用于在体外选择对黑斑病损伤有抗性的马铃薯克隆的方法及由此生成的马铃薯

                    发明领域

一般而言，本发明涉及为了获得期望特征而进行的植物组织培 养。更具体的说，本发明涉及在体外选择对黑斑损伤有抗性的Lemhi 和Russet Burbank马铃薯克隆。

                    发明背景

黑斑病是影响操作过程中受损伤的马铃薯块茎的生理学(非传染 性)紊乱，也称为青变、青斑、蓝变、损伤、内部黑斑、内部损伤、 内部灰斑、和茎端变黑。这种紊乱表现为在将受伤块茎削皮或切片时 可以看到的内部变色和变黑。变黑通常限于表皮与维管环之间块茎组 织的外部1/4”-1/2”。斑点的颜色可以变化，由浅灰色至蓝灰色至 强烈的煤黑色。斑点的大小和强度通常在受伤24小时内达到最大值， 而且一旦形成，变黑区域将不会消失。

黑斑病通常是由操作、运输、储藏、或包装过程中对块茎的冲击 (碰撞、掉落、等)引起的，但也可能在不同程度上与其它物理损伤 (诸如压力擦伤和/或散落破裂)有关。起始黑斑病所需要的力量不 必强烈，特别是对于易感栽培种而言。

1912年英国首次报告并描述了这种紊乱，此后它成为整个欧洲的 严重问题。1940年美国鉴定了这种紊乱，而现在在这个国家的所有马 铃薯种植区也都可以找到它。

虽然受影响的马铃薯仍可使用，但是因它们的外观而使它们的商 业价值受到限制。这种紊乱是特别严重的，因为受影响的块茎可能不 显示外部损伤，甚至在清洗块茎之后也如此。在鲜货市场和加工马铃 薯(包括切片和油炸食物)中，黑斑损伤常常导致严重的经济损失。

块茎易感性和足以破坏细胞的冲击力度是对起始和形成黑斑病负 有责任的两个最重要的因素。这些条件激活了一系列即四步由酚类化 合物(由酪氨酸开始)至醌缀合物的生化转变。中间化合物包括咖啡 酸和对香豆酸。由多酚氧化酶作用介导的该系列之后是醌聚合形成黑 色素。在健康的、未受伤组织中，这些酚类化合物与多酚氧化酶通常 是隔开的，不发生接触。然而，细胞破裂引起内含物混和，并发生变 黑反应。虽然酪氨酸和多酚氧化酶在黑斑形成中发挥主要作用，但是 块茎中存在的这些化合物的总量通常与块茎易感性无关，不能解释块 茎和栽培种之间黑斑反应的差异。关于黑斑现象的生物化学的最近工 作指出细胞内游离酪氨酸库的减小可增加块茎对变黑的抗性 (Corsini等人，Evidence for highly conserved tuber tyrosine levels among potato genotypes and implications for blackspot resistance即关于马铃薯基因型间高度保守的块茎酪氨酸 水平的证据和黑斑抗性的含义，Am.Potato J.，66：511-512， 1989)。这些调查人员发现许多马铃薯栽培种的酪氨酸总含量显著相 似，尽管这些栽培种的黑斑病易感性差异很大。在那些对黑斑病具有 最大抗性的栽培种中，发现大部分酪氨酸与蛋白质结合，只有很少的 游离酪氨酸可用于形成黑色素。在易感的栽培种中发现了相反情况。

除了上文讨论的生化因素，许多环境和栽培因素也可能促成这种 紊乱的显现。块茎膨压、温度、比重、矿质营养、种植日期、土壤湿 度、和土壤温度都可以影响黑斑形成(Hiller等人，Physiological disorders of potato tubers即马铃薯块茎的生理学紊乱，Patato Physiology，389-455，Academic出版社，纽约，1985)。

甚至在考虑了所有诱病因素之后，马铃薯栽培种对冲击损伤的反 应仍旧差异显著。有些栽培种可能对黑斑病具有高度抗性，而其它栽 培种可能高度易感。来自单一植株的块茎在变黑反应中也可能不同。 在一个块茎中，由茎端至芽端的易感性也可能不同。

可以通过在生长季节采用生产实践而将因黑斑病引起的损失控制 在某种程度。目前用于控制黑斑损伤的实践是通过提供适当的疾病和 害虫控制及优良的土壤湿度和肥力(特别是钾)而使植物尽可能的健 康。不应当使土壤在收获前变干，而且应当及早处死蔓藤以降低块茎 的水分损失。控制黑斑形成程度的最重要手段是减少收获过程之中和 之后对块茎的损伤。可以如下实现这一要求：不在土壤温度较低(8 ℃)时收获块茎，调节操作速度、掉落距离、和给所有的马铃薯操作 设备添加衬垫。选择对黑斑病最有抗性的栽培种也是一种重要的考 虑。然而，由于生产限制，这并非总是可行。有些栽培种显示商业生 产的极大潜力，但是因黑斑损伤而受损。栽培种Lemhi Russet和 Russet Burbank(程度较轻)就是这种情况。

Lemhi和Russet Burbank因具有许多特征而使之成为加工工业的 合适且重要的栽培种，包括还原糖水平较低、储藏性较好、加工极 好、和休眠。然而，它们对黑斑病极其易感。尚未发现天然有抗性的 Lemhi和Russet Burbank。这限制了它们的可接受性，因为由擦伤受 损马铃薯获得的加工产品(如切片和油炸食物)的质量显著降低。虽 然可以通过传统育种技术获得黑斑抗性，但是这也可能改变使得栽培 种在商业上可接受的其它特征(诸如糖水平、形状、比重、或产 量)。在维持每一种期望特征的基础上培育改进的栽培种是很困难 的，而且这种方法将牵涉几年的杂交和测试。

