一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型的建立方法 |
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| 申请号 | CN201510065553.X | 申请日 | 2015-02-09 | 公开(公告)号 | CN104783921A | 公开(公告)日 | 2015-07-22 |
| 申请人 | 大连医科大学附属第一医院; | 发明人 | 巩鹏; 张健; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种观察 肿瘤 血管微循环的裸鼠 皮肤 褶皱模型的建立方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：取对数期的CBRH-7919肝癌细胞，将其用0.25%的胰蛋白酶消化后，离心浓缩获得CBRH-7919肝癌细胞悬液，然后将一定量的CBRH-7919肝癌细胞悬液注射到裸鼠表皮下，保证进入裸鼠表皮下的CBRH-7919肝癌细胞的数量范围在5×105至4×106个/ml；注射完成后2-3天取形成肿瘤瘤体的裸鼠，在肿瘤瘤体生长的一面建立皮肤褶皱模型。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型的建立方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行： |
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| 说明书全文 | 一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型的建立方法技术领域[0001] 本发明涉及一种裸鼠皮肤褶皱模型的建立方法，特别是一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型的建立方法。 背景技术[0002] 恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，2008年全球估计发病人数1279万。其中，在发达国家，恶性肿瘤是导致死亡的首要原因，而在发展中国家，也高居第二位。癌症对各国的社会经济发展造成了巨大的疾病和经济负担。因此，如果攻克癌症，治疗癌症，成为目前肿瘤研究的热点。 [0003] 肿瘤周围的血管生成在肿瘤的发生、转移中发挥了重要作用。肿瘤生长具有明确的血管依赖性，肿瘤通过新生血管从宿主获取营养成分，又经过血管向宿主输送肿瘤细胞，增强肿瘤灶的远处转移能力。肿瘤的生长可分为无血管期和血管期。体积超过2mm3的肿瘤即进入血管期，其继续生成需要新生血管维持营养供给和排泄代谢产物 如果没有新生血管长入，肿瘤就将保持休眠状态甚至退化。因此，足够的血管形成以提供充分的营养及氧供是肿瘤生长的必要条件。 [0004] 目前，动物模型是研究肿瘤血管生成的重要研究工具。然而，构建原位肿瘤模型研究血管生成具有一定的局限性。首先，部分深部肿瘤，如胰腺癌，肝癌等肿瘤模型，构建难度高、标本取材困难，且不易观察；其次，对肿瘤无法进行实时性研究，从而导致对肿瘤血管发生机制，发生、发展过程不能进行详细、充分的探讨。 [0005] 在1924年，Sandison 是第一次提及在活体显微观测技术下应用动物观察视窗模型来研究活体组织细胞，此后，各种旨在调查动物（小鼠、仓鼠、大鼠、兔子等）微循环的研究开始引入视窗观测的方法。1980年Endrich等首次提出了鼠背部皮肤皱褶模型，这一发现在过去30年中被广泛应用于微循环的研究领域，并被用来做了大量的实验研究。这一模型在以下几个研究领域具有突出的优势：1）微循环生理；2）炎症与坏死；3）缺血再灌注；4）血管生成过程；5）移植。