在牙科应用中用于诊断炎性组织的口香糖 |
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| 申请号 | CN201380012576.3 | 申请日 | 2013-03-07 | 公开(公告)号 | CN104159616A | 公开(公告)日 | 2014-11-19 |
| 申请人 | 托门医学股份公司; | 发明人 | 马蒂亚斯·施纳贝尔劳赫; 洛伦茨·迈内尔; 法尔科·施洛蒂希; 拉尔夫·维瓦; | ||||
| 摘要 | 本文件提出了用于在使用者的口中(特别是在下颌骨、 上颌骨 、 植入物 或 牙齿 中或其附近)鉴定炎性组织之存在的诊断性口香糖，其包含基材或者包埋和/或附着至所述基材的颗粒(3)；元件(1，5-7)(例如可释放调味分子)，其附着至所述基材和/或所述颗粒以产生可直接由使用者检测的所述口香糖的变化；其中所述元件(1，5-7)在直接或间接 接触 标志物(4)后产生所述变化，所述标志物(4)应答于细菌介质而由炎性组织释放，例如蛋白 水 解 酶。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于在使用者的口中特别是在下颌骨、上颌骨、植入物或牙齿中或其附近鉴定炎性组织之存在的诊断性口香糖，其包含： |
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| 说明书全文 | 在牙科应用中用于诊断炎性组织的口香糖技术领域[0002] 一次近期共识会议得出这样的结论：约12-40％的经植入的牙发生种植体周围炎(peri-implantitis)。这使得种植体周围炎在如今植入物(implant)可靠性和性能的提升中成为真正的威胁。 [0003] 可论证的是，大多数从业者遵从的用于诊断植入物周围感染和种植体周围炎(感染性植入物周围并发症的最晚期)的技术状态为探诊出血(bleeding on probing，BOP)。基础的假设是，探诊出血指示炎症和晚期组织退化，并且因此许多在植入物情形下被视为指示种植体周围炎。这个观点太过简单。已经证明了只有重复观察到不存在出血具有高阴性预测值(98％；即，牙齿和周围组织是健康的)，而存在出血不是预后的(阳性预测6％； 即，对于预测牙齿和周围组织的疾病状态是无用的)。 [0004] 可获得新的测试，允许床旁检测(point of care，PoC)评估胶原酶表达，包含例如MMP-8的系统。已经建立了在沟液(sulcus fluid)内检测到的MMP-8预测区分健康对象与具有炎性组织的患者，即，已经证明了MMP-8的高预后力。而且，在成功的医疗干预后MMP-8水平回到正常，允许在治疗已经开始后两周内以及在植入物炎症的特定情况下治疗成功的监测。 [0005] 从沟液测量MMP-8水平的床旁检测或者说PoC技术是复杂的。将由牙科医生从目的部位采集之沟液浸透的测试条转移至复杂的装置中，在所述装置中促进ELISA样反应以产生对MMP-8活性的读出(read-out)，本质上是复杂、昂贵且难于操作的系统。 [0006] 存在非常多的科学文章涉及金属蛋白酶活性作为口中组织炎症程度之函数的存在和水平。参考例如Tschesche，Journal of protein chemistry17(6)41，1998，549-551；Pozo 等 的 Journal of periodontal research40(3)，2005，199-207；Kahrmaran 等 的Disease markers，30(6)，2011，299-305以及Barnett等的Journal of periodontology， 79(5)，2008，819-826。 [0007] WO-A-2007/133721提供了减轻对象中牙周疾病之体征或症状的方法，其通过向对象施用含有天然化合物的组合物，所述化合物抑制基质金属蛋白酶活性和白细胞介素-1活性。 发明内容[0008] 因此本发明的一个目的在于提供在牙科领域中用于检测炎性组织的新方法。 [0009] 该目的和其他目的通过要求保护的主题达到。 [0010] 特别地，本发明尤其涉及用于在使用者的口中(特别是在下颌骨、上颌骨、植入物或牙齿中或其附近)鉴定炎性组织之存在的诊断性口香糖。根据本发明，该口香糖包含至少一种基材(base material)或者包埋和/或附着至所述基材的颗粒；至少一种元件(element)，例如分子，其用于产生可直接由使用者检测的所述口香糖之变化(即，无需另外的分析工具等，如此基本通过使用5种感官中的至少一种检测，5种感官即看-视觉(ophthalmoception)、听-听觉(audioception)、尝-味觉(gustaoception)、闻-嗅觉(olfacoception)和触-触觉(tactioception)或其组合)。根据本发明，所述元件在直接或间接接触标志物后产生变化，所述标志物应答于细菌介质而由炎性组织释放。 [0011] 这样的口香糖医药用途是已知的。例如，DE3700180提供了与常规口香糖作用不同的口香糖，其允许像海绵一样带有使用者的唾液使得在取出所述口香糖后，其可例如对于使用者的DNA进行分析。其还提出在所述口香糖中具有着色指示剂。然而用于分析目的和用于实际诊断的所述口香糖需要从使用者的口中取出。US2011/008 1673也涉及用于诊断目的的口香糖，在该案件中为糖尿病的情形。这里所述的口香糖提供酶(例如辣根过氧化物酶)，并且根据使用者唾液中葡萄糖的存在所述口香糖改变颜色，且在取出所述口香糖之后，其可与颜色图表进行比较来确定糖尿病的风险。WO01/14875也涉及口香糖，此处用来检测使用者唾液中的pH值。将相应的pH敏感性物质分散在胶基中，其作为pH的函数改变颜色。然而这些应用都没有涉及在口中检测炎性组织或建议这样的用途。相反地，本文提出的系统允许患者自监测。本提案(proposal)中的链条(chain)如下：响应于组织退化，(i)例如以强烈苦味形式的变化由本系统释放，(ii)该苦味可由患者报告。(iii)基于此报告，可作出诊断，以及(iv)如果适当的话可引导早期治疗。 [0012] 如上所指出的，种植体周围炎在如今植入物可靠性和性能的提升中是真正的威胁。本提案通过利用人的感觉(特别例如尝/味觉系统)来解决该挑战，从而监督结缔组织退化，其在牙龈炎/黏膜炎和牙周炎(periodontitis)(也称作脓溢、parodontitis或paradontitis)/种植体周围炎间标记了边界线(也参见图1)。