作为传统育种技术的候选，植物细胞培养提供了机会而能够评估 有潜力再生成有价值的体细胞克隆变体的大量细胞(精确的说是以百 万计)。通常，需要大量的再生植株来鉴定具有期望性状的体细胞克 隆。增加和测试这种群体是费力的，而且需要大量的温室和田地空 间。这个问题通常由能够在再生成植株前在组织培养中对体细胞克隆 筛选所需特征的开发技术来解决。在细胞培养水平进行的评估极大降 低了所要求的空间，并增加了可以检验的体细胞克隆系的数目。体外 筛选流程通过消除不需要的材料而在本质上增加了鉴定得到具有期望 性状的克隆的可能性。因此，需要提供传统育种方法的候选方法，用 于马铃薯栽培种的改进和开发。还需要增加鉴定得到黑斑抗性Lemhi 和Russet Burbank马铃薯克隆的可能性。还需要增加鉴定并选择期望 黑斑抗性Lemhi和Russet Burbank体细胞克隆的容易度和功效的技 术。本发明满足了这些需要，并提供了其它相关优势。

                  发明概述

本发明涉及使用植物组织培养技术和使用添加到组织培养培养基 中的至少一种黑色素前体(诸如酪氨酸或咖啡酸)而在体外筛选对黑 斑病有抗性的Lemhi和Russet Burbank的方法。本发明还涉及由体外 筛选生成的黑斑抗性块茎。这些方法基于体外体细胞分离、培养、筛 选、选择、和再生，但不涉及有性杂交。

这些方法通常包括：在细胞层培养基和相关储存培养基中培养由 马铃薯植株获得的组织，将组织在愈伤组织增殖培养基上传代培养以 获得愈伤组织形成，将愈伤组织在苗诱导培养基上传代培养以获得苗 形成，并将苗在生根培养基上传代培养以确保根形成，从而再生得到 马铃薯植株，由此可生成对黑斑病有抗性的块茎。可以向储存培养 基、愈伤组织增殖培养基、和生根培养基中添加至少一种黑色素前 体，以进一步增加鉴定得到黑斑抗性克隆的可能性。在使用黑色素前 体筛选方法时，由在各种培养基中存在黑色素前体时不显示变黑应答 的愈伤组织和根再生得到马铃薯植株。

根据下文更详细的描述，本发明的其它特色和优势将变得清晰。

                     发明详述

本发明提供了用于提高黑斑抗性增加的再生Lemhi和Russet Burbank马铃薯克隆的数目的方法及由其生成的马铃薯块茎。 用于马铃薯叶肉原生质体的收集、培养、和再生的流程

阅读下列流程时应当参阅下列缩写和组成：                缩写表 BAP 6-苄基氨基嘌呤 GA3 赤霉酸 NAA 萘乙酸 MES 2[N-吗啉代]乙烷磺酸 PVP-10 聚乙烯吡咯烷酮(10,000MW) EDTA 乙二胺四乙酸(钠盐)       主要盐原液的组成 KNO3  19.0g/L CaCl2·2H2O  4.4 MgSO4·7H2O  3.7 KH2PO4  1.7     微量元素(原液I)的组成 H3BO4  0.620g/L MnCl2·4H2O  1.980 ZnSO4·7H2O  0.920      微量元素(原液II)的组成 KI  0.083g/L Na2MoO4·2H2O  0.025  CuSO4·5H2O  0.0025  CoSO4·7H2O  0.003      有机物原液的组成 肌肉-肌醇 20.2g/L 硫胺素·HCl 0.1 甘氨酸 0.4 尼克酸 1.0 盐酸吡哆醇 0.1 叶酸 0.1 生物素 0.01        Fe-EDTA原液的组成 Na2 EDTA  0.373g/L FeSO4·7H2O  0.278        混杂原液的组成 酪蛋白水解物 10.0mg/mL NH4Cl 0.1M MES 0.5M     植物生长调节剂原液的组成  BAP、GA3、NAA、和玉米素原液的浓度是0.1mg/ml 来源植株的栽培

应当将马铃薯块茎维持于室温以中断休眠。这通常发生于7-14 天内。在发芽起始后，将各块茎单个种植到装有人造土壤混和物诸如 Jiffy-Mix(JPA，1400 Harvester路，West Chicago，IL 60185) 或Sunshine-Mix(Fisons Western公司，Vancouver，BC，加拿大 V6H 3V1)的20cm陶罐中。应当用蒸馏水使土壤保持潮湿，但是应当 避免浇水过度。当芽的长度达到6-10cm时，由母本块茎切下芽，并 种植到装有土壤混和物的20cm陶罐中。应当在相对湿度70-80％、以 冷白色荧光灯照明12小时光周期的受控环境室中栽培植物。照明方案 应当包括5小时的90μE m-2 sec-1、2小时的325μE m-2 sec-1、和5小 时的90μE m-2 sec-1。将温度维持在16℃，但是在光照周期的第2-6 小时升高至22℃。如Shepard，J.F.，Mutant selection and plant regeneration from potato mesophyll protoplasts，Genetic Improvement of Crops：Emergent Techniques即由马铃薯叶肉原生 质体选择突变体和再生植株，农作物的遗传改良：新兴技术，明尼苏 达大学出版社，第185-219页，1980所述，两周一次给植株施肥。

