观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法 |
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| 申请号 | CN201510060576.1 | 申请日 | 2015-02-06 | 公开(公告)号 | CN104688185A | 公开(公告)日 | 2015-06-10 |
| 申请人 | 唐佩福; 张立海; 张金辉; 张建; 陈超; | 发明人 | 张金辉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其包括以下步骤：(1)DRG手术；(2)DRG病毒注射；(3)同时观察脊髓侧面轴突和DRG手术；(4)背侧轴突观察手术；(5)背侧插电势差监测 电极 手术；(6)成像。本发明观察动物背腹侧轴突对比和脊髓电活动的方法可避免成像时反复手术，降低了试验动物的 疼痛 和压 力 ，能对动物脊髓侧面观察及运动和感觉神经元轴突对照研究，能对动物脊髓背侧在清醒状态下观察；有助于实现整个神经系统的全方位贯通，对整个神经系统自身的结构及功能运行机制的研究起到极大的推动作用，对学习睡眠等动物行为学的整体化研究分析提供了切实可行的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法技术领域[0001] 本发明涉及动物DRG及脊髓的研究技术领域，尤其涉及一种观察动物DRG脊髓结构及记录脊髓电活动的方法。 背景技术[0002] 因为细胞级活体成像方法的缺失，更因为活体清醒状态下制动成像方法的缺失，导致我们对背根神经节的研究还处于离体研究状态，不能对脊髓侧面观察及运动和感觉神经元轴突对照研究，不能对脊髓背侧在清醒状态下观察，另外还有脊髓插电极容易脱落等需要解决。 [0003] 在非线性显微镜下活体甚至清醒状态下观察动物皮质1mm深的结构及功能，在神经生理病理学研究中具有独特的价值。在目前所有的研究中，通过手术保证观察时目标位置完全制动，是研究的必备条件。在神经节的研究中，目前依然滞留在离体试验阶段；在脊髓轴突研究中，仅限于麻醉状态下对背侧的观察，不能实现清醒状态下的观察，另外，无论在麻醉状态还是清醒状态下均不能对运动和感觉轴突进行区别试验甚至对照试验。 [0004] 在目前的神经研究方面，依然面临着最初手术后，每次成像需反复手术的难题。反复手术增加了感染的机会，增加了感染引起的混杂因素，引起组织损伤，额外增加了试验动物的疼痛和压力，更主要的是这样减少了成像次数。不像颅骨那样，脊椎的相关部位承受着常规的弯曲，肌肉组织发达，另外需要承受长期的准备以保证脊椎的稳定性，减少成像时的动作伪影。 发明内容[0005] 针对以上问题，本发明提供了一种可避免成像时反复手术，降低了试验动物的疼痛和压力，能对动物脊髓侧面DRG观察及运动和感觉神经元轴突对照研究，能对动物脊髓背侧在清醒状态下观察，对整个神经系统自身的结构及功能运行机制的研究起到极大的推动作用的观察动物脊髓电活动的方法。 [0006] 本发明是通过以下技术方案实现的： [0007] 上述的观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，包括以下步骤： [0008] (1)选择成年转基因荧光小鼠，将其麻醉后进行剃毛处理，接着分离小鼠剃毛区的皮肤和肌肉组织之间的筋膜，找到一节段脊椎并暴露其横突下的DRG，接着封闭DRG暴露区以形成封闭观察室，最后等待小鼠恢复； [0009] (2)选择一个成年转基因荧光小鼠，将其麻醉后进行剃毛处理，接着分离小鼠剃毛区的皮肤和肌肉组织之间的筋膜，找到不同于上述步骤(1)的一节段脊椎并暴露其横突下的DRG，向DRG内注射病毒后，缝合剃毛区皮肤，等待小鼠恢复后饲养； [0010] (3)选择一个成年转基因荧光小