该完全新且易于使用的诊断性工具鉴定并区分有种植体周围炎发展风险的对象，为医疗风险评估的机会打开了一个新的窗口，并因此可能在早期干预。该早期检测允许优先的、成功的、不复杂且良好耐受的治疗。本文遵循的策略是破坏性的，将目前的床旁检测(PoC；即从业者的办公室)诊断转换为自监测，允许在临床不明显的疾病阶段咨询其牙科医生，且在其中相对适度的治疗干涉足以防止植入物和周围组织的进一步破坏，并且相比之下在稍后阶段需要更彻底的干涉(也参见图1)。 [0013] 因此通过获得数位贡献者的先进技术能力开发了完全新的诊断平台。 [0014] 植入物周围感染的病程及其最严重形式(种植体周围炎)从微生物挑战(microbial challenge)和生物薄膜(biofilm)形成开始。所述微生物挑战触发响应于细菌介质(例如脂多糖(LPS；革兰氏细菌细胞壁的组分))的防御性宿主应答(释放细胞因子和其他信号)，导致巨噬细胞(Φ)的大量渗入。这些Φ能够释放多种蛋白水解酶，包括MMP。在测试的许多其他MMP中，MMP-8(也称为II型胶原酶)已经证明了引人注目的预后力，用于通过增强的袋(pocket)形成、连接丧失、骨再吸收、牙龈退缩、增加的牙/齿植入物移动以及最终的牙/齿植入物丧失预测临床进展。MMP-8破坏致密组织胶原网络，从而允许有效的Φ渗入作为细菌移除的先决条件，换言之，MMP-8活性直接与牙龈结缔组织破坏的第一和临床完全可逆阶段相联系(也参见图1，自上面的第二个和第三个框)。与其他炎性齿疾病相比，在植入物周围感染中的MMP-8大幅上调。例如，把从健康部位吸出之沟液中的MMP-8水平任意设为1U(袋深3.3mm；牙龈指数(GI)为0.6)，所述MMP-8水平在中等慢性牙周炎中升至80U(袋深5.6mm；GI1.6)，对于严重慢性牙周炎升至78U(袋深5.9mm；GI2.0)。 相反地，相比健康植入物(袋深2.4mm；GI1.0)，在患有种植体周围炎的患者中MMP-8被上调至大于950U(袋深5.0mm；GI2.0)。因此，MMP-8是用于在达到更严重的疾病状态(例如种植体周围炎)很早之前检测植入物周围感染之超敏感的预后生物标志物。在本提案中处理的挑战将使得患者能够使用所述系统(在图1中概念呈现)自监测MMP-8活性并且功能性如图2概述。 [0015] 因此根据本发明一个优选的实施方案，诱导变化的标志物为由炎性组织(优选由巨噬细胞)释放或上调的蛋白水解酶。 [0016] 根据另一个优选的实施方案诱导变化的标志物最优选为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，其优选地被活化。优选地，基质金属蛋白酶-8(MMP-8)、活化的基质金属蛋白酶-8(aMMP-8)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、活化的基质金属蛋白酶-2(aMMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、活化的基质金属蛋白酶-9(aMMP-9)或其组合是触发所述口香糖使用者可察觉之变化的目的标志物。 [0017] 味觉系统主要具有四种识别甜、酸、咸和苦的原味亚感觉模式。对苦味提供了最大敏感性，且可使用欧洲药典中概述的方法校准苦味来控制患者间变化性。在患者间更难以校准甜味，但是甜味也用作一种策略，尽管对于甜觉察的个体校准有着潜在挑战。人舌头为品尝甜味和苦味提供了有吸引力的敏感性范围，覆盖了5个数量级。硫酸奎宁(苦)在低至0.0004mM被感觉到，甚至与如今我们可得的最先进的分析检测器相当。人工甜味剂(糖精)可在低至0.02mM被一般人识别。在本申请的情形下，重要的是某些短肽通常可在低至0.05至6mM被感知，并且此见解通过为所述系统设计在切割后产生苦味的肽序列而被利用。通过此策略，可避免调味物质的偶联，这是因为经切割的肽序列本身介导受影响患者对苦感觉的识别。 [0018] 总之，特别地MMP-8(系统1)蛋白酶敏感性系统提供了牙科医生早期检测并持续监督植入物周围疾病的必要力。所述MMP-8敏感性系统识别早期结缔组织损伤。所述系统提供完全新的、对于牙科医生和患者来说易于使用的工具用于早期监测与患者口腔健康直接相关的植入物周围疾病。 [0019] 所提出的系统旨在广泛的应用，包括遵循本文对植入物周围感染概述的原理来检测口腔和黏膜改变。 [0020] 因此所述系统完全将植入物周围感染的监测从包含复杂机械的评估转换至使用使用者之人舌头或人眼作为灵敏检测器的自监测。替代了将监测口腔健康状态限制于拜访牙科医生，本方法支持频繁的自监测使得在有阳性信号的情况下，对象可拜访牙科医生的办公室以得到彻底的诊断。通过所述系统(也参见图2)的模式，临床不明显的口腔疾病组织变得及早检测。主要的创新方面如下： [0021] ·利用人味觉感觉/味觉系统来监测炎性或其他疾病是完全新的。 [0022] ·没有描述过提供用于监测植入物周围疾病最早体征之可察觉响应的结缔组织损伤检测齿植入物系统。 [0023] ·具有诊断性特征的口香糖是已知的，但不是响应于用于口腔疾病发展预后之经活化酶上调的那些。 [0024] ·从已知序列选择MMP-8敏感系统，其提供在植入物周围疾病中相对于其他蛋白酶优先检测MMP-8的必要性能。 [0025] ·如本文确定的植入物周围疾病与MMP-8上升的相关性控制通过数据集在文献中可得的信息，从而提供用于精调谐我们系统的敏感性和选择性并使其适于植入物周围区的目标疾病状态的可靠基础。 [0026] ·利用现代偶联技术来直接用肽序列修饰塑性(球形系统)表面或胶。 [0027] 一旦附着至肽序列，偶联的调味物质可降低其(苦)味道的潜力。该风险可通过在(苦)味分子上选择不同偶联位点、通过选择不同(苦)味分子以及通过设计苦味肽序列(已知其诱导苦味)而降低。 [0028] 因此相应地，根据另一个优选的实施方案，元件可在一方面为分子或分子装配物(assembly)，其在直接或间接接触标志物后发生可被使用者裸眼察觉的颜色变化，并且其包埋或附着至基材或者颗粒，所述颗粒包埋和/或附着至所述基材。 [0029] 在另一方面所述元件可为可释放的、优选可共价释放的调味分子，其附着至基材或颗粒，所述颗粒包埋和/或附着至所述基材。 [0030] 调味分子可以通过氢键结合或通过可在直接或间接与标志物接触时切割分子链(可释放地)附着至基材或颗粒，所述颗粒包埋和/或附着至所述基材。