也可以由自分生组织培养物起始的植株生成原生质体来源植株， 并通过节扦插增加数目。可以用下文处理苗延长/根起始的“植物再 生指令序列”部分中描述的培养基E和条件来培养并维持它们。 原生质体的分离

(叶片采集)

当由移植后4-8周的植株收集小叶时，原生质体的产量是相当一 致的。由第3-7节(自植株顶端开始)剪下叶子。应当避免使用很嫩 的叶或很老的叶。具有大型末端小叶(＞5cm)的叶通常产生大量的原 生质体。选择最大的叶。让一部分叶柄留在小叶上以便于操作。大约 3.5-4.5g叶组织(5-6片小叶)通常将提供足够的细胞用于处理。 在测定鲜重后，小叶已经准备就绪，可用于酶促分离的预处理。

原生质体分离(小叶预处理)

必须极度小心以确保在下文所述体外操作的整个过程中维持绝对 无菌条件。在将小叶置于预处理溶液中之前，必须将小叶灭菌。将每 片小叶浸入70％乙醇(1-2秒钟)，然后转移至装有1000ml 10％漂 白剂(Chlorox、Hilex、等)溶液的烧杯中。将小叶在次氯酸盐溶液 中浸没2-3分钟，然后转移至装有500ml无菌蒸馏水的烧杯中。将每 片小叶浸入水中大约10次即漂洗，然后转移至装有无菌蒸馏水的第二 个烧杯中，并重复漂洗步骤。第二次漂洗后，将小叶浸入70％乙醇 (1-2秒钟)。现在小叶已经准备就绪，可用于预处理溶液。将 250ml无菌漂浮液无菌转移至大型(20cm)、有盖的玻璃洗盆(无 菌)中           漂浮液 NH4NO3 80mg CaCl2·2H2O 147mg NAA(2mg/L) 20ml原液 BAP(1mg/L) 10ml原液 总体积1000ml 高压灭菌

将小叶漂浮在漂浮液表面上，背轴(顶)面向下。用箔片覆盖 盆，并于24℃保温48小时。保温后，取出小叶，并如上所述重复表面 灭菌步骤。最后一次浸入70％乙醇后，将小叶在层流罩超净台中在无 菌纸巾上空气干燥。

通过在95％乙醇中浸泡5-10分钟，将尼龙刚毛美工刷灭菌。将 刷子空气干燥，并小心的刷过每片小叶的向轴(底)面。刷的动作应 当朝向小叶尖端，而且应当持续至由小叶剥去表皮。当组织由浅绿色 变成深绿色时，剥离步骤就完成了。由每片小叶除去中脉并丢弃。将 刷过的组织无菌切成窄条(1-3mm宽)，并转移至装有200ml无菌浸 泡液的500ml侧臂烧瓶。将烧瓶漩涡晃动，使组织片均匀分布在溶液 中。用箔片覆盖烧瓶，并于4-10℃保温24小时。             浸泡液 主要盐 2.5ml原液 Fe-EDTA 2.5ml原液 有机物 0.25ml原液 微量元素I 0.25ml原液 微量元素II 0.25ml原液 NH4Cl 1.0ml原液 NAA 2.0ml原液 BAP 1.0ml原液 总体积200ml pH5.6 高压灭菌

原生质体分离(小叶消化)

浸泡阶段完成后，由烧瓶小心的倒出液体，并换入100ml酶溶 液。            酶溶液 Yakult离析酶R-10 0.1g Yakult纤维素酶RS 0.5g 主要盐 5.0ml原液 MES 1.0ml原液 PVP-10 1.0g 酪蛋白水解物 1.0mg 蔗糖 10.27g NH4Cl 0.5ml原液 总体积100ml pH5.6 过滤除菌

将小叶切片真空浸润(25-27英寸Hg)7分钟，并将烧瓶置于旋 转摇床(100rpm)上，于室温(27℃)保温至组织分离(3-5小 时)。消化时间随栽培种、组织年龄、温度、摇床速度、和酶溶液的 比重而变化。

原生质体分离(原生质体收获)

通过无菌Babcock(乳试验)瓶中的离心浮选来收集原生质体 (除去细胞壁的细胞)。将消化烧瓶的内容物和缓的倒入装有几层粗 棉布的无菌漏斗内。漏斗尖端经一段塑料管装配了5 1/4英寸巴氏吸 管。吸管尖端应当靠在Babcock瓶颈的内侧，距离瓶口大约1/2-1/3 距离。原生质体极端脆弱，因此应当使原生质体悬浮液沿瓶壁流下， 而不是直接溅落瓶底。新鲜分离的原生质体还对光敏感，因此收集步 骤应当在柔和的光照下进行。将无菌漂洗液倒到滞留在粗棉布滤器上 的碎片上，同时用吸管尖端温和摇动滤器。            漂洗液 主要盐 10.0ml原液 酪蛋白水解物 1.0ml原液 蔗糖 20.54g NH4Cl 1.0ml原液 总体积200ml pH5.6 过滤除菌

