싹(tooth bud)」이란, 「치배」의 단계보다 나중의 조직을 가리키고, 치아의 경조직의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 시작된 단계부터, 치아가 치육으로부터 돋기 시작하여 일반적으로 치아로서의 기능을 발현하기 전 단계의 조직을 말한다.

본 명세서에 있어서「재생 치배」란, 세포배양기술에 의해 인공적으로 형성한 치배를 말한다.

본 명세서에 있어서 「재생 치아 유닛」이란, 재생 치배를 배양하고, 재생 치배에 포함되는 각종 세포를 분화시킨 결과 얻어지는, 치아와 치아를 지지하는 치주 조직으로 되는 유닛을 말한다.

재생 치아 유닛에 있어서의 치아의 부분은, 전술한 치아의 싹부터 치아의 단계의 구성을 가지고 있다. 또한, 치주 조직은, 치근막과 치조골을 포함한다.

즉, 재생 치배를 포유동물의 생체 내에서 배양하면 재생 치아 유닛이 얻어지고, 재생 치아 유닛을 구강 내에 이식하여 생착시키거나, 또는 돋게 하고, 성장시킴으로써 재생 치아가 얻어진다.

본 명세서에 있어서, 스페이서란, 포유동물의 생체 내에서 재생 치배를 배양할 때에, 재생 치배가 필요 이상으로 신장되지 않는 것을 목적으로 하여, 재생 치배를 덮도록 배치되는 기구를 의미한다. 또한, 스페이서는, 예를 들면, 신피막하 등의 생체 내에서 배양하는 경우에 있어서는, 피막의 압력이나 생체 내의 조직으로부터 과잉 압력을 재생 치배가 받지 않도록 하는 역할을 할 수 있다. 스페이서의 형상은, 이들 목적이 달성되는 한 어떠한 형상이어도 된다.

즉, 스페이서의 형상은, 목적하는 재생 치아 유닛의 사이즈(주로, 길이와 두께)를 갖는 재생 치아 유닛을 발생시킬 수 있는 내부공간을 확보할 수 있는 것이면 된다. 재생 치아 유닛의 길이란, 재생 치아 유닛의 치아의 부분에 있어서 장래 교합면이 되는 부위부터 장래 근첨이 되는 부위까지의 길이를 말한다. 장래 근첨이 되는 부위의 주변에 치주 조직이 형성되어 있는 경우는, 그의 선단(장래 교합면이 되는 부위로부터 가장 먼 부위)까지의 거리를 의미한다. 재생 치아 유닛 길이의 대략 최대 허용치란, 포유동물의 생체 내에서 재생 치배를 배양한 후에 얻어지는 재생 치아 유닛의 길이로서 허용되는 최대값 정도를 의미한다. 당해 대략 최대 허용치는, 재생 치배가 그 후 이식되는 대상이나 부위에 따라 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 재생 치아 유닛의 두께는, 일반적으로는, 재생 치아 유닛의 치관부의 두께를 말하는데, 장래 근첨이 되는 부위의 주변에, 치주 조직이 형성되어 있는 경우에는, 치주 조직의 어느 한 부분의 두께를 말하는 경우도 있다. 인간의 치아가 그렇듯이, 치관부의 단면은, 통상, 완전한 정사각형도 직사각형도 아니고, 오히려 장경과 단경에 의해 규정된다.

종래의 지견(知見)으로부터, 재생 치배의 신장방향은 상당 정도 제어 가능하기 때문에, 스페이서 내부에 있어서, 재생 치배 조성물을 배치할 때의 재생 치배 조성물 자체의 방향이나, 스페이서 내부에 있어서의 상대적 위치를, 바람직한 신장의 방향을 의도하여, 임의로 조정할 수 있다. 따라서, 목적하는 사이즈가 얻어지도록, 재생 치배 조성물의 신장방향을 고려하여, 스페이서의 3차원의 크기를 설계할 수 있다.

일반적으로는, 스페이서의 내부공간은, 목적하는 재생 치아 유닛보다도 큰 것이어야만 한다. 바꿔말하면, 스페이서의 내부공간은, 재생 치아 유닛이 최대 허용치 이상으로 신장되는 것을 방지하는 역할을 하게 된다.

이하에 있어서, 스페이서의 형상을, 상하가 열린 원통형상(링형상)으로 하는 경우에 대해서 설명한다. 당연히, 당업자라면, 본 명세서의 개시 등에 기초하여, 목적하는 형상을 갖는 스페이서를 디자인하는 것은, 용이하게 이룰 수 있을 것이다.

이와 같은 상하가 열린 원통형상(링형상)으로 하는 경우에는, 상하의 해방부를 통해, 스페이서 외부로부터의 영양 공급로도 충분히 확보되어, 재생 치아 유닛의 형성이 가능해진다.

또한, 그러한 원통형상(링형상)의 스페이서를 사용하는 경우, 재생 치배의 신장방향을 원통 링의 가로방향(즉, 원통의 지름방향)으로 하면, 원통의 세로방향(즉, 원통의 높이)은, 목적하는 재생 치아 유닛의 교합면의 두께를 얻을 수 있게, 또한, 최대 허용치를 초과하지 않게, 설정하면 된다. 또한, 링의 안지름은, 재생 치아 유닛이 필요 이상으로 신장되는 것을 방지하기 위해, 재생 치아 유닛 길이의 대략 최대 허용치를 의도하여 설정하면 된다.

이와 같은 원통형상의 스페이서를 사용하는 경우에, 링의 지름방향을 신장방향으로 하고, 세로방향(높이방향)을 재생 치아 유닛의 치관의 폭이 되도록, 재생 치배를 배치하는 경우에는, 통의 높이는, 예를 들면, 인간의 치아를 배양하는 경우는 3-15 ㎜, 바람직하게는 5-12 ㎜로 하고, 마우스의 치아를 배양하는 경우는 0.4-2.0 ㎜, 바람직하게는 0.6-1.8 ㎜로 하며, 그의 안지름(내직경)은, 인간의 치아를 배양하는 경우는 10-30 ㎜, 바람직하게는 15-26 ㎜로 하고, 마우스의 치아를 배양하는 경우는, 0.9-2.0 ㎜, 바람직하게는 1.2-1.9 ㎜로 한다.

또한, 대략 원통형상의 스페이서를 이용하는 경우에는, 재생 치배의 장래 교합면이 되는 부위를, 스페이서의 내벽 아주 가까이에, 내벽에 면하도록 배치하고, 또한, 장래 근첨이 되는 부위를 통의 지름방향을 향하도록 배치함으로써, 재생 치배가, 생체 내의 조직으로부터 과잉 압력을 받지 않아, 재생 치배가 필요 이상으로 신장되는 것을 방지하며, 또한 외부와 연통 가능하여 물질 공급로를 확보할 수 있다.

