一种附骨痈模型兔的制备方法及其应用 |
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| 申请号 | CN201510076274.3 | 申请日 | 2015-02-12 | 公开(公告)号 | CN104644283A | 公开(公告)日 | 2015-05-27 |
| 申请人 | 浙江省中医药研究院; | 发明人 | 张扬; 黄孝闻; 沈立锋; 王绪平; 俞忠明; 董宇; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种属于实验动物领域，尤其涉及一种附骨痈模型兔的制备，以及采用该模型进行附骨痈骨不连 治疗 作用评价的应用。该方法包括以下的步骤：1）动物选择及饲养条件、2）菌种复苏及培养、3）胫骨局部物理刺激、4）麻醉、5）附骨痈模型制备、6）术后观察及处理、7）附骨痈模型评价、8）附骨痈模型兔在附骨痈骨不连治疗作用评价中的应用。本发明开发的附骨痈兔模型，能够为促进附骨痈骨不连治疗的药物的筛选和开发提供动物模型和检测指标。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种附骨痈模型兔的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤： |
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| 说明书全文 | 一种附骨痈模型兔的制备方法及其应用技术领域背景技术[0002] 骨损伤合并感染疾病在骨外科高发，以细菌感染所致的附骨疽常见。附骨疽/痈（Bone Abscess，BA），现代医学称之为慢性骨髓炎（Chronic Osteomyelitis, CO），其临床特点为病程长、反复发作、长期不愈，骨不连发生率达10-15%，因而致残率高。目前临床采用手术清创联合抗生素局部缓释系统给药达到局部抗感染作用，已取得一定进展，降低了复发率。但骨愈合时间较长，骨修复重建困难，导致骨延迟愈合（即骨不连）发生率高，部分患者需二次手术，严重者甚至导致运动功能丧失或障碍。 [0003] 中医将慢性骨髓炎归为“附骨疽”、“附骨疽”、“骨痈”范畴，而骨不连属“骨痹”、“骨萎”范畴，中医对附骨痈的认识记载有《外科正宗》云：“夫附骨疽者，乃阴寒入骨之病也。但人之气血生平壮实，虽遇寒冷则邪不入骨。凡入者，皆由体虚之人，寒气乘虚入里，遂成斯疾也。”即是对本病病因病机的论述，“虚”是其本，而寒湿邪、病毒侵袭营血，导致气滞血瘀，髓海瘀滞而髓死骨枯为外因。简单说邪毒雍遏附骨，经络阻塞，气血凝滞是发病初期的主要病机，邪毒化热腐肌伤骨，是病情的进一步发展，正虚邪实是附骨痈的病机关键。因此内外兼治，正确处理驱邪和扶正的关系是中医治疗该病的原则。 [0004] 近些年，国内外在建立慢性骨髓炎的动物模型上已有很多报道。大多以大鼠和兔作为实验模型对象，采用胫骨钻孔接种金葡菌造成局部感染，或采用截骨形成开放性骨折制备模型。由于大鼠骨骼较细不易操作，钻孔易造成骨折，动物行动不便。由于兔的抗感染能力较强，胫骨较大，便于钻孔和金黄色葡萄球菌的接种，且接种量易于控制。但是根据文献报道，采用兔作为骨髓炎造模动物，在金黄色葡萄球菌浓度方面，往往采用每只动物注射一定剂量的菌混悬液，加上动物体重的差异，造模过程造成动物感染程度不一，死亡率高，造模成功率低；而采用开放截骨，与临床实际情况存在差异，且创伤较大，制备模型后动物难以恢复。另一方面，基于附骨痈发生发展的中医理论基础，正虚邪实是其病机关键，而寒湿邪入侵发病初始的诱因，该方面的动物模型未见文献及专利报道。 [0005] 因此，本发明建立的局部物理刺激结合金黄色葡萄球菌感染的附骨痈兔模型，造模前增加了物理刺激（冰敷）处理过程，模拟寒湿邪入侵；其次对接种细菌的浓度及接种量进行了优化。手术创伤小，造模成功率高，致死率低，造模动物活动及进食情况较好，能成功制备附骨痈兔模型，且遵循附骨痈发生发展的中医理论，符合附骨痈的发病机制。该模型的成功制备能够为附骨痈的病理机制研究，以及具有促进骨愈合的药物对附骨痈骨不连的治疗作用研究提供动物实验模型和评价指标。