漂洗碎片至注满3个Babcock瓶。用无菌漂洗液注满第四个瓶。将 该瓶用于平衡离心机。将4个瓶以500rpm离心10分钟(IEC HN-SII离 心机，配备转头215和套管367A)。碎片离心到瓶底，而完整原生质 体漂浮在顶部。由平衡瓶取出5-10ml无菌漂洗液。用无菌9英寸巴氏 吸管将其它3个瓶的原生质体层转移至漂洗瓶。将吸管尖端插入漂洗 液，然后将原生质体缓慢且温和的注入溶液。将瓶子倾斜大约45度角 并旋转几分钟，使原生质体均匀分布于漂洗液中。加入新鲜漂洗液至 Babcock瓶颈(#8)上的顶级并再次离心。若在CL培养基中使用1X 盐，则现在就可以涂布生成的漂浮原生质体。若CL培养基含有4X 盐，则必须在涂布前将原生质体在保持液中适应至少1小时。            保持液 主要盐 20.0ml原液 Fe-EDTA 5.0ml原液 微量元素I 0.5ml原液 微量元素II 0.5ml原液 酪蛋白水解物 0.1ml原液 蔗糖 6.8g 肌醇 0.45g 木糖醇 0.45g 山梨醇 0.455g 甘露醇 0.455g 总体积100ml pH5.6 过滤除菌

由瓶颈读取原生质体层占据的分区数目，以估计收集的细胞数目 (一个大分区包含大约250万个原生质体)。通过几次漂洗用保持液 包被无菌巴氏吸管的内壁，排出原生质体层，并用保持液将原生质体 稀释至浓度1百万个细胞/ml。将原生质体在保持液中于22-24℃维持 最少1小时。 体外选择黑斑抗性原生质体衍生的马铃薯克隆的方法 植株再生顺序

(原生质体培养)

在塑料四分板中培养原生质体。准备平板，即用电焊枪沿每个分 区的底部割一条缝。向两个相对分区的每一个都注入10ml R培养基。             R培养基 主要盐 50.0ml原液 NH4Cl 5.0ml原液      Fe-EDTA 50.0ml原液 微量元素I 5.0ml原液 微量元素II 5.0ml原液 有机物 5.0ml原液 酪蛋白水解物 100.0mg 甘露醇 18.2g 蔗糖 34.2g NAA 10.0ml原液 BAP 4.0ml原液 Difco纯化琼脂 6.0g 总体积1000ml pH5.6 高压灭菌

 R培养基的工作浓度如下：        R培养基的工作浓度 NH4Cl  27mg/L 主要盐   KNO3  950mg/L   CaCl2·2H2O  220   MgSO4·7H2O  185   KH2PO4  85 铁和微量元素   Na2·EDTA  18.5mg/L   FeSO4·7H2O  13.9   H3BO4  3.1   MnCl2·4H2O  9.9   ZnSO4·7H2O  4.6   KI  0.42   Na2MoO4·2H2O  0.13   CuSO4·5H2O  0.013   COSO4·7H2O  0.015 有机物   硫胺素·HCl 0.5mg/L   甘氨酸 2.0   尼克酸 5.0   盐酸吡哆醇 0.5   叶酸 0.5   生物素 0.05   酪蛋白水解物 100.0 渗压剂   蔗糖 0.1M   甘露醇 0.1 其它   NAA 1.0mg/L   BAP 0.4mg/L   琼脂 0.6％   pH 5.6

制备原生质体细胞层培养基(CL培养基)，即混和4份SLLX溶液 与1份CL成分。        SLLX 主要盐 50.0ml原液 蔗糖 0.56g 肌醇 0.56g 木糖醇 0.56g 山梨醇 0.56g 甘露醇 0.56g 总体积100ml pH5.6 过滤除菌               CL Fe-EDTA  6.25ml原液 微量元素I  0.625ml原液 微量元素II  0.625ml原液 酪蛋白水解物  0.625ml原液 NAA  1.25ml原液 BAP  0.5ml原液 琼脂(VII型)  0.56g 总体积25ml pH5.6 高压灭菌

CL培养基的工作浓度如下：     CL培养基的工作浓度 主要盐     KNO3  7600mg/L     CaCl2·2H2O  1760     MgSO4·7H2O  1480     KH2PO4  680 铁和微量元素   Na2·EDTA  18.5mg/L   FeSO4·7H2O  13.9   H3BO4  3.1   MnCl2·4H2O  9.9   ZnSO4·7H2O  4.6   KI  0.42   Na2MoO4·2H2O  0.13   CuSO4·5H2O  0.013   CoSO4·7H2O  0.015 有机物   硫胺素·HCl  0.5mg/L   甘氨酸  2.0   尼克酸  5.0   盐酸吡哆醇  0.5   叶酸  0.5   生物素  0.05   酪蛋白水解物  50.0 渗压剂   蔗糖  0.200M   甘露醇  0.025   肌醇  0.025   山梨醇  0.025   木糖醇  0.025 其它   NAA  1.0mg/L   BAP  0.4mg/L   琼脂(VII型)  0.45％   pH  5.6

将混和的CL/SLLX培养基冷却至室温(10-15分钟)。然后将原 生质体悬浮液稀释至期望浓度(20,000-40,000细胞/ml)。使用无 菌吸管尖端，将原生质体在培养基中温和的混匀成均一的悬浮液。将 3ml悬浮液转移至每个空的四分板分区，合计每个板6ml。用 Parafilm石蜡膜密封平板，并在恒定照明(冷白色荧光灯)下于24 ℃保温10-14天。在这一起始生长阶段需要低光照强度(大约 600lux)。

植物再生顺序(愈伤组织培养)