释放例如可能通过由标志物本身的分子链裂解，然而还可能通过以下机制：例如所述标志物团聚或附着至接头或附近的另一个元件，诱导构象变化等，相应地降低所述调味分子与支持物的结合常数并释放所述分子以产生相应的味道感觉。 [0031] 分子链可例如为多肽链或糖链或者其组合。在多肽链的情况下，优选地由2-15个，更优选地由3-7个氨基酸构成，并且优选地接头分子直接或间接地通过锚定元件附着至基材或颗粒，所述颗粒包埋和/或附着至所述基材。 [0032] 用作可在直接或间接与标志物接触时切割分子链以附着例如苦味分子(例如奎宁、咖啡因、可可碱、柚苷、三氯蔗糖(sucralose)或纽甜(neotame))的可能接头序列由以下系统给出，其中MMP-8系统的切割位点由斜线指明： [0033] Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID1)； [0034] Gly-Asn-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID2)； [0035] Gly-Leu-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID3)； [0036] Gly-Pro-Asp-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID4)； [0037] Gly-Pro-Leu-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID5)； [0038] Gly-Pro-Gln-Glu/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID6)； [0039] Gly-Pro-Gln-Phe/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID7)； [0040] Gly-Pro-Gln-Arg/Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID8)； [0041] Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID9)； [0042] Gly-Pro-Gln-Gly/Tyr-Ala-Gly-Gln(SEQ-ID10)； [0043] Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Phe-Gly-Gln(SEQ-ID11)； [0044] Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Glu-Gly-Gln(SEQ-ID12)； [0045] Ala-Ser-Gln-Lys-Arg-Pro-Ser-Gln-Arg-His-Gly-Ser-Lys-Tyr/Leu-Ala-Thr-Ala-Ser(SEQ-ID13)； [0046] Ala-Ser-Gln-Lys-Arg-Pro-Gln-Arg-Ser-Lys-Tyr/Leu-Ala-Thr-Ala-Ser(SEQ-ID14)； [0047] Ac-Pro-Leu-Gly-(2-巯基-4-甲基-戊酰基)-Leu-Gly-OEt(SEQ-ID15)； [0048] Ac-Pro-Leu-Gly-S-Leu-Leu-Gly-OC2H5(SEQ-ID16)； [0049] Ac-Pro-Leu-Gly-S-CH2CH(CH3)CH2CH3(SEQ-ID17)； [0050] Ac-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-GIy-OC2H5(SEQ-ID18)； [0051] DNP-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH(SEQ-ID19)； [0052] Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Lys(Dnp)-Ala-Arg-NH2(SEQ-ID20)； [0053] (Gly-Pro-Hyp)5-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dnp)-Gly-Val-Arg-(Gly-Pro-Hyp)5-NH2(SEQ-ID21)； [0054] (Gly-Pro-Hyp)5-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Lys(-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dnp)-Gly-Val-Arg-(Gly-Pro-Hyp)5-NH2(SEQ-ID22)； [0055] (Gly-Pro-Hyp)4-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Gln-Gly/Leu-Arg-Gly-Gln-Lys(Dnp)-Gly-Val-Arg-Gly-Leu-Hyp-Gly-Gln-Arg-Gly-Glu-Arg-(Gly-Pro-Hyp)4-NH2(SEQ-ID23).[0056] 调味分子释放后优选地通过刺激甜味和/或苦味优选地触发使用者的味觉系统。 [0057] 调味分子与接头一起可为肽本身，所以例如以下系统的组合之一，其中如果释放斜线的右边部分，则提供味觉： [0058] Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly/Ile-Ala-Gly-Gln-Arg(SEQ-ID24)； [0059] Gly-Thr-Ala-Gly-Pro-Pro/Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ-ID25)； [0060] 