재생 치배의 교합면은, 압력에 의해 찌부러지지 않고 자연스러운 형상으로 성장할 수 있어, 치아는 통의 직경방향으로 신장하여, 일반적으로, 반대측 벽에 도달하기 전에, 또는, 도달 후, 최대 허용치 미만의 길이에서 신장을 멈출 수 있다.

재생 치배는, 통의 수평방향으로부터의 압력을 스페이서의 벽에 의해 회피할 수 있는 동시에, 상하방향으로부터의 압력을 스페이서의 상단 및 하단에 의해 대부분 회피할 수 있다.

당업자라면, 원통형상에 한정되지 않고, 본 명세서에서 규정한 목적하는 바를 달성하기 위해, 또는, 기타, 경우에 따라서 필요로 해지는 다른 목적을 달성하기 위해, 생체 내에 있어서 재생 치아 유닛의 제조에 있어서 임의의 목적하는 형상의 스페이서를 사용할 수 있다. 예를 들면, 원통 대신에 바닥면이 타원이나 다각형인 것이나, 구형상의 것을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 스페이서는, 내부에 배치된 재생 치배가, 스페이서의 외부와 연통 가능한 구성으로 되어 있다. 재생 치배는, 포유동물의 생체 내의 조직으로부터 영양 등의 공급을 받거나, 동물세포가 생산하는 사이토카인의 작용을 받아서, 이들 물질이 스페이서 내의 재생 치배에 도달하기 위한 공급로를 확보할 필요가 있기 때문이다. 연통 가능하기 때문에, 스페이서의 형상으로서, 크고 작음, 개수를 불문하고, 물질의 공급에 족한 구멍을 형성할 수 있다. 예를 들면, 통형상과 같이 부분적으로 커다란 구멍을 갖는 것이어도 되고, 또한, 스페이서 전체에 대해서, 메시와 같이 작은 구멍을 다수 갖는 것이어도 된다. 또한, 스페이서의 재질이 물질을 투과 가능한 것이라면, 구멍이 있는 것이 아니어도 된다.

본 명세서에 있어서 포유동물이란, 생체 내에서 재생 치배를 배양할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 비인간 포유동물이어도 된다. 예를 들면, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 마우스를 들 수 있고, 바람직하게는, 돼지, 마우스이다. 또한, 치배 조직과 동일 종인 것이 특히 바람직하다. 치배 조직과 동일 종이 아닌 동물에 이식하여 배양하는 경우는, 면역부전으로 개변한 동물을 사용하는 것이 바람직하다. 생체 내 성육에 바람직한 생체 부위로서는, 동물세포의 기관이나 조직을 될 수 있는 한 정상으로 발생시키기 위해, 신피막하, 장간막, 피하 등이 바람직하다.

이식 후의 배양기간은, 이식시의 치아의 크기와 발생시키는 치아의 크기에 따라 다르나, 일반적으로 3일~400일로 할 수 있다. 예를 들면, 신피막하에 이식하는 경우, 이식하는 치배의 크기와 재생시키는 치아의 크기에 따라서도 다르나, 7일~60일 정도가 바람직하다.

스페이서의 재질은 특별히 한정되지 않고, 생체 내의 조직으로부터의 압력에 대해 충분한 경성을 갖는 것이면 되고, 예를 들면, 금, 은, 철, 동, 알루미늄, 폴리에틸렌, 수지, 치과용 레진, 치과용 시멘트 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법에서는, 스페이서 내에 재생 치배를 배치하여 배양하는 공정이, 스페이서 내를 지지 담체로 채우고, 그 지지 담체 내에 재생 치배를 배치하여 행해지는 것이 바람직하다.

지지 담체는, 내부에서 세포의 배양이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 겔상, 섬유상, 고체상의 것이 바람직하고, 이러한 지지 담체를 사용함으로써, 추가로 생체 내에서 재생 치배에 과잉 압력이 가해지는 것을 방지할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 지지 담체로서는, 예를 들면, 콜라겐, 아가로스 겔, 카르복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀매트릭스(상품명), 메비올겔(상품명), 매트리겔(상품명), 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 세포외 매트릭스 혼합물, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산/글리콜산 공중합체(PLGA) 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 적절한 경도나 유지력(retentivity)을 갖는 콜라겐, 아가로스 겔, 카르복시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 한천, 하이드로겔, 셀매트릭스, 메비올겔, 매트리겔, 세포외 매트릭스 혼합물, 엘라스틴, 피브린, 라미닌이 바람직하다.

예를 들면, 지지 담체는 액상의 것을 사용하고, 재생 치배를 배치한 후에 경화시켜도 된다. 예를 들면, 스페이서 내부를 콜라겐 용액으로 채우고, 콜라겐 용액 내에 재생 치배를 배치한 후, 37℃의 CO ₂ 인큐베이터 내에서 배양함으로써, 콜라겐을 겔화시킬 수 있다. 이어서, 재생 치배를 스페이서째 포유동물의 생체 내에 배치하여 배양을 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 태양은, 포유동물의 생체 내에서 재생 치배를 배양하는 공정을 포함하는 치아의 제조방법으로서, 재생 치배를 배양할 때, 포유동물의 외부로부터 기계적 자극을 부여하는 것을 특징으로 한다.

기계적 자극을 부여함으로써, 재생 치아 유닛에 있어서의 치근막의 형성이 촉진된다. 기계적 자극이란, 예를 들면, 진동, 압박, 마찰 등을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. 예를 들면, 음파 정도의 주파수(예를 들면, 20000 Hz~40000 Hz 정도)의 진동을 부여하는 것이 바람직하다.

전술한, 본 발명의 스페이서를 사용하는 재생 치아 유닛의 제조방법에 있어서, 재생 치배를 생체 내에서 배양할 때, 포유동물의 외부로부터 기계적 자극을 부여하는 것도 바람직하다.

다음으로, 본 발명의 방법에 사용되는 재생 치배에 대해서 설명한다.

재생 치배는 어떠한 방법으로 제작한 것이어도 되나, 예를 들면, 실질적으로 간엽계 세포로 구성되는 제1 세포 집합체와, 실질적으로 상피 세포로 구성되는 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정과, 제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제작할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 2개의 세포 집합체를 구별하기 위해, 편의상, 실질적으로 간엽계 세포로 구성되는 세포 집합체 쪽을 제1 세포 집합체라 불렀으나, 실질적으로 상피 세포로 구성되는 세포 집합체 쪽을 제1 세포 집합체라 부르는 것도 가능하여, 어느 것을 제1 세포 집합체라 부르는지 여부는 중요하지 않다.

본 발명에 있어서 「간엽계 세포」는, 간엽 조직 유래의 세포 및 그 세포를 배양하여 얻어지는 세포를 의미하고, 「상피계 세포」는, 상피 조직 유래의 세포 및 그 세포를 배양하여 얻어지는 세포를 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서 「치주 조직」이란, 치아의 주로 외층에 형성된 치조골 및 치근막을 말한다. 치조골 및 치근막은, 당업자가 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하게 특정할 수 있다.