鼠并对其进行剃毛处理，然后分离剃毛区的皮肤和肌肉组织之间的筋膜，选择不同于上述步骤(1)、(2)的一节段脊椎并暴露其横突，接着封闭DRG暴露区，以形成封闭观察室，最后等待小鼠恢复； [0011] (4)选择一个成年转基因荧光小鼠，将其麻醉后进行剃毛处理，接着分离小鼠剃毛区的皮肤和肌肉组织之间的筋膜；再牵开剃毛区皮肤，将椎板从脊髓上切除分离；最后覆盖封闭椎板切除部位，以形成封闭观察槽，等待小鼠恢复； [0012] (5)选择一个成年转基因荧光小鼠，将其麻醉后进行剃毛处理，接着分离小鼠剃毛区的皮肤和肌肉组织之间的筋膜；再牵开剃毛区皮肤，去除覆盖在与上述步骤(4)相同的一节段脊椎上的肌肉组织，将两根电极插入脊椎背侧后突旁和头尾端；再将所述两根电极插入到脊柱一侧肌肉组织中，最后粘合牵开的皮肤，等待小鼠恢复； [0013] (6)将上述步骤(1)至(5)所选择的小鼠均调整到自然状态，进行观察成像，最后放回鼠笼饲养。 [0014] 所述观察动物DRG，脊髓背侧轴突和树突对比和脊髓电活动的方法，其中，所述步骤(1)具体包括(1.01)选择成年转基因荧光小鼠并在其腹腔注射戊巴比妥钠；(1.02)将小鼠麻醉后，转移至远离手术区并进行相应部位的剃毛处理，接着用酒精进行清洗，刮除剃毛区的鼠毛后，反复清洗干净并擦干剃毛区皮肤；(1.03)将小鼠转移至手术区并覆盖剪空纱布，接着切开小鼠背侧正中的皮肤，分离皮肤和肌肉组织之间的筋膜；(1.04)找到一节段脊椎，离断其肌肉组织和肌腱，暴露横突，在脊椎横突的位置紧贴椎骨钝性分离两小孔；(1.05)脊柱侧面肌肉组织离断后回缩，用夹具对应于轴突位置插入肌肉组织，夹紧夹具并紧固；(1.06)将小鼠撑开皮肤和肌肉组织充分暴露手术视野；(1.07)清除剩余肌肉等组织，控制出血并拭除附着在椎骨上的组织，充分暴露脊椎横突下的DRG；(1.08)磨除脊椎横突并把DRG周围椎板磨薄磨平至DRG稍隆出于骨平面，然后止血并擦干手术区；(1.09)在DRG区注射适量Kwik-Sil生物胶并避免有气泡残留；(1.10)覆盖封闭DRG暴露区并轻柔挤压；(1.11)等待10min～20min生物胶固定后，用牙托水丙烯酸涂抹在皮肤边缘和背负装置边缘，并用牙托水丙烯酸填充观察槽，以形成良好的封闭观察室；(1.12)等3min～5min，待牙托水丙烯酸硬化后，将小鼠转移到加热板上等待恢复； [0015] 所述步骤(2)具体包括(2.01)如上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤(1.01)-(1.06)所述；(2.02)对肌肉组织稍作清除，暴露DRG，用向DRG内注射30nL的可以转染GcaMP6钙离子感应器的病毒；(2.03)拆下夹具并缝合皮肤，将小鼠转移至加热板上等待恢复；(2.04)饲养14或18天后，重复上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤(1.01)-(1.12)； [0016] 所述步骤(3)具体包括(3.01)如上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤(1.01)-(1.03)所述；(3.02)找到不同于步骤(1)和(2)的一节段脊椎并暴露其横突，在脊椎横突的位置紧贴椎骨钝性分离两小孔，用夹具夹于脊椎的侧面正中处，之后方法同上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤(1.05)-(1.08)；(3.03)轻柔离断神经节表面硬脊膜延伸部分在椎骨上的附着处；(3.04)用弯针轻轻划裂磨薄的椎板，并勾起揭除椎板；(3.05)如上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤(1.09)-(1.12)所述； [0017] 