一般而言，下面的苦味序列可与上面提到的接头肽(仅取其斜线的左边部分)组合： [0061] ..../Ile-Ala-Met-Glu-Lys((SEQ-ID26)； [0062] .../Leu-Leu-Gly-Ala-Ile-Leu(SEQ-ID27)； [0063] .../Ile-Ala-Gly-Ile-Phe-Pro(SEQ-ID28)； [0064] .../Ile-Ala-Phe-Pro(SEQ-ID29)； [0065] .../Ile-Ala-Gly-Ile(SEQ-ID30)； [0066] .../Ile-Phe-Phe-Pro(SEQ-ID31)； [0067] .../Ile-Phe-Ile-Phe(SEQ-ID32)； [0068] .../Ile-Phe-Val-Leu(SEQ-ID33)； [0069] .../Ile-Phe-Trp-Ile(SEQ-ID34)； [0070] .../Ile-Phe-Trp-Tyr(SEQ-ID35)； [0071] .../Tyr-Ile-Phe-Pro-Lau-Val(SEQ-ID36)； [0072] .../Ile-Trp-Gly-Gln(SEQ-ID37)； [0073] .../Ile-Trp-Ile-Phe(SEQ-ID38)； [0074] .../Ile-Trp-Gly-Pro(SEQ-ID39)； [0075] .../Ile-Ala-Gly-Gln-Ile-Tyr-Pro-Ile(SEQ-ID40)； [0076] .../Ile-Ser-Pro-Pro-Pro-Gly(SEQ-ID41)； [0077] .../Ile-Ala-Gly-Gln-Val-Val-Val(SEQ-ID42)； [0078] .../Gly-Pro-Phe-Pro-Val-Ile(SEQ-ID43)； [0079] .../Phe-Ala-Leu-Pro-Glu-Tyr-Leu-Lys(SEQ-ID44)； [0080] .../Leu-Ile-Tyr-Pro-Ile(SEQ-ID45)； [0081] 可仅在切割位点之前使用乙基化或乙酰化来降低苦味。例如： [0082] OEt-Gly-Pro-Leu-Gly/...(SEQ-ID46)； [0083] CH3(O)C-Gly-Pro-Leu-Gly/...(SEQ-ID47)。 [0084] 一般而言，Tyr、Ile、Tyr、Phe、Pro、Leu、Val的组合以及Tyr、Ile、Tyr、Phe、Pro、Leu、Val的组合可用于苦味部分序列。根据另一个优选的实施方案，当在使用者唾液中达到最小标志物浓度时，触发与所述标志物直接或间接接触后的变化。优选地，当在使用者唾液中达到最小基质金属蛋白酶标志物浓度时，触发与所述标志物直接或间接接触后的变化，特别是基质金属蛋白酶-8(MMP-8)或活化的基质金属蛋白酶-8(aMMP-8)，用于产生可直接由使用者检测的口香糖之变化的所述唾液中最小标志物浓度大于1ng/ml，优选大于5ng/ml，更优选大于8ng/ml。 [0085] 当在使用者唾液中达到最小标志物浓度时，优选触发与所述标志物直接或间接接触后的变化，其中优选地标志物为基质金属蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶-8(MMP-8)或活化的基质金属蛋白酶-8(aMMP-8)，并且其中用于产生可直接由使用者检测的口香糖之变化的所述唾液中最小标志物浓度在1至6000ng/ml的范围内，优选地在5至4000ng/ml的范围内，最优选地在8至2000ng/ml的范围内。 [0086] 用于检测牙周炎的最小标志物浓度比用于检测种植体周围炎的最小标志物浓度小10倍，优选小100倍并且更优选小500倍，其中甚至更优选的是，基于此临界浓度差异区分牙周炎和种植体周围炎中可直接由所述使用者检测的所述口香糖之变化的产生。 [0087] 元件可附着至颗粒，所述颗粒具有5至300μm、优选20至250μm的大小，其中所述颗粒优选基于聚合物或共聚物或(共)聚合物混合物或(共)聚合物掺合物(blend)，优选基于选自聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)的聚合物或共聚物，也可能选自聚乙烯、聚丙烯、聚(氯乙烯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚砜、聚(醚砜)、聚醚、聚(醚-酮)、聚(醚-醚-酮)、聚(四氟乙烯)、聚(偏氟乙烯)(poly(vinylidenefluoride))、聚酯、聚(羟基烷酸酯)(poly(hydroxyalkanoate))、聚氨酯、聚酰亚胺、聚(醚-酰亚胺)、聚(丁二烯)、聚(乙烯醇缩丁醛)、聚酐、聚(氨基酸)、聚(有机硅氧烷)、纤维素、几丁质或者其混合物或掺合物。系统可形成三维基质，例如由于交联过程。所述三维基质可基于羧基、氨基、巯基(thiol group)或其组合。优选使用具有三维羧基基质的聚(甲基丙烯酸甲酯)。 [0088] 优选地，将元件或互联的锚定元件通过常规偶联技术附着至颗粒，优选地通过二硫化物偶联、通过酯化的溴化合物与叠氮化钠进行或通过经二羧酸、二异氰酸酯或双环氧化合物(diepoxide)的偶联。可通过以下方法将所述元件或互联的锚定元件附着至颗粒：使用肽偶联方法的酰胺形成、二硫化物偶联、使用如碳二亚胺活化之酯化的酯形成、通过与二异氰酸酯或二异硫氰酸酯反应产生的尿烷、脲或异硫脲形成、通过与含有环氧基团的分子(如双环氧化合物)或活化的卤代烷基衍生物反应的醚形成、与二醛反应后进行还原氨化、迈克尔型加成反应(Michael-type addition reaction)(如例如通过丙烯酸化的反应参与物(reaction partner)与巯基修饰的反应参与物进行的反应)或者通过已知的点击化学(Click Chemistry)偶联方案(如Cu(I)促进的叠氮化物-炔[3+2]环加成)。炎性组织引起的口腔和/或黏膜改变通常诱导变化，特别为至少一种以下的炎性状态：牙龈炎、黏膜炎、牙周炎、种植体周围炎或其组合。 [0089] 此外，本发明涉及如上概述的口香糖用于在使用者的口中(特别是在下颌骨、上颌骨、植入物或牙齿中或其附近)检测炎性组织的用途。 [0091] 在下文参考附图描述了本发明一些优选的实施方案，其是为了说明本发明目前一些优选实施方案的目的，并且不是为了限制本发明的目的。