염증성 조직을 진단하기 위한 치과적 용도의 츄잉검

염증성 조직을 진단하기 위한 치과적 용도의 츄잉검 {CHEWING GUM FOR THE DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY TISSUES IN DENTAL APPLICATIONS}

본 발명은 염증성 조직을 진단하기 위한 치과적 용도의 기구, 보다 상세하게는 츄잉 검에 관한 것이다.

최근 컨센서스 미팅에서, 임플란트 치아의 약 12 - 40%에서 임플란트 주위염 (peri-implantitis)이 발생하는 것으로 결론지어졌다. 이는 임플란트 주위염이 오늘날 임플란트에 대한 신뢰도와 성능 진전에 진정한 위협 요소가 된다는 것을 말해준다.

대부분의 의사들이 채택하는, 임플란트 주위 감염 및 임플란트 주위염 (감염성 임플란트 합병증에서 가장 진행된 상태)을 진단하는 현재의 기술은 아마 BOP (bleeding on probing)일 것이다. 기본 전제는, BOP가 염증과 진행된 조직의 분해를 나타내는 것이며, 따라서, 대부분의 의사들이 임플란트 측면에서 임플란트 주위염에 대한 지표로 본다는 것이다. 이런 관점은 매우 단순하다. 반복적인 출혈이 관찰되지 않으면 음성 예측도가 매우 높은데 (98%; 즉, 치아와 주변 조직은 건강함) 반해, 출혈의 존재는 예후를 예측하지 못하는 (양성 예측도 6%; 즉, 치아와 주변 조직에 대한 질병 상태를 예측하는데 소용없음) 것으로 확인되고 있다.

MMP-8과 같은 시스템을 비롯하여, 콜라게나제 발현을 현장 진단 (PoC: point of care)으로 측정 가능한 새로운 검사법이 이용가능하다. 열구액 (sulcus fluid)에서 검출되는 MMP-8은 염증성 조직을 가지고 있는 환자들을 건강한 개체와 분류하는 예측 수단이며, 즉, MMP-8은 예후력이 높은 것으로 입증되고 있다. 아울러, MMP-8의 수준은 성공적인 의학적 개입 이후에 정상으로 복원되므로, 치료 개시 후 2주 이내에, 특수한 임플란트 염증 상황에서의 치료학적 성공을 모니터링할 수 있다.

MMP-8의 수준을 열구액에서 측정하는 현장 진단 또는 PoC 기술은 복잡하다. 검사용 스트립을 치과 의사가 대상 부위에서 채취한 열구액에 담근 다음, ELISA와 같은 반응을 수행하여 MMP-8 활성을 판독하는 컴플렉스 디바이스로 옮겨야 하는데, 사실, 복잡하고, 비싸며, 시스템을 다루기 어렵다.

입 안 조직의 염증 정도에 따른 메탈로프로테나제 활성의 존재 및 수준을 다루고 있는 과학 논문들이 상당히 많이 존재한다. 예로, Tschesche, Journal of protein chemistry 17 (6) 41, 1998, 549-551; Pozo et al in Journal of periodontal research 40 (3), 2005, 199-207; Kahrmaran et al in Disease markers, 30 (6), 2011, 299-305 및 Barnett et al in Journal of periodontology, 79 (5), 2008, 819-826을 참조한다.

WO-A-2007/133721에서는, 매트릭스 메탈로프로테나제 활성 및 인터루킨-1 활성을 저해하는 천연 화합물을 포함하는 조성물을 개체에게 투여함으로써, 개체에서 치주 질환의 징후 또는 증상을 완화하는 방법을 제시하고 있다.

이에, 본 발명의 과제는 치과 분야에서 염증성 조직을 검출하기 위한 새로운 접근 방식을 제공하는 것이다.

이러한 과제와 그외 과제들은 특허청구범위에 기재된 발명에 의해 달성된다.

구체적으로, 본 발명은, 사용자의 입 안, 특히 하악골, 상악골, 임플란트 또는 치아에서 또는 그 부근에서 염증성 조직의 존재를 동정하기 위한 진단용 츄잉 검에 관한 것이다. 본 발명에서, 이러한 츄잉 검은 한가지 이상의 베이스 물질 또는 상기 베이스 물질에 임베디드(embeded)되어 있거나 및/또는 부착된 입자; 하나 이상의 요소 (elemnet), 예를 들어 사용자에 의해 직접 검출가능한 변화를 츄잉 검에서 발생시키는 분자 (즉, 오감, 즉 시각 - 눈을 이용한 인지, 청각 - 소리 인지, 미각 - 맛 인지, 후각 - 후각을 이용한 인지 및 촉감 - 접촉 인지, 및 이들의 임의 조합)를 포함한다. 본 발명에서, 상기 요소는 세균성 매개인자에 대한 반응으로 염증성 조직에 의해 분비되는 마커와의 직접 또는 간접 접촉시 변화를 발생시킨다.

이와 같은 츄잉 검의 의학적 사용은 공지되어 있다. 예를 들어, DE 3700180호에서는 츄잉 검을 입에서 꺼낸 다음, 예컨대 사용자의 DNA 측면에서 분석가능하며, 스폰지 같이 사용자의 타액을 흡수하는, 일반적인 츄잉 검의 작용과는 다른, 츄잉 검을 제공하고 있다. 또한, 츄잉 검에 색 표시제 (colourant indicator)를 포함시키는 것도 제안되고 있다. 그러나, 분석 목적용 및 실제 진단용 츄잉 검은 사용자의 입에서 꺼내야 한다. 또한, US 2011/0081673은 진단 목적을 위한, 이 경우에는 당뇨병을 진단하기 위한 츄잉 검에 관한 것이다. 여기서, 츄잉 검은 효소, 예를 들어, 서양고추냉이의 퍼옥시다제를 함유하여 제공되며, 사용자의 타액에 존재하는 글루코스에 따라 츄잉 검의 색이 변하므로, 츄잉 검을 꺼내어 이를 색 차트와 비교함으로써 당뇨병 위험성을 확인할 수 있다. 또한, WO 01/14875는 사용자의 타액에서 pH 값을 검출하기 위한 츄잉 검에 관한 것이다. 해당 pH 민감성 물질이 검 베이스에 분산되어 있어, pH에 따라 색이 변하게 된다. 그러나, 이러한 종래 기술들은 모두 입 안 염증성 조직의 검출이 아니거나 또는 이러한 용법과는 관계가 없는 것이다.

반면, 본원에서 제안된 시스템은 환자가 자가-모니터링할 수 있다. 예를 들어, 그 순서는 다음과 같다: 조직 분해에 반응하여, (i) 변화, 예를 들어, 매우 쓴 맛 형태의 변화가 시스템에 의해 표출되고, (ii) 이 쓴 맛을 환자가 기록할 수 있다. (iii) 이 기록을 토대로, 진단을 행할 수 있으며, (iv) 적절한 경우 조기에 치료를 시작할 수 있다.

앞에서 지적한 바와 같이, 임플란트 주위염은 오늘날 임플란트의 신뢰성과 성능 향상에 진정한 위협이 된다. 본 발명은, 치은염/점막염과 치근막염 (농루 (pyorrhea), 치주염 (parodontitis) 또는 치조농루 (paradontitis)라고도 함) / 임플란트 주위염 (도 1 참조) 사이의 경계 선이 되는, 결합 조직의 분해를 감시하기 위해, 인간 감각, 특히 예를 들어 맛/미각 시스템을 적절하게 사용함으로써, 이러한 문제를 해결한다. 이는, 근본적으로, 새롭고 이용이 용이한 진단 툴이며, 임플란트 주위염의 발병 위험성에 대해 개체를 식별 및 계층화하고, 의학적인 위험 평가를 하기 위한 새로운 기회를 제공해주며, 따라서 초기 단계에 가능한 개입이 행해질수 있게 한다. 이러한 초기 검출은, 선제적이고, 성공적이며, 복잡하지 않으며, 충분히 허용되는 치료를 가능하게 한다. 본원에서 추구하는 후술되는 전략은, 현행 현장 진단 (PoC; 즉, 실무자의 사무실)에서 자가-모니터링으로의 변천 측면에서 혁신적이므로, 임상적으로 뚜렷하게 나타나지 않으며, 후기 병기에서 필연적인 보다 과격한 개입과는 대조적으로, 상대적으로 온건한 치료학적 개입으로도 임플란트와 주변 조직에 대한 추가적인 손상을 예방할 수 있는 충분한 초기의 질병 병기에서, 치과 의사의 도움을 받을 수 있게 한다는 것이다 (도 1 참조).

완전히 새로운 진단 플랫폼은 몇몇 요인들에 대한 진보된 기술력을 입수하는 방식에 의해 개발되어 왔다.