「실질적으로 간엽계 세포로 구성되는 제1 세포 집합체와, 실질적으로 상피 세포로 구성되는 제2 세포 집합체를 밀착시켜서 배치하는 공정」은, 예를 들면, 특허문헌 1 내지 5에 기재되어 있고, 그들 각 문헌의 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

상기 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체는, 각각 실질적으로 간엽계 세포만, 또는 상피계 세포만으로 구성되어 있다. 「실질적으로 간엽계 세포만으로 구성되어 있다」는 것은, 본 발명에 있어서, 어느 한 세포 집합체가 간엽계 세포만으로 구성되어 있는 경우와 동일한 기능을 하는 것을 의미하고, 간엽계 세포로 되는 세포 이외의 것을 될 수 있는 한 포함하지 않는 상태를 말한다. 「실질적으로 상피계 세포만으로 된다」고 하는 경우도 마찬가지이다.

여기에서, 세포 집합체란, 세포가 밀착된 상태를 말하고, 조직이어도 되고, 제각각의 세포로 조제된 세포 응집괴여도 된다. 조직을 사용하면, 세포 배치나 형상이 바른 치아가 얻어지기 쉽다고 하는 이점이 있으나, 입수할 수 있는 양에 제약이 있는 경우도 있다. 세포 응집괴는, 배양세포도 사용할 수 있기 때문에, 비교적 입수하기 쉬워 바람직하다. 본 발명의 방법에 의하면, 세포 응집괴를 사용해도, 세포 배치나 형상이 바른 재생 치아를 얻을 수 있다.

세포 집합체를 구성하는 간엽계 세포 및 상피계 세포는, 적어도 어느 한쪽을 치배 유래로 한다. 이것에 의해, 생체 내에서의 세포 배치를 재현하여 특유의 구조 및 방향성을 갖는 치아를 효과적으로 형성할 수 있다. 간엽계 세포 및 상피계 세포가 모두 치배 유래인 것이 보다 바람직하다. 당해 치배는, 세포의 분화단계의 유약성(blastogenicity)과 균질성(homogenicity)의 관점에서, 뇌상기(bud stage)부터 모상기(cap stage)의 것인 것이 바람직하다.

치배 이외에 유래하는 간엽계 세포로서, 생체 내의 다른 간엽계 조직에 유래하는 세포를 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 혈액세포를 포함하지 않는 골수세포나 간엽계 세포, 더욱 바람직하게는 구강 내 간엽계 세포나 악골 내부의 골수세포, 두부 신경제세포(cephalic neural crest cell)에 유래하는 간엽계 세포, 이들 간엽계 세포로 분화 가능한 간엽계 전구세포나 그의 줄기세포 등이다. 간엽계 세포로서, 양막 유래 세포를 사용하는 예가 특허문헌 3에, 전능성 줄기세포를 분화 유도한 세포를 사용하는 예가 특허문헌 4에 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

치배 이외에 유래하는 상피계 세포로서, 생체 내의 다른 상피계 조직에 유래하는 세포를 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 피부나 구강 내의 점막이나 치육의 상피계 세포, 더욱 바람직하게는 피부나 점막 등의 분화된, 예를 들면 각화(keratinization)된, 또는 착각화(parakeratinization)된 상피계 세포로 분화 가능한 미숙한 상피계 전구세포, 예를 들면 비각화 상피계 세포나 그의 줄기세포 등이다. 구강 내 상피세포나 그의 초대 배양세포를 상피계 세포로서 사용하는 예가 특허문헌 2에 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

치배 및 다른 조직은, 포유동물의 영장류(예를 들면 인간, 원숭이 등), 유제류(ungulates)(예를 들면 돼지, 소, 말 등), 소형 포유류의 설치류(예를 들면 마우스, 랫트, 토끼 등) 외에, 개, 고양이 등 각종 동물의 악골 등으로부터 채취할 수 있다. 치배 및 조직의 채취는, 통상, 조직의 채취에서 사용되는 조건을 그대로 적용하면 되고, 무균상태에서 꺼내, 적당한 보존액에 보존하면 된다. 또한, 인간의 치배로서는, 제3 대구치, 소위 사랑니의 치배 외에, 태아 치배를 들 수 있으나, 자가 조직 이용의 관점에서, 사랑니의 치배를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 마우스의 경우, 태아령 10일~16일의 치배를 사용하는 것이 바람직하다.

치배로부터의 간엽계 세포 및 상피계 세포의 조제는, 먼저 주위의 조직으로부터 단리된 치배를, 형상에 따라, 치배 간엽 조직 및 치배 상피 조직으로 분리함으로써 행해진다. 이때, 분리를 용이하게 행하기 위해 효소를 사용해도 된다. 효소로서는, 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 세포 응집괴는, 간엽 조직 또는 상피 조직에 유래하는 세포가 응집된 것을 의미하고, 간엽 조직 또는 상피 조직을 제각각 분산시켜서 얻은 세포, 또는 당해 세포의 초대 또는 계대 배양에 의해 얻은 세포를 응집시켜서 조제할 수 있다.

세포를 분산시키기 위해서는, 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등의 효소를 사용해도 된다. 충분한 세포 수를 얻기 위해, 세포 응집괴를 조제하기 전에 분산된 세포의 초대 또는 계대 배양을 행하는 경우, 배양에 사용되는 배지로서는, 일반적으로 동물세포의 배양에 사용되는 배지, 예를 들면 둘벡코 개변 이글배지(DMEM) 등을 사용할 수 있다. 세포의 증식을 촉진하기 위한 혈청을 첨가하거나, 또는 혈청에 대체하는 것으로서, 예를 들면 FGF, EGF, PDGF 등의 세포 증식 인자나 트랜스페린 등의 기지 혈청 성분을 첨가해도 된다. 또한, 혈청을 첨가하는 경우의 농도는, 그때의 배양상태에 따라 적절히 변경할 수 있으나, 통상 10% 전후로 할 수 있다. 세포의 배양에는, 통상의 배양조건, 예를 들면 약 37℃의 온도에서 5% CO ₂ 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 또한, 적절히, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가한 것이어도 된다.

세포를 응집시키기 위해서는, 예를 들면, 세포 현탁액을 원심처리하면 된다. 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포 응집괴는, 양자를 밀착시켰을 때에 확실히 세포 상호작용하도록, 각각을 고밀도의 상태로 해두는 것이 바람직하다. 고밀도의 상태란, 조직을 구성할 때의 밀도와 동등 정도인 것을 말하고, 예를 들면, 5×10 ⁷ 개/㎖~1×10 ⁹ 개/㎖, 바람직하게는 1×10 ⁸ 개/㎖~1×10 ⁹ 개/㎖, 가장 바람직하게는 2×10 ⁸ 개/㎖~8×10 ⁸ 개/㎖이다. 세포 응집괴를 고밀도로 하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 세포를 원심처리에 의해 응집시켜 침전화하는 방법에 의해 행할 수 있다. 원심처리는 세포의 활성을 손상하지 않고 간편하게 고밀도화할 수 있기 때문에 바람직하다. 원심처리는 300×g~1200×g, 바람직하게는 500×g~1000×g의 원심력을 부여하는 회전 수로 3분간~10분간 행하면 된다. 300×g보다도 낮은 원심처리에서는, 세포밀도를 충분히 높게 할 수 없게 되는 경향이 있는 한편, 1200×g보다도 높은 원심처리에서는, 세포가 손상을 받는 경우가 있다.