在附图中， [0092] 图1示意性地示出在本申请中用于早期诊断植入物周围感染发展之风险因子所遵循的诊断方法，其中系统(框5)正在检测指示结缔组织退化的基质金属蛋白酶(MMP)调节，如在牙龈炎/黏膜炎和牙周炎/种植体周围炎的边界线上所示；如今一旦临床体征出现(框4)其中病程可能不可逆且可流行持久并发症的阶段，通常就可识别并发症；如今，可在牙科医生的办公室使用床旁检测系统进行单一评估，所述床旁检测系统优先测量来自受影响植入物附近采集之沟液样品的MMP-8，其中自然地，这些单一评估提供有限的信息；所提出的系统设计为允许基于需要、自监测，因此向患者提供连续的监测，并且基于此牙科医生可早期诊断并发症； [0093] 图2在(A)中示出功能性如何与MMP-8蛋白酶敏感性肽序列(中间部分)相联系，所述序列位于锚(anchor)(左)和调味物质(右)之间；在(B)中示出所述序列如何与颗粒或另一表面连接，在本申请中称为“系统”；当与特定水平下的MMP-8接触后，切割所述肽序列且松开的调味物质触发被患者识别的强烈味道；在(C)中示出所述系统如何配制入口香糖；在咀嚼期间，所述对于结缔组织损伤的自监测启动，所述结缔组织损伤是发生植入物周围感染的预后因素；所述口香糖提供全口特征(full mouth profile)；清楚的是，当被活化时，牙科医生必须进行彻底的诊断以鉴定如患者品尝到的阳性信号的根本原因；以及[0094] 图3示出不同的实施方案，其中在a)和b)中示出第一实施方案，其中切割附着至基底(substrate)或锚的接头序列(最初(a)调味物质附着其上)来释放所述调味物质(b)，在c)和d)中示出第二实施方案，其中附着至基底或锚的接头序列(最初(c)调味物质通过非共价键合附着，例如配位键)构象变化使得释放所述调味物质(d)，并且在e)和f)中示出第三实施方案，其中物质通过接头附着至基底(e)且示出在接触触发分子后的颜色变化。 [0095] 优选实施方案的描述 [0096] 图3示出可释放调味物质1之附着(a)-(d)或在与存在于唾液中的MMP(特别是MMP-8)相互作用后易于改变颜色之着色剂的附着的不同可能性。 [0097] 在如图3a举例说明的第一实施方案中，调味物质分子或复合物1经由接头元件2附着在基底3上，所述基底3可例如为口香糖的颗粒或基材，所述接头元件2通常为短并可切割的多肽链。所述调味物质分子1本身可为多肽或蛋白质，且其可仅为所述接头元件2的延伸。当存在于唾液中的标志物4与所述接头元件2接触后，后者因蛋白水解作用而被切割，将所述调味物质释放成游离状态5，诱导味觉(参见图3b)。 [0098] 如图3c)和d)举例说明，存在于唾液中的触发物/标志物4之间的相互作用不一定是MMP触发物和接头元件之间蛋白水解作用情况下的直接相互作用，其也可为间接相互作用，例如这样的情况：MMP触发物在接头元件附近与基底附着或形成复合物，诱导一些变化(例如氢键结构的变化)，从而释放调味分子或调味复合物5至周围的唾液中。在此情况下，通常在所述接头元件2和所述调味物质1之间不存在化学键，然而也可能所述MMP触发物附着且本身触发设置在所述基底3上的蛋白水解系统或者所述接头元件2造成蛋白水解切割以释放所述调味物质。 [0099] 图3e)和f)示出当MMP触发物不诱导调味物质释放而诱导颜色变化的情形。为此，当所述MMP触发物4与相应的着色剂物质6接触后，后者转化为第二个不同的颜色状态7，产生对使用者可察觉的视觉信号和指示提供唾液中足够水平的MMP触发物。如图3e)和f)举例说明的，颜色变化不仅可能发生在着色剂6保持固定于口香糖的情形下，也可能在接触所述MMP触发物后，释放所述着色剂6，造成在唾液中或口组织中对使用者可察觉的颜色变化。 [0100] 实验部分： [0101] 在第一步中，通过使用MMP-8敏感系统的固相合成来合成肽序列，所述肽序列使用固相化学由(i)锚偶联至(ii)敏感性肽序列偶联至(iii)调味物质构成(图2)。 [0102] 合成所述系统的三个组分(从C-N末端)：(i)锚偶联至(ii)敏感性肽序列偶联至(iii)调味物质。 [0103] 合成了具有不同蛋白酶敏感性蛋白序列的30个系统(作为平台，从其中可选择具有最佳MMP-8敏感性的序列并调整对MMP-8切割的敏感性)。绝对MMP-8敏感性与通常具有广泛的底物特异性的蛋白酶不同，使得将系统优化为优先(认识到严格的MMP-8排他性是不可能的)报道MMP-8。MMP-8应答系统的一些交叉敏感性(特别对于MMP-1或MMP-3)必须耐受并对其进行测试。在概念上且在诊断上，该交叉敏感性是没问题的，因为通过将Φ渗入居住于宿主组织中的细菌来伴随上调MMP-1、MMP-3和特别是MMP-8，即，所有三种蛋白酶检测为同样的生理机制。然而，至少50∶1的相对比例(MMP-8切割相对于MMP-1或MMP-8切割相对于MMP-3)为特异(specification)，如例如序列SEQ-ID2、6和10的情况。选择相比MMP-1水解更敏感的蛋白质序列及其相对比例。在内部(in-house)自动固相肽合成(SPPS)平台上进行合成。合成(C至N末端)遵循已建立的方案，通过将一个氨基酸的羧基偶联至另一个氨基酸的氨基以及通过适当使用保护基团来避免不期望的反应。最后，如下所概述地将调味物质附着。由人志愿者测试偶联至所述调味物质的经切割肽序列片段的味道，并且这些测试的反馈有助于进一步修饰肽序列和调味物质以优化苦味。 [0104] 寡肽中的苦味与疏水性紧密相关。事实上，并且为了筛选目的，可通过测定肽的Q值(肽平均疏水性的量度，Q＞1400cal/mol为可能苦味的阈值)来进行。基于此方法，选择以下MMP-8切割产物表明是否有苦味：NAGASE，H.& FIELDS，G.B.1996(Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptides.Biopolymers，40，399-416)之表2的前5个序列(序列#1-5)，其示出大约1400-1700cal/mol的Q＊并且例如第四序列示出苦味道。如果经切割的肽序列对于可靠识别足够苦，则所述调味物质的偶联有时不是必需的。 [0105] 序列#1-5为从Nagase选择的MMP-8敏感性序列，基于Q值计算预测#4为苦的并预测#2为不苦的。通过用另一个异亮氨酸和/或亮氨酸在C末端修饰更改#2产生预测的苦味，并已经在N和C末端分别存在亮氨酸的情形下对苦味优化。当将Q值和苦味联系时已经报道了不一致，因此感觉测试对确认基于Q的预测是重要的。通常，对于肽的感觉识别阈值为0.05至6.0mmol/L，即，低于对奎宁的感觉(约0.0004mmol/L)。还偶联奎宁和其他强味道物质并且作为使用如上给出的经切割产物之苦味道的替代方案。 [0106] 可当仍在固相上时进行奎宁(用于味觉检测的苦和用于切割之简单测试的荧光，特别是当利用球形系统时)或阿斯巴甜(aspartame)(人工甜味剂)至“锚-蛋白酶敏感性肽”序列N末端的偶联(参见图2)。