임플란트 주위 감염증과 이의 가장 중증인 형태, 즉 임플란트 주위염의 질환 진행은 미생물 감염 (microbial challenge)과 생물막 형성에서 시작된다. 미생물 감염은 세균성 매개인자, 예를 들어 대규모 대식세포 침윤 (Φ)을 유발하는 리포폴리사카라이드 (LPS; 그람 박테리아의 세포벽 구성 인자)에 반응하는, 숙주의 방어 반응 (사이토카인 및 그외 신호들의 분비)을 촉발시킨다. 이는, MMP 등의 다양한 단백질 분해 효소들을 분비할 수 있는 Φ이다. 테스트한 수많은 다른 MMP들 중에서도, II형 콜라게나제라고도 하는 MMP-8은 치주낭 형성 강화 (enhanced pocket formation), 유착 소실, 골 재흡수, 잇몸 퇴축, 이/치아 임플란트 가동성 및 최종적으로 이/치아 임플란트 유실을 통한 임상적인 진행을 예측하는 강력한 예후력을 입증받았다. MMP-8은 치밀 조직의 콜라겐 네트워크를 파괴함으로써, 세균을 없애기 위한 전제 조건인 효과적인 Φ 침윤을 가능케 하며, 다시 말해, MMP-8 활성은 잇몸 결합 조직을 파괴하는 일차적이고 임상적으로 완전히 가역적인 단계와 직접 연결되어 있다 (도 1 참조, 상단의 2번째 및 3번째 박스). 임플란트 주위 감염에서 MMP-8의 상향 조절은 다른 염증성 치아 질환에 비해 매우 강하다. 예를 들어, 건강한 부위의 열구액 흡입물내 MMP-8 농도를 임의적으로 1 U (치주낭 깊이 3.3 mm; 치은 치수 (GI) 0.6)로 설정하면, 중등도의 만성 치근막염에서는 80 U (치주낭 깊이 5.6 mm; GI 1.6)까지, 중증의 만성 치근막염에서는 78 U (치주낭 깊이 5.9 mm; GI 2.0)까지 상승한다. 반면, MMP-8은, 건강한 임플란트 (치주낭 깊이 2.4 mm; GI 1.0)와 비교하여, 임플란트 주위염 환자에서는 950 U 보다 높은 수준으로 상향 조절된다 (치주낭 깊이 5.0 mm; GI 2.0). 즉, MMP-8은, 임플란트 주위염과 같은 좀더 중증인 질환 상태가 되기 훨씬 전에, 임플란트 주위 감염을 감지하는 극도로 민감한 예측 바이오마커이다. 본 제안에서 다루어지는 문제는 시스템 (도 1에 개념적으로 제시됨)과 도 2에 개괄적으로 도시된 기능을 이용하여 환자가 MMP-8의 활성을 자가-진단할 수 있다는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이에, 변화를 유도하는 마커는 염증성 조직, 바람직하게는 대식세포에 의해 분비 또는 상향 조절되는 단백질 분해 효소이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 변화를 유도하는 마커는 가장 바람직하게는 매트릭스 메탈로프로테나제 (MMP), 바람직하게는 활성화된 MMP이다. 바람직하게는, 매트릭스 메탈로프로테나제-8 (MMP-8), 활성화된 매트릭스 메탈로프로테나제-8 (aMMP-8), 매트릭스 메탈로프로테나제-2 (MMP-2), 활성화된 매트릭스 메탈로프로테나제-2 (aMMP-2), 매트릭스 메탈로프로테나제-9 (MMP-9), 활성화된 매트릭스 메탈로프로테나제-9 (aMMP-9) 또는 이들의 조합은, 사용자 인지가능한 변화를 츄잉 검에서 촉발시키는 대상 마커이다.

미각 시스템은 원칙적으로 단 맛, 신 맛, 짠 맛 및 쓴 맛을 인지하는 4가지 기본적인 미각 아양상 (taste submodality)을 가진다. 최고 감각은 쓴 맛이며, 쓴 맛은 유럽 약전에서 개략적으로 서술된 방법을 이용하여 환자간 편차를 조절하기 위해 보정할 수 있다. 단 맛은 환자들 간에 보정하기 더 어렵지만, 전략으로서, 단 맛 감지에 대해 개체별로 보정해야하는 잠재적인 난제들에도 불구하고도 사용되고 있다. 인간의 혀는, 10 ⁵ 에 이르는, 단 맛과 쓴 맛을 느끼는 흥미로운 감지 범위를 제공한다. 퀴닌 설페이트 (쓴 맛)는 0.0004 mM 까지 감지하며, 심지어 오늘날 이용가능한 가장 진보된 분석 검출기에 필적한다. 인공 감미료, 사카린은 평균적으로 인간이 0.02 mM 까지 감지한다. 본 출원에서, 일부 짧은 펩타이드들을 전형적으로 0.05 - 6 mM에서 감지할 수 있으며, 이런 통찰을 절단시 쓴 맛을 발생시키는 시스템으로 펩타이드 서열을 설계하는데 이용하였다. 이런 전략을 통해, 절단된 펩타이드 서열 자체가 질병에 걸린 환자에 의해 인지되는 쓴 맛을 매개하기 때문에, 향미 물질을 커플링시키는 것을 피할 수 있다.

결론적으로, 특히, MMP-8 (시스템 1) 프로테아제 민감성 시스템은 임플란트 주위 질환들을 초기에 검출하고 지속적으로 감시하는데 필요한 능력을 치과 의사에게 제공해준다. MMP-8 민감성 시스템은 초기에 결합 조직 손상을 인지한다. 이 시스템은 환자의 구강 건강에 대한 직접적인 관련성을 이용하여 임플란트 주위 질환들을 초기에 모니터링하기 위한 근본적으로 새롭고 사용하기 쉬운 도구를 환자와 치과 의사에게 제공해준다.

제안된 시스템은 임플란트 주위 감염에 대해 본원에 기술된 원칙에 따라 구강 및 점막의 변동를 감지하는 등의 광범위한 사용을 목표로 한다.

따라서, 본 시스템은 임플란트 주위 감염에 대한 모니터링을 복잡한 장치를 이용한 측정에서 사용자의 인간 눈 또는 인간 혀를 민감성 검출기로서 이용한 자가-모니터링으로 근본적으로 바꾼다. 구강 건강 상태에 대한 모니터링을, 치과 진찰로 한정하기 보다는, 본 방식은 자주 자가-모니터링하여, 양성 신호일 때 개체가 치과에 방문하여 세밀하게 진단받을 수 있게 한다.

본 시스템 (도 2 참조)은 임상적으로 뚜렷하지 않은 구강 질환에 걸린 조직을 초기에 검출하는 방식이다. 주된 혁신적인 측면은 다음과 같다:

- 염증 질환 또는 그외 질환을 모니터링하는데 인간의 맛 감지/미각 시스템을 사용한다는 것은 근본적으로 새롭다.

- 임플란트 주위 질환의 최초기 신호를 모니터링하기 위해, 인지가능한 반응을 제공하는 결합 조직 손상을 감지하는 치아 임플란트 시스템은 개시된 바 없다.

- 진단 측면을 구비한 츄잉 검은 알려져 있지만, 구강 질환 발병을 예측하는 활성화된 효소의 상향 조절에 반응하는 것은 공지되어 있지 않다.

- 임플란트 주위 질환에서 다른 프로테아제에 비해 MMP-8을 선호적으로 감지하는데 필수적인 성능을 제공하는 MMP-8 감시 시스템을, 공지된 서열들에서 선택함

- 본원에서 수행되는 바와 같이, MMP-8 상승과 임플란트 주위 질환의 연관성은, 문헌에서 데이타 세트에 의해 입수가능한 정보를 우선시하여, 임플란트 주위 영역의 타겟화된 질환 상태에 대해 본 시스템의 민감성과 선택성을 미세-조정 및 개조하기 위한 신뢰성있는 토대를 제공해준다.

- 현행 커플링 기법들을 이용하여, 플라스틱 (구형 시스템) 표면 또는 검에 직접 펩타이드 서열을 부가한다.

커플링된 향미 물질은, 펩타이드 서열의 부착시, 이의 (쓴) 맛 포텐셜이 감소할 수 있다. 이런 위험은 (쓴) 맛을 내는 분자에서 여러가지 커플링 부위들을 선택함으로써, 여러가지 (쓴) 맛을 내는 분자들을 선택함으로써, 그리고 쓴 맛을 유발하는 것으로 알려진 쓴 맛을 내는 펩타이드 서열들을 설계함으로써, 낮출 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 요소는, 한편으로는, 마커와의 직접 또는 간접 접촉시 사용자의 육안으로 인지가능한 색 변화를 이행하며, 베이스 물질 또는 상기 베이스 물질에 임베디드되거나 및/또는 부착된 입자에 임베디드되어 있거나 부착된, 분자 또는 분자 어셈블리 (molecular assembly)일 수 있다.

한편, 요소는 베이스 물질 또는 상기 베이스 물질에 임베디드되거나 및/또는 부착된 입자에 부착된, 해리가능한, 바람직하게는 공유 결합된 해리가능한, 향미 분자일 수 있다.

향미 분자는, 수소 결합을 이용하거나, 또는 마커와 직접 또는 간접 접촉시 절단될 수 있는 분자 체인을 이용함으로써, 베이스 물질 또는 상기 베이스 물질에 임베디드되거나 및/또는 부착된 입자에 (해리가능하게) 부착될 수 있다. 해리는, 예를 들어, 마커 자체에 의한 분자 체인의 라이시스 (lysis)에 의해서도 가능하지만, 또한, 향미 분자의 지지체에 대한 결합 상수 감소 및 대응되는 맛을 감지하기 위한 분자의 분리에 상응하는, 형태 변화 등의 유도에 의한 링커 또는 다른 관련 요소에 대한 마커의 부착 또는 응집 등의 기전에 의해서도 가능하다.