원심분리에 의해 고밀도의 세포 응집괴를 조제하는 경우에는, 통상, 세포의 원심분리를 하기 위해 사용되는 튜브 등의 용기에 세포의 현탁액을 조제한 후에 원심분리를 행하고, 침전물로서의 세포를 남기고 상청을 될 수 있는 한 제거하면 된다. 이때, 목적으로 하는 세포 이외의 성분(예를 들면, 배양액, 완충액 등)은, 세포의 용량과 등량 이하인 것이 바람직하고, 목적으로 하는 세포 이외의 성분을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다. 이러한 고밀도의 세포 집합체를 후술하는 방법에 의해 지지 담체 내에서 밀착시키면, 세포가 긴밀히 접촉하여, 세포간 상호작용이 효과적으로 발휘된다.

지지 담체로서는, 전술한 스페이서 내에 배치되는 지지 담체와 동일한 것을 사용할 수 있다. 제1 및 제2 세포 집합체를 배양할 목적으로 사용되는 지지 담체는, 세포가 분산되지 않고, 세포 집합체의 밀착상태를 유지 가능한 유지력을 구비하고 있는 것이 바람직하다. 밀착된 상태란, 전술한 고밀도의 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포 집합체가, 간엽계 세포와 상피계 세포의 접촉면 부근에 있어서도 동일 정도의 높이의 밀도를 유지하고 있는 상태를 의미한다. 밀착상태를 유지 가능한 지지 담체는, 예를 들면, 콜라겐의 경우, 최종농도 2 ㎎/㎖~3 ㎎/㎖의 농도, 즉 JIS-K6503-1996에 준거한 방법(12.7 ㎜ 직경의 플런저(plunger)로 4 ㎜ 눌러내리는데 필요한 하중으로서 측정)에 의해 120 g~250 g의 젤리 강도가 되는 농도에서의 사용이 적절한 경도를 제공한다. 다른 종류의 지지 담체에 있어서도, 동일한 평가방법에 의해 동일한 강도가 있으면 본 발명의 지지 담체로서 바람직하게 사용된다. 또한 1종 또는 복수 종의 지지 담체를 혼합함으로써, 목적으로 하는 젤리 강도에 상당하는 경도의 지지 담체를 얻어도 된다.

제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체 내에 배치하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 세포 집합체가 세포 응집괴인 경우는, 예를 들면 전술한 원심분리로 얻어지는 침전물을 마이크로시린지 등으로 지지 담체 내에 삽입하여 배치할 수 있다. 세포 집합체가 조직인 경우에는, 시린지의 바늘 선단(先端) 등을 사용하여 지지 담체 내의 임의 위치에 배치할 수 있다.

본 발명에 있어서 제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체에 밀착시켜서 배치하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 한쪽의 세포 집합체를 지지 담체 내에 배치한 후, 다른 쪽의 세포 집합체를 그것에 내리누르듯이 배치함으로써, 양자를 밀착시킬 수 있다. 보다 구체적으로는, 지지 담체 내에 있어서 상기 시린지의 바늘 선단의 위치를 적절히 변경함으로써 한쪽의 세포 집합체를 다른 쪽의 세포 집합체에 내리누르는 것이 가능하다. 또한, 세포 집합체로서 상피계 조직 또는 간엽계 조직을 사용하는 경우에는, 당해 조직이 원래의 치배에 있어서 간엽계 조직 또는 상피계 조직과 접촉하고 있던 면을, 다른 쪽의 세포 집합체에 접촉하도록 배치하는 것이 바람직하다.

또한, 배치한 후에, 지지 담체를 고화하는 공정을 마련하는 것도 바람직하다. 이것에 의해, 세포가 더욱 응집되어, 보다 고밀도의 상태로 할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 겔의 경우, 배양온도하에서 수 분~수십 분간 정치함으로써 고화할 수 있다. 이때, 세포 집합체 내에 세포 이외의 성분이 적으면 적을수록, 보다 고밀도의 상태가 실현된다.

본 발명에 있어서의, 「제1 및 제2 세포 집합체를 지지 담체의 내부에서 배양하는 공정」은, 예를 들면, 특허문헌 1 내지 4 및 일본국 특허공개 제2008-29757호 공보에 기재되어 있고, 그들 각 문헌의 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

배양기간은, 지지 담체 내부에 배치된 세포 수, 세포 집합체의 상태, 배양의 조건, 동물종 등에 따라 달라, 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 구강 내에 이식했을 때 기능적인 치아로서 돋게 하기 위해서는, 1일 이상 배양하는 것이 바람직하고, 3일 이상이 보다 바람직하다.

배양기간을 길게 함으로써, 상아질 및 에나멜질의 축적, 치관의 형성, 및 치근의 형성과 같이, 재구성 치배의 형성을 보다 진행시킬 수 있다. 목적하는 상태를 얻기 위해, 예를 들면, 6일 이상, 30일 이상, 50일 이상, 100일 이상, 또는 300일 이상 배양해도 되고, 배양 도중에 배지나 배양조건을 변경하는 것도 가능하다.

지지 담체 내부에 있어서의 배양공정은, 제1 및 제2 세포 집합체를 내포하는 지지 담체를 단독으로 배양해도 되고, 다른 동물세포 등의 존재하에서 배양해도 된다.

지지 담체를 단독으로 배양하는 경우, 배양조건은, 일반적인 동물세포의 배양에 사용되는 조건으로 할 수 있다. 또한, 배양에는, 포유동물 유래의 혈청을 첨가해도 되고, 또한 이들 세포의 증식이나 분화에 유효한 것이 알려져 있는 각종 세포인자를 첨가해도 된다. 이러한 세포인자로서는 FGF, BMP 등을 들 수 있다.

세포 집합체의 가스 교환이나 영양공급의 관점, 및 다른 동물세포와의 접촉·혼입이 없고, 또한 전체 공정을 인 비트로(in vitro)로 행할 수 있다는 관점에서, 지지 담체 내부에 있어서의 배양을, 기관배양으로 하는 것이 바람직하다. 기관배양에서는, 일반적으로, 동물세포의 증식에 적합한 배지 상에 다공성의 막을 띄우고, 그 막 상에 제1 및 제2 세포 집합체를 내포하는 지지 담체를 올려놓고 배양을 행한다. 여기에서 사용되는 다공성의 막은, 0.3~5 ㎛ 정도의 구멍을 다수 갖는 것인 것이 바람직하고, 예를 들면, 셀 컬쳐 인서트(상품명)나 아이소포어 필터(상품명)를 들 수 있다.