所述步骤(4)具体包括(4.01)如上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤(1.01)-(1.03)所述；(4.02)牵开皮肤，以形成暴露区；(4.03)去除覆盖在不同于上述步骤(1)、(2)和(3)的一节段脊椎上的肌肉组织，控制出血并擦除附着在骨上的组织；(4.04)在脊椎侧面正中椎骨分离出四个小孔，分别将夹具的四齿对应于四个小孔插入肌肉组织，再夹紧夹具并紧固；(4.05)将小鼠转移到自制夹板上，去除脊椎的椎骨上所有软组织；(4.06)将椎板从脊髓上切除分离，控制出血并干净的暴露脊髓后，在切除椎板的位置注射KwikSil生物胶且避免有气泡残留；(4.07)覆盖封闭椎板切除部位并轻柔地挤压；(4.08)等待大概10min～20min硅胶固定，用牙科水丙烯酸或超强力胶水涂在观察槽；(4.09)把皮肤牵拉回背负装置边缘，用粘合剂胶水粘合；(4.10)等待3min～5min粘合剂硬化后，将小鼠转移到加热板上等待恢复； [0018] 所述步骤(5)具体包括(5.01)如上述背侧轴突观察手术步骤(4.01)-(4.05)所述；(5.02)在与上述步骤(4)相同的一节段脊椎背侧后突旁和头尾端各钻取一个小洞且不要磨穿，然后挑开磨薄揭除剩余的椎骨；(5.03)将电极的两根银丝分别插入到小洞中，之后用超强力胶滴加在小洞处；(5.04)等待3min～5min后，将两根电极以近乎平行于肌肉组织的角度插入到脊柱一侧肌肉组织中且避免插穿背腹膜进入腹腔；(5.05)将剩余长度的电极丝用牙托水丙烯酸牢固地固定在夹具上；(5.06)把皮肤牵拉回背负装置边缘，用粘合剂胶水粘合；(5.07)等待10min后，将小鼠转移到加热板上等待恢复； [0019] 所述步骤(6)具体是调整上述步骤(1)-(5)所述小鼠侧躺板的高度，使得小鼠处于较自然的状态，然后进行长达数分钟到数小时的观察成像，最后将小鼠放回鼠笼饲养。 [0020] 所述观察DRG，脊髓背侧轴突和树突对比和脊髓电活动法，其中：所述步骤(1.01)中戊巴比妥钠采用的是0.08mg的10mg/mL的戊巴比妥钠。 [0021] 所述观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其中；所述步骤(1.02)是采用70％酒精对剃毛处理的小鼠进行清洗，然后用适量脱毛膏涂抹于相应的剃毛区，涂抹均匀后等待3min～5min后用刮板顺向刮除脱毛膏和鼠毛，再用棉球蘸取生理盐水轻拭去除残余脱毛剂和鼠毛，如此反复直至清洗干净，最后用棉球擦干剃毛区皮肤。 [0022] 观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其中：所述步骤(1.03)具体是将小鼠覆盖3层剪空纱布，然后用#10手术刀在小鼠背侧正中切开皮肤，切口为2-2.5cm，用手术钳钝性分离皮肤和肌肉组织之间的筋膜。 [0023] 所述观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其中：所述步骤(3.04)在去除骨组织时用鹰磨钩或者小针完全去除。 [0024] 所述观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其中：所述步骤(4.02)是用牵开器牵开皮肤，形成一个1x1.5cm的暴露区。 [0025] 所述观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其中：所述步骤(4.05)去除脊椎的椎骨上的软组织可通过用棉球或通过用柔和的氰基丙烯酸盐粘合剂胶水硬化后移除来实现；所述步骤(4.06)的椎板切除术中用棉球进行止血，且在去除骨组织时用硬磨钩或者小针完全去除。 [0026] 所述观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其中，其特征在于：所述步骤(4.09)、(4.10)和(5.06)中的粘合剂均采用的是氰基丙烯酸盐粘合剂。 [0027] 所述观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，其中：所述步骤(5.03)中电极的两根银丝分别插入小洞中的深度在0.3mm～0.6mm；所述步骤(5.04)中的两根电极均采用的是铜电极。 [0028] 有益效果： [0029] 本发明观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法可避免成像时反复手术，降低了试验动物的疼痛和压力，能对动物脊髓侧面观察及运动和感觉神经元轴突对照研究，能对动物脊髓背侧在清醒状态下观察；可实现整个神经系统的全方位贯通，对整个神经系统自身的结构及功能运行机制的研究起到极大的推动作用，对学习睡眠等动物行为学的整体化研究分析提供了切实可行的方法；可实现长期观察，结合钙信号技术将成为脊髓损伤退化再生的研究提供更好更全面的技术方法；同时我们对YFP小鼠做侧位椎板去除术后，小鼠清醒状态下制动效果良好，能同时观察一个神经节和一个椎骨节段的脊髓节段；可以很稳定的实现对神经节中结构以及脊髓中感觉和运动轴突的对比观察。本发明为两种神经元轴突在病理生理等方面进行分别研究或者对比研究提供了可能，将对临床中不同部位脊髓损伤中愈合以及变性等方面提供科学依据进而促进临床中脊髓损伤的愈合或者退变起到实质性推进作用。本发明将对疼痛等感觉上的研究起到极大的推进作用，再结合现有的去除小胶质细胞等相关技术将对疼痛机制的研究以及临床治疗起到革命性的作用，另外本发明可以帮助我们对睡眠以及学习过程中DRG所起到的作用进行开创性的研究。本发明可成功的记录小鼠的运动同小鼠脊髓灰质区电势差的变化，发现随着小鼠的运动，脊髓灰质区的电势差相对于小鼠静止状态会减小，这对于脊髓内生理状态下电信号的产生传导的理解提供帮助，为脊髓损伤后断端电势差变化，头端或尾端电势差的变化及差异的研究提供了一种简单可行的方法，另外结合脑电极的使用，本发明可以从点活动上将脊髓和脑中相关区域核团联系成一个整体，对于信号的产生传导，以及睡眠学习等行为学的研究提供了一种简单实用的方法。 具体实施方式[0030] 以下将对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。 [0031] 实施例1 [0032] 本发明观察动物DRG、脊髓结构及记录脊髓电活动的方法，包括以下步骤： [0033] S100、YFP/GFP小鼠DRG手术 [0034] S101、选择成年YFP或GFP小鼠(YFP和GFP小鼠为转基因荧光小鼠，对于普通动物通过荧光剂注射等亦可实现荧光观察)并在其腹腔注射0.08mg的10mg/mL的戊巴比妥钠； [0035] S102、麻醉后，将小鼠转移至远离手术区进行相应部位的剃毛处理，并用70％酒精进行清洗，然后用适量脱毛膏涂抹于相应的剃毛区，涂抹均匀后等待3min～5min后用刮板顺向刮除脱毛膏和鼠毛；用棉球蘸取生理盐水轻拭去除残余脱毛剂和鼠毛，如此反复直至清洗干净，最后用棉球擦干剃毛区皮肤； [0036] S103、将小鼠转移至手术区并覆盖3层剪空纱布，接着用#10手术刀在小鼠背侧正中切开皮肤，切口为2cm～2.5cm，用手术钳钝性分离皮肤和肌肉组织之间的筋膜； [0037] S104、找到L4-L6，离断L4、L5全部以及L6上半部的肌肉组织和肌腱，暴露横突，在L4、L6横突的位置紧贴椎骨钝性分离两小孔； [0038] S105、脊柱侧面肌肉组织离断后回缩，用夹具对应于四个轴突位置插入肌肉组织，夹紧夹具并紧固； [0039] S106、将小鼠撑开皮肤和肌肉组织充分暴露手术视野； [0040] S107、用弯剪和镊子进一步清除剩余肌肉等组织，