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建立家兔动脉粥样硬化模型的方法
申请号	CN201410697550.3	申请日	2014-11-26	公开(公告)号	CN104490885A	公开(公告)日	2015-04-08
申请人	湖南中医药大学;			发明人	乔寅飞; 朱克俭; 肖长江; 柏正平; 李勇敏; 肖梅英; 翦林宏; 喻正科; 韩育明; 赵启; 李志; 颜旭; 谭宇军; 张婷; 朱筱婧; 杨文丽; 夏相宜;
摘要	本发明公开了建立家兔动脉粥样硬化模型的方法，包括对家兔基础饲料的高脂化加工，静脉注射牛血清蛋白，还包括采用血管鞘与测力计联合使用将家兔动脉血管内皮损伤，具体包括如下步骤：以21G桡动脉穿刺针在股动脉中下段行穿刺术；穿刺成功后，借助于导丝插入桡动脉鞘管达5cm深；之后在耳缘静脉注射肝素200U/Kg；拔出导丝后，在血鞘管尾部固定一根细线，细线另一端接测力计，术者左手手指并拢按压内有血管鞘的股动脉部分，右手握测力计向外将血管鞘拉出4cm，左手按压力量以测力计上显示10牛顿为度，以造成血管内皮损伤。本发明的目的是要提供一种周期短、可操作性强且成本较为低廉的家兔动脉粥样硬化模型的造模方法。
权利要求	1.建立家兔动脉粥样硬化模型的方法，包括对家兔基础饲料的高脂化加工，静脉注射牛血清蛋白，其特征在于：还包括采用血管鞘与测力计联合使用将家兔动脉血管内皮损伤，具体包括如下步骤： 1)以21G桡动脉穿刺针在股动脉中下段行穿刺术； 2)穿刺成功后，借助于导丝插入桡动脉鞘管达5cm深； 3)之后在耳缘静脉注射肝素200U/Kg； 4)拔出导丝后，在血鞘管尾部固定一根细线，细线另一端接测力计，术者左手手指并拢按压内有血管鞘的股动脉部分，右手握测力计向外将血管鞘拉出4cm，左手按压力量以测力计上显示10牛顿为度，按以上方法重复操作3次，以造成血管内皮损伤。 2.如权利要求1所述的建立家兔动脉粥样硬化模型的方法，其特征在于：所述家兔基础饲料的高脂化加工为在基础家兔饲料59.7-75.9％中分别加入1-3％胆固醇，8-12％猪油，15-25％蛋黄粉，0.1-0.3％丙硫氧嘧啶。 3.如权利要求1所述的建立家兔动脉粥样硬化模型的方法，其特征在于：所述步骤2)中的鞘管为1.8kg兔选择使用4F鞘管，2.0kg选择使用5F鞘管，2.2kg兔选择使用6F鞘管。 4.如权利要求1所述的建立家兔动脉粥样硬化模型的方法，其特征在于：所述静脉注射牛血清蛋白，在造模第1天和第7天，每只家兔从耳静脉注射牛血清白蛋，每次剂量均为 200-300mg/kg。
说明书全文	建立家兔动脉粥样硬化模型的方法技术领域 [0001] 本发明属于实验动物疾病模型的范畴，具体为建立家兔动脉粥样硬化模型的方法。背景技术 [0002] 动脉粥样硬化是一种有免疫系统参与的慢性反应性炎性疾病，是心脑血管疾病的主要病理基础，严重危害人类健康，是造成心脑血管疾病的主要原因。但其发病其机制至今仍未完全阐明，需要进行深入的实验研究，因此迫切需要一种快速、经济、易于制造及复制、与人类动脉粥样硬化的发病机制更接近的动物模型。 [0003] 张军平等人曾在《中国比较医学杂志》2009年第19卷第1期报道中提出采用“高脂饲料+静脉注射牛血清白蛋白+动脉内皮球囊拉伤”法制备家兔腹主动脉粥样硬化模型的方法，符凌等人在《中西医结合心脑血管病杂志》2010年7月第8卷第七期中报道，在高脂饲料中加入一定量的丙基硫氧嘧啶，它能够抑制甲状腺功能，使肝内胆固醇增加，减少对胆固醇的代谢，保证血清胆固醇含量的升高，进而诱发高脂血症，加快建模的进程。但“高脂饲料+静脉注射牛血清白蛋白+动脉内皮球囊拉伤”法造模需12周，耗时较长，且使用的耗材“动脉球囊”和“压力泵”价格昂贵，不利于推广使用。发明内容 [0004] 本发明的目的是要提供一种周期短、可操作性强且成本较为低廉的家兔动脉粥样硬化模型的造模方法。 [0005] 为了达到上述目的，本发明有如下技术方案： [0006] 本发明的建立家兔动脉粥样硬化模型的方法，包括对家兔基础饲料的高脂化加工，静脉注射牛血清蛋白，采用血管鞘与测力计联合使用将家兔动脉血管内皮损伤，其中，采用血管鞘与测力计联合使用将家兔动脉血管内皮损伤具体包括如下步骤： [0007] 1)以21G桡动脉穿刺针在股动脉中下段行穿刺术； [0008] 2)穿刺成功后，借助于导丝插入桡动脉鞘管达5cm深； [0009] 3)之后在耳缘静脉注射肝素200U/Kg； [0010] 4)拔出导丝后，在血鞘管尾部固定一根细线，细线另一端接测力计，术者左手手指并拢按压内有血管鞘的股动脉部分，右手握测力计向外将血管鞘拉出4cm，左手按压力量以测力计上显示10牛顿为度，按以上方法重复操作3次，以造成血管内皮损伤。 [0011] 其中，所述家兔基础饲料的高脂化加工为在基础家兔饲料59.7-75.9％中分别加入1-3％胆固醇，8-12％猪油，15-25％蛋黄粉，0.1-0.3％丙硫氧嘧啶。 [0012] 其中，所述步骤2)中的鞘管为1.8kg兔选择使用4F鞘管，2.0kg选择使用5F鞘管，2.2kg兔选择使用6F鞘管。 [0013] 其中，所述静脉注射牛血清蛋白，在造模第1天和第7天，每只家兔从耳静脉注射牛血清白蛋，每次剂量均为200-300mg/kg。 [0014] 由于采取了以上技术方案，本发明的有益效果： [0015] 本发明实验组动物采用高脂饮食直接导致脂质摄入过多，造成高脂血症；丙硫氧嘧啶使家兔甲状腺功能减退，减慢脂质代谢；静脉注射牛血清白蛋白造成全身性免疫炎性反应，血管鞘拉伤术直接造成内皮损伤，四者在体内相互影响形成一种立体的生物效应。本模型在前三者造成全身反应的基础上加以局部血管鞘拉伤使得观测部位更加确定，便于取材。 [0016] 进行家兔股动脉内皮拉伤术操作中不再使用价格昂贵的“球囊+压力泵”，“动脉球囊”价格为3700余元，“压力泵”价格为4800余元，并且球囊导管管壁脆弱易损坏，不宜多次使用。而“动脉血管鞘”价格为220余元，测力计价格为50余元，且动脉血管鞘质地坚硬，可消毒后重复使用，主要耗材费用大大降低。 [0017] 造模总时间从12周缩减为7周，节约了大量的动物喂养和管理成本。附图说明 [0018] 图1为本发明实验组中未经动脉血管鞘损伤的部位； [0019] 图2、图4为本发明实验组中经动脉血管鞘损伤的部位； [0020] 图3为本发明实验组动脉血管内的血栓； [0021] 图5为本发明对照组正常的动脉血管。 [0022] 图中：1、泡沫细胞 2、血管内皮 3、钙化点 4、血栓具体实施方式 [0023] 以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。 [0024] 实验动物分组 [0025] 选用普通级雄性日本大耳白兔20只，体重2.0±0.2kg。随机分为实验组10例和对照组10例。 [0026] 对照组雄性日本大耳白兔予普通兔饲料每日每只予150g饲料，喂养7周；实验组雄性日本大耳白兔予普通兔饲料及高脂饲料，配方为：2％胆固醇+10％猪油+20％蛋黄粉+0.2％丙硫氧嘧啶+基础饲料67.8％，实验组每只雄性日本大耳白兔每日上午给予普通基础饲料100g，下午给予高脂饲料50g。 [0027] 实施例1 [0028] 1、雄性日本大耳白兔称重、编号后，除对照组的雄性日本大耳白兔，其余实验组雄性日本大耳白兔在造模第1天和第7天，对每只雄性日本大耳白兔从耳静脉注射牛血清蛋白，每次注射剂量均为250mg/kg。第一天注射完毕后，随即在全麻下行左侧股动脉拉伤术，同日开始用高脂饲料喂养，直至第七周取材。 [0029] 左侧股动脉拉伤术操作方法：实验组雄性日本大耳白兔术前12小时禁食但无需禁水；用3％戊巴比妥钠(30mg/kg)肌肉注射麻醉后将动物固定于手术台；左侧腹股沟周边区域剪毛常规皮肤消毒，沿股动脉走行切开皮肤，分离股动脉。直视下以21G桡动脉穿刺针在股动脉中下段行穿刺术。