可使用双功能接头来将奎宁偶联至所述锚-蛋白酶敏感性蛋白序列的N末端。为避免在体内将所述接头从奎宁迅速切割，可安装水解或酶促较不敏感的连接。在第一种方法中，用奎宁的游离仲OH-基团处理二异氰酸酯接头(如六亚甲基二异氰酸酯)形成尿烷键，随后经其保留的异氰酸酯基团将所述接头偶联至肽的N末端形成脲键。第二种方法在于奎宁双键与双环氧化合物(例如1，4-丁二醇二环氧甘油醚)的反应，产生的醚连接的奎宁可随后通过N烷基化偶联至固相附着的蛋白质。阿斯巴甜(或如果需要的话，N保护的阿斯巴甜)可经其羧基通过常规肽合成偶联至肽的N末端。在将所述调味分子偶联至肽之后，可从固相切割所形成的缀合物，使用普通分析方法(FT-IR、NMR、MS)纯化和表征。关于锚的策略在下面概述。 [0107] 口香糖中球形系统的配制 [0108] 为制备肽-调味物质缀合物-支持球，使用具有三维羧基基质的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)载体(颗粒直径：17至30μm)。通过常规肽形成方案(例如通过使用水溶性碳二亚胺来活化PMMA基质的羧基)来将如上概述所合成的缀合物固定至PMMA球。在使用具有干扰官能团之缀合物的情况下，可如上所述使用二硫化物偶联方法。 [0109] 为了偶联肽来建立敏感性肽序列，使用以下方法： [0110] 手动偶联氨基酸：使树脂在DMF中膨胀30分钟并移出后，添加1mL40％哌啶/DMF并孵育3分钟。然后，在通过真空过滤移除后，添加1mL20％哌啶/DMF并孵育10分钟。在移出后，用DMF洗涤树脂6次(1mL，每次1分钟)。将氨基酸(5当量)溶解于DMF中的410.90μL0.5M HOBt中，然后转移至N末端去保护的肽基树脂。将31.81μL(8当量)的DIC添加至反应混合物并轻轻地振荡1小时。通过真空过滤移除反应混合物后，用DMF洗涤树脂6次(1mL，每次1分钟)并用DCM洗涤6次(1mL，每次1分钟)。之后通过使用MMP切割肽。必须用MALDI-MS检查单一同位素质量。通过高压液相色谱(HPLC)的制备性纯化以Phenomenex C18柱(21.2mm内径，250mm长，7mm粒径)用洗脱剂A(含0.2％TFA的水)和洗脱剂B(含0.2％TFA的1∶4水-乙腈)进行。必须用29％至54％梯度的洗脱剂B在 50分钟内纯化所述肽。为将调味物质(奎宁、咖啡因、可可碱、柚苷、三氯蔗糖或纽甜)偶联至敏感性肽序列，可使用以下特定的方法： [0111] 用锚基团修饰含有羟基的调味分子： [0112] 实施例1： [0113] 将1.5mmol的所述调味分子溶解于二氯甲烷中并连续添加3mmol的己二酸、3mmol的N，N-二环己基碳二亚胺和3mmol的4-(N，N-二甲基氨基)吡啶。在室温下搅拌混合物24小时。然后，用饱和的NaHCO3溶液、2N HCl溶液和水彻底洗涤反应混合物。分离有机相，经MgSO4干燥并在真空下蒸干。通过快速色谱使用硅胶柱并将氯仿/甲醇作为洗脱剂纯化所获得的原料(raw material)。 [0114] 实施例2： [0115] 在室温下于甲苯中将3mmol十二烷二酸与3mmol的2，4，6-三氯苯甲酰氯和10mmol的三乙胺一起搅拌。在3小时的搅拌后，添加3mmol的奎宁和3mmol的4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，并另外搅拌混合物20小时。用饱和NaHCO3溶液和水彻底洗涤反应混合物，并用乙酸乙酯洗涤水相两次。合并有机相并经MgSO4干燥。在真空下蒸发溶剂后，通过快速色谱使用硅胶柱并将氯仿∶甲醇＝3∶1作为洗脱剂纯化所获得的原料。产率：47％，棕色油状物。IR(ATR，cm-1)：2923，2852，1738，1623，1590，1505，1476，1433，1357，1305， 1229，1157，1090，1033，995，914，852，829，762，719。 [0116] 实施例3： [0117] 步骤1：将1mmol奎宁、1mmol11-溴-十一烷酸、1mmol N，N-二环己基碳二亚胺和1mmol4-(N，N-二甲基氨基)吡啶的混合物在干燥二氯甲烷中于室温下搅拌24小时。然后，用饱和的NaHCO3溶液、2N HCl溶液和水彻底洗涤反应混合物。分离有机相，经MgSO4干燥并在真空下蒸干。通过快速色谱使用硅胶柱并将甲醇作为洗脱剂进一步纯化产物。产率： 20％，黄色油状物。IR(ATR，cm-1)：3323，2924，2852，2119，1738，1695，1619，1571，1509， 1452，1357，1310，1223，1167，1086，1029，990，914，852，833，719，647。 [0118] 步骤2：将1mmol的含有溴基的调味分子溶解于DMF中，并添加过量的叠氮化钠(3mmol)。在室温下搅拌混合物20小时。添加水后，用乙酸乙酯萃取所述反应混合物三次。通过快速色谱使用硅胶柱并将氯仿∶甲醇＝3∶1作为洗脱剂纯化所得到的粗产物(raw product)。 [0119] 实施例4： [0120] 将2.5mmol的调味分子溶解于二氯甲烷中，并添加0.025mmol的二月桂酸二丁锡，之后添加溶解于二氯甲烷的5mmol的六亚甲基二异氰酸酯。在室温下搅拌混合物24小时。在溶剂蒸发之后，在下一步中使用含有异氰酸酯的调味分子而无需进一步纯化。 [0121] 实施例5： [0122] 将2.5mmol的调味分子和5mmol的聚(乙二醇)-双环氧化合物(分子量：2000Da)溶解于DMSO(20ml)中，随后添加5mmol KOH。在室温下搅拌3小时后，添加水并用氯仿萃取混合物。经MgSO4干燥有机相，并且在蒸发溶剂之后，使用所得产物而无需进一步纯化。 [0123] 用锚基团修饰肽： [0124] 实施例6： [0125] 将1mmol的肽溶解于二氧六环/水混合物(1∶1)中并添加2M NaOH直至pH达到9-10。在氮气氛下，添加1.1mmol3-丁炔-1-基-氯甲酸酯并允许混合物搅拌18小时。通过FCPC使用n-BuOH/H2O系统冻干并纯化产物。纯化后，以白色固体获得所述产物。 [0126] 含有羧基的调味分子与肽的偶联： [0127] 实施例7： [0128] 在室温下将1mmol来自实施例1或2的含有羧基的调味分子、1mmol肽、1mmol N，N-二环己基碳二亚胺和1mmol4-(N，N-二甲基氨基)吡啶在干燥二氯甲烷中的混合物搅拌24小时。