분자 체인은, 예를 들어, 폴리펩타이드 체인, 당 체인 또는 이들의 조합일 수 있다. 폴리펩타이드 체인의 경우, 이것은 바람직하게는 아미노산 2-15개, 가장 바람직하게는 3-7개로 구성되며, 바람직하게는, 링커 분자는 고정 요소를 통해 직접 또는 간접적으로 베이스 물질 또는 상기 베이스 물질에 임베디드되거나 및/또는 부착된 입자에 부착된다.

예를 들어, 퀴닌, 카페인 (caffeine), 테오브로민 (theobromine), 나린긴 (naringin), 수크랄로스 (sucralose) 또는 네오탐 (neotame)과 같이 쓴 맛을 내는 향미 분자를 부착하기 위해, 마커와의 직접 또는 간접 접촉 시 절단가능한 분자 체인으로서 사용할 수 있는 링커 서열들은, 아래 시스템으로 제시되며, 여기서 MMP-8 시스템에 의해 절단되는 부위는 /로 표시된다:

Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 1);

Gly-Asn-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 2);

Gly-Leu-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 3);

Gly-Pro-Asp-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 4);

Gly-Pro-Leu-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 5);

Gly-Pro-Gln-Glu/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 6);

Gly-Pro-Gln-Phe/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 7);

Gly-Pro-Gln-Arg/Ile-Ala-Gly-Gln (서열번호 8);

Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Ala-Gly-Gln (서열번호 9);

Gly-Pro-Gln-Gly/Tyr-Ala-Gly-Gln (서열번호 10);

Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Phe-Gly-Gln (서열번호 11);

Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Glu-Gly-Gln (서열번호 12);

Ala-Ser-Gln-Lys-Arg-Pro-Ser-Gln-Arg-His-Gly-Ser-Lys-Tyr/Leu-Ala-Thr-Ala-Ser (서열번호 13);

Ala-Ser-Gln-Lys-Arg-Pro-Gln-Arg-Ser-Lys-Tyr/Leu-Ala-Thr-Ala-Ser (서열번호 14);

Ac-Pro-Leu-Gly-(2-mercapto-4-methyl-pentanoly)-Leu-Gly-OEt (서열번호 15);

Ac-Pro-Leu-Gly-S-Leu-Leu-Gly-OC2H5 (서열번호 16);

Ac-Pro-Leu-Gly-S-CH2CH(CH3)CH2CH3 (서열번호 17);

Ac-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-GIy-OC2H5 (서열번호 18);

DNP-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH (서열번호 19);

Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Lys (Dnp)-Ala-Arg-NH2 (서열번호 20);

(Gly-Pro-Hyp)5-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dnp)-Gly-Val-Arg-(Gly-Pro-Hyp)5-NH2 (서열번호 21);

(Gly-Pro-Hyp)5-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Lys(-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dnp)-Gly-Val-Arg-(Gly-Pro-Hyp)5-NH2 (서열번호 22);

(Gly-Pro-Hyp)4-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dnp)-Gly-Val-Arg-Gly-Leu-Hyp-Gly-Gln-Arg-Gly-Glu-Arg-(Gly-Pro-Hyp)4-NH2 (서열번호 23).

향미 분자는, 해리 시, 바람직하게는 사용자의 미각 시스템을, 바람직하게는 단 맛 및/또는 쓴 맛을 자극함으로써 촉발시킨다.

향미 분자는, 링커와 함께, 그 자체가 펩타이드일 수 있으며, 그래서, 예를 들어, 하기 시스템 조합들 중 하나일 수 있으며, 여기서, / 표시의 우측 부분은 해리시 미각적인 감각을 제공해준다:

Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln-Arg (서열번호 24);

Gly-Thr-Ala-Gly-Pro-Pro/Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (서열번호 25);

일반적으로, 아래 쓴 맛 서열들은 / 표시의 좌측 부분에 전술한 링커 펩타이드를 취하여, 조합될 수 있다:

.../Ile-Ala-Met-Glu-Lys ((서열번호 26);

.../Leu-Leu-Gly-Ala-Ile-Leu (서열번호 27);

.../Ile-Ala-Gly-Ile-Phe-Pro (서열번호 28);

.../Ile-Ala-Phe-Pro (서열번호 29);

.../Ile-Ala-Gly-Ile (서열번호 30);

.../Ile-Phe-Phe-Pro (서열번호 31);

.../Ile-Phe-Ile-Phe (서열번호 32);

.../Ile-Phe-Val-Leu (서열번호 33);

.../Ile-Phe-Trp-Ile (서열번호 34);

.../Ile-Phe-Trp-Tyr (서열번호 35);

.../Tyr-Ile-Phe-Pro-Lau-Val (서열번호 36);

.../Ile-Trp-Gly-Gln (서열번호 37);

.../Ile-Trp-Ile-Phe (서열번호 38);

.../Ile-Trp-Gly-Pro (서열번호 39);

.../Ile-Ala-Gly-Gln-Ile-Tyr-Pro-Ile (서열번호 40);

.../Ile-Ser-Pro-Pro-Pro-Gly (서열번호 41);

.../Ile-Ala-Gly-Gln-Val-Val-Val (서열번호 42);

.../Gly-Pro-Phe-Pro-Val-Ile (서열번호 43);

.../Phe-Ala-Leu-Pro-Glu-Tyr-Leu-Lys (서열번호 44);

.../Leu-Ile-Tyr-Pro-Ile (서열번호 45);

절단부 바로 앞에 에틸화 또는 아세틸화를 사용하여 쓴 맛을 낮출 수 있다. 예를 들어:

OEt-Gly-Pro-Leu-Gly/...(서열번호 46);

CH3(O)C-Gly-Pro-Leu-Gly/...(서열번호 47).

일반적으로, 쓴 맛 부분의 서열에는, Tyr, Ile, Tyr, Phe, Pro, Leu, Val의 조합과 Tyr, Ile, Tyr, Phe, Pro, Leu, Val의 조합이 사용될 수 있다. 마커와의 직접 또는 간접 접촉시 발생되는 변화는, 또 다른 바람직한 구현예에서, 사용자의 타액에서 마커가 최소 농도에까지 도달하였을 때 촉발된다. 바람직하게는, 마커와의 직접 또는 간접 접촉시 발생되는 변화는, 사용자의 타액에서 매트릭스 메탈로프로테나제 마커, 특히 매트릭스 메탈로프로테나제-8 (MMP-8) 또는 활성화된 매트릭스 메탈로프로테나제-8 (aMMP-8)가 최소 농도 이상으로 도달하였을 때 촉발되며, 사용자에 의해 직접 검출가능한 변화를 츄잉 검에서 발생시키기 위한 타액내 마커의 상기 최소 농도는 1 ng/ml 이상, 바람직하게는 5 ng/ml 이상, 더 바람직하게는 8 ng/ml 이상이다.

마커와의 직접 또는 간접 접촉시 발생되는 변화는, 바람직하게는, 사용자의 타액에서 마커가 최소 농도 이상으로 도달하였을 때 촉발되며, 여기서, 바람직하게는, 마커는 매트릭스 메탈로프로테나제, 특히 매트릭스 메탈로프로테나제-8 (MMP-8) 또는 활성화된 매트릭스 메탈로프로테나제-8 (aMMP-8)이며, 사용자에 의해 직접 검출가능한 변화를 츄잉 검에서 발생시키기 위한 타액내 마커의 최소 농도는 1-6000 ng/ml, 바람직하게는 5-4000 ng/ml, 가장 바람직하게는 8-2000 ng/ml 범위이다.

치근막염을 검출하기 위한 마커의 최소 농도는, 전형적으로, 임플란트 주위염을 검출하기 위한 마커의 최소 농도 보다 10배, 바람직하게는 100배, 더 바람직하게는 500배 낮으며, 보다 더 바람직하게는, 이러한 임계 농도 차이를 토대로, 츄잉 검에서 사용자에 의해 직접 검출가능한 변화 발생은 치근막염과 임플란트 주위염 간에 차이가 있다.

요소는 5-300 ㎛, 바람직하게는 20-250 ㎛ 범위의 크기를 가진 입자에 부착될 수 있으며, 바람직하게는, 상기 입자는 폴리머 또는 코폴리머, 또는 (코)폴리머 혼합 또는 (코)폴리머 블렌드 (blend), 바람직하게는, 폴리스티렌, 폴리(메틸메타크릴레이트), 또한 가능하게는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(비닐클로라이드), 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리설폰, 폴리(에테르설폰), 폴리에테르, 폴리(에테르-케톤), 폴리(에테르-에테르-케톤), 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리(비닐리덴플루오라이드), 폴리에스테르, 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리우레탄, 폴리이미드, 폴리(에테르-이미드), 폴리(부타디엔), 폴리(비닐부티랄), 폴리안하이드라이드, 폴리(아미노산), 폴리(오가노실록산), 셀룰로스, 키틴 또는 이들의 혼합 또는 블렌드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머 또는 코폴리머를 기재로 한다. 본 시스템은 예를 들어 가교 공정을 통해 3차원 매트릭스를 형성할 수 있다. 3차원 매트릭스는 카르복시기, 아미노기, 티올기 또는 이들의 조합을 기재로 할 수 있다. 바람직하게는, 3차원의 카르복시기 매트릭스를 가진 폴리(메틸메타크릴레이트)가 사용된다.