用无菌解剖刀将凝胶形式的细胞层切成小片，并将这些凝胶片转 移至装有20ml C培养基(＝C1)(愈伤组织增殖培养基)的皮氏培养 皿。一个四分区的整个内容物应当涂布在一个C培养基平板上。用 Parafilm石蜡膜密封平板，并在大约3000lux的恒定照明(冷白色荧 光灯)下于24℃保温。2-3周后，愈伤组织(小型细胞聚集体)应当 是浅绿色的，直径大约1-2mm。用无菌解剖刀片尖端由凝胶挑取个别 愈伤组织，并转移至装有新鲜C培养基的平板(25-50愈伤组织/平 板)。如上所述将这些C培养基平板(＝C2)保温。       C培养基 主要盐  100.0ml原液 NH4Cl  20.0ml原液 Fe-EDTA 50.0ml原液 微量元素I 5.0ml原液 微量元素II 5.0ml原液 有机物 5.0ml原液 酪蛋白水解物 400.0mg 硫酸腺嘌呤 40.0mg 甘露醇 54.6g 蔗糖 2.5g NAA 1.0ml原液 BAP 5.0ml原液 MES 10.0ml原液 Difco纯化琼脂 9.0g 总体积1000ml pH5.6 高压灭菌

C培养基的工作浓度如下：       C培养基的工作浓度 NH4Cl  107mg/L 主要盐   KNO3  1900mg/L   CaCl2·2H2O  440   MgSO4·7H2O  370   KH2PO4  170 铁和微量元素   Na2·EDTA  18.5mg/L   FeSO4·7H2O  13.9   H3BO4  3.1   MnCl2·4H2O  9.9   ZnSO4·7H2O  4.6   KI  0.42   Na2MoO4·2H2O  0.13   CuSO4·5H2O  0.013   CoSO4·7H2O  0.015 有机物   肌醇  100.0mg/L   硫胺素·HCl  0.5   甘氨酸  2.0   尼克酸  5.0   盐酸吡哆醇  0.5   叶酸  0.5   生物素  0.05   酪蛋白水解物  100.0   硫酸腺嘌呤  40.0 渗压剂   蔗糖  0.25％   甘露醇  0.3M 其它   NAA  0.1mg/L   BAP  0.5mg/L   MES  5.0mM   琼脂  0.9％   pH  5.6

植物再生顺序(愈伤组织分化)

当愈伤组织变成深绿色时(3-5周)，将来自C培养基平板的愈 伤组织转移至装有苗诱导培养基(6D培养基)的平板(10-25愈伤组 织/平板)。用Parafilm石蜡膜密封平板，并在冷白色荧光灯下(大 约3000-4000lux)以每日周期16小时光照/8小时黑暗于24℃保温。 苗诱导通常发生于6-8周后。然而，有些栽培种只在苗再生培养基上 长期培养(6-8个月)后才生成苗。           6D培养基 主要盐  100.0ml原液 NH4Cl  50.0ml原液 Fe-EDTA  50.0ml原液 微量元素I  5.0ml原液 微量元素II  5.0ml原液 有机物  5.0ml原液 酪蛋白水解物  100.0mg 硫酸腺嘌呤  80.0mg 甘露醇 36.4g 蔗糖 2.5g 玉米素(反式异构体) 20.0ml原液 NAA 0.1ml原液 GA3 0.1ml原液 MES 10.0ml原液 Difco纯化琼脂 10.0g 总体积1000ml pH5.6 高压灭菌 高压灭菌后加入玉米素和GA3

6D培养基的工作浓度如下：       6D培养基的工作浓度 NH4Cl  267.5mg/L 主要盐   KNO3  1900mg/L   CaCl2·2H2O  440   MgSO4·7H2O  370   KH2PO4  170 铁和微量元素   Na2·EDTA  18.5mg/L   FeSO4·7H2O  13.9   H3BO4 3.1   MnCl2·4H2O 9.9   ZnSO4·7H2O 4.6   KI 0.42   Na2MoO4·2H2O 0.13   CuSO4·5H2O 0.013   COSO4·7H2O 0.015 有机物   肌醇 100.0mg/L   硫胺素·HCl 0.5   甘氨酸 2.0   尼克酸 5.0   盐酸吡哆醇 0.5   叶酸 0.5   生物素 0.05   酪蛋白水解物 100.0   硫酸腺嘌呤 80.0 渗压剂   蔗糖 0.25％   甘露醇 0.2M 其它   玉米素(反式异构体) 2.0mg/L     NAA  0.01     GA3  0.01     MES  5.0mM     琼脂  1.0％     pH  5.6

植物再生顺序(苗延长/根起始)

当愈伤组织上的苗长到2-10mm长时，由各愈伤组织切下苗，并 转移至装有15ml E培养基的玻璃试管(25×150mm)。将每根苗的基部 压入培养基，盖上试管帽，并用滤纸条密封。将试管在冷白色荧光灯 下(大约1500-2000lux，每天8小时黑暗期)于24℃保温。根起始应 当发生于2-5周内。            E培养基 主要盐  100.0ml原液 NH4Cl  50.0ml原液 Fe-EDTA  50.0ml原液 微量元素I  5.0ml原液 微量元素II  5.0ml原液 有机物  5.0ml原液 硫酸腺嘌呤  40.0mg 蔗糖  6.0g MES  10.0ml原液 Difco纯化琼脂  5.0g 总体积1000ml pH5.6 高压灭菌