经文献检索，目前采用物理刺激结合细菌感染制备附骨痈兔模型的方法以及其在附骨痈骨不连治疗作用评价等方面的应用，未见文献报道及专利公开。 发明内容[0006] 本发明的目的是建立一种附骨痈模型兔的制备方法，并采用该方法应用于附骨痈骨不连的治疗中，为具有促进附骨痈骨修复治疗作用的药物评价提供实验动物模型，并建立了系统的疾病病理评价指标体系。 [0007] 为了实现上述目的，本发明建立了一种采用局部物理冰敷刺激，并结合金黄色葡萄球菌感染的方法制备附骨痈兔模型，并采用该模型进行附骨痈骨不连治疗的研究，该方法包括以下的步骤：1）动物选择及饲养条件 新西兰兔，雄性，体重2.0-2.5kg，动物饲养及整体实验均屏障级实验动物中心完成； 2）菌种复苏及培养 取金黄色葡萄球菌标准菌株的冷冻干燥菌种，加入营养肉汁琼脂培养基，振荡，使之溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，移植于营养肉汁琼脂培养基试管中，在37℃有氧条件下，培 8 养24h，与1.0麦氏单位浓度的标准比浊管进行比浊，达到统一浓度后，配制成1×10cfu/mL浓度的菌液，在12 h内使用； 3）胫骨局部物理刺激 兔子左下肢采用预冷的冰带捆缚，每天刺激3次，每次20min，2次刺激间隔30min，连续处理七天； 4）麻醉 麻醉前测量动物体重，3%戊巴比妥钠，以50mg/Kg剂量腹腔注射麻醉，给药同时观察肌肉紧张度、角膜反射和对皮肤捏夹的反应，当上述反应明显减弱或消失时即完全麻醉； 5）附骨痈模型制备 兔子固定于手术台上，左下肢胫骨至膝关节周围剃毛，聚维酮碘消毒。于胫骨前内侧缘切开皮肤，逐层分离皮下、筋膜、肌肉，剥离骨膜，显露胫骨上端前内侧，用骨钻钻孔至髓腔，抽取骨髓后，向髓腔内注射5%鱼肝油酸钠，5min后按体重注射一定浓度的金黄色葡萄球菌，孔洞用无菌骨蜡封闭，缝合皮肤，3周后对模型进行指标检测及评价； 6）术后观察及处理 所有动物麻醉清醒后单笼饲养，笼内自由活动，统一标准饲养，不使用任何抗菌药物，动物均出现患肢跛行，进食量减少等现象； 7）附骨痈模型评价 大体情况：观察动物基本情况，包括患肢局部情况，局部皮肤颜色呈暗红色、步态蹒跚、体温上升、局部肿胀并形成窦道； 血液生化指标检查：耳缘静脉取血，进行血常规、及血清ALP检查； 微生物学检查：取髓腔内组织，置于无菌牛肉汤24小时后作细菌培养，均证实为金黄色葡萄球感染菌； 三维重建CT检查：按照120KV，35mA，0.14L，DLP4，TI为2.7s条件进行扫描，经三维重建形成三维图，精确评估骨缺损面积； 病理学检查：随机选取造模成功的动物，处死取材，置10%福尔马林液中固定48小时，再冲洗后置复合脱钙液脱钙24小时，脱水、石蜡包埋切片（纵切厚度5μm），HE染色，光镜下观察新骨形成情况及骨缺损处血管化情况。根据Lane-Sandhu组织学评分法，对病理组织HE染色光镜下所见进行组织学评分； 8）附骨痈模型兔在附骨痈骨不连治疗作用评价中的应用 取步骤5）造模的动物，经过步骤6）与步骤7）的模型评价，得到造模成功的附骨痈兔模型。造模成功的动物进行分组，分为模型组，抗炎治疗组，抗炎+骨修复治疗组，同时设定空白对照组和假手术组。抗炎治疗组于胫骨前内侧缘切开皮肤，逐层分离皮下、筋膜、肌肉，剥离骨膜，显露胫骨上端前内侧，用4mm骨钻钻孔至髓腔，植入载万古霉素-硫酸钙颗粒，缝合皮肤。抗炎+骨修复治疗组植入载万古霉素-硫酸钙颗粒后，缝合皮肤，每天口服给予骨修复作用药物。每隔4周随机挑选动物，通过微生物血检查，三维重建CT检查，病理学检查等进行骨修复作用评价。 [0008] 作为优选，上述的步骤2）中菌种复苏及培养如下：取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 25923 Staphylococcus aureus subsp. aureus）的冷冻干燥菌种，加入0.3mL营养肉汁琼脂培养基，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，移植于营养肉汁琼脂培养基试管中，在37℃有氧条件下，培养24h。