바람직하게는, 요소 또는 상호연결성 고정 요소 (interlinked anchoring element)는, 통상적인 커플링 기법, 바람직하게는 이황화 결합에 의한, 소듐 아지드를 이용한 에스테르화 브롬 화합물의 구현 또는 다이카르복시산, 다이이소시아네이트 또는 다이에폭사이드를 통한 커플링을 이용함으로써, 입자에 부착된다. 요소 또는 상호연결성 고정 요소는, 펩타이드 커플링 방법을 이용한 아미드 형성, 이황화 결합, 카르보디이미드-활성화된 에스테르화와 같은 공정을 이용한 에스테르 형성, 다이이소시아네이트 또는 다이이소티오시아네이트와의 반응에 의해 형성되는 우레탄, 우레아 또는 이소티오유레아 형성, 다이에폭사이드 또는 활성화된 할로알킬 유도체와 같은 에폭시기를 함유한 분자와의 반응을 통한 에테르 형성, 다이알데하이드와의 반응 후 환원성 아민화, 예를 들어, 티올-변형된 것과 아크릴화된 반응 파트너의 반응에 의해 수행되는 바와 같은 미카엘-타입의 부가 반응, 또는 Cu(I)-촉매화된 아지드-알킨 [3+2] 첨가환화와 같은 공지된 클릭 화학 커플링 프로토콜에 의해, 입자에 부착시킬 수 있다. 염증성 조직으로 인한 구강의 및/또는 점막의 변동는, 변이, 특히 치은염, 점막염, 치근막염, 임플란트 주위염 또는 이들의 조합과 같은 염증성 상태 중 한가지 이상을 유발한다.

아울러, 본 발명은 사용자의 입 안, 특히 하악골, 상악골, 임플란트 또는 치아에서 또는 그 부근에서 염증성 조직을 검출하기 위한, 전술한 츄잉 검의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 구현예들은 독립항으로 기술된다.

본 발명의 바람직한 구현예들은 도면을 참조하여 아래에서 기술되며, 이는 본 발명의 바람직한 구현예를 예시하기 위한 목적일 뿐 이로 한정하기 위한 것은 아니다. 도면들에서,
도 1은 임플란트 주위 감염에 대한 발병 위험 인자를 초기에 진단하기 위한 본 출원에 따른 진단 방법을 개략적으로 나타낸 것으로, 본 시스템 (박스 5)은 치은염/점막염 및 치근막염/임플란트 주위염의 경계부에 존재하는, 결합 조직 분해를 표시하는 메트릭스 메탈로프로테나제 (MMP) 조절을 감지하며; 현재 합병증들은 임상 징후가 나타나면 (박스 4), 전형적으로, 질병 진행이 비가역적일 수 있으며 영구적인 합병증이 지배적일 수 있는 병기로 인지되며; 오늘날, 단회 측정은, 치과에서, 문제가 발생한 임플란트 주위에서 채취한 열구액 샘플에서 우선적으로 MMP-8을 측정하는 현장 진단 시스템을 이용하여 행할 수 있으며, 이때, 본래, 이러한 단회 측정은 제한적인 정보를 제공해주지만; 본원에서 제안된 시스템은 요구시 자가-모니터링가능하게 설계되어, 환자는 지속적인 모니터링을 제공받으며, 이를 토대로 치과 의사가 초기에 합병증을 진단할 수 있다;
도 2는 (A) 고정 요소 (좌측)와 향미 물질 (우측) 사이에 위치한 MMP-8 프로테아제 민감성 펩타이드 서열 (가운데 부분)이 어떻게 기능적으로 연결되어 있는지; (B) 본 출원에서 시스템으로 언급된, 입자 또는 다른 표면에 서열이 연결된 방식; 특정 수준의 MMP-8과의 접촉시, 펩타이드 서열이 절단되고, 떨어져 나온 향미 물질은 환자가 인지하는 강한 맛을 촉발시키며; (C) 본 시스템이 츄잉 검으로 제형화되는 방식을 나타낸 것으로, 씹는 동안, 자가-모니터링은 임플란트 주위 감염 발병에 대한 예후 인자인 결합 조직 손상에 대해 이루어지며; 츄잉 검은 전체 구강 프로파일 (full mouth profile)을 제공해주며; 명확하게는, 활성화되었을 때, 환자가 맛을 인지한 양성 신호에 대한 근본적인 요인을 파악하기 위해 치과 의사로부터 세밀한 진단을 받아야 한다.
도 3은 a) 및 b)에서, 기질 또는 고정 요소에 부착된 링커 서열이, 먼저 (a) 여기에 향미 물질이 부착되고, (b) 향미 물질의 해리를 위해 절단되는 제1 구현예와, c) 및 d)에서, 기질 또는 고정 요소에 부착된 링커 서열에, 먼저 (c) 향미 물질이 비-공유 결합에 의해, 예컨대 배위 결합에 의해 부착되고, (d) 구조적으로 변경되어 향미 물질이 해리되는 제2 구현예와, e) 및 f)에서, (e) 기질에 링커를 통해 부착된 물질과 촉발 분자와의 접촉시 색 변화를 나타내는 제3 구현예를 도시한 것이다.

도 3은 해리가능한 향미 물질 (1) (a) -(d)의 부착 또는 타액에 존재하는 MMP, 특히 MMP-8과의 상호작용시 색 변화되기 쉬운 착색제의 부착에 대한 여러가지 가능성을 도시한다.

도 3a에 예시된 제1 구현예에서, 예를 들어 츄잉 검의 베이스 물질 또는 입자일 수 있는, 기질 (3) 위에, 향미 물질 분자 또는 복합체 (1)가 통상적으로 짧고 절단가능한 폴리펩타이드 체인인 링커 요소 (2)를 통해 부착된다. 향미 물질 분자 (1)는 그 자체가 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있으며, 링커 요소 (2)의 단순 연장부일 수 있다. 타액에 존재하는 마커 (4)가 링커 요소 (2)와 접촉하면, 링커 요소가 단백질분해성 상호작용에 의해 절단되어, 향미 물질이 유리 상태 (5)로 해리되어, 맛 감지를 유발한다 (도 3b 참조).

도 3c) 및 d)에 예시된 바와 같이, 타액에 존재하는 촉발제/마커 (4) 간의 상호작용이 MMP 촉발제와 링커 요소 간의 단백질 분해성 상호작용이라는 의미에서 반드시 직접적인 상호작용인 것은 아니며, 또한 예를 들어 MMP 촉발제가 링커 요소의 부근에서 기질에 부착하거나 기질과 복합체를 형성한다는 의미에서 간접적인 상호작용일 수 있으며, 일부 변화, 예를 들어 수소 결합된 구조에 변화를 유발하며, 그에 따라 향미 분자 또는 향미 복합체 (5)가 주변 타액으로 해리된다. 이 경우, 링커 요소 (2)와 향미 물질 (1) 간에는 보통 화학 결합이 존재하지 않지만, 또한, MMP 촉발제가 부착하여, 기질 (3) 또는 링커 요소 (2) 상에 배치된 단백질분해 시스템을 스스로 촉발시킴으로써, 향미 물질을 해리시키기 위한 단백질분해성 절단 발생도 가능하다.

도 3e) 및 f)는, MMP 촉발제가 향미 물질의 해리를 유발하진 않지만, 색 변화를 유발하는 상황을 나타낸 것이다. 이를 위해, MMP 촉발제 (4)가 대응되는 착색 물질 (6)과 접촉하게 되면, 이 착색 물질이 제2의 다른 색을 띄는 상태 (7)로 전환되어, 사용자가 인지가능한 가시적인 신호를 발생시키고, 타액내 충분한 수준의 MMP 촉발제가 있음을 직접적으로 표시해준다. 도 3e) 및 f)에 예시된 바와 같이, 색 변화는, 착색 인자 (6)가 츄잉 검에 고정된 상태로 존재하는 상황에서 발생하며, 이는 또한 착색 인자 (6)가 MMP 촉발제와의 접촉시 해리되어 사용자가 인지가능한 색 변화를 타액 또는 입 조직에서 유발하는 것도 가능하다.

실험 섹션:

제1 단계에서, (i) 고정 요소와 여기에 커플링된 (ii) 민감성 펩타이드 서열 및 이에 커플링된 (iii) 향미 물질로 구성된 펩타이드 서열을 고상 화학법 (도 2)을 이용하여, MMP-8 감지 시스템을 고상 합성함으로써, 합성하였다.

본 시스템의 구성 요소 3가지를 (CN 말단으로) 합성하였다: (i) 고정 요소와 여기에 커플링된 (ii) 민감성 펩타이드 서열 및 이에 커플링된 (iii) 향미 물질.