E培养基的工作浓度如下：         E培养基的工作浓度 NH4Cl  267.5mg/L 主要盐   KNO3  1900mg/L   CaCl2·2H2O  440   MgSO4·7H2O  370   KH2PO4  170 铁和微量元素   Na2·EDTA  18.5mg/L   FeSO4·7H2O  13.9   H3BO4  3.1   MnCl2·4H2O  9.9   ZnSO4·7H2O  4.6   KI  0.42   Na2MoO4·2H2O  0.13   CuSO4·5H2O  0.013   CoSO4·7H2O  0.015 有机物   肌醇  100.0mg/L   硫胺素·HCl  0.5   甘氨酸 2.0   尼克酸 5.0   盐酸吡哆醇 0.5   叶酸 0.5   生物素 0.05   硫酸腺嘌呤 40.0 渗压剂   蔗糖 1.0％   甘露醇 0.1M 其它   琼脂 0.5％   pH 5.6

植物再生顺序(再生小植株的栽培)

由试管中取出小植株，并用蒸馏水洗去根上的琼脂。将每株小植 株转移至装有Jiffy-Mix的8cm陶罐。用大约100ml Peters 20-20-20 肥料(0.5g/L)给陶罐浇水。将每个陶罐密封在干净的塑料袋中。将 袋装的陶罐在荧光灯下于室温(22-27℃)保温。一周后，打开袋子 的顶部。随后7-10天扩大开口，然后除去整个袋子。让植株继续生 长2-4周。当植株长到15-25cm高时，应当将它们移植到装有Jiffy- Mix的更大陶罐(20-30cm)中。然后在温室中栽培植株直至完成块 茎结果(2-4个月)。收获前大约1周，切断蔓藤，并让陶罐中的土 壤干燥。将每个原生质体衍生克隆的块茎收集到纸袋中并冷藏，用于 田间扩大。

上文所述技术基于Shepard，J.F.，Mutant selection and plant regeneration from potato mesophyll protoplasts， Genetic Improvement of Crops：Emergent Techniques即由马铃薯 叶肉原生质体选择突变体和再生植株，农作物的遗传改良：新兴技 术，明尼苏达大学出版社，第185-219页，1980描述的流程，并经过 Taylor，R.J.和Secor，G.A.，A shoot induction procedure altered for increased shoot efficiency of potato protoplast -derived calli即为了提高马铃薯原生质体衍生愈伤组织的苗效率 而改变的苗诱导流程，Potato Research，31：651-658，1988的修 改(收入本文作为参考)。

在一个优选实施方案中，依照上文所述流程进行马铃薯叶肉原生 质体的收集、培养、和再生，只是在有些组织培养培养基中包含至少 一种黑色素前体诸如酪氨酸或咖啡酸。这种方法能够额外增加黑斑抗 性克隆的数目。如上所述不含至少一种黑色素前体的培养诱导筛选方 法自身将导致一些黑色素抗性克隆。

在黑色素前体筛选方法的第一阶段，在普通CL培养基(不含黑色 素前体)中稀释(40,000细胞/ml)原生质体，然后转移至装有含 0.25mM酪氨酸或咖啡酸的R培养基(储存培养基)的培养平板。正常 保温期后，将原生质体和原生质体衍生微小愈伤组织与细胞层培养基 (CL)一起转移至含0.5mM酪氨酸的C培养基。此第一次转移至C培养 基是该方法的第二阶段。标准保温期后，只选择不显示变黑应答的愈 伤组织，并转移至含1.0mM酪氨酸或咖啡酸的新鲜C培养基，用于第三 阶段的筛选。将愈伤组织继续保温2-4周，并通过无菌解剖刀片的切 割使那些保持绿色(不显示变黑)的愈伤组织受损。24小时后，对割 伤的愈伤组织评估受损区域的变黑情况。此第四阶段筛选后，只将存 活的绿色愈伤组织转移至普通6D培养基(苗诱导培养基)(不含黑色 素前体)，用于小植株起始。将再生植株转移至含0.5mM酪氨酸或咖 啡酸的E培养基(生根培养基)，用于最后第五阶段的筛选。回收所 有在培养基中形成不展示根变黑的苗，作为潜在的黑斑抗性克隆。将 这些植株转移至陶罐中，并在温室中栽培，用于生成块茎。每株植株 通常生成6-24个块茎，保留它们直至下一个田间种植季节。随后将 选定克隆的块茎扩大1或2次田间世代。在温室和田间两个场所检验克 隆的解剖特征，并对收获的块茎测试黑斑损伤。可能有利的是只在有 些阶段添加酪氨酸或咖啡酸，因为否则的话原生质体和愈伤组织可能 受伤并因而不能用。 表1：筛选和再生顺序所牵涉的最短时间的概述 阶段 持续时间 累积时间 小植株再生 CL/R筛选(1) 10天 10天 C1筛选(2) 10天 20天 C2筛选(3) 21天 41天 C2筛选(4) 1天 42天 6D再生 45天 87天 E筛选(5) 21天 108天 块茎生成 (实验室预处理) 14天 122天 (温室) 90天 212天 讨论

用于鉴定可生成黑斑抗性植株的细胞和愈伤组织的流程基于的是 受伤块茎中通常发生的生化过程。上文所述标准组织培养培养基中包 含酪氨酸(通过一系列生化反应转变成黑色素的主要化合物)或咖啡 酸(黑色素途径中的中间化合物)作为额外成分。在组织培养过程的 几个阶段对由单个原生质体衍生的愈伤组织评估黑色色素形成。丢弃 那些在存在酪氨酸或咖啡酸时展示变黑应答的愈伤组织(推测是易感 体)，保留那些在整个生长和再生过程中不显示变黑的愈伤组织(可 能是抗性克隆)。将由这些愈伤组织生成的植株进行温室和田间扩 大，以生成足够数量的块茎用于随后的损伤和黑斑评估。 黑斑测试(所用方法和评估系统)