본 발명의 치아의 제조방법에서는, 포유동물의 생체 내에 재생 치배를 배치하여 배양하기 전에, 재생 치배를 생체 외에서 전배양하는 것도 바람직하다. 전배양에 의해 세포간의 결합 및 세포간 상호작용을 보다 강고하게 할 수 있어, 그 결과, 전체의 성육기간을 단축할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 얻어지는 치아는, 내측에 상아질, 외측에 에나멜질이라는 치아 특유의 세포 배치(구조)를 갖는 것이고, 바람직하게는 치아의 선단(치관)과 치근을 바른 위치에 갖는 방향성도 구비한 것으로, 치아로서의 기능을 충분히 하는 것이다. 따라서, 치아의 대체물로서 널리 이용하는 것이 가능하다. 또한, 치아의 발생과정을 해명하기 위한 연구에 유용한 리서치 툴로서 사용하는 것도 가능하다.

또한, 배양기간을 연장함으로써, 치아 그 자체에 더하여, 치아를 악골 상에서 지지하여 고정화하는 치조골이나 치근막 등의 치주 조직도 형성시킬 수 있다. 이것에 의해, 이식 후의 치아의 실용성을 더욱 높일 수 있다. 또한, 치주 조직만을 분리하여 이용하는 것도 가능하다.

[치아 결손부의 수복방법]

본 발명의 구강 내의 치아 결손부의 수복방법은, 본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법으로 제조된 재생 치아 유닛을 결손부에 이식하는 공정을 포함한다. 본 방법에 의하면, 결손부의 크기 및 형상에 적합한 재생 치아 유닛을 제조하여 이식하는 것이 가능하다.

본 발명의 재생 치아 유닛의 제조방법에 의하면, 재생 치배를 생체 내에서 배양할 때, 치아가 생체 내에서 압력을 받아 찌부러지는 경우가 없어, 자연스러운 형상으로 성장시킬 수 있기 때문에, 결손부에 적합한 형상의 치아를 제조하기 쉽다.

또한, 결손부에 이식하기 위해서는, 결손된 치아와 동일한 길이를 갖는 재생 치아를 제작하는 것이 바람직한 바, 본 발명의 치아의 제조방법에 의하면, 치아의 길이의 최대값을 제어할 수 있다. 치아의 길이가 최대 허용치를 초과하고 있는 경우, 그 치아를 그대로 이식할 수 없으나, 최대 허용치보다 짧으면, 이식한 후에 성장시켜서 목적하는 길이의 재생 치아를 얻는 것이 가능하다.

본 발명의 구강 내의 치아 결손부의 수복방법에 있어서는, 재생 치아 유닛으로서 치아 발생의 어느 단계에 있는 것을 이식해도 된다. 이미 치관의 형성이 확인되고 있으면 치관이 구강 내측이 되도록 배치하는 것이 바람직하다. 치관의 형성이 확인되지 않는 단계의 경우에는, 치관 상당부의 상피 세포층 또는 재생 치배의 상피 세포층을 구강 내측이 되도록 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 재생 치배의 상피·간엽 세포층의 개방부분이 구강 내측과는 반대측이 되도록 배치하는 것도 바람직하다. 이것에 의해, 치아의 선단부(치관)가 구강 내측이 되어, 주위의 치아와 동일한 방향성을 부여할 수 있다.

결손부란, 발치 등에 의해 치육에 만들어진 부분을 의미하고, 형상에 특별히 제한은 없다. 재생한 치배 또는 치아를 매설 가능한 한, 결손 장소, 목적으로 하는 치아의 종류는 특별히 한정되지 않는다.

결손부는, 통상, 악골, 구강의 치조골 등에 위치한다. 또한 치아의 상실에 수반하여 치조골량이 저하되어 있는 경우에는, 결손부위에 대해 GTR법(guided tissue regeneration: 조직 재생 유도법) 등, 임플란트의 매설을 위해 임상에서 사용되는 공지의 방법에 의해 치주 조직의 재생을 촉진시키고자 해도 된다. 치배 또는 치아를 구멍부로 배치한 후에는, 통상의 처리에 따라 봉합 등을 행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구강 내의 치아 결손부의 수복방법에서는, 이식 대상을, 치아의 제조에 사용한 치배를 적출한 동물과 동종으로 하는 것이 바람직하고, 치배를 적출한 개체와 동일 개체로 하는 것이 더욱 바람직하다. 동물로서는, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하는 포유동물을 들 수 있다. 비인간 포유동물로 하는 것도 바람직하다.

본 발명의 다른 실시태양으로서는, 재생 치배로서, 복수의 재생 치배를 사용할 수 있다. 복수의 재생 치배는, 각 재생 치배가 개별적으로 조제된 재생 치배인 것이 바람직하다. 개별적으로 조제된 재생 치배란, 장래 단일 치아를 형성하도록 조제된 재생 치배를 말한다. 재생 치배의 제작방법은, 상기와 같다. 개별적으로 조제된 재생 치배란, 예를 들면 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 복수 치배를 포함하는 재생 치배를 제작한 후에 분리하는 것도 가능하다. 그러나, 일반적으로 보다 바람직하게는, 예를 들면 특허문헌 5에 있어서 기재되어 있는 바와 같이, 재생 치배에 포함되는 에나멜 결절의 수를 조절함으로써, 장래 단일의 치아를 형성하도록 조제할 수 있다. 또한, 상기 개별적으로 조제된 재생 치배는, 결손부의 크기나 재생시키는 치아의 크기에 따라, 적절히 그 크기를 조절하여 제작할 수 있다. 예를 들면, 재생 치배를 제작할 때에, 상기 간엽계 세포 집합체와 상기 상피계 세포 집합체를 접촉시켜서 배치할 때, 각각의 세포 집합체를 대략 기둥형상으로 형성할 수 있고, 그 경우에, 그 기둥의 축방향의 접촉길이를 제어함으로써, 일방향으로 목적하는 길이를 갖는 치아를 형성할 수 있다. 예를 들면, 상기 간엽계 세포 집합체와 상기 상피계 세포 집합체의 접촉길이를, 목적하는 재생 치아의 치관 폭의 ±25%로 함으로써, 당해 목적하는 길이를 갖는 재생 치아를 제작할 수 있다. 배양 결과, 목적하는 재생 치아의 크기, 형상을 구비하도록, 세포 집합체의 길이 등을 조절하여 제작할 수 있다. 상기와 같이 하여 개별적으로 조제된 재생 치배를 정렬 배치하여 배양함으로써 복수의 재생 치아를 포함하는 재생 치아 유닛을 제작한다. 재생 치배는, 장래 교합면이 되는 부위의 중심과 장래 근첨이 되는 부위의 중심을 연결한 축선의 방향을 대략 나란히 정렬하여 배치하는 것이 바람직하다. 장래 교합면이 되는 부위의 중심과 장래 근첨이 되는 부위의 중심을 연결한 축선의 방향과, 재생 치아의 치관과 치근을 연결한 축선의 방향은 대략 일치하여, 본 명세서에 있어서, 이 방향을 「치관-치근방향」이라 부르는 경우가 있다. 이 축선의 방향을 대략 나란히 정렬하여 배치함으로써, 타고난 치아와 동일하게, 치관―치근방향이 정렬된 복수의 치아를 포함하는 재생 치아 유닛을 얻을 수 있다. 또한, 복수의 재생 치배를 배치하는 경우에는, 일평면 상에 배치하는 것이 바람직하다. 일평면 상에 배치함으로써, 치열이 고른 재생 치아 유닛을 얻을 수 있다. 또한, 치열이 치경(gum)의 커브를 따라 정렬된 상태로 하고자 하는 경우에는, 평면 상이 아닌, 치경의 커브를 따른 곡면 상에 배치하는 것도 가능하다. 재생 치배를 복수 배치하는 경우, 재생 치아 내지 재생 치배의 개수는 특별히 한정되지 않고, 치아 결손부위의 형상·크기, 또는, 목적하는 재생 치아의 개수에 따라 선택할 수 있고, 바람직하게는 2~6개, 보다 바람직하게는 2~4개 배치할 수 있다.