穿刺成功后,借助于导丝插入桡动脉鞘管达5cm深，1.8kg兔选择使用4F鞘管，随即在耳缘静脉注射肝素200U/Kg。拔出导丝后，在血鞘管尾部固定一根细线，细线另一端接测力计。术者左手手指并拢按压内有血管鞘的股动脉部分，右手握测力计向外将血管鞘拉出约4cm，左手按压力量以测力计上显示10牛顿为度。按上法重复操作3次，以造成血管内皮损伤。操作完成后拔出鞘管,迅速在动脉穿刺处撒入云南白药粉0.5g，压迫止血4-5分钟。止血后在伤处洒入庆大霉素注射液8万U以防止感染。常规逐层缝合手术切口。术后连续3d每日肌注青霉素钠40万单位抗感染。 [0030] 2、标本的收集与处理 [0031] 3、血清的留取与血脂检测：分别于实验开始的第一天、第3周、第7周采血。每次采血前禁食12h，不禁水。将血液标本用全自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDC-C。 [0032] 4、病理标本的留取及检测：于实验第7周末取材，将所有动物固定于手术台，用空气栓塞法处死，取出左侧动脉血管组织用生理盐水冲洗后置于10％中性福尔马林固定，将病理标本以石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察病理改变。 [0033] 实施例2 [0034] 穿刺成功后,借助于导丝插入桡动脉鞘管达5cm深，2.0kg兔选择使用5F鞘管，随即在耳缘静脉注射肝素200U/Kg，其它同实施例1。 [0035] 实施例3 [0036] 穿刺成功后,借助于导丝插入桡动脉鞘管达5cm深，2.2kg兔选择使用6F鞘管，随即在耳缘静脉注射肝素200U/Kg，其它同实施例1。 [0037] 实验结果： [0038] 实验数据计量资料以表示，计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验(SPSS16.0统计软件)，差异显著性水平设为a＝0.05。 [0039] 1、生存及死亡情况 [0040] 对照组动物：精神状态良好，毛色较白有光泽，目光亮有神，反应灵敏，饲喂时见有较大反应，不断抓挠食盒。实验组动物：从3周左右开始出现精神欠佳，目光呆滞，活动少，可饮食；5周左右饲喂时较少有反应，喜卧少动，饮食有所减少，毛色变暗。四肢末端甲床处出现溃烂，结痂，耳内侧开始出现黄色结痂，尾部体毛部分脱落；7周时发现目光混浊，可见有脂肪沉积。对照组10只，无死亡；实验组10只，突发死亡1只，尸检未发现异常，原因不明，其死亡时间为7周中期。 [0041] 2、血脂水平 [0042] 对照组在实验前及第3周和第7周的血脂水平基本接近,无显著性差异(P>0.05)，见表1。 [0043] 表1 对照组不同时间血脂水平( n＝8,mmol/L) [0044] [0045] 实验组在造模前及第3周和第7周的血脂水平差异较大,有显著性差异(P<0.01)，见表2。 [0046] 表2 实验组不同时间血脂水平( n＝10,mmol/L) [0047] [0048] 实验组血脂水平在3周出现升高，与对照组相比TC、TG、LDL均升高(P<0.01)，随着时间的推移，至7周取材时血脂水平(TC、TG、LDL)进一步增高(P<0.01)。 [0049] 3、病理形态学观察 [0050] 光镜观察：对照组主动脉内皮细胞完整，单层紧贴内弹力板，中层平滑肌细胞排列整齐，呈长椭圆形(见图5)；实验组血管可见有斑块形成，斑块表面有纤维组织覆盖，管腔内有机化的血栓形成，有点灶钙化点。动脉管壁厚度不均匀，一侧变薄，肌层断裂，由较多纤维组织替代。另一侧动脉中层见泡沫细胞不均匀分布，周围有红色均质的胶原存在，有点灶钙化。可见动脉中层与外层之间有出血、血肿形成。动脉血管鞘拉伤部位血管内皮不完整(图1-4)。 [0051] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

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