一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法 |
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| 申请号 | CN201610025035.X | 申请日 | 2016-01-15 | 公开(公告)号 | CN105662634A | 公开(公告)日 | 2016-06-15 |
| 申请人 | 首都医科大学附属北京朝阳医院; | 发明人 | 刘洪彦; 郑毅; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法， 石膏 干硬前在石膏外以环绕方式缠以细 铁 丝，铁丝圈间距3～5mm；具体包括：适应性喂养1周后将兔毛剪短至0.5cm，左后肢 膝关节 完全屈曲，用管型石膏固定于过屈位，长度从髋关节远端2cm至踝关节上缘2cm，石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距3～5mm，待石膏干硬后，再将兔放回兔笼，造模过程中观察家兔状态、双腿活动情况、造模肢体改变，发现有肢端明显肿胀、张 力 性 水 泡或溃烂感染及石膏松脱、咬损严重现象，则立即卸掉重打，固定7周成模。本发明的方法简单，操作方便，提高了制作兔骨关节炎模型的效率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，其特征在于，该改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距 |
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| 说明书全文 | 一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法技术领域[0001] 本发明属于骨关节炎技术领域，尤其涉及一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法。 背景技术[0002] 骨关节炎是(Osteoarthritis，OA)是由多种原因所致的慢性退行性关节病变。目前临床上尚缺乏有效的根治措施，通过建立OA动物模型来深入探讨其病理机制并寻找合理有效的治疗手段是研究OA的重要方法。关节制动法可用于制作OA模型，以管型石膏过伸位固定膝关节的方法最为常见。但研究表明，此方法石膏末端啃噬情况严重，导致造模过程中多次拆除石膏、重新固定，导致试验繁琐并影响造模成功率。 发明内容[0003] 本发明的目的在于提供一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，旨在解决现有的石膏末端啃噬情况严重，导致造模过程中多次拆除石膏、重新固定，导致试验繁琐并影响造模成功率的问题。 [0005] 具体包括：适应性喂养1周后，将兔毛剪短至0.5cm，左后肢膝关节完全屈曲，用管型石膏固定于过屈位，长度从髋关节远端2cm至踝关节上缘2cm，石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距3～5mm，待石膏干硬后，再将兔放回兔笼，造模过程中观察家兔状态、双腿活动情况、造模肢体改变，发现有肢端明显肿胀、张力性水泡或溃烂感染及石膏松脱、咬损严重现象，则立即卸掉重打，固定7周成模。 [0006] 进一步，该改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法还包括：影像学检查，于第7周末行左膝关节正位片DR摄影；具体方法：OA组提前拆卸石膏；拍摄时以黑色布袋套住动物头部，将左下肢伸直后安抚动物，快速进行DR摄影；按X线Kellgren-Lawrence分级标准进行分级。 [0007] 进一步，该改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法还包括：取材； [0008] 于DR摄影后处死全部动物；处死及取材方法：3％戊巴比妥钠按30mg/kg耳缘静脉注射麻醉动物，打开左膝关节腔，切断交叉韧带，肉眼观察并记录关节软骨整体变化情况，并着重观察股骨内髁、股骨外髁，并进行分级。 [0009] 进一步，该改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法还包括：病理学检查软骨组织制作蜡块、切片，经梯度酒精、二甲苯脱水、透明，进行HE染色和甲苯胺蓝染色，采用Mankin骨关节炎评分法对软骨标本进行评分； [0010] 本发明提供的改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，采用伸直位固定法制作兔OA模型，从影像学、大体形态学及病理学等方面对OA进行了鉴定及评估，本发明的兔OA模型中X线检查发现了与人OA类似的病变，骨赘形成、关节间隙狭窄，从影像学上证实兔OA模型的制备成功；兔OA模型软骨呈现灰黄色，表面粗糙不平甚至可见局部糜烂，证实了OA软骨的破坏；软骨采用甲苯胺蓝染色可出现基质异染性，主要是由于硫酸软骨素的存在，而实验中OA软骨出现明显的失染现象，提示硫酸软骨素的丢失，这与人OA软骨基质的丢失相符；实验中兔OA软骨细胞变形，排列紊乱，潮线中断或消失，均提示软骨细胞的退化，符合人OA的特点；软骨细胞凋亡是OA发病机制中的重要环节。