복수의 재생 치배를 정렬 배치할 때는, 재생 치배끼리를 인접시켜서 배치하는 것이 바람직하다. 인접시켜서 배치한다는 것은, 재생 치배를 서로 접촉 또는 거의 접촉시켜서 배치하는 것을 말한다. 재생 치배끼리를 인접시켜서 배치시키면, 치열방향의 치아 사이의 극간이 없거나 또는 작은 재생 치아 유닛을 얻을 수 있다. 또한, 복수의 재생 치배를 인접시켜서 배치하고, 배양한 경우, 배양기간이 길어지면, 치주 조직이 서로 결합하여 일체가 된 형상의 재생 치아 유닛을 얻을 수 있다. 이와 같이, 치주 조직이 일체로 형성된 재생 치아 유닛은, 재생 치아마다 분리하지 않고, 그대로 치아 결손부위에 이식할 수 있다. 이와 같이 복수의 재생 치아를 포함하여 일체로 형성된 재생 치아 유닛은, 개별의 재생 치아 유닛을 하나씩 이식하는 경우에 비해, 이식을 간편하게 하고, 또한, 개개의 치아를 일체의 치주 조직에 의해 강고하게 지지할 수 있다. 또한, 복수의 재생 치아를 포함하여 일체로 형성된 재생 치아 유닛은, 개별의 재생 치아 유닛을 하나씩 이식하는 경우에 비해, 이식시 또는 이식 후에 치열의 방향이 흐트러질 걱정 없이, 이식할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양으로서는, 상기 복수의 재생 치배를, 전술한 바와 같이 스페이서 내에 배치하여 배양하는 것도 가능하다. 스페이서에 대해서는, 상기와 동일하고, 정렬하는 재생 치배의 수에 따라 적절한 형상으로 하는 것이 바람직하다. 복수의 재생 치배를 정렬하는 경우에는, 복수 치배의 치열방향의 치관 폭의 합계값 또는 치열방향의 치주 조직의 길이가 얻어지는 형상으로 하는 것이 바람직하다. 그 때문에, 스페이서로서 통형상의 것을 사용하는 경우에는, 타원 또는 직사각형에 가까운 형상을 바닥면으로 하는 통을 사용하는 것이 바람직하다. 복수의 재생 치아를 포함하는 재생 치아 유닛을 제작하는 경우에, 스페이서를 사용함으로써, 정렬된 재생 치배의 상태, 즉, 재생 치배의 방향이나 재생 치배끼리의 간격, 및 재생 치배가 정렬되는 평면을 유지한 채로, 생체 내에 삽입하여 생체 내 배양을 할 수 있다는 이점이 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특정 실시태양을 설명하기 위해 사용되는 것으로, 발명을 한정할 의도는 아니다.

또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 「포함한다」는 용어는, 문맥상 명확하게 상이한 이해를 해야 하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.

상이한 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는, 상이한 정의가 명시되어 있지 않은 한, 본 명세서 및 관련 기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 이상화되거나, 또는, 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 실시태양은 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있는데, 모식도인 경우, 설명을 명확하게 하기 위해, 과장되어 표현되어 있는 경우가 있다.

제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되나, 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어서는 안 되는 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 제1 요소를 제2 요소로 기재하고, 마찬가지로, 제2 요소는 제1 요소로 기재하는 것은, 본 발명의 범위를 일탈함 없이 가능하다.

실시예

이하에 있어서, 본 발명을, 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 태양에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로서 해석되어서는 안 된다.

<실시예 1：스페이서를 사용한 재생 치배의 생체 내 배양>

신피막하 이식에 있어서 신피막의 압력의 영향을 회피할 목적으로, 스페이서를 사용하여 재생 치배의 생체 내 배양을 행하였다.

마이크로피펫 칩(HRI-110NEW, Molecular Bio Products, SanDiego, CA, USA)을 안지름(내직경) 1.3 ㎜, 높이 1.3 ㎜가 되도록 링형상(통형상)으로 절단하여 스페이서를 제작하고, 내부에 콜라겐 용액을 채워서 사용하였다. 재생 치배는, 치근방향으로의 신장을 촉진하기 위해 스페이서의 벽면에 치관측을 접근시키도록 배치하고, 37℃의 CO ₂ 인큐베이터(산요 덴키, 오사카, 일본)에서 배양하여, 콜라겐 겔을 경화시켰다. 다음으로, 재생 치배를 포함하는 스페이서를 7주령 C57BL/6 마우스의 양측 신피막하에 이식하였다. 신피막하로의 이식은, 신장 피막에 2~3 ㎜의 절개를 넣어, 신장 피막과 신장 실질을 박리하고, 그 사이에 재생 치배를 포함하는 스페이서를 삽입함으로써 행하였다. 비교예로서, 7일간 기관배양한 재생 치배를, 스페이서를 사용하지 않고 신피막하에 이식하였다. 이식시의 사진을 도 1에 나타낸다. 또한, 이식시의 스페이서와 재생 치배의 위치 관계의 모식도를 도 11에 나타낸다.

이식 3주 후에, 마이크로 CT 촬영을 행하고, 화상 데이터는 통합 화상처리 소프트웨어를 사용하여 해석하였다. 치관부에 있어서의 최대경을 장경으로 하고, 장경과 직교하는 최대경을 단경으로 정의하고, 각각의 길이를 계측하여, 그 비율을 산출하였다.

스페이서를 사용하여 배양한 예를 도 2에, 사용하지 않고 배양한 예를 도 3에 나타낸다. 스페이서를 사용하여 배양한 재생 치아 유닛은, 정상 치아에 가까운 형태인 한편, 스페이서를 사용하지 않고 배양한 재생 치아 유닛은, 장경이 단경에 대해 극단적으로 길고, 편평한 형상이었다.