使用与Kunkel等人，Improvements of techniques for blackspot evaluation and some errors associated with measurements即用于黑斑评估的技术改进和与测量有关的一些误差， Am.Potato J.，63：13-23，1986(收入本文作为参考)所述相似 的器械，在受控条件下使块茎受伤。对每个克隆的5个块茎进行测 试，方法是将一个115g砝码由45或50cm高度落下而冲击块茎，每个块 茎接受9次冲击(茎端3次、中部3次、芽端3次)。将块茎于75℃维持 24小时，然后评估。在测试的第一年，可用再生块茎的数量因环境条 件而是最小的。在第一年和第三年，每个克隆测试5个块茎，每个块 茎接受9次冲击，合计45次擦伤斑点。在第二年，每个克隆重复测试3 次，即每个克隆15个块茎，每个块茎9次冲击，合计135个擦伤斑点。 下文所示第二年的结果反映了三次试验的平均值。对于有些克隆，第 二年是测试该克隆的第一年。用刀在冲击区域切片，目视测定黑斑形 成。平行于块茎表面切下薄薄的组织切片直至获得最大直径的变黑强 度。

使用3种标准来量化黑斑病易感性： (1)依照5分等级来评估每个冲击点的损伤严重程度(S)，其中

   0＝不形成斑点

   1＝很小的斑点，稍微黑

   2＝小斑点，有限变黑

   3＝中等斑点，中度变黑

   4＝大斑点

   5＝很大的斑点，强烈变黑 (2)对斑点计数，并由该信息测定形成斑点的冲击区域的百分比 (PC)。 (3)依照下面的公式，由上述信息计算黑斑指数(BI)：

    BI＝S×PC

将栽培种的易感性/抗性表述成由所有受伤块茎计算得到的平均 黑斑指数。 结果

下表以百分比显示了结果：             汇总表 处理 抗性*/总数 ％抗性 培养诱导筛选 第一年 8/22  36.4 第二年 12/38  31.6 第三年 7/26  26.9                      平均值：31.6 黑色素前体筛选 第一年 5/7  71.42 第二年 21/40  52.5 第三年 22/49  44.9                      平均值：56.3 咖啡酸筛选 第一年 5/7  71.42 第二年 3/9  33.3 第三年 3/9  33.3         平均值：46.0 酪氨酸筛选 第一年 ---- 第二年 18/31  58.1 第三年 19/40  47.5            平均值：52.8 *它们在统计上比母本克隆更有抗性。

下表鉴定了由未进行黑色素前体体外选择筛选流程的Lemhi愈伤 组织系再生的克隆。该群体代表了人们对于不含黑色素前体的体外筛 选所预期的黑斑抗性变体的分布。可以看出，组织培养过程自身可增 加黑斑抗性Lemhi克隆的数目，因为Lemhi在自然界通常显示相对较少 (如果有的话)的抗性。 组织培养筛选Lemhi克隆群体的黑斑反应 克隆编号                      黑斑指数

            第一年        第二年         第三年 84-39                         182.7 92-10            1.2* 84-114           3.5*         5.0*           55.0* 84-210B          5.4*         98.5           102.8 84-196          10.6*         144.2          62.6 84-117          11.4*         60.4           13.0* 84-256          12.1*         78.8           83.1 84-254          16.7*         102.3          47.7* 84-8            20.7* 84-148          42.6          97.9           126.8 84-16           42.6          113.1          163.3 84-305          47.9          158.6          172.3 92-25           64.1          53.2*          19.2* 84-231          101.0         29.5* 84-155          105.0         36.2*           - 84-1            106.4         151.4          180.7 84-5            121.7         206.4          218.8 84-143          141.3         255.9          163.3 84-9            160.2         133.6          101.3 84-63           203.3         137.2          188.8 81-1            237.2         135.1          161.3 84-249                        236.6 84-329                        181.9 84-163                        125.5 84-31                         99.2 84-184          70.9          98.7           69.8 84-278          79.5          84.8 84-351A                       74.6 84-27                         73.2           60.5 84-20                         69.2 84-314                        50.9*          105.7 84-492                        46.1*          113.9 84-393                        46.0*          105.1 84-459                        24.9*          50.5* 84-78                         0.4*           1.2* 92-3                          125.0 115-3                         103.6          103.2 91-64                         39.1* 81-8                          36.3* 120-11                        1.7* 84-402                                       199.5 84-166                                       47.3* Lemhi MC        51.5          124.1          147.4 (原生质体来源) Lemhi           47.9          94.5           160.5 (国家种子分生组织计划) *＝显著比栽培种Lemhi更有抗性(p＝0.05) 第一年的数据基于1次损伤测试试验(5个块茎) 第二年的数据基于3次损伤测试试验(15个块茎) 第三年的数据基于1次损伤测试试验(5个块茎)

这些结果证明容易发生黑斑病易感性的变化，而且能够在Lemhi 体细胞克隆的筛选群体中找到黑斑损伤抗性增强的体细胞克隆。

下表鉴定了由进行了黑色素前体体外筛选流程但不显示变黑应答 的Lemhi愈伤组织系再生的克隆。如下所述在不同阶段筛选这些克 隆。 用黑色素前体(酪氨酸或咖啡酸(CA))在体外筛选的Lemhi克隆群