用棉球控制出血并拭除附着在椎骨上的组织，充分暴露L5横突下的DRG，同时避免损伤覆盖在DRG上的硬脊膜； [0041] S108、用小钻磨除L5横突，并把DRG周围椎板磨薄磨平至DRG稍隆出于骨平面，然后用棉球止血擦干手术区，同时磨除过程需缓慢轻柔，避免用力过大磨穿椎板； [0042] S109、在DRG区注射适量Kwik-Sil生物胶并避免有气泡残留； [0043] S110、直接用#0盖玻片覆盖封闭DRG暴露区并轻柔挤压使得生物胶进入观察槽的其他部分； [0044] S111、等待10min～20min生物胶固定后，用牙托水丙烯酸涂抹在皮肤边缘和背负装置边缘，并用牙托水丙烯酸填充观察槽，以形成良好的封闭观察室； [0045] S113、等待大概10-20min生物胶固定；S114、将自制的U型槽侧置于夹具组件a的小齿上方，并用少量超强力胶水使二者粘合；S115、用适量牙托水丙烯酸涂在U型槽周围形成方形槽，并用其填充其他空隙，避免成像时方形槽中水外渗；S116、约3-5min后，牙托水丙烯酸硬化，即可将插板尾部剪掉；S117、用牙托水丙烯酸涂抹在皮肤边缘和背负装置边缘，并用其填充观察槽，提供良好的封闭观察室； [0046] S112、等3min～5min后，牙托水丙烯酸硬化，将小鼠转移到加热板上等待恢复； [0047] S200、DRG病毒注射 [0048] S201、如上述YFP/GFP小鼠DRG手术步骤S101-S106所述； [0049] S202、对肌肉组织稍作清除，暴露DRG，用荧光注射设备向DRG内注射30nL的GcamP6病毒(为一种可以转染GcaMP6钙离子感应器的病毒)； [0050] S203、拆下夹具缝合皮肤，将小鼠转移至加热板上等待恢复； [0051] S204、饲养14或18天后，重复上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤S101-S112； [0052] S300、同时观察脊髓侧面轴突和DRG手术 [0053] S301如上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤S101-S103所述； [0054] S302找到L1-L3(本叙述以观察同时L3、L2之间DRG以及L2节段脊髓侧面为目的)并暴露其横突，用在L1、L3横突的位置紧贴椎骨钝性分离两小孔，用夹具夹于L1、L3的侧面正中处，之后方法同上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤S105-S108； [0055] S303、用注射器尖部轻柔离断神经节表面硬脊膜延伸部分在椎骨上的附着处； [0056] S304、用弯针轻轻划裂磨薄的椎板并勾起揭除椎板；同时，在去除骨组织时可能会有骨膜残留覆盖在脊髓上，这些组织应该用鹰磨沟或者小针完全去除，从硬脊膜上分离骨膜时要小心； [0057] S305如上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤S109-S112所述； [0058] S400、背侧轴突观察手术 [0059] S401、如上述转基因荧光小鼠DRG手术步骤S101-S103所述； [0060] S402、用牵开器牵开皮肤，形成一个1x1.5cm的暴露区； [0061] S403、找到L1，L3后，用手术钳穿过肌肉组织夹牢椎骨，用手术刀和刮刀去除覆盖在L1-L3上的肌肉组织，用无菌棉球控制出血并擦除附着在骨上的组织； [0062] S404、使用弯剪和镊子横断附着在L1-L3椎骨上的部分肌腱，在L1，L3侧面正中用尖镊紧贴椎骨分离出四个小孔，分别将夹具的四齿对应于四个小孔插入肌肉组织，再夹紧 |
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