附图说明 [0012] 图2是本发明实施例提供的对照组及OA组膝关节影像学特点示意图； [0013] 图中：(a)正常对照组膝关节DR图像，关节面光滑，关节间隙正常(K-L分级0级)； [0014] (b)OA模型组膝关节DR图像，可见关节骨赘形成，关节间隙变窄(K-L分级3级)； [0015] 图3是本发明实施例提供的兔膝关节软骨大体观察及大体形态学评分示意图； [0016] 图中：(a)为正常对照组：软骨表面光滑，色泽光亮(大体形态学评分0分)； [0017] (b)为OA模型组：滑膜增厚，软骨表面粗糙、欠光滑，局部出现轻度糜烂，病变以内侧髁为重(大体形态学评分2分)； [0018] 图4是本发明实施例提供的兔膝关节软骨病理学特点(甲苯胺蓝染色，×200倍)示意图； [0019] 图中；(a)关节面平整，潮线完整，细胞形态正常、排列整齐，基质均匀(简单病理分级：0级)； [0020] (b)破坏只在表层，软骨表面粗糙断裂，潮线改变，细胞排列紊乱，出现细胞聚集现象(简单病理分级：2级)； [0021] (c)破坏只在中层，软骨表面粗糙断裂，潮线改变，细胞排列紊乱，出现细胞聚集现象(简单病理分级：2级)； [0022] (d)和(e)破坏到达软骨深层，潮线完全消失，细胞大量聚集，排列紊乱(简单病理分级：3级)； [0023] (f)破坏到达软骨深层，潮线完全消失，细胞变形、大量聚集、排列紊乱，软骨基质明显失染(简单病理分级：4级)。 具体实施方式[0024] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0025] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。 [0026] 如图1所示，本发明实施例的改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法包括以下步骤： [0027] S101：将兔毛剪短至0.5cm左右，左后肢膝关节完全屈曲，用管型石膏将其固定于过屈位，长度从髋关节远端约2cm至踝关节上缘2cm； [0028] S102：石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距3～5mm；待石膏干硬后，再将兔放回兔笼； [0029] S103：造模过程中观察家兔一般状态、双腿活动情况、造模肢体改变等；若发现有肢端明显肿胀、张力性水泡或溃烂感染及石膏松脱、咬损严重等现象，则立即卸掉重打；固定7周成模。 [0030] 本发明的具体实施例： [0031] 1 材料与方法 [0033] 1.2造模 [0034] 适应性喂养1周后随机分为OA组(8只)和正常对照组(8只)，正常对照组不做处理；OA组进行改良造模，具体方法如下：将兔毛剪短至0.5cm左右，左后肢膝关节完全屈曲，用管型石膏将其固定于过屈位，长度从髋关节远端约2cm至踝关节上缘2cm，石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距3～5mm；待石膏干硬后，再将兔放回兔笼；造模过程中观察家兔一般状态、双腿活动情况、造模肢体改变等；若发现有肢端明显肿胀、张力性水泡或溃烂感染及石膏松脱、咬损严重等现象，则立即卸掉重打；固定7周成模； [0035] 1.3影像学检查 [0036] 于第7周末行左膝关节正位片DR摄影；具体方法：OA组提前拆卸石膏；拍摄时以黑色布袋套住动物头部，将左下肢伸直后安抚动物，快速进行DR摄影；按X线Kellgren-Lawrence分级标准(简称K-L分级)进行分级： [0037] 1.4取材 [0038] 于DR摄影后处死全部动物；处死及取材方法：3％戊巴比妥钠按30mg/kg耳缘静脉注射麻醉动物，打开左膝关节腔，切断交叉韧带，肉眼观察并记录关节软骨整体变化情况，并着重观察股骨内髁、股骨外髁，并进行分级：0分：关节面光整，色泽如常；1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；3分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露；生理盐水冲洗膝关节腔，取股骨内侧髁处软骨3mm×3mm组织，置于10％福尔马林溶液中固定； [0039] 1.5病理学检查 [0040] 软骨组织制作蜡块、切片，经梯度酒精、二甲苯脱水、透明，进行HE染色和甲苯胺蓝染色，采用骨关节炎评分法对软骨标本进行评分； [0041] 1.5统计学分析 [0042] 采用SPSS 17.0进行统计分析；计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。 [0043] 2.结果 [0044] 2.1一般状态 [0045] 与正常对照组相比，造模动物出现精神不振，活动量及饮食减少，1周～10天后精神、活动量及饮食逐渐恢复正常；1只动物造模次日出现左后肢明显肿胀，拆卸石膏后重新石膏固定；全部动物在造模早期未出现明显啃咬现象，均未破坏石膏固定的完整性和有效性； [0046] 2.2影像学特点 [0047] 正常对照组关节表面光滑，无骨赘形成，关节间隙正常；单纯OA模型组可见表面模糊，有骨赘形成，关节间隙狭窄(图2)；Kellgren-Lawrence分级对照组全部为0级，OA组Ⅱ级3例，Ⅲ级5例(表1)； [0048] 表1 兔膝关节X线Kellgren-Lawrence分级 [0049] [0050] 2.3大体形态学特点 [0051] 正常对照组无明显关节积液及滑膜增生，关节软骨面光滑，色泽明亮(图3a)。OA组造模关节出现关节积液、滑膜增厚。软骨改变集中在股骨内侧髁关节面，软骨表面粗糙不平，颜色灰黄，部分开始出现软骨糜烂、甚至有溃疡发生(图2b)。膝关节大体评分对照组均为0分，OA组3例为1分，3例为2分(表2)。 [0052] 表2 兔膝关节大体形态学评分 [0053] [0054] 2.4病理学特点 [0055] 正常对照组膝关节软骨切片显示关节面平整，潮线完好，细胞形态正常、排列整齐，基质均匀(图4a)。OA组4例呈现2级(图4b，4c)，3例呈现3级(图4d，图4e)表现，1例出现4级表现(图4f)。正常对照组Mankin病理评分为0分，OA组Mankin病理评分为7.43±1.20分，明显高于正常对照组，差异有统计学意义，P＜0.05。 [0056] 兔OA模型制作方法有多种，最常使用的有关节腔注射法(如瓜蛋白酶注射法)、手术方法(如膝关节半月板切除和Hulth法)和本发明中采用的机械制动法等。伸直位固定法是机械制动法的一种，其原理是过伸位固定限制了膝关节的活动，肌肉和关节囊的收缩，对关节面造成过度压力而引起关节损伤。此造模方法，具有一定的优势和劣势。其优势在于避免了手术方法和关节腔注射方法制作兔OA对关节内环境的破坏，制作过程更加接近人OA的自然发展过程，具有简便易于操作、耗材少、家兔适用性好等优点。其劣势在于制作模型过程中石膏下端啃噬现象非常严重，导致石膏固定不牢甚至脱落。维持膝关节的持续伸直位是制作兔OA模型的关键因素，石膏的固定不牢或脱落会降低模型的成功率。 [0057] 为避免上述情况的发生，本发明中对伸直位固定法进行改良，造模成功率达到100％。具体方法是于石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距3～5mm。这一改良措施有效的减少了兔的啃噬现象和石膏的脱落，维持膝关节持续处于伸直位状态，增加了模型制作的稳定性和成功率。多数研究未提及此方法的制作成功率，本发明的成功率为100％，模型制作方法的改良可能是保证成功率100％的重要因素。 [0058] 人OA是一个退行性疾病，其临床特点是影像学可见关节间隙变窄、软骨下骨硬化和(或)囊性变、关节缘骨赘形成，病理学特点为软骨基质的丢失和软骨细胞的退化。本发明采用伸直位固定法制作兔OA模型，从影像学、大体形态学及病理学等方面对OA进行了鉴定及评估，结果证实此方法制作的兔OA特点均符合人膝OA的特点。1、影像学改变：兔OA模型中X线检查发现了与人OA类似的病变，骨赘形成、关节间隙狭窄，从影像学上证实兔OA模型的制备成功。2、大体形态学：兔OA模型软骨呈现灰黄色，表面粗糙不平甚至可见局部糜烂，证实了OA软骨的破坏。3、软骨基质丢失：软骨采用甲苯胺蓝染色可出现基质异染性，主要是由于硫酸软骨素的存在，而实验中OA软骨出现明显的失染现象，提示硫酸软骨素的丢失，这与人OA软骨基质的丢失相符。4、软骨细胞退化：实验中兔OA软骨细胞变形，排列紊乱，潮线中断或消失，均提示软骨细胞的退化，符合人OA的特点。5、软骨细胞凋亡：软骨细胞凋亡是OA发病机制中的重要环节，这一理论目前被大多数学者所接受。实验中发现，正常软骨亦存在有少量的凋亡软骨细胞，而OA软骨细胞的凋亡比例明显增加，多位于表层及中层，与人OA软骨细胞的凋亡相似。 [0059] 综上所述，采用改良伸直位固定法7周可成功制作兔OA模型，其影像学及病理学特点与人OA相似，是研究OA的理想模型，也是研究软骨细胞凋亡及OA防治的重要手段。 |
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