取试管置比浊仪中，与1.0麦氏单位浓度的标准比浊管进行比浊，达到统一浓度后，用移液枪提取0.1mL，加至1 ml的生理盐水，8 配制成1×10cfu/mL浓度的菌液，配制后12 h内使用。 [0009] 作为优选，上述的步骤3）的胫骨局部物理刺激步骤如下：兔子适应性喂养一周后，左下肢用预冷的，可塑形的冰带（5cm×15cm）敷于胫骨表面，并用弹性绷带捆缚，每天刺激3次，每次20min，2次刺激间隔30min，连续处理七天。 [0010] 作为优选，上述的步骤5）的附骨痈模型制备步骤包括：将兔子固定于手术台上，左下肢胫骨至膝关节周围剃毛，聚维酮碘消毒。于胫骨前内侧缘切开皮肤，逐层分离皮下、筋膜、肌肉，剥离骨膜，显露胫骨上端前内侧，用2mm的骨钻钻孔至髓腔，抽取骨髓后，向髓8 腔内注射0.1mL的5%鱼肝油酸钠，5min后注射4µL/kg体重的1×10cfu/mL金黄色葡萄球菌，孔洞用无菌骨蜡封闭，缝合皮肤。 [0011] 作为优选，上述的步骤7）附骨痈模型评价中大体情况：观察动物基本情况，包括患肢局部情况，局部皮肤颜色呈暗红色、步态蹒跚、体温上升、局部肿胀并形成窦道；血液指标：碱性磷酸酶（ALP）、白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（CRP）模型组与空白对照组相比显著升高，假手术组与空白对照组相比指标显著提升，且低于模型组；三维重建CT检查：按照120KV，35mA，0.14L，DLP4，TI为2.7s条件进行扫描，经三维重建形成胫骨三维图，并在二维层面，精确评估骨缺损面积；病理学检查：随机选取造模成功的动物，处死取材，置10%福尔马林液中固定48小时，再冲洗后置脱钙液脱钙24小时，脱水、石蜡包埋切片（纵切厚度5μm），HE染色，光镜下观察病灶局部，自骨髓外周结缔组织及骨组织至骨髓内，均见大量中性嗜酸性粒细胞呈弥散性浸润，成骨细胞与破骨细胞均大量分布，破骨细胞周围有大量深紫色的炎症细胞，骨小梁明显减少，未见新骨形成。 [0012] 本发明由于采用了上述的技术方案及步骤，具有以下的特点：1、理论创新性 本发明采用局部冰敷物理刺激造成寒湿邪入侵的模型，符合附骨痈的发病机制。该方法方便可行，能够为附骨痈的病理过程以及发病机制等提供实验动物模型，开展以中医理论为指导的病理机制及药物干预评价研究。 [0013] 2、方法优越性本发明发明了一种物理刺激结合细菌感染制备附骨痈兔模型，目前国内的文献和专利中未见报道，该方法与传统的附骨痈模型比较，严格控制菌悬液的浓度，造模成功率高，且手术创伤小，造模成功后动物皮肤的愈合情况较好，动物活动和进食情况均较好。 [0015] 图1为局部物理刺激图。 [0016] 图2为手术造模过程图。 [0017] 图3为模型验证图(A、B、F、G为模型感染灶，C、D为骨组织病理图，H、I为骨膜病理图，E、J为CT三维重建图）。 [0018] 图4~图6为造模过程中血液指标动态变化图。 [0019] 图7为治疗前、后各组动物骨CT扫描三维重建图。 具体实施方式[0020] 下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。 [0021] 一种附骨痈模型兔的制备方法及其应用，该方法包括以下的步骤：1）动物选择及饲养条件 新西兰兔，雄性，体重2.25±0.25 kg，动物饲养及整体实验均在屏障级实验动物中心完成； 2）菌种复苏及培养 取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 25923 Staphylococcus aureus subsp. aureus）的冷冻干燥菌种，加入0.3mL营养肉汁琼脂培养基，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液，移植于营养肉汁琼脂培养基试管中，在37℃有氧条件下，培养24h。取试管置XXX中，与1.0麦氏单位浓度的标准比浊管进行比浊，达到统一浓度后，用移液枪提取 8 0.1mL，加至1 ml的生理盐水，配制成1×10cfu/mL浓度的菌液，立即使用； 3）胫骨局部物理刺激 兔子适应性喂养一周后，左下肢用预冷的，可塑形的冰带（5cm×15cm）敷于胫骨表面，并用弹性绷带捆缚，每天3次，每次20min，2次之间间隔30min，连续处理七天； 4）麻醉 麻醉前测量动物体重，3%戊巴比妥钠，以50mg/Kg剂量腹腔注射麻醉，给药同时观察肌肉紧张度、角膜反射和对皮肤捏夹的反应，当上述反应明显减弱或消失时即完全麻醉； 5）附骨痈模型制备 兔子固定于手术台上，左下肢胫骨至膝关节周围剃毛，聚维酮碘消毒。