然后，用饱和的NaHCO3溶液、2N HCl溶液和水彻底洗涤反应混合物。分离有机相，经MgSO4干燥并在真空下蒸干。使用制备型HPLC进一步纯化产物。 [0129] 实施例8： [0130] 将0.5mmol来自实施例6的含有三键的肽和来自实施例3的0.5mmol含有叠氮基团的调味分子溶解于20ml DMF中。在添加催化剂溴化亚铜/五甲基二乙烯三胺(0.05mmol)后，在室温下搅拌混合物24小时。在添加水(150ml)后，用氯仿萃取所述混合物三次。用饱和NaHCO3溶液、2N HCl溶液和水洗涤合并的氯仿萃取物。经MgSO4干燥有机相，并在蒸发溶剂后，以淡黄色固体获得肽偶联的调味分子。 [0131] 实施例9： [0132] 将1mmol异氰酸酯终止的调味分子溶解于二氯甲烷(10ml)中，随后添加0.005mmol二月桂酸二丁锡。在添加1mmol的肽之后，在室温下搅拌混合物24小时。通过添加10ml的二氯甲烷来稀释反应混合物，并用饱和NaHCO3溶液、2N HCl溶液和水洗涤。经MgSO4干燥有机相，且在蒸发溶剂后，使用制备型HPLC来纯化所得粗产物。 [0133] 实施例10： [0134] 将1mmol环氧化物修饰的调味分子和1mmol的肽溶解于DMSO(20ml)中。添加2mmol KOH并在室温下搅拌混合物6小时。添加水并用氯仿多次萃取反应混合物。用饱和NaHCO3溶液、2N HCl溶液和水洗涤有机相。经MgSO4干燥氯仿萃取物，并在真空下蒸发溶剂后，使用制备型HPLC来纯化其余材料。 [0135] 为了将调味分子修饰的肽偶联至聚合物颗粒，可使用以下方法： [0136] 实施例13： [0137] 将含有氨基的聚合物颗粒(100mg)悬浮在二氯甲烷中，并添加1mmol肽的干燥二氯甲烷溶液。搅拌5分钟后，添加溶解于二氯甲烷中的1mmol的N，N-二环己基碳二亚胺和1mmol的4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，并在室温下搅拌混合物24小时。分离所述颗粒并用二氯甲烷、乙醇和水洗涤两次。 [0138] 实施例14： [0139] 将含有氨基的聚合物颗粒(100mg)和含有调味分子的肽(1mmol)悬浮在磷酸盐缓冲盐水(10mg/ml，pH＝5-6)中。5分钟后，添加1mmol1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，并在室温下搅拌混合物4小时。分离所述聚合物颗粒，用去离子水洗涤并在室温下通过对去离子水渗析36小时来纯化。已经建立了对于球的合适的纯化途径以及用于表征它们的分析技术(固定后的粒径、机械完整性、负载能力)。 [0140] 在口香糖中配制的球形系统的开发 [0141] 所述口香糖可选自山梨醇、甘露醇或这些糖类/多元醇的组合来产生强咬力(球形系统的低负载)、中等咬力(开始时焦糖样，球形系统的中等负载)或平滑系统(球形系统的高负载)。此起始材料为自由浮动的粉末，允许与其他成分容易地混合，包括例如上述的球形系统。平均粉末粒径为约200至250μm或甚至200至340μm，以致颗粒隔离可以有时对于直径小于20μm的球形系统是成问题的。在其中隔离有问题的情况下，可在甘露醇DC粒(Mannitol DC granulate)中制备预混物并压紧所述预混物。所述粉末混合物通常需要润滑剂用于压缩(例如，1.5％硬脂酸镁或3％硬脂酸镁∶滑石(1∶1))。在标准旋转式压片机上完成压紧(可能有利的参数：压紧力：7KN，预压力：2.2KN，圆筒(cylinder)高度(压缩)：2.8mm，圆筒高度(压缩前)：3.5mm，片直径：14mm，片高度：5mm，片重量：1.15克)。转换(turnover)高至每小时6000个口香糖或几乎任何较小的规模，允许中试规模(pilot scale)生产来降低稍后在口香糖中生产所述系统的生产风险。使用小型化系统，允许以实验室规模实验(迷你片/口香糖)迅速制剂筛选，还使用单冲压压片机，其中之一装备有合适的压力检测系统作为压片条件合理设计的前提条件。典型的制剂由86.5％或86.95％S以及分别0.5％或0.05％的球形系统、3％硬脂酸镁、7％山梨醇和3％ 碳酸钠压缩。作为替代方案，将使用3种不同的CAFOSA粉末混合物的Health in 典型的制剂含有92.7％Health in 0.05％球形系统、2.0％粉末调味剂、2.0％封装调味剂、1.5％润滑剂、1.0％二氧化硅、0.55％液体调味剂和0.20％强烈甜味剂。 [0142] 通过向不同温度和湿度特征暴露所述球形系统/口香糖制剂来进行稳定性测试。所得口香糖是化学惰性的，并且在储存时不吸湿或仅轻微吸湿并是稳定的。所述制剂不含有酸成分使得当咀嚼时胶部分再团聚被阻止。所得制剂还可在以下方面进一步表征：压缩力、制剂的赋形剂优化、稳定性研究、由水银孔率计测量的压紧密度以及测量硬度、水含量和其他标准药物特征测试。 [0143] 从患有不同疾病期的植入物周围疾病的患者和健康植入物周围袋采集沟液，以及对获得样品的MMP-8水平的医疗检查和确定，通过测量的MMP-8浓度与临床诊断的相关性定义疾病阶段特异性阈值MMP-8浓度：沟液采集和MMP-8水平： [0144] 在临床访问期间检查患有植入物周围疾病的患者和携带植入物的健康对象。在已经获得知情同意之后，所有对象回答问卷，随后进行放射性研究和口腔检查。所述口腔检查包括牙周参数，例如袋探诊深度、临床附着水平和标志植入物的缩退(recession at the index implant)，以及整体口腔卫生和出血指数。 [0145] 使用标准化的MMP-8采集条从标志植入物周围区采集沟液，将其放置在牙周袋中30秒。将aMMP-8从所述条洗脱30秒并用DentoAnalyzer(Dentognostics GmbH，Jena，Germany)定量地评估。所述DentoAnalyzer是有效CE认证的PoC机器，在椅边(chair-side)12分钟内自动进行整个测定过程。所述测定允许在从2ng/ml aMMP-8的洗脱物高至200ng/ml的洗脱物的范围内评估。 [0146] 沟液中的MMP-8浓度与临床检查相关，使得阈值可以作为疾病评分的函数定义。 [0147] 建立系统的MMP-8性能(特异性和敏感性)： [0148] 对于这些测试，使用工具间(tool shop)改造内部机器。通过参考欧洲药典(Pharm.Eur.)