因此，皮肤褶皱模型对研究肿瘤微循环具有得天独厚的优势。 [0006] 既往运用皮肤褶皱模型研究肿瘤微循环，多以肿瘤细胞接种于视窗之内，进而模拟肿瘤微环境。然而，这并不能充分阐明肿瘤瘤体周围微循环的形成、进展过程。因此，我们研究发明一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型。 发明内容[0007] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型，这种模型可以更贴近模拟肿瘤生长的微循环发生、发展过程，同时便于即时观察。 [0008] 本发明的技术解决方案是：一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型的建立方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：取对数期的CBRH-7919肝癌细胞，将其用0.25%的胰蛋白酶消化后，离心浓缩获得CBRH-7919肝癌细胞悬液，然后将一定量的CBRH-7919肝癌细胞悬液注射到裸鼠表皮下，保 5 6 证进入裸鼠表皮下的CBRH-7919肝癌细胞的数量范围在5×10至4×10 个/ml。 [0009] 注射完成后2-3天取形成肿瘤瘤体的裸鼠，在肿瘤瘤体生长的一面建立皮肤褶皱模型，具体方法如下：麻醉：将戊巴比妥钠用无菌生理盐水配制成1%的无菌溶液，根据体重按45mg/kg行腹腔内注射麻醉，若术中麻醉过浅可追加0.1ml的无菌溶液于腹腔中， 备皮：应用脱毛剂将裸鼠背部的微绒毛彻底清除干净， 术前准备：将裸鼠放置于操作台上，沿其脊柱捏起裸鼠背部皱褶皮肤，取其头部中央皮皱部与尾部正中延长线之间的正中线位置做一标记，在正中线两侧分别取两点，该两点与正中线中点之间的距离为2cm，分别用2根无菌丝线从该两点穿过皮肤皱褶，并利用这2根无菌丝线拉起实验鼠皮肤，术者视线垂直于实验鼠正中线，在对侧透射光源的照射下，看清主要血管走向及位置并做标记， 安装小室套件：将第一片小室架放于裸鼠背靠近术者一侧的背部正中皮肤上缘处，用无菌丝线将其缝扎固定，后在透射性光源的照射下，用记号笔根据已安装小室架的一侧的圆形视窗区的范围，标记出对侧相对应的视窗区范围， 拆除术前准备时用于悬挂裸鼠皮肤的丝线，然后让实验裸鼠朝向背离术者一侧侧卧，将实验裸鼠放置于万向支架显微镜下，用无菌纱布垫于皱褶皮肤下，使视窗区处于水平，并调节显微镜对焦与标记区域， 应用无菌显微外科手术器材在显微镜观察下去除标记侧的皮肤、皮下组织及双侧牵拉肌，切除范围为直径15mm的原型面积， 切除了视野区的皮肤后，把玻璃架放置于视窗区中央，将第二片小室架固定到对应的位置，两片套件之间由防挤压垫片分隔开以避免压迫供血血管，后用螺母和缝线固定好两片小室架，上述操作过程中，视窗区域要用温生理盐水保持湿润， 在两片小室架中的玻璃架内覆盖一层可拆卸的无菌圆形盖玻片并固定，且在放置盖玻片前向玻璃架内滴足量的温生理盐水。 [0010] 在将CBRH-7919肝癌细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，取一定量的细胞悬液在光镜下计数，然后将肿瘤细胞离心、浓缩、重悬，并调整CBRH-7919肝癌细胞悬液中CBRH-7919肝癌细胞数为5×106个/ml至 2×107个/ml，将0.1ml-0.2ml的CBRH-7919肝癌细胞悬液注射到裸鼠表皮下。 [0011] 本发明同现有技术相比，具有如下优点：1.本实验模型取材便捷，建立方法简单，成功率高； 2.本实验模型可以更真实模拟肿瘤生长环境，与肿瘤血管发生、发展过程更为贴近； 3.本实验模型可对肿瘤周围血管行即时观察，且观察方法简单、便捷。 附图说明 [0012] 图1是利用本方法建立模型的过程示意图一。 [0013] 图2是利用本方法建立模型的过程示意图二。 [0014] 图3是利用本方法建立模型的过程示意图三。 [0015] 图4是利用本方法建立的模型的一侧示意图。 [0016] 图5是利用本方法建立的模型的另一侧示意图。 [0017] 图6是利用本方法建立的模型的光镜下血管微循环示意图。 [0018] 图7是利用本方法建立的模型的荧光下血管微循环示意图。 具体实施方式[0019] 下面将结合附图说明本发明的具体实施方式。如图1至图5所示：一种观察肿瘤血管微循环的裸鼠皮肤褶皱模型的建立方法，按照以下步骤进行：取对数期的CBRH-7919肝癌细胞，将其用0.25%的胰蛋白酶消化后，取20ul的消化液在光镜下进行肝癌细胞的计数，然后将消化液离心浓缩，并根据计数结果向消化液中添加 6 7 溶剂，使消化液的肝癌细胞浓度为调整5×10个/ml至 2×10 个/ml的细胞悬液，然后用 1ml的注射器取0.1ml-0.2ml的细胞悬液注射到裸鼠表皮下，在裸鼠皮下形成直径约2mm的包块，注射部位应尽量选取在背部皮肤大血管周围，同时应小心避免针头碰触血管，防止血管破裂，造成出血。 [0020] 注射完成后2-3天取形成肿瘤瘤体的裸鼠，在肿瘤瘤体生长的一面建立皮肤褶皱模型，具体方法如下：麻醉：将戊巴比妥钠用无菌生理盐水配制成1%的无菌溶液，即配即用，根据体重按 45mg/kg行腹腔内注射麻醉，选择右下腹部靠外侧进针，注射前回抽，防止药物直接注入腹腔脏器或血管，若术中麻醉过浅可追加0.1ml（10mg）的无菌溶液于腹腔中，备皮：应用脱毛剂将裸鼠背部的微绒毛彻底清除干净，注意这里不可直接剔除微绒毛，直接剃除绒毛会诱发机械性刺激和皮肤微损伤，这将不能保证模型的质量，术前准备：将裸鼠放置于温暖舒适的操作台上，沿其脊柱捏起裸鼠背部皱褶皮肤，取其头部中央皮皱部与尾部正中延长线之间的正中线，在正中线两侧分别取两点，该两点与正中线中点之间的距离为2cm，分别用2根无菌丝线从该两点穿过皮肤皱褶，并利用这2根无菌丝线拉起实验鼠皮肤，术者视线垂直于实验鼠正中线，在对侧透射光源的照射下，看清主要血管走向及位置并做标记，这里做标记是为了在之后固定安装背部小室套件时可避免损伤到任何主要血管及微血管结构。 [0021] 安装小室套件：将第一片小室架放于裸鼠背靠近术者一侧的背部正中皮肤上缘处，用无菌丝线将其缝扎固定，后在透射性光源的照射下，用记号笔根据已安装小室架的一侧的圆形视窗区的范围，标记出对侧相对应的视窗区范围，需要注意的是，裸鼠背部肿瘤及其周围血管应尽量位于视窗内，拆除术前准备时用于悬挂裸鼠皮肤的丝线，然后让实验裸鼠朝向背离术者一侧侧卧，将实验裸鼠放置于万向支架显微镜下，用无菌纱布垫于皱褶皮肤下，使视窗区处于水平，并调节显微镜对焦与标记区域， 应用无菌显微外科手术器材在显微镜观察下去除标记侧的皮肤、皮下组织及双侧牵拉肌，切除范围为一个直径15mm的圆形面积，需注意的是，在操作过程中一定要精细操作，避免所切除范围内的对侧视野区血管损伤、出血，从而影响了模型的质量。而限制切除范围还可避免在安装第二片小室架时，引起两片小室架过紧挤压到两侧皮肤组织，进而压迫供血血管并最终导致组织缺血模型失败的情况出现；同时这样做还可以限制皮缘肉芽组织植入到移植区。 [0022] 切除了视野区的皮肤后，把玻璃架放置于视窗区中央，将第二片小室架固定到对应的位置，两片套件之间由防挤压垫片分隔开以避免压迫供血血管，后用螺母和缝线固定好两片小室架，上述操作过程中，视窗区域要用温生理盐水保持湿润，在两片小室架中的玻璃架内覆盖一层可拆卸的无菌圆形盖玻片并固定，用以显微镜下直接观测微血管生长情况，且在放置盖玻片前向玻璃架内滴足量的温生理盐水，以防止盖玻片内气泡产生。 |
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