于胫骨前内侧缘切开皮肤，逐层分离皮下、筋膜、肌肉，剥离骨膜，显露胫骨上端前内侧，用2mm的骨钻钻孔至髓腔，抽取骨髓后，向髓腔内注射0.1mL的5%鱼肝油酸钠，5min后用200µL的微量注射器 8 注射40µL/kg体重的1×10cfu/mL金黄色葡萄球菌，孔洞用无菌骨蜡封闭，缝合皮肤； 6）术后观察及处理 所有动物麻醉清醒后单笼饲养，笼内自由活动，统一标准饲养，不使用任何抗菌药物，动物均出现患肢跛行，进食量减少等现象； 7）附骨痈模型评价 大体情况：观察动物基本情况，包括患肢局部情况，局部皮肤颜色呈暗红色、步态蹒跚、体温上升、局部肿胀并形成窦道。 [0022] 血液指标检查：耳缘静脉取血，进行血常规、及血清ALP检查，结果见表1-3。模型组与空白对照组相比，碱性磷酸酶（ALP）、白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（CRP）显著升高，假手术组与空白对照组相比指标显著提升，但低于模型组。 [0023] 表1 造模手术前及术后2、4周碱性磷酸酶（ALP）指标变化表1) 2) 3) 注：与空白组比较，p<0.01，与假手术组比较 p<0.01，p<0.05。 [0024] 表2 造模手术前及术后2、4周超敏C反应蛋白（CRP）指标变化表1) 2) 注：与空白组比较，p<0.01，与假手术组比较 p<0.01。 [0025] 表3 造模手术前及术后2、4周白细胞计数（WBC）指标变化表1) 2) 注：与空白组比较，p<0.01，与假手术组比较 p<0.01。 [0026] 微生物学检查：取髓腔内组织，置于无菌牛肉汤24小时后作细菌培养，均证实为金黄色葡萄球感染菌。 [0027] 三维重建CT检查：按照120KV，35mA，0.14L，DLP4，TI为2.7s条件进行扫描，经三维重建形成三维图，并在二维层面，精确评估骨缺损面积。 [0028] 病理学检查：随机选取造模成功的动物，处死取材，置10%福尔马林液中固定48小时，再冲洗后置脱钙液脱钙24小时，脱水、石蜡包埋切片（纵切厚度5μm），HE染色，光镜下观察病灶局部，自骨髓外周结缔组织及骨组织至骨髓内，均见大量中性嗜酸性粒细胞呈弥散性浸润，成骨细胞与破骨细胞均大量分布，破骨细胞周围有大量深紫色的炎症细胞，骨小梁明显减少，未见新骨形成。 [0029] 8）附骨痈模型兔在附骨痈骨不连治疗作用评价中的应用取步骤5）造模的动物，经过步骤6）与步骤7）的模型评价，得到造模成功的附骨痈兔模型。造模成功的动物进行分组，分为模型组，抗炎治疗组，抗炎+骨修复治疗组，同时设定空白对照组和假手术组。抗炎治疗组于胫骨前内侧缘切开皮肤，逐层分离皮下、筋膜、肌肉，剥离骨膜，显露胫骨上端前内侧，用4mm骨钻钻孔至髓腔，植入载万古霉素-硫酸钙颗粒，缝合皮肤。抗炎+骨修复治疗组植入载万古霉素-硫酸钙颗粒后，缝合皮肤，每天口服给予骨修复作用药物。每隔4周随机挑选动物，通过微生物血检查，三维重建CT检查，病理学检查等进行骨修复作用评价。 [0030] 治疗后10周，血液指标检测结果见表4。治疗组与模型组相比，碱性磷酸酶（ALP）、白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（CRP）显著降低，治疗组与假手术组相比，假手术组WBC、CRP指标高于治疗组，ALP低于治疗组。 [0031] 表4 治疗后10周血液指标变化表注：治疗组与模型组比较，1)p<0.01，治疗组与假手术组比较2)p<0.01，3)p<0.05。 [0032] 治疗前及治疗后10周，各组动物CT扫描三维重建图见图4，可见抗炎+骨修复组骨缺损面积显著缩小，与模型及假手术组相比，有显著性差异，提示该组治疗方法具有较好的骨修复治疗作用。 |
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