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一种小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法
申请号	CN201610921580.7	申请日	2016-10-21	公开(公告)号	CN106333757A	公开(公告)日	2017-01-18
申请人	石河子大学;			发明人	吴向未; 陈雪玲; 程文哲; 王小义; 陈聪哲; 董丹;
摘要	本发明公开了一种小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法，通过电击装置简单方便精确安全稳定的造成小鼠骨髓微环境的损害，小鼠死亡率低。并且造模2周和4周后，骨髓微环境的恢复情况也有不同的变化，为研究血管再生以及分段观察骨髓微环境的损伤情况提供一个良好的技术平台。直接铁镍铬合金金属丝插入骨髓腔的方法，既可以保证骨髓微环境的损害，又不会对股骨周围的血管神经肌肉等组织造成极大的损伤。采用1ml 注射器针头钻孔，孔径小，对骨皮质的损害小，可以保证骨髓腔的完整性并减短恢复周期。金属丝的插入，减小了电击所需的电压和时间，操作更安全。整个电击装置所需仪器便宜安全，具有较强的稳定性。
权利要求	1.一种小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法，其特征在于，具体步骤如下：将小鼠腹腔注射0.15ml浓度为5％水合氯醛麻醉，实验小鼠进入麻醉状态后，将其放置在消毒的工作台上，固定四肢；用2％碘伏对小鼠右后肢膝关节处手术区域进行消毒处理，采用无菌眼科剪切开皮层与肌层，并将髌骨推向一边，暴露股骨关节面；屈曲膝关节，将实验鼠股骨与操作台保持垂直；用1ml注射器针头在股骨关节面正中央与骨髓腔平行方向钻孔，边旋转边进针，深度为3-5mm，恰有血液渗出时拔出；后将长度为1.5cm直径约为0.27mm材质为铁镍铬合金的金属丝轻轻插入小孔深度为6mm；将电针一段接触金属丝露出部分，另一端置于同一股骨近心端，两电极端的距离为2cm，调节时间控制器输入通电时间，调节可调变压器以及滑动变阻器输入通电电压，接通电源后造成骨髓微环境损伤；立刻取其双侧股骨浸入组织固定液固定，通过大体观察以及HE染色共聚焦显微镜观察得到能使骨髓微环境损伤的最小电压以及最短时间；按照此参数电击实验鼠股骨，电击后用生理盐水冲洗清除血块以及钻孔部位清理，不做其他处理，行关节复位，逐层缝合，关闭膝关节；术后注射青霉素钠2000u,1次/d，连续5d，以防感染；造模2周和4周以后取其双侧股骨观察骨髓微环境恢复情况。 2.根据权利要求1所述的小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法，其特征在于，所述电击过程中所使用的电击装置具体为：包括220V交流电源、稳压器、接触器、时间继电器、可调变压器、滑动变阻器、电压表、电流表、电针、股骨和金属丝，所述220V交流电源、稳压器、接触器、时间继电器、可调变压器依次串联，电压表与股骨并联，滑动变阻器、电流表与股骨串联，电针的数量为两个，一个与电压表连接，一个与电流表连接，所述金属丝插入股骨的骨髓腔内。 3.根据权利要求2所述的小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法，其特征在于，两电针之间相距2cm。 4.根据权利要求2所述的小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法，其特征在于，所述金属丝的直径为0.27mm材质为铁镍铬合金。
说明书全文	一种小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法技术领域 [0001] 本发明属于医学技术领域，涉及一种小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法。背景技术 [0002] 骨髓微环境由多种造血细胞成分、非造血细胞、胞外基质和其他信号蛋白组成，是造血干细胞赖以生存的基础，是支持造血干细胞自我更新和分化的场所，并且与造血生成调控、干细胞的静息、更新、分化、迁移、动员及归巢密切相关。正常的骨髓微环境对造血干细胞发挥正常功能十分重要，一旦发生紊乱，会引发血液疾病和癌症等病症。因此，深入研究骨髓微环境，揭示调控机制以及相关的干细胞命运决定机制，将极大的推动骨髓移植、组织修复和再生医学等领域的发展。但其具体机制仍然未知，研究方法也较少，临床治疗效果很不好，迫切需要进一步研究。 [0003] 在关于骨髓微环境的损伤模型研究中，人们已经成功建立了若干小动物模型。例如：通过运用SARRP(小动物放疗仪)照射来达到局部骨损伤引起骨髓微环境破坏的小动物模型。