(최상의 MMP-8 선택성과 MMP-8 절단에 맞춤화된 민감성을 갖춘 서열들을 선별할 수 있는 플랫폼으로서) 여러가지 프로테아제 민감성 단백질 서열을 구비한 시스템 30종을 합성하였다. 프로테아제는 전형적으로 광범위한 기질 선택성을 가지고 있어, 절대적인 MMP-8 선택성은 가능할 것 같지 않으므로, 이들 시스템들은 선호적인 (엄격한 MMP-8 전용성은 불가능하게 생각됨) MMP-8 리포팅에 대해 최적화한다. MMP-8 응답 시스템, 특히 MMP-1 또는 MMP-3의 일부 교차-민감성도 허용하여야 하며, 테스트하였다. 개념상 그리고 진단 측면에서, MMP-1, MMP-3 특히 MMP-8은 숙주 조직에 기생하는 세균 쪽으로 Φ의 침윤에 의해 동시에 상향 조절되기 때문에, 이러한 교차-민감성은 문제가 되지 않으며, 즉, 동일한 생리학적 기전이 이들 3종의 프로테아제 모두에서 감지된다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어 서열번호 2, 6 및 10의 서열의 경우에서와 같이, 적어도 50:1의 (MMP-1 대비 MMP-8 절단 또는 MMP-3 대비 MMP-8 절단) 상대적인 비율을 나타낸다. 보다 민감한 단백질 서열들과 이들의 MMP-1 가수분해를 기준으로 하는 상대적인 비율을 선택한다. 합성은 사내에서 자동 고상 펩타이드 합성 (SPPS) 플렛폼으로 수행한다. (C에서 N-말단으로의) 합성은, 하나의 아미노산의 카르복시기를 다른 아미노산의 아미노기에 커플링하고, 의도하지 않은 반응을 피하기 위해 보호기를 적절하게 사용함으로써, 확립된 프로토콜에 따라 이루어진다. 마지막으로, 향미 물질을 후술된 바와 같이 부착한다. 향미 물질에 커플링된 절단된 펩타이드 서열 단편의 맛은 인간 자원자들을 통해 검사하였으며, 이들 검사 결과를 피드백하여 쓴 맛 최적화를 위해 펩타이드 서열과 향미 물질을 추가로 변형하는데 일조하였다.

올리고펩타이드의 쓴 맛은 소수성과 매우 밀접하게 관련되어 있다. 실제, 스크리닝 목적으로, 펩타이드의 Q 값 (펩타이드의 평균 소수성 측정치, Q > 1,400 cal/mol은 잠재적인 쓴 맛에 대한 역치임)을 분석함으로써 진행할 수 있다. 이 방법을 토대로, 다음과 같은 MMP-8 절단 산물들을 선택하여 쓴 맛인지 아닌지를 확인한다: NAGASE, H. & FIELDS, GB 1996; Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptides. Biopolymers, 40, 399-416의 표 2에서 첫번째 서열 5개 (#1-5의 서열들)는, 대략 1400-1700 cal/mol의 Q*를 나타내며, 예를 들어 4번째 서열이 쓴 맛을 나타낸다. 절단된 펩타이드가 신뢰성 있는 인지를 제공하기에 충분히 쓰다면, 때로는 향미 물질을 커플링 시키지 않아도 된다.

# 1-5 서열들은 Nagase에서 유래된 MMP-8 민감성 서열들로부터 선택한 것으로, Q 값 계산을 토대로 #4는 쓴 것으로 예측되며, #2는 쓰지 않은 것으로 예측된다. C-말단에 다른 이소루신 및/또는 루신을 부착하여 #2를 변형시키면 쓴 맛이 예상되며, 각각 N-말단과 C-말단에 루신이 존재한다는 측면에서 쓴 맛이 최적화되었다. Q 값과 쓴 맛을 연결지었을 때 모순이 확인되어, Q 기반의 예측을 검증하는데 관능 검사가 중요하다. 전형적으로, 펩타이드에 대한 감각 인지 역치는 0.05 - 6.0 mmol/L이며, 즉, 퀴닌을 감지하는 역치 보다 낮다 (약 0.0004 mmol/L). 퀴닌과 그외 강한 맛을 내는 물질들도 물론 커플링되며, 전술한 절단된 산물의 쓴 맛을 이용하기 위한 대안으로서 커플링된다.

퀴닌 (특히 구형 시스템을 이용하는 경우, 미각 검출을 위한 쓴 맛과 절단을 용이하게 검사하기 위한 형광) 또는 인공 감미료인 아스파르탐을, '고정요소-프로테아제 민감성 펩타이드' 서열의 N-말단에 커플링하는 것을, 여전히 고상에서, 수행할 수 있다 (도 2). 2중 기능성 링커를 사용하여, 퀴닌을 고정요소-프로테아제 민감성 단백질 서열의 N-말단에 커플링할 수 있다. 생체내에서 퀴닌으로부터 링커가 빨리 절단되는 것을 방지하기 위해, 가수분해나 효소적으로 덜 민감한 연결을 채택할 수 있다. 첫번째 방식은, 헥사메틸렌 다이이소시아네이트와 같은 다이이소시아네이트 링커에 퀴닌의 2차 유리 OH기를 처리하여 우레탄 결합을 형성한 다음, 이의 남아있는 이소시아네이트 기를 통해 링커를 펩타이드의 N-말단에 커플링시켜, 우레아 결합을 형성한다. 두번째 방식은, 퀴닌 이중 결합을 비스-에폭사이드 (예, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르)와 반응시켜, 에테르 결합된 퀴닌을 형성한 다음, N-알킬화에 의해 고상 부착된 단백질에 커플링시킬 수 있다. 아스파르탐 또는 필요에 따라 N-보호된 아스파르탐을 이의 카르복시기를 통해 펩타이드 N-말단에 통상적인 펩타이드 합성에 의해 커플링시킬 수 있다. 향미 분자를 펩타이드에 커플링한 후, 형성된 접합체를 고상에서 절단 및 정제한 다음, 일반적인 분석 방법 (FT-IR, NMR, MS)을 이용하여 특정화할 수 있다. 고정 요소와 관련된 전략을 아래에 개략적으로 기술한다.

츄잉 검에서 구형 시스템 포뮬레이션 (formulation).

펩타이드-향미 물질 접합체를 보유한 구형체를 제조하기 위해, 3차원의 카르복시기 매트릭스를 구비한 폴리(메틸메타크릴레이트) (PMMA) 캐리어 (입자 직경: 17 - 30 ㎛)를 사용한다. 전술한 바와 같이 합성한 접합체를 기존의 펩타이드 형성 프로토콜 (예, 수용성 카르보다이이미드를 이용하여 PMMA 매트릭스의 카르복시기를 활성화함으로써)을 통해 PMMA 구형체에 고정시킨다. 간섭형 관능기를 가진 접합체를 이용하는 경우, 이황화 커플링 방법을 전술한 바와 같이 사용할 수 있다.

민감성 펩타이드 서열을 구축하기 위한 펩타이드의 커플링에는 하기 방법들을 사용하였다:

아미노산의 매뉴얼 커플링 : 수지를 30분간 DMF에서 팽윤시켜 꺼낸 후, 40% 피페리딘/DMF 1 mL을 첨가하여, 3분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 진공 여과에 의해 제거한 후, 20% 피페리딘/DMF 1 mL을 첨가하여 10분간 인큐베이션하였다. 이를 제거한 후, 수지를 DMF (1 mL, 각각 1분)로 6번 헹구었다. 아미노산 (5 eq)을 DMF 중의 0.5 M HOBt 410.90 ㎕에 용해한 다음, N-말단이 탈보호된 펩티딜 수지로 이동시킨다. DIC 31.81 ㎕ (8 eq)를 반응 혼합물에 첨가하여, 1시간 동안 부드럽게 교반한다. 반응 혼합물을 진공 여과에 의해 제거한 후, 수지를 DMF로 6번 (1 mL, 각각 1분), 그리고 DCM으로 6번 (1 mL, 각각 1분) 헹구었다. MMP를 이용하여 펩타이드를 절단하였다. 단일동위원소를 가진 질량체 (monoisotopic mass)들은 MALDI-MS로 체크하여야 한다. 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 분취용 정제를 Phenomenex C18 컬럼 (21.2-mm 내경, 250-mm 길이, 7-mm 입자 크기)과 용리제 A (0.2% TFA 수용액) 및 용리제 B (물-아세토니트릴 1:4 용액 중의 0.2% TFA)를 이용하여 수행한다. 펩타이드는 50분 동안 용리제 B 29 -> 54% 농도 구배를 이용하여 정제하여야 한다. 민감성 펩타이드 서열에 향미 물질 (퀴닌, 카페인, 테오브로민, 나린긴, 수크랄로스 또는 네오탐)을 커플링하는데, 아래 특수 방법을 이용할 수 있다:

고정 기를 이용한 하이드록시기를 함유한 향미 분자의 변형:

실시예 1:

향미 분자 1.5 mmol을 다이클로로메탄에 용해한 다음, 아디프산 3 mmol, N,N-다이사이클로헥실카르보디이미드 3 mmol 및 4-(N,N-다이메틸아미노)피리딘 3 mmol을 연속 첨가한다. 이 혼합물을 실온에서 24시간 교반한다. 그런 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 용액, 2N HCl 용액 및 물로 잘 세정한다. 유기 층을 분리하여, MgSO4 상에서 건조한 다음 진공 하에 증발시켜 건조한다. 수득한 원료를 실리카겔 컬럼과 클로로포름/메탄올을 용리제로 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제한다.