用于检测口香糖的专论，所述机器由两个电子控制的活塞组成，所述活塞如咀嚼胶期间所发生的那样传递扭力和压紧力。第三个垂直的活塞(“舌头”)将胶保持在适当的位置。将设定整合入温度控制室(40mL体积)中，在其中放置了20mL的缓冲液或人工唾液。所述缓冲液或唾液掺入如下概述的各蛋白酶来测试配制入口香糖之球形系统的性能(选择性和特异性)。通过装备有荧光检测器的HPLC(在奎宁修饰的情况下，其为强荧光)或通过LC-MS/MS来分析在所述缓冲液或人工唾液中出现的片段以提供更高的敏感性。Pharm.Eur.专论方法和合格分析方法的使用提供了用于当寻求上市许可时将所述系统将来提交至卫生主管部门(Health Authorities)之结果的紧密相关性。 [0149] 体外测试系统对MMP挑战的敏感性： [0150] 对所述系统进行不同MMP挑战，并选择具有经优化之特异性和选择性的5个系统用于MMP-8切割。 [0151] 当暴露于MMP时，如图2B、D切割特征系统(偶联至球形载体或该偶联的球形载体配制入口香糖)。购买MMP-1、2、3、7、8、9、13。进行酶测量来确定kcat/KM值(当底物浓度高时，酶是饱和的并因此反应动力学受kcat控制)和序列特异性的相对比例(MMP-1、MMP-2和MMP-3相对于MMP-8)。当合适时通过常规HPLC方法用UV-VIS检测和荧光检测(对于例如奎宁修饰的系统为荧光)评估切割。使用三级LC-MS/MS来分析和表征片段。当片段小于1500amu(m/z)时，在UWU采用的LC-MS/MS能够稳健地评估这些具有高敏感性的切割产物，同时伴随着通过串联质谱法(MS/MS)采集结构数据用于增强的鉴定和确认。患者中系统功能性/口香糖的评价，进行患者接受评估/调味物质的味觉敏感性： [0152] 使用怀疑具有软组织炎症/种植体周围炎的具有至少一个植入物的患者，所述植入物在研究开始前≥1年插入。筛选其合格参加此研究(纳入/排除标准)之后，要求他们签署知情同意书(ICF)。评估临床参数，即改良菌斑指数(mPLI)、改良沟出血指数(mSBI)、植入物周围袋深度(PPD)、植入物至沟边缘距离(DIM)和临床附着高度(CAL)，以及探诊出血(BoP)。完成根尖周X射线以确认存在冠状半透明(阳性X射线)。具有确认的植入物周围疾病的患者(阳性BoP和阳性根尖周X射线)以随机次序接受口香糖中的植入物周围味觉传感器或相应“安慰剂(dummy)”。记录他们的味觉反应。如下所概述地对每名患者本身的校正因子进行校准。 [0153] 样本大小：至少20名患者，(每名患者的顺序研究设计是盲的，并接受口香糖中的味觉传感器或相应的安慰剂，在施用之间有至少30分钟的等待时间)。 [0154] 方法：用口香糖中的“植入物周围味觉传感器”(测试组；在如上概述的口香糖中提供)和相应的“安慰剂”(对照组；作为具有安慰口香糖的真实组(verum group))使用预先确定的随机化列表处理具有临床确认的种植体周围炎症(BoP；X射线)的患者，并在处理之间具有至少30分钟的等待时间。在如下概述的校准后对个体味觉反应进行归一化。 [0155] 味觉评估，口香糖中植入物周围味觉传感器的咀嚼：在如下概述地校准每名患者(确定个体校正因子)后，记录患者味觉体验(苦味/无特殊味道)。 [0156] 系统的味道测试： [0157] 需要这些研究评价带有调味物质的经切割之肽序列的味道。为此，如下所概述地测试截短的肽序列，所述截短的肽序列代表在系统的蛋白酶切割之后的“切割”部分并带有调味物质(参见图2A)。原则上可以以两个阶段进行：阶段I为每个志愿者的校准(确定校正因子)且阶段2为暴露于带有所述调味物质的肽片段，对于其如下概述地采集苦味值： [0158] 在本公开内容中使用的预期的调味物质(苦味)不来自单一的化学种类(例如肽相对于奎宁)。苦味物质通常具有环结合羰基，其可为具有环的内酯环系统的部分，所述环的打开通常导致苦味道的丧失。为了评估苦味道，采用苦味物质稀释(其刚好被注意为是苦的)的倒数值。因此，苦值10000意味着1g的测试对象并稀释于10000mL水中刚好被识别为苦的。确定所述苦值为6次单个测量的平均值，其由6名志愿者进行。由于这是生物测试测定，每个人在研究开始前必须校准，在校准已经完成后计算每名志愿者的个体校正因子。为此，使用具有200000苦值的奎宁-HCl(在100mL水R中稀释0.1g奎宁-HCl R。取1mL那样的溶液并用水R稀释至100mL＝储备溶液。将那样不同体积的储备溶液用水R稀释至10mL＝参考溶液)。如果志愿者刚好品尝出此参考溶液是苦的，则不需要校正因子。 在所有其他情况下，如下确定校正因子：每名志愿者接受相同体积的稀释奎宁-HCl。如果人几乎没有感觉到苦味，则该志愿者必须将所述溶液保持在其口中30秒。在用另一个稀释液测试人之前必须精确等待10分钟。在室温下并在品尝所述溶液前保持所述溶液，志愿者用水漱洗口。在整个过程期间，除了一些无味的白面包，不允许进食或吸烟。以k＝n/5计算所述校正因子，n为毫升储备溶液中刚好品尝出苦的量。将由于敏感性的缺失而不能品尝参考溶液(由大于5.8mL的储备溶液用水R稀释至10mL构成)的志愿者排除出测试。 为了测试本文开发的调味物质/系统，制造在蛋白酶切割后产生的片段并连接至所述调味物质，且使用这些片段用于测试。为此，在搅动下将10mg的所述片段溶解于1mL的水R中。 在溶解后，使用水R将此溶液稀释至100mL(称为溶液C1，其稀释因子为100)。用水R稀释 10mL那样的溶液来产生100mL的溶液C2(稀释因子1000)等。以C4开始，每名志愿者分别确定其个体苦阈值水平和刚好品尝的溶液。此刚好品尝的溶液称为D。使用D，制备以下稀释液组，使用水R：1.2、1.5、2.0、3.0、6.0、8.0mL总是将所述稀释液组的体积加至10mL。 以mL确定溶液D的量，其为刚好品尝为苦的。对于每名志愿者，如下计算苦值：(Y＊k)/(X＊0.1)，其中Y为刚好被识别为苦的Cn＝D的个体稀释因子，k为如上概述的校正因子且X为溶液D的mL量，其已经被识别为苦的。所述过程与约20-30％的误差相连，其在数据阐释期间被考虑。 [0159] 参考标记的列表 [0160] 1 调味物质 6 在第一状态下的着色剂物质 [0161] 2 接头元件 7 在第二着色状态下的着色剂物质 [0162] 3 基底和/或锚 [0163] 4 MMP触发物 [0164] 5 释放的调味物质 |
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