此仪器对小鼠照射区域的骨髓微环境损害明显，整体损伤小，但对照射区域的皮肤、肌肉、血管、骨皮质都有不同程度伤害，影响骨髓微环境的恢复。并且SARRP造价昂贵，操作复杂，对操作者健康也有一定伤害。发明内容 [0004] 本发明的目的在于建立一个操作简便，精确可靠，易于控制的小动物模型，为研究血管再生以及分段观察骨髓微环境的损伤情况提供一个良好的技术平台，提供一种小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法。 [0005] 其具体技术方案为： [0006] 一种小鼠骨髓微环境损伤模型的建立方法，具体步骤如下： [0007] 将小鼠腹腔注射0.15ml浓度为5％水合氯醛麻醉，实验小鼠进入麻醉状态后，将其放置在消毒的工作台上，固定四肢；用2％碘伏对小鼠右后肢膝关节处手术区域进行消毒处理，采用无菌眼科剪切开皮层与肌层，并将髌骨推向一边，暴露股骨关节面；屈曲膝关节，将实验鼠股骨与操作台保持垂直；用1ml注射器针头在股骨关节面正中央与骨髓腔平行方向钻孔，边旋转边进针，深度为3-5mm，恰有血液渗出时拔出；后将长度为1.5cm直径约为0.27mm材质为铁镍铬合金的金属丝轻轻插入小孔深度约6mm；将电针一段接触金属丝露出部分，另一端置于同一股骨近心端，两电极端的距离为2cm，调节时间控制器输入通电时间，调节可调变压器以及滑动变阻器输入通电电压，接通电源后造成骨髓微环境损伤；立刻取其双侧股骨浸入组织固定液固定，通过大体观察以及HE染色共聚焦显微镜观察得到能使骨髓微环境损伤的最小电压以及最短时间；按照此参数电击实验鼠股骨，电击后用生理盐水冲洗清除血块以及钻孔部位清理，不做其他处理，行关节复位，逐层缝合，关闭膝关节；术后注射青霉素钠2000u,1次/d，连续5d，以防感染；造模2周和4周以后取其双侧股骨观察骨髓微环境恢复情况。 [0008] 进一步，所述电击过程中所使用的电击装置具体为：包括220V交流电源、稳压器、接触器、时间继电器、可调变压器、滑动变阻器、电压表、电流表、电针、股骨和金属丝，所述220V交流电源、稳压器、接触器、时间继电器、可调变压器依次串联，电压表与股骨并联，滑动变阻器、电流表与股骨串联，电针的数量为两个，一个与电压表连接，一个与电流表连接，所述金属丝插入股骨的骨髓腔内。 [0009] 进一步，两电针之间相距大概为2cm。 [0010] 进一步，所述金属丝的直径约为0.27mm材质为铁镍铬合金。 [0011] 将稳压器接入220V交流电源，调节旋钮，保证输出电压稳定在220V。接触器起到断开和接通电源的作用，与时间继电器串联可在规定的时间内断开或接通电源。可调变压器与时间继电器串联可将电路中220V电压升高或是降低以满足试验的需要(为通过股骨的真实电源，主要为降低电压，保证电路的以及操作者的安全)，并通过改变滑动变阻器的电阻大小来改变通过股骨的电流大小。电压表与股骨并联，保证在实验中可及时观察到通过股骨的电压示数。电流表与股骨串联，通过观察电压表以及电流表示数可粗略的估计两电针的间的电阻大小，及时调整两电针之间的距离，以减小实验的误差。(也就是说要基本上保证电针两端的电阻是一定的，为电路中的定量，经过实验两电针之间相距大概为2cm，只用改变电压和时间这两个变量，就能达到实验结果)。 [0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果为： [0013] 本发明通过自制电击装置简单方便精确安全稳定的造成小鼠骨髓微环境的损害，小鼠死亡率低。并且造模2周和4周后，骨髓微环境的恢复情况也有不同的变化，为研究血管再生以及分段观察骨髓微环境的损伤情况提供一个良好的技术平台。直接铁镍铬合金金属丝插入骨髓腔的方法，既可以保证骨髓微环境的损害，又不会对股骨周围的血管神经肌肉等组织造成极大的损伤。采用1ml注射器针头钻孔，孔径小，对骨皮质的损害小，可以保证骨髓腔的完整性并减短恢复周期。金属丝的插入，减小了电击所需的电压和时间，操作更安全。整个实验设计只是造成部分骨髓微环境损伤，既可以同只小鼠左右股骨对照，也可同一股骨近心端和远心端对照。更加方便用来研究骨髓微环境的恢复情况，为后续研究相关干细胞的静息、更新、分化、迁移、动员及归巢提供合适的实验平台。整个电击装置所需仪器便宜安全，具有较强的稳定性。附图说明 [0014] 图1为电击装置结构图； [0015] 图2为股骨标本的大体观察； [0016] 图3为HE染色光显微镜(×200)下观察骨髓微环境的变化情况，其中，A表示0周，B表示2周，C表示4周，D表示正常。具体实施方式 [0017] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。 [0018] 1材料和方法 [0019] 1.1材料：选取12周龄的健康昆明小鼠(雌雄不限)，体重(30±5)g，均购于新疆自治区疾控中心。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。 [0020] 1.2实验方法： [0021] 1.2.1自制小鼠电击装置设计 [0022] 为了通过简单而又有效的方法造成小鼠骨髓微环境的损伤，本实验自行研制一套电击装置(如图1所示)。骨头作为小鼠体内电阻最大的物质，很难通过直接电击的方式造成骨髓微环境的损害。过大的电压，过长的电击时间将造成骨头的碳化甚至坏死，周围血管和肌肉也将大面积损伤，骨髓微环境将更加难以恢复。并且过大的电压以及过长的时间也会给操作者带来危险。为了更加安全可靠的达到实验目的，最终选择在股骨关节面钻孔，并且插进合适金属丝的方法来损伤骨髓微环境。这样既可以通过较小的电压和较短的时间来造成骨髓微环境的损伤，也可以保证操作者的安全。 [0023] 电路中所用仪器名称以及型号： [0024] 德力西单相交流稳压器型号：TND-500VA [0025] 德力西交流接触器型号：CJX2-2510 [0026] 德力西数显循环时间继电器型号：JSS48A-S [0027] 德力西单相可调变压器型号：TDGCAP5 [0028] Anzhou滑动变阻器型号：BC1-500w [0029] 欣灵电压表型号：SX-96B AC500V [0030] 卓一(TOONE)电流表型号：ZYX96A-I [0031] 1.2.2小鼠骨髓微环境损伤模型的建立 [0032] 将小鼠腹腔注射0.15ml浓度为5％水合氯醛麻醉。实验小鼠进入麻醉状态后，将其放置在消毒的工作台上，固定四肢。用2％碘伏对小鼠右后肢膝关节处手术区域进行消毒处理，采用无菌眼科剪切开皮层与肌层，并将髌骨推向一边，暴露股骨关节面。屈曲膝关节，将实验鼠股骨与操作台保持垂直。用1ml注射器针头在股骨关节面正中央与骨髓腔平行方向钻孔，边旋转边进针，深度为3-5mm，恰有血液渗出时拔出。后将长度为1.5cm直径约为0.27mm材质为铁镍铬合金的金属丝轻轻插入小孔深度约6mm。将电针一段接触金属丝露出部分，另一端置于同一股骨近心端，两电极端的距离为2cm，调节时间控制器输入通电时间，调节可调变压器以及滑动变阻器输入通电电压，接通电源后造成骨髓微环境损伤。立刻取其双侧股骨浸入组织固定液固定，通过大体观察以及HE染色共聚焦显微镜观察得到能使骨髓微环境损伤的最小电压以及最短时间。按照此参数电击实验鼠股骨，电击后用生理盐水冲洗清除血块以及钻孔部位清理，不做其他处理，行关节复位，逐层缝合，关闭膝关节。术后注射青霉素钠2000u,1次/d，连续5d，以防感染。造模2周和4周以后取其双侧股骨观察骨髓微环境恢复情况。 [0033] 1.2.3取材 [0034] 于制模后2,4周，对实验小鼠行腹腔注射过量麻药处死，取出双侧后肢股骨，取材后，行大体、病理组织学观察标本。 [0035] 1.3大体观察： [0036] 从外观大体观察电击后取出股骨标本的损伤情况。 [0037] 1.4病理组织学检查： [0038] 将标本用由10％中性福尔马林、磷酸盐缓冲液等组成的组织固定液固定4天后，用以7g 氧化铝：5ml甲酸：8.5ml盐酸：100ml单蒸水为比例所配制的脱钙液方法脱钙6小时，逐级乙醇脱水-石蜡包埋-切片-常规苏木精-伊红染色-显微镜下观察骨髓微环境损伤情况并拍片，采用共聚焦显微镜观察其特征。 [0039] 2结果 [0040] 2.1自制电击装置最佳电击参数 [0041] 骨髓微环境在100±10v时间为1.5±0.5分钟时可出现明显的损伤情况并且小鼠死亡率低。并且在此电压和时间下不会对操作者造成危险。 [0042] 2.2股骨标本的大体观察 [0043] 将标本在组织固定液中浸泡4天后取出，分别观察其变化并与正常股骨作对比(如图2所示)。0周时电击部位骨髓腔明显出现出血坏死，颜色大面积发黑。2周时电击部位骨髓腔出血坏死面积明显减少。4周时电击部位骨髓腔恢复良好和正常骨髓腔大体观察相似。 [0044] ABCD分别代表电击0周、2周、4周和正常的小鼠右后肢股骨(组织固定液中浸泡4天后取出)。 [0045] 2.3骨髓腔的病理组织学观察 [0046] 如图3所示，HE染色光显微镜(×200)下观察骨髓微环境的变化情况可见右后肢股骨骨髓腔远心端与近心端出现明显差异。股骨近心端细胞排列整齐紧密，结构正常，骨小梁未见明显变化，血管散在分布。股骨远心端细胞紊乱，排列疏松，细胞结构以及骨小梁明显受到破坏，几乎无血管存在。左后肢股骨骨髓腔远心端与近心端未见损伤。 [0047] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

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