실시예 2:

3 mmol 도데칸디온산을, 톨루엔 중의 3 mmol 2,4,6-트리클로로벤조일 클로라이드 및 10 mmol 트리에틸아민과 함께 실온에서 교반한다. 3시간 교반한 후, 퀴닌 3 mmol과 4-(N,N-다이메틸아미노)피리딘 3 mmol를 첨가하고, 이 혼합물을 다시 20시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 용액과 물로 잘 헹구고, 수 층을 에틸 아세테이트로 2번 헹군다. 유기 층들을 합하여, MgSO4 상에서 건조한다. 진공 하에 용매를 증발시킨 후, 수득되는 원료를 실리카 겔 컬럼과 용리제로서 클로로포름:메탄올 = 3:1을 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제한다. 수율: 47 %, 갈색 오일. IR (ATR, cm-1): 2923, 2852, 1738, 1623, 1590, 1505, 1476, 1433, 1357, 1305, 1229, 1157, 1090, 1033, 995, 914, 852, 829, 762, 719.

실시예 3:

단계 1: 드라이 다이클로로메탄 중의 퀴닌 1 mmol, 11-브로모-운데칸산 1 mmol, N,N-다이사이클로헥실카르보디이미드 1 mmol 및 4-(N,N-다이메틸아미노)피리딘 1 mmol 혼합물을, 실온에서 24시간 동안 교반한다. 그런 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 용액, 2N HCl 용액 및 물로 잘 헹군다. 유기 층을 분리하여, MgSO4 상에서 건조한 다음, 진공 하에 증발시켜 건조한다. 산물을 실리카 겔 컬럼과 용리제로서 메탄올을 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 수율: 20%, 노란색 오일. IR (ATR, cm-1): 3323, 2924, 2852, 2119, 1738, 1695, 1619, 1571, 1509, 1452, 1357, 1310, 1223, 1167, 1086, 1029, 990, 914, 852, 833, 719, 647.

단계 2: 브로모 기를 함유한 향미 분자 1 mmol을 DMF에 용해하고, 과량의 소듐 아지드 (3 mmol)를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 20시간 교반한다. 물을 첨가한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 3번 추출한다. 수득한 원 산물을 실리카 겔 컬럼에서 클로로포름:메탄올 = 3:1을 용리제로서 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다.

실시예 4:

향미 분자 2.5 mmol을 다이클로로메탄에 용해하고, 다이부틸틴 다이라우레이트 0.025 mmol과 다이클로로메탄에 용해한 헥사메틸렌 다이이소시아네이트 5 mmol을 순차적으로 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 교반한다. 용매를 증발시킨 후, 이소시아네이트-함유한 향미 분자를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용한다.

실시예 5:

향미 분자 2.5 mmol과 폴리(에틸렌 글리콜)-다이에폭사이드 (분자량: 2000 Da) 5 mmol을 DMSO (20 ml)에 용해한 다음, 5 mmol KOH를 첨가한다. 실온에서 3시간 교반한 후, 물을 첨가하고, 혼합물을 클로로포름으로 추출한다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조하고, 용매를 증발시킨 후 수득되는 산물을 추가로 정제하지 않고 사용한다.

고정 기를 이용한 펩타이드의 변형:

실시예 6

펩타이드 1 mmol을 다이옥산/물 혼합물 (1:1)에 용해하고, pH 9-10이 될 때까지 2M NaOH를 첨가한다. 질소 분위기 하에, 3-부틴-1-일-클로로포르메이트 1.1 mmol을 첨가하여, 혼합물을 18시간 동안 교반한다. 산물을 동결건조하고, n-BuOH/H2O 시스템을 이용하여 FCPC로 정제한다. 정제 후, 산물을 백색 고형물로 수득한다.

카르복시기를 함유한 향미 분자와 펩타이드의 커플링:

실시예 7:

드라이 다이클로로메탄 중의 실시예 1 또는 2의 카르복시기를 함유한 향미 분자 1 mmol, 펩타이드 1 mmol, N,N-다이사이클로헥실카르보디이미드 1 mmol 및 4-(N,N-다이메틸아미노)피리딘 1 mmol 혼합물을 실온에서 24시간 교반한다. 그런 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 용액, 2N HCl 용액 및 물로 잘 헹군다. 유기 층을 분리하여 MgSO4 상에서 건조한 다음 진공 하에 증발시켜 건조한다. 산물을 분취용 HPLC를 이용하여 추가로 정제한다.

실시예 8:

실시예 6의 삼중 결합을 함유한 펩타이드 0.5 mmol과 실시예 3의 아지드기를 함유한 향미 분자 0.5 mmol을 DMF 20 ml에 용해한다. 촉매 구리-I-브로마이드/펜타메틸다이에틸렌트리아민 (0.05 mmol)을 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 24시간 교반한다. 물 (150 ml)을 첨가한 후, 혼합물을 클로로포름으로 3번 추출한다. 합친 클로로포름 추출물을 NaHCO3 포화 용액, 2N HCl 용액 및 물로 잘 헹군다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조하고, 용매를 증발한 후, 펩타이드가 커플링된 향미 분자를 연한 노란색 고형물로 수득한다.

실시예 9:

말단이 이소시아네이트인 향미 분자 1 mmol을 다이클로로메탄 (10 ml)에 용해한 다음, 다이부틸틴 다이라우레이트 0.005 ml을 첨가한다. 펩타이드 1 mmol을 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 24시간 교반한다. 반응 혼합물에 다이클로로메탄 10 ml을 첨가하여 희석하고, NaHCO3 포화 용액, 2N HCl 용액 및 물로 헹군다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조하고, 용매를 증발시킨 후 수득되는 원 산물을 분취용 HPLC를 이용하여 정제한다.

실시예 10:

에폭사이드로 변형된 향미 분자 1 mmol과 펩타이드 1 mmol을 DMSO (20 ml)에 용해한다. 2 mmol KOH를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 6시간 교반한다. 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 수회 추출한다. 유기 층을 NaHCO3 포화 용액, 2N HCl 용액 및 물로 헹군다. 클로로포름 추출물을 MgSO4 상에서 건조하고, 용매를 진공 하에 증발시킨 후 잔류 물질을 분취용 HPLC로 정제한다. 향미 분자-변형된 펩타이드를 폴리머 입자에 커플링하기 위해, 아래 방법들을 이용할 수 있다:

실시예 13:

아미노기를 함유한 폴리머 입자 (100 mg)를 다이클로로메탄에 현탁하고, 드라이 다이클로로메탄 중의 펩타이드 1 mmol 용액을 첨가한다. 5분간 교반한 후, 다이클로로메탄에 용해한 1 mmol N,N-다이사이클로헥실카르보디이미드와 1 mmol 4-(N,N-다이메틸아미노)피리딘을 첨가하여, 혼합물을 실온에서 24시간 교반한다. 입자를 분리하여 다이클로로메탄, 에탄올 및 물로 2번 헹군다.

실시예 14:

아미노기를 함유한 폴리머 입자 (100 mg)과 향미 분자를 함유한 펩타이드 (1 mmol)를 포스페이트 완충 염수 (10 mg/ml, pH = 5-6)에 현탁한다. 5분 후, 1 mmol 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)와 0.6 mmol N-하이드록시숙신이미드를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 교반한다. 폴리머 입자를 분리하여 탈이온수로 세척한 후, 실온에서 36시간 동안 탈이온수에 대해 투석함으로써 정제한다.

구체 (sphere)에 적합한 정제 경로 뿐만 아니라 이를 특정화 (고정 후 입자 크기, 기계적 통합성 (mechanical integrity), 적재 용량 (load capacity))하기 위한 분석 기법도 잘 확립되어 있다.

츄잉 검으로 제형화되는 구형 시스템 (spherical system)의 개발.

츄잉 검은 소르비톨, 만니톨 또는 이들 당/폴리올의 조합으로부터 선택하여, 저작력 (bite strength)이 세거나 (구형 시스템의 부하 수준이 낮음) 중간 (처음에는 카라멜과 비슷함, 구형 시스템의 부하 수준이 중간임)이거나, 또는 부드러운 시스템 (구형 시스템의 부하 수준이 높음)을 만들 수 있다. 이 출발 물질은 자유 유동형 분말 (free floating powder)이므로, 전술한 것과 같은 구형 시스템을 비롯한 다른 성분들과 쉽게 혼합가능하다. 분말 입자의 평균 크기는, 직경이 20 ㎛ 미만인 구형 시스템은 입자 분리 (particle segregation)가 때때로 문제가 될 수 있으므로, 약 200 - 250 ㎛이거나 또는 심지어 200 - 340 ㎛이다. 분리가 문제가 되는 경우, 만니톨 DC 그래뉼레이트 중의 프리-믹스로 준비하여 프리믹스를 압축시킬 수 있다. 분말 혼합물에는 전형적으로 압축을 위해 윤활제가 필요하다 (예, 1.5% 마그네슘 스테아레이트 또는 3% Mg-스테아레이트:Talkum (1:1)). 압축은 표준 회전식 타정기에서 행해진다 (가능한 유익한 파라미터들:

가압력 (pressing force): 7 KN, 사전-압력: 2,2 KN, 실리더 높이 (압착): 2,8 mm, 실린더 높이 (사전-압착): 3,5 mm, 정제 직경: 14 mm, 정제 길이: 5 mm, 정제 무게: 1,15 gr). 턴오버는 시간 당 츄잉 검 최대 6,000개이거나, 거의 그 이하의 임의 범위이므로, 파일럿 규모의 생산은 츄잉 검으로 본 시스템을 향후 생산하는 생산 리스크를 낮출 수 있다. 최소형 시스템을 사용하여, 타정 조건을 합리적으로 설계하기 위한 전제 조건으로서 적정 압력 모니터링 시스템이 장착된 싱글-펀치 타정기와 같이, 실험실 규모의 실험들로 (미니-정제/츄잉 검) 빠른 제형 스크리닝이 가능하다. 86.5% 또는 86.95% Pharmagum ^® S, 각각 0.5% 또는 0.05%의 구형 시스템, 3% 마그네슘 스테아레이트, 7% 소르비톨 및 3% 소듐 카보네이트로부터 전형적인 제형을 압축한다. 대안으로서, CAFOSA 사의 3종의 Health in gum ^® 분말 혼합물이 사용될 수 있다. 전형적인 제형들은 92.7% Health in Gum ^® , 0.05% 구형 시스템, 2.0% 분말 향미제, 2.0% 캡슐화된 향미제, 1.5% 윤활제, 1.0% 실리콘 다이옥사이드, 0.55% 액상 향미제 및 0.20% 인텐시브 감미제를 포함한다.