스페이서를 사용하여 배양한 군(제어군) 및 스페이서를 사용하지 않고 배양한 군(비제어군)의 각 7예에 대해서 장경과 단경을 계측하여, 장경/단경비를 구한 결과를 도 4(우측)에 나타낸다. 재생 치아 유닛의 장경/단경비는, 스페이서를 사용하여 배양한 군(제어군：실시예)에서는 1.46±0.16 ㎜이고, 스페이서를 사용하지 않고 배양한 군(비제어군：비교예)에서는 2.30±0.35 ㎜였다.

도 4(좌측)에는, 성수 마우스(adult mouse)의 하악 제1, 제2, 제3 구치(molar tooth)(M1, M2, M3)의 치관부에 있어서의 최대경을 장경으로 하고, 장경과 직교하는 최대경을 단경으로 정의하여 측정하고, 장경/단경비를 구한 결과를 나타낸다. M1, M2, M3의 장경/단경비는, 각각, 1.61±0.05(n=5), 1.09±0.04(n=5), 1.12±0.04(n=5)였다.

이상으로부터, 스페이서를 사용하지 않고 생체 내 배양한 재생 치아 유닛 형상이 편평해지는 것에 대해, 스페이서를 사용하여 생체 내 배양한 재생 치아 유닛은 형상이 편평해지지 않아, 양자의 장경/단경비는 유의차가 있는 것, 또한, 스페이서를 사용하여 생체 내 배양한 재생 치아 유닛의 장경/단경비는 천연의 치아와 동등해지는 것이 확인되었다(Student's-t검정, ＊p<0.0001).

또한 신피막하 이식 30일, 60일째의 재생 치아 유닛을 적출하여, 마이크로 CT 촬영, 및 통합 화상처리 소프트웨어에 의한 해석을 행하여 길이를 측정하였다. 마이크로 CT 화상 상에서 형성된 치조골의 영역을 포함시키지 않고, 치아의 교두(cusp)부터 근첨까지의 길이를 계측하였다.

결과를 도 5에 나타낸다. 스페이서를 사용하지 않는 비제어군에 있어서는 교두-근첨 길이가 30일째에 1.07±0.20 ㎜(n=6)였던 바, 60일째에는 1.70±0.26 ㎜(n=6)로 되어 있어, 유의하게 치아의 길이가 증가되어 있었다. 한편, 스페이서에 의한 제어군에서는, 30일째에서 1.01±0.19 ㎜(n=13), 60일째에서 1.02±0.11 ㎜(n=10)로, 이식 일수에 따른 치아의 길이의 증가는 확인되지 않았다(Student's-t검정, ＊p<0.0001).

이상으로부터, 스페이서를 사용하여 재생 치배를 생체 내 배양하면, 재생 치아의 길이를 임의로 조절할 수 있는 것이 명확해졌다.

<실시예 2：기계적 자극을 부여한 재생 치배의 생체 내 배양>

실시예 1의 방법에 따라, 스페이서를 사용하여 기관배양을 행한 재생 치배를 스페이서째 신피막하에 이식하고, 기계적 자극으로서, 신피막하 이식 후 7일째부터 음파 전동 칫솔(주파수 31, 000 Hz：Doltz(상표), 파나소닉)을 마우스 배부 피부에 3.9×10 ⁴ Pa의 압력으로 압접하였다(5분간/일). 대조군에는 기계적 자극을 부여하지 않고, 30일간의 이식기간 후에 적출하여 비교 대상으로 하였다.

적출한 재생 치아 유닛은 실시예 1과 동일한 방법으로 마이크로 CT 촬영을 행하고, 3차원 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 치근막강의 폭(간단히, 「치근막의 폭」이라 부르는 경우도 있다.)을 계측하였다. 구체적으로는, 3차원 화상 상에서 재생 치아 유닛의 치근 표면과 형성된 치조골의 거리를 치근막강의 폭으로 하고, 장경·단경에 있어서의 단면에 있어서, 각각 6점씩 계측하였다. 그 후, 재생 치아를 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde：PFA)로 고정하고, 10% 에틸렌디아민사초산(EDTA)로 탈회(decalcifying)하여, 파라핀 포매하였다. 그 후, 두께 8 마이크로미터의 연속 절편을 제작하고, 헤마톡실린·에오신(HE) 염색을 행하여, 조직학적 평가를 행하였다.

조직학적 평가의 결과를 도 6에 나타낸다. 도면 중, B는 치조골, D는 상아질, P는 치근막을 나타내고, 도면 중의 P의 문자 옆의 바가 치근막의 폭을 나타낸다. 또한, 도면 중의 오른쪽 아래의 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다. 유자극군의 치근막은, 무자극군보다 두껍게 형성되고, 치근막 영역의 세포의 규칙적인 배열이 확인되었다.

또한 CT 화상 상에서 치근막의 폭을 계측한 결과를 도 7에 나타낸다. 유자극군의 치근막의 폭은, 108.5±30.6 ㎛(n=33)이고, 무자극군의 치근막의 폭은, 68.7±14.1 ㎛(n=12)였다(Student's-t검정, ＊p<0.0001).

이상의 결과로부터, 재생 치배를 생체 내 배양할 때에, 외부로부터 기계적인 자극을 부여함으로써, 충분한 치근막 조직을 갖는 재생 치아 유닛이 얻어지는 것이 판명되었다.

<실시예 3：생체 내 배양에 의해 얻어진 재생 치아 유닛의 악골 이식>

4주령 C57BL/6 마우스의 하악 제1 구치를 발치하고, 3일간의 치유기간을 마련하였다. 그 후, 동일 부위의 치육 절개·박리를 행하고, 치과용 마이크로 모터(Viva-Mate Plus, 나카니시, 도쿄, 일본)를 사용해서 치조골을 절삭하여, 근원심 지름(mesiodistal diameter) 1 ㎜, 협설 지름(buccolingual diameter) 0.8 ㎜의 이식와(transplantation fossa)를 형성하였다.

실시예 1에 따라, 스페이서를 사용하여 30일간 신피막하에서 배양하고, 또한, 실시예 2에 따라 배양 중에 기계적 자극을 가하여 제작한 재생 치아 유닛을, 악골 이식와에 매입(embedding)하고, 8-0 나일론 봉합사(베아메딕, 치바, 일본)로 치육 봉합하였다.

도 8에 이식와의 형성 및 재생 치아 유닛의 이식 모습을 나타낸다.

재생 치아 유닛을 이식한 마우스는 이식 0일, 14일, 30일째에 전술과 동일한 방법으로 마이크로 CT 촬영을 행하여, 이식편과 수용자(recipient)의 치조골에 있어서의 결합을 평가하였다. 그 후, 이식편을 포함하는 악골을 4% PFA로 고정하고, 10% 포름산-구연산 나트륨 탈회액으로 탈회하여, 파라핀 포매한 후에, 두께 8 ㎛의 연속 절편을 제작하고, HE 염색으로 조직학적 평가를 행하였다.

