[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种采用单侧两点注射法建造帕金森病模型鼠的方法。

[0002] 帕金森病(Parkinson disease，PD)作为神经系统退行性病变，其典型的病理特征为中脑黑质多巴胺(dopamine DA)能神经元缺失以及黑质纹状体通路DA数量降低。帕金森动物模型的建立方法有多种，目前最常用的是6-OHDA(6羟基多巴胺)制备的大鼠模型和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)制作的小鼠或灵长类动物模型。通常以选择大鼠制作动物模型居多。6-OHDA诱发的PD动物模型在神经生化、病理和行为学方面与人类PD具有很大相似性，已被广泛用于PD的研究。然而，6-0HDA诱导PD神经退行性变性的程度和特点明显受注射部位的影响口。6-OHDA建造PD大鼠模型目前多采用黑质致密部(SNc)、中脑腹侧被盖(VTA)、纹状体及前脑内侧束(medial forebrain bundle MFB)单点或双点注射法来制作单侧或双侧损毁PD模型。SNc区域小，一般造模成功率低。VTA作为另一个重要靶点与躯体运动密切相关，与PD病理有关的重要区域，如果单独损伤，也会出现造模率低的情况。采用SNc与VTA的双点联合毁损法，可以使损伤范围较大，缩短造模周期，有效提高造模成功率建立稳定的模拟PD中晚期的大鼠模型，为疾病的研究治疗提供实验室基础研究平台。

[0003] 本发明的目的在于提供一种采用单侧两点注射法建造帕金森病模型鼠的方法。

[0004] 其具体技术方案为：

[0005] 一种采用单侧两点注射法建造帕金森病模型鼠的方法，包括以下步骤：

[0006] 步骤1、将大鼠腹腔注射麻醉后，剪去头顶部毛发，固定于脑立体定位仪上，双侧耳杆尖端插入外耳道，使头部固定保持水平，并尽量使前、后囟保持同一平面上，碘酒消毒，切开头皮、皮下组织和骨膜；

[0007] 步骤2、采用牙科钻或注射器针头小心钻透定位处的颅骨不要损伤硬脑膜，按确定右侧、SNc：前囟后5.4±0.1mm，矢状缝右侧1.4±0.1mm，硬脑膜下7.8±0.1mm；VTA：前囟后5.0±0.1mm，中线右侧0.9±0.1mm，硬脑膜下7.2±0.1mm，确定好的坐标将吸入药物的微量注射器连接于微量推进器上，向SNc和VTA注射配置好的6-OHDA 5μl，垂直入颅，缓慢进针，注射保持速度为1μl/min，留针10min，缓慢退针1mm/min，术中观察大鼠生命体征；

[0008] 步骤3、缝合后，三天连续腹腔注射青霉素5万单位以防治感染，建造动物模型；

[0009] 步骤4、在10天后腹腔注射APO诱发大鼠向左侧的旋转行为，注射后10min大鼠就出现行为学改变，连续记录40min：旋转时多数以左侧后肢为支点，身体环曲呈“C”状，首尾相接，伴探嗅觅食样动作，有的旋转速度过快甚至出现翻转。

[0010] 进一步，步骤2中，所述的注射器针头为4号注射器针头。

[0011] 进一步，步骤2中，所述的6-OHDA的浓度为2μg/μl。

[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0013] 本发明的方法在模型制作过程中采用针头穿刺大鼠颅骨可以有效节省模型制作时间，同时可减少因力度过大导致的穿透深度过深导致脑组织的损伤，方便快捷，对仪器的要求简单同时可更加无菌。另一方面，采用的单侧两点方法制备大鼠PD模型，可以从病理基础仿效PD的发生，更加符合疾病本书的发病机制，更能缩短模型制作时间，从而提高模型的时效性，同时也可有效保证成功率。适合PD基础的研究。

[0014] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

[0015] 将大鼠腹腔注射麻醉后，剪去头顶部毛发，固定于脑立体定位仪上(双侧耳杆尖端插入外耳道，使头部固定保持水平，并尽量使前、后囟保持同一平面上)。碘酒消毒，切开头皮、皮下组织和骨膜。通常采用牙科钻(课题组均采用为4号注射器针头代替牙科钻，因牙科钻一方面操作需要掌握一定技巧，同时也容易造成因使用力度不易控制，导致容易损伤硬脑膜。采用针头旋转穿刺时可以提高位点的稳定性，同时评估针头直径约为0.5mm，操作方便容易掌握)。小心钻透定位处的颅骨不要损伤硬脑膜，参照Paxinos等主编的《大鼠脑立体定位图谱》。按确定右侧、SNc：前囟后(5.4±0.1mm)，矢状缝右侧(1.4±0.1mm)，硬脑膜下(7.8±0.1mm)；VTA：前囟后(5.0±0.1mm)，中线右侧(0.9±0.1mm)，硬脑膜下(7.2±0.1)mm。确定好的坐标将吸入药物的微量注射器连接于微量推进器上，向SNc和VTA注射配置好的6-OHDA(2μg/μl)5μl，垂直入颅，缓慢进针，注射保持速度为1μl/min，留针10min，缓慢退针1mm/min，术中观察大鼠生命体征。常规缝合，三天连续腹腔注射青霉素5万单位以防治感染。建造动物模型。在10天后腹腔注射APO诱发大鼠向左侧(健侧)的旋转行为。注射后10min左右大鼠就可出现行为学改变，连续记录40min：旋转时多数以左侧后肢为支点，身体环曲呈“C”状，首尾相接，伴探嗅觅食样动作，有的旋转速度过快甚至出现翻转。造模成功率可达到40％左右。并通过动物的旋转行为及病理、生化可以得以验证模型的成功。

[0016] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。