구형 시스템/츄잉 검 제형을 여러가지 온도와 습도 프로파일에 노출시켜, 안정성 검사를 수행한다. 제조된 츄잉 검은 화학적으로 불활성이며, 저장시 흡습성이 없거나 매우 약하며 안정적이다. 제형에는 산 성분이 함유되어 있지 않아, 저작시 검 부분의 재-응집이 방지된다. 수득되는 제형들은, 압착력, 제형의 부형제 최적화, 안정성 실험, 수은 기공측정기에 의한 압밀도 (compaction density) 뿐만 아니라 경도, 수분량 및 그외 표준적인 약제 특정화 검사의 측정치에 대해 더욱 특정화할 수 있다.

여러가지 질환 병기의 임플란트 주위 질환에 걸린 환자들과 건강한 임플란트 주위 치주낭으로부터 열구액 채취, 의학적 검사 및 수득한 샘플에서 MMP-8 수준 측정, MMP-8 농도 측정치와 임상 진단의 연관성에 의한 질환-병기에 특이적인 MMP-8 역치 농도 규명:

열구액 채취 및 MMP-8 농도:

임플란트가 장착되어 있으며 임플란트 주위 질환에 걸린 환자와 임플란트를 장착한 건강한 개체를 대상으로 클리닉 방문시 검사를 수행하였다. 고지하여 동의를 구한 후, 모든 개체를 대상으로 설문지에 응답을 받은 다음 방사능 검사와 구강 검사를 수행한다. 구강 검사에는 치주낭 탐침 깊이 (probing pocket depth), 임상적인 결합 수준 및 인덱스 임플란트에서의 퇴축 뿐만 아니라 전반적인 구강 위생 및 출혈 인덱스 등의 치주 파라미터들이 포함된다.

치주낭에 30초간 배치시킨 표준화된 MMP-8 채취 스트립을 이용하여 인덱스 임플란트 주위 영역으로부터 열구액을 채취하였다. 30초간 스트립에서 aMMP-8을 용출시켜, DentoAnalyzer (Dentognostics GmbH, Jena, Germany)로 정량적으로 측정한다. DentoAnalyzer는 공인된 CE 표시된 PoC 기계로서, 체어-사이드에서 12분 이내에 분석 전 공정을 자동화된 방식으로 수행한다. 본 분석은 용출물에서 2 ng/ml aMMP-8에서 최대 200 ng/ml aMMP-8 범위로 측정이 가능하다.

열구액내 MMP-8 농도는 임상 검사와 상호 연관되어 있으므로, 역치 값은 질병 평가 (disease scoring)에 대한 함수로서 정의할 수 있었다.

본 시스템의 MMP-8 성능 확립 (특이성 및 민감성):

이들 검사를 위해, 사내 장치를 공구 샵에서 조작하였다. 츄잉 검을 검사하기 위한 유럽 약전 (Pharm.Eur.) 자료를 참조하여, 장치는 검을 씹는 동안 이루어지는 바와 같이 회전력과 가압력을 전달하는 전기적으로 조절되는 2개의 피스톤으로 구성된다. 3번째 수직 피스톤 ('혀')은 검을 그 위치에 있도록 한다. 이러한 셋업을 20 mL의 완충액 또는 인공 타액이 든 온도 조절되는 챔버 (체적 40 mL)와 결합시킨다. 완충액 또는 타액에, 츄잉 검으로 제형화된 구형 시스템의 성능 (선택성과 특이성)을 검사하기 위해 후술된 바와 같은 해당 프로테아제를 혼합한다. 완충액 또는 인공 타액 중에서 생기는 단편들은 (형광성이 강한 퀴닌이 부착된 경우) 형광 검출기가 장착된 HPLC로, 또는 좀더 향상된 민감성을 제공하기 위해 LC-MS/MS로 분석한다. Pharm.Eur. 자료에 따른 방법과 적격인 분석 방법을 이용하면, 시판 허가를 받고자 할 때 보건 당국에 향후 본 시스템에 대한 신청서 제출을 위한 직접적으로 관련있는 결과들이 수득된다.

MMP 챌런지에 대한 시스템의 시험관내 민감성 검사:

본 시스템에 여러가지 MMP를 시도하여, MMP-8 절단에 대해 최적화된 특이성과 선택성을 갖춘 시스템 5종을 선별한다.

MMP들에 노출시켰을 때, 도 2B에서와 같은 프로파일 시스템 절단, (구형 캐리어에 커플링되거나, 또는 커플링된 구형 캐리어가 츄잉 검으로 제형화된) D. MMP-1, 2, 3, 7, 8, 9, 13을 구입하였다. kcat/KM 값 (기질 농도가 높을 수록, 효소가 포화되며, 따라서 반응 속도는 kcat에 의해 조절됨)과 서열 특이성에 대한 상대적인 비율 (MMP-8 대비 MMP-1, MMP-2 및 MMP-13)을 구하기 위해, 효소 분석을 수행하였다. 절단은 UV-VIS 검출과 필요에 따라 형광 검출 (예, 퀴닌으로 변형된 시스템의 경우 형광성)이 구비된 통상적인 HPLC 방법을 통해 분석하였다. 단편들의 분석과 특정화를 위해 트리플 스테이지 LC-MS/MS를 사용하였다. 단편이 1500 amu (m/z) 미만이기 때문에, UWU에서 사용한 LC-MS/MS는 동정 및 검증 강화를 위해 텐덤 질량 분광측정 (MS/MS)을 이용하여 구조 데이타를 수집하면서 동시에 높은 민감도로 이들 절단된 산물들을 세밀하게 분석할 수 있다.

환자에서 시스템 기능성 / 츄잉 검 평가, 환자 순응 평가 수행/향미 물질의 미각 감도:

본 실험을 착수하기 전 1년 이상 한개 이상의 임플란트를 장착하고 있으며 연조직 염증/임플란트 주위염이 의심되는 환자를 대상으로 하였다. 본 실험에 참여하기 위한 적격성 (포함/제외 기준)을 스크리닝한 후, 피험자 동의서 (ICF: informed consent form)에 사인을 요청하였다. 임상 파라미터들, 즉, 변형된 플라그 인덱스 (mPLI), 변형된 열구 출혈 인덱스 (mSBI), 임플란트 주위 치주낭 깊이 (PPD), 임플란트에서 열구 주변까지의 거리 (DIM: distance implant to sulcus margin) 및 임상적인 부착 깊이 (CAL: clinical attachment height)를 분석하였다. 치근단 주위 X-레이를 수행하여, 코로나 투명대 (coronal translucency)의 존재를 검증하였다 (X-레이 양성). 임플란트 주위 질환이 확인된 (BoP 양성 및 치근단 주위 X-레이 양성) 환자에게, 무작위 순서로 츄잉 검 또는 대응되는 "더미 (dummy)"로 임플란트 주위 미각 센서를 제공하였다. 이들의 미각 반응을 기록하였다. 각각의 환자는 후술한 바와 같이 자신의 보정 계수 (correction factor)로 캘리브레이션하였다.

샘플 크기: 환자 20명 이상, (순차적인 환자 맹검 실험 디자인으로, 츄잉 검 또는 대응되는 더미로 미각 센서를 제공하며, 투여 사이의 대기 시간은 30분 이상임).

방법: 임상적으로 임플란트 주위 염증으로 확증된 환자 (BoP; X-레이)에게 츄잉 검 (실험군: 전술한 츄잉 검을 제공함) 및 대응되는 "더미" (대조군: 위약 츄잉 검을 이용한 베럼군 (verum)임)로 "임플란트 주위 미각 센서"를 미리 정해진 무작위 리스트를 이용하여 처리 별 대기 시간 30분 이상으로 처리하였다. 개체별 미각 반응은 후술된 바와 같이 조정하여 표준화하였다.

미각 측정, 츄잉 검 형태의 임플란트 주위 미각 센서의 저작: 환자의 미각 경험 기록 (쓴 맛/특정한 맛 없음) 이후 각 환자에서 후술한 바와 같이 보정함 (개체별 보정 계수가 결정됨).