도 9에 CT 화상, 도 10에 HE 염색상을 나타낸다.

도 9에 나타내는 바와 같이, 이식 14일째에는 이식편과 수용자의 하악 제2 구치 치조골 사이에 부분적인 결합이 확인되고, 이식 30일째에는 거의 전체 둘레에 걸쳐 골 결합이 확인되었다. 도면 중, 화살표는 재생 치아 유닛을 나타낸다.

도 10에 나타내는 바와 같이, 이식 30일째의 조직상에서는, 재생 치아와 하악 제2 구치의 치조간 중격(interalveolar septum) 치조골이 융합되어 있어, 재생 치아 유닛이 골 결합을 매개로 이식부위의 치조골에 생착되어 있을 가능성이 시사되었다. 또한 조직 해석으로부터, 이식에 의한 우발증으로서 재생 치아 치수의 일부에 석회화가 확인되었으나(16예 중 3예), 재생 치아 유닛의 치근막은 이식 후에도 유지되고 있어, 골성 유착은 확인되지 않았다(16예 중 0예). 도면 중, 화살표는 골 결합에 의한 생착을 나타내고, 스케일 바는 100 ㎛를 나타내며, BT는 재생 치아를, NT는 천연 하악 제2 구치를 나타낸다. 이상으로부터, 본 발명의 제조방법으로 제조된 재생 치아 유닛은, 악골에 이식하면 양호하게 생착되는 것이 나타내어졌다.

<실시예 4：다수 치아 재생 치아 유닛의 제작>

치아의 대형 결손에 대해서 이식 가능한 다수 치아 재생 치아 유닛을 제작할 목적으로, 신피막하 이식에 있어서 스페이서를 사용하여 복수의 재생 치배의 생체 내 배양을 행하였다.

마이크로피펫 칩(HRI-110New Molecular Bio Products, SanDiego, Ca, USA)을 통형상으로 절단하고, 통의 단면형상이 장경 3 ㎜·단경 2 ㎜·높이 1.3 ㎜의 모서리가 둥근 사각형이 되도록 성형하여 이것을 스페이서로서 사용하며, 그 내부에 콜라겐 용액을 채워서 사용하였다. 통의 높이방향이 장래의 재생 치아의 두께방향이 되도록, 또한, 모서리가 둥근 사각형의 단경방향이 치아의 신장방향, 모서리가 둥근 사각형의 장경방향이 치아의 치열방향이 되도록 4개의 재생 치배를 서로 접촉시켜서 배치하였다. 그때, 치근방향으로의 신장을 촉진하기 위해 스페이서 단면의 모서리가 둥근 사각형의 장경에 닿는 한쪽 벽면에 재생 치배의 장래 치관이 되는 쪽을 약간 접근시켜서 배치하고, 37℃의 CO ₂ 인큐베이터(산요 덴키, 오사카, 일본)에서 콜라겐 겔을 경화시켰다. 스페이서 내에 복수의 재생 치배를 배치한 상태에 대해서, 모식도를 도 12에 나타내고, 그 사진을 도 13에 나타낸다. 도 12 및 도 13은, 통형상의 스페이서를 통의 축방향에서 본 도면 또는 사진이다. 다음으로, 재생 치배를 포함하는 스페이서를 7주령 C57BL/6 마우스의 양측 신피막하에 이식하였다. 신피막하로의 이식은, 신장 피막에 5 ㎜의 절개를 넣어, 신장 피막과 신장 실질을 박리하고, 그 사이에 복수의 재생 치배를 포함하는 스페이서를 삽입함으로써 행하였다.

신피막하 이식 60일 후에, 신장으로부터 적출한 바, 복수의 치아를 갖는 한 덩어리의 다수 치아 유닛이 얻어졌다. 신피막하 이식 60일 후의 다수 치아 유닛에 대해서, 실체 사진을 도 14에 나타낸다. 마이크로 CT(리가쿠, 도쿄, 일본)로 해석한 바, 각각의 치아의 주위에 치근막강, 치조골의 치조간 중격이 확인되었다. 신피막하 이식 60일 후의 다수 치아 유닛에 대해서, T 외관상 및 CT 단면상을 도 15에 나타낸다. 이 사실로부터, 본 발명의 제조방법의 일태양으로서, 각각 단일의 치아로 성장하는 개별의 재생 치배를, 장래 교합면이 되는 방향을 정렬 배치하여 배양함으로써, 복수의 개별의 치아에 대해서, 타고난 치아와 동일하게 치관-치근방향이 일방향으로 정렬되고, 또한, 복수의 치아가 치열을 형성하도록 일렬로 정렬된 상태의 재생 치아 유닛을 얻을 수 있는 것이 나타내어졌다. 또한, 본 발명의 제조방법의 일태양으로서, 다수의 재생 치배를 배치하여 제작된 재생 치아 유닛은, 복수의 치아가 정상의 조직 구조를 가지고 존재하며, 또한, 그 치근부분을 덮도록 치조골이 일체로 형성되어 있는 것이 나타내어졌다.

<실시예 5：다수 치아 유닛의 무치악(edentulous jaw) 모델에 대한 이식>

4주령 C57BL/6 마우스의 하악 제1, 제2, 및 제3 구치를 발치하여, 무치악 모델을 제작하고, 3일간의 치유기간을 마련하였다. 그 후, 동일 부위의 치육 절개·박리를 행하고, 치과용 마이크로 모터(Viva-Mate Plus, 나카니시, 도쿄, 일본)를 사용해서 치조골을 절삭하여, 근원심 지름 3~4 ㎜, 협설 지름 1.2 ㎜의 이식와를 형성하였다. 마우스 신장 피막하에서 제작한 재생 치아 유닛을, 악골 이식와에 매입하고, 8-0 나일론 봉합사(베아메딕, 치바, 일본)로 치육 봉합하였다.

다수 치아 유닛을 이식한 무치악 모델 마우스에 대해서 마이크로 CT 촬영을 행하였다. 다수 치아 유닛의 구강 내 이식 후 1일째의 CT 화상을 도 16에 나타낸다. 본 실시예의 관찰에 의해 다수 치아 유닛 치조골과 수용자 치조골의 골성 결합에 의한 생착이 시사되었다.

이것에 의해, 치아 결손부위가 대형인 경우에도, 그 형상에 적합한 복수 치아를 포함하는 재생 치아 유닛을 한번에 이식할 수 있는 것이 나타내어지고, 이식된 재생 치아 유닛의 치주 조직과 이식된 고체의 악골이 양호하게 골 결합하는 것이 시사되었다. 또한, 이식 후 50일째의 CT 화상에 있어서, 이식된 재생 치아 유닛의 치주 조직과 이식된 고체의 악골의 골의 생착이 관찰되었다.