                   体的黑斑反应 克隆编号  筛选阶段(添加黑

      色素前体的阶段)           黑斑指数

                         第一年  第二年   第三年 L-DB27(CA)  1  2  3  4       0.0*    68.3     53.0* L-DB23(CA)  1  2  3  4       1.2*    83.6     75.9 L-DB14(CA)  1  2  3  4       3.0*    27.6*    93.0 L-DB18(CA)  1  2  3  4       3.4*    90.6     105.2 L-DB21(CA)  1  2  3  4       4.9*    144.6    170.5 L-DB24(CA)  1  2  3  4       36.8    241.3 92-7  (CA)        3          60.5    109.1    128.6 111-6          2  3     5            203.8    89.6 103-13         2  3     5            174.5    69.4 111-4          2  3     5            157.0    136.7 111-17         2  3     5            107.3    2.5 98-2           2  3     5            104.8 94-1                    5            97.4     103.3 111-13         2  3     5            84.4     51.3* 97-19          2  3     5            83.6     50.7* 111-20         2  3     5            77.7     83.2 111-12         2  3     5            75.8 111-14         2  3     5            75.4     134.4 98-1           2  3     5            66.6 103-3          2  3     5            62.6     106.3 91-95                   5            55.3*    33.8* 97-18          2  3     5            53.6*    21.0* 97-26          2  3     5            46.6*    36.1* 111-3          2  3     5            45.6*    100.8 91-13                   5            42.1*    54.7* 103-2          2  3     5            41.7*    199.4 111-28         2  3     5            38.5*    94.8 92-67                   5            35.3*    15.3 L-DB4       1  2  3  4               31.8* 91-62                   5            23.8*    59.2* L-DB6       1  2  3  4               18.6*    35.1* 91-28                   5            15.2* L-DB25(CA)  1  2  3  4               14.6*    2.5* 114-8          2  3     5            13.4*    83.8* 97-30          2  3     5            9.5*     132.9 92-66                   5            2.5* 91-7                    5            1.9* L-DB22(CA)  1  2  3  4               0.5* 115-1          2  3     5            0.4*     57.5 111-33            3     5            0.1*     55.8 84-515                  5 L-DB19(CA)  1  2  3  4                        114.4 114-5          2  3  4  5                     102.0 111-38         2  3     5                     99.1 97-43             3                           95.5 110-17            3  4  5                     72.6 97-17             3     5                     63.5 97-44       1     3     5                     57.7 91-14                    5                                38.9* 103-14          2  3     5                                33.1* 91-61                    5                                32.3* L-DB15(CA)   1  2  3  4                                   31.1* 97-12              3     5                                27.6* 91-12                    5                                26.9* 111-37          2  3     5                                22.4* 98-5               3  4  5                                21.2* 115-2                                                     14.1* 111-29          2  3  4  5                                11.8* Lemhi MC                           51.5          124.1    147.4 (原生质体来源)     Lemhi                              47.9          94.5    160.5 (国家种子分生组织计划) *＝显著比栽培种Lemhi更有抗性(p＝0.05) 第一年的数据基于1次损伤测试试验(5个块茎) 第二年的数据基于3次损伤测试试验(15个块茎) 第三年的数据基于1次损伤测试试验(5个块茎)

下列克隆是由进行了黑色素前体体外筛选流程且在至少一个阶段 显示变黑应答的Lemhi愈伤组织系再生的。 克隆编号         筛选阶段             黑斑指数

                          第一年   第二年      第三年 111-15          2  3     5             133.4 103-1           2  3     5             121.2    30.2* 110-2              3     5             75.4 91-51                    5             57.7 111-11          2  3     5             39.7* 97-8               3     5             36.7*    16.1* 115-9           2  3     5             0.2*     7.4* 111-35          2  3  4  5                      58.0 111-26          2  3     5                      28.4* 92-125                   5                      35.6* Lemhi母本克隆                 51.5     124.1    147.4 (原生质体来源) Lemhi                         47.9     94.5     160.5 (国家种子分生组织计划) *＝显著比栽培种Lemhi更有抗性(p＝0.05) 第一年的数据基于1次损伤测试试验(5个块茎) 第二年的数据基于3次损伤测试试验(15个块茎) 第三年的数据基于1次损伤测试试验(5个块茎)

这些结果证明可以在体外选择的体细胞克隆群体中鉴定黑斑损伤 易感性，暗示通过在组织培养的同时筛选材料可以提高黑斑抗性克隆 的比例。 结论

来源种质Lemhi通常不如过去对损伤易感。Lemhi通常是高度易感 的，预期BI值250-300。相反，长出的Lemhi块茎的平均BI在第一年 是51.1，第二年是124.1，第三年是147.4。这证明了这种紊乱的表达 是多么密切依赖环境条件和植物生理学。将Lemhi的黑斑应答用作评 估体细胞克隆的比较手段。

清楚的是，可以通过体外选择获得显示黑斑损伤抗性增强的克 隆。可以证明，起作用的黑斑抗性体外筛选系统是如何控制这种紊乱 的一个因素。应用这种系统可能是有意义的，因为可以鉴定出大比例 的黑斑抗性增强的体细胞克隆。这将极大增加获得具有最初栽培种所 有重要特征的克隆的可能性。找到除了黑斑抗性以外还显示其它性状 改进的体细胞克隆的概率也将增加。

虽然为了例示目的已经详细描述了本发明的具体实施方案，但是 可以进行各种修改而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明将不 受限制，除了所附权利要求。