시스템의 맛 검사:

이러한 실험들에는 향미 물질을 보유하고 있는 절단된 펩타이드 서열의 맛을 평가하여야 한다. 이를 위해, 시스템이 프로테아제로 절단된 후 향미 물질을 보유한 "절단된" 파트인 절단된 펩타이드 서열 (도 2A 참조)을 아래와 같이 검사한다. 기본적으로, 2 단계로 진행할 수 있다: 1 단계는 각 지원자를 캘리브레이션하는 단계 (보정 계수 결정)이고, 2 단계는 쓴 맛 수치를 후술된 바와 같이 수집하기 위해 향미 물질을 보유한 펩타이드 단편에 노출시키는 단계이다:

본원에서 사용된 향미 물질 (쓴 맛)은 한가지 화학 종이 아니다 (예, 펩타이드 대 퀴닌). 쓴 맛 물질은 전형적으로 고리에 결합된 카르보닐기를 가지고 있는데, 이것은 락톤 고리 시스템의 일부로서 전형적으로 개환되면 쓴 맛이 없어진다. 쓴 맛을 평가하기 위해, 최소한으로 쓰게 느껴지는 쓴 물질의 희석율의 역수를 구한다. 즉, 쓴 맛 수치 10,000은, 쓴 맛이 인지되는 임계 수준이 최소 검사 물질 1 g을 물 10,000 mL에 희석하였을 때라는 의미이다. 쓴 맛 수치는 지원자 6명을 대상으로 수행한 각 측정 6번의 평균으로 결정된다. 이는 생물학적인 검사 분석이기 때문에, 각각의 개체는 실험을 개시하기 전에 개체별 보정 계수로 캘리브레이션하여야 하며, 캘리브레이션이 끝난 후 각 지원자에게 계산이 적용된다. 이를 위해, 쓴 맛 수치가 200,000인 퀴닌-HCl을 사용한다 (물 R 100 mL에 퀴닌-HCl R 0.1 g 희석. 이 용액 1 mL을 취하여, 물 100 mL로 희석함, R = 스톡 용액. 스톡 용액의 부피 차이는 물 R로 채워넣어 희석하여, 10 mL = 기준 용액을 만듬). 지원자들이 이 기준 용액을 최소한의 쓴 맛으로 인지한다면 보정 계수는 필요하지 않다. 그외 모든 경우들에서는, 보정 계수를 다음과 같이 구한다: 각 지원자에게 동일 부피로 희석한 퀴닌-HCl을 제공한다. 만일 개체가 쓴 맛을 간신히 감지하는 경우라면, 지원자는 30초간 입 안에 이 용액을 물고 있어야 한다. 다른 희석액으로 다시 검사하기 전까지 정확하게 10분을 대기하여야 한다. 용액은 실온에 보관하며, 용액을 맛 검사하기 전에 지원자가 물로 입을 헹구게 한다. 전 과정을 진행하는 동안, 맛이 가미되지 않은 일부 백색 빵을 제외하고는 어떠한 것도 먹거나 흡연하지 않게 한다. 보정 계수는 k = n/5로 계산하며, 여기서 n은 최소한으로 쓴 맛을 감지하는 스톡 용액의 양 mL이다. 물 R 10 mL로 희석한 스톡 용액 5.8 mL 보다 높은 농도로 구성된 기준 용액을 맛으로 느끼지 못하는 지원자는 선택성 누락으로 인해 검사에서 제외한다. 본원에서 개발된 향미 물질/시스템을 검사하기 위해, 프로테아제 절단으로 생성된 단편들을 제작하여, 향미 물질과 결합시키고, 이들 단편들을 검사한다. 이를 위해, 단편 10 mg을 물 R 1 mL에 교반하면서 용해시킨다. 용해되면, 이 용액을 물 R 100 mL로 희석한다 (용액 C1으로 지칭됨, 희석 배수 100). 용액 10 mL을 물 R로 희석하여 C2 용액 100 mL (희석 배수 1,000)을 만들며, 이러한 방식으로 계속한다. C4에서 시작하여, 각 지원자에서 개별 쓴 맛 역치 수준과 겨우 맛을 느끼는 용액을 각각 확인한다. 이렇듯 겨우 맛이 느껴지는 용액을 D로 지칭한다. D를 이용하여, 다음과 같은 희석 세트를 준비하고, 항상 총 부피를 물 R을 이용하여 10 mL로 채운다: 1.2, 1.5, 2.0, 3.0, 6.0, 8.0 mL. 간신히 쓴 맛으로 감지되는 용액 D의 양 mL을 측정한다. 각 지원자에 대해 쓴 맛 수치를 다음과 같이 계산한다: (Y*k)/(X*0.1), 여기서 Y는 간신히 쓴 맛으로 인지되었던 개체별 희석 배수 Cn = D이고, k는 전술한 보정 계수이고, X는 쓴 맛으로 인지되었던 D 용액의 양 mL이다. 이 과정은 오차 수준이 약 20-30%이므로, 데이타 해석시 이를 고려한다.

1 향미 물질
2 링커 요소
3 기질 및/또는 고정 요소
4 MMP 촉발제
5 분리된 향미 물질
6 제1 상태의 착색 물질
7 제2 상태에서의 착색 물질

<110> Thommen Medical AG <120> Device for the diagnosis of inflammatory tissues in dental applications <160> 47 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Asn Gln Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Leu Gln Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Pro Asp Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Pro Gln Glu Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Pro Gln Phe Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Pro Gln Arg Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Pro Gln Gly Tyr Ala Gly Gln 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Pro Gln Gly Ile Phe Gly Gln 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Pro Gln Gly Ile Glu Gly Gln 1 5 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala 1 5 10 15 Thr Ala Ser <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Ser Gln Lys Arg Pro Gln Arg Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ac-Pro-Leu-Gly-(2-mercapto-4-methyl-pentanoly)-Leu-Gly-OEt <400> 15 Pro Leu Gly Leu Gly 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ac-Pro-Leu-Gly-S-Leu-Leu-Gly-OC2H5 <400> 16 Pro Leu Gly Leu Leu Gly 1 5 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ac-Pro-Leu-Gly-S-CH2CH(CH3)CH2CH3 <400> 17 Pro Leu Gly Met 1 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ac-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-GIy-OC2H5 <400> 1 8 Pro Leu Gly Leu Leu Gly 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ac-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-OC2H5 <400> 19 Pro Leu Gly Leu Leu Gly 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Lys (Dnp)-Ala-Arg-NH2 <400> 20 Lys Pro Leu Gly Leu Lys Ala Arg 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (Gly-Pro-Hyp)5-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dn p)-Gly-Val-Arg-(Gly-Pro-Hyp)5-NH2 <400> 21 Gly Pro Leu Gln Arg Pro 1 5 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (Gly-Pro-Hyp)5-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Gln-Gl y/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dnp)-Gly-Val-Arg-(Gly-Pro-Hyp)5-NH2 <400> 22 Gly Pro Gly Pro Ser Gly Ala Glu Gly Pro Lys Gly Pro Gln Gly Leu 1 5 10 15 Arg Gly Gln Lys Gly Val Arg Gly Pro 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (Gly-Pro-Hyp)4-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dn p)-Gly-Val-Arg-Gly-Leu-Hyp-Gly -Gln-Arg-Gly-Glu-Arg-(Gly-Pro-Hyp)4 -NH2 <400> 23 Gly Pro Gly Pro Lys Gly Pro Gln Gly Leu Arg Gly Gln Lys Gly Val 1 5 10 15 Arg Gly Leu Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Pro 20 25 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gly Thr Ala Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 26 Ile Ala Met Glu Lys 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 27 Leu Leu Gly Ala Ile Leu 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 28 Ile Ala Gly Ile Phe Pro 1 5 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 29 Ile Ala Phe Pro 1 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 30 Ile Ala Gly Ile 1 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 31 Ile Phe Phe Pro 1 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 32 Ile Phe Ile Phe 1 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 33 Ile Phe Val Leu 1 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 34 Ile Phe Trp Ile 1 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 35 Ile Phe Trp Tyr 1 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generally speaking, combinations of Tyr, Ile, Phe, Pro, Leu, Val can be used for the bitter part sequences. "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mention ed linker peptides, taking the part left of the slash listed in <400> 36 Tyr Ile Phe Pro Leu Val 1 5 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 37 Ile Trp Gly Gln 1 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 38 Ile Trp Ile Phe 1 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 39 Ile Trp Gly Pro 1 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 40 Ile Ala Gly Gln Ile Tyr Pro Ile 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 41 Ile Ser Pro Pro Pro Gly 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 42 Ile Ala Gly Gln Val Val Val 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 43 Gly Pro Phe Pro Val Ile 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 44 Phe Ala Leu Pro Glu Tyr Leu Lys 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The following bitter sequence can be combined with the in sequence 1 untill 25 mentioned linker peptides, taking the part left of the slash listed in the text thereof only: <400> 45 Leu Ile Tyr Pro Ile 1 5 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ethylation or acetylation just ahead of the cleavage site can be used to reduce the bitterness. Eg: OEtGlyProLeuGly <400> 46 Gly Pro Leu Gly 1 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ethylation or acetylation just ahead of the cleavage site can be used to reduce the bitterness. Eg: CH3(O)CGlyProLeuGly <400> 47 Gly Pro Leu Gly 1