针对马铃薯中抗病性的种质与分子标记

发明领域

本发明涉及高等植物的遗传操作的领域。更具体地讲，本发明涉 及通过家养的和野生的马铃薯物种的体细胞融合所产生的或鉴定的 新的种质、生殖原种以及分子标记，它们对于抗晚疫和其它真菌病原 体的马铃薯品种的开发是很有用的。

发明的背景

为了更加全面地描述本发明涉及的现有技术的状况，在本申请中 在圆括号中注明了若干篇出版物的来源。在本说明书结尾处可以找到 这些参考文献的完整的引述。这些出版物的每一篇的公开内容均插入 本文仅供参考。

植物病害每年都给美国以及世界上其它地方的农民造成数十亿 美元的损失。制造出天然抵抗病害的农作物已是植物育种工作者数十 年来的一个目标。近年来，分子遗传技术已经对传统的育种方法进行 了补充，例如鉴定出编码具有抗真菌或抗细菌性质的蛋白质的基因 (通常不是植物基因)，然后在植物中高水平地表达该基因。

另一种途径是使用来自野生物种的基因来提高培养的农作物的 抗病性和其它的农学特性。但对大多数情况来说，育种工作者已被限 制到那些可以通过直接的性杂交或通过几个物种的跨接杂交 (bridging crosses)得到的遗传重组的技术上。

在某些情况下，原生质体融合已经提供了很宽范围的可以利用的 基因。通过这一技术，把两个物种的体细胞结合在一起。然后由该结 合体可以再生出植物，并且检查该植物的所期望的属性的表达和生育 力。以这种方式可能会把来自广泛分离着的性不亲和的物种的有用性 状掺入到繁殖系当中。采用其它的分子技术，也可能鉴定出在那些野 生物种中决定着赋予有用性状(诸如对一种或多种植物病原体的抗 性)的基因。然后可以把该基因掺入到多种不同物种的基因组中，以 便开发对一种或多种植物病原体的抗性。

马铃薯(Solanum tuberosum)是世界上第四种最有价值的农作 物。在美国，该作物的价值每年超过二十亿美元。尽管其价值很高， 但这种商业作物经历了许多的病害问题，其中包括诸如晚疫和早疫之 类的叶部病害、病毒病害、诸如那些由线虫或轮枝孢属的种导致的土 壤问题、以及诸如细菌性萎蔫病(在土壤中)或欧文氏软腐病(在储 藏中)之类的细菌病害。在农作物的损失、与施加化学药品有关的开 支以及杀虫剂的使用对环境的影响方面，这些病害的代价是很高的。 如果可以得到抗性马铃薯品种的话，那么可以使这类花销降低到最小 或者免除。但是，尚未把对晚疫、欧文氏软腐病和许多其它病害的足 够的抗性掺入马铃薯的栽培品种中，这一部分是因为缺乏育种工作者 可以用于开发抗性栽培品种的抗性基因的良好的多样性。

其中特别严重的是由真菌蔓延疫霉导致的晚疫病。晚疫仍是全世 界范围内对马铃薯最具毁灭性的病害之一。尽管它很重要，但是目前 在美国没有培育出具有足够的晚疫抗性的主要的栽培品种。直到近 来，还是通过培养方法(例如轮作、农作物卫生)和使用杀真菌剂来 保护该作物以防病害。迄今在美国，亲和交配类型的缺乏已经妨碍了 性重组。但是，第二交配类型现已在美国普及开来，并且所述真菌的 许多株系已经对一种主要的、非常有效的注册用于马铃薯晚疫防治的 内吸杀真菌剂(Metalaxyl)变得有抗性了。

晚疫真菌对除马铃薯以外的农作物同样是一种具毁灭性的病原 体。它感染番茄、茄子以及其它茄科的种。其它的疫霉属的种使一个 很宽系列的在农学上重要的植物致病，其中包括葡萄、鳄梨以及若干 种果树和坚果树。因此，通过分子遗传技术可以引入这些物种中的对 疫霉属的种具有抗性的来源也是很有价值的。

对许多马铃薯病原体具有抗性的可能的来源存在于有关的茄属 的种中。已将若干茄属的种与培养的马铃薯杂交，以便渐渗入抗病性 基因。

当性杂交技术失败时，通过体细胞融合已经尝试了抗病性的转 移。已经把马铃薯的原生质体与许多性不亲和的野生的茄属的种(例 如S.brevidens、S.bulbocastanum、S.commersonii、S. po1yadenium、S.etuburosum)融合在一起，并且已经再生出许多能 育的体细胞杂种(Austin等人，1985,1993；Ehlenfeldt&Helgeson, 1987；Kim-Lee等人，1993；Novy&Helgeson,1994b)。针对有用 的抗病性，已经筛选出体细胞杂种(Helgeson等人，1986；Austin 等人，1988；Novy&Helgeson,1994b)，并且这些抗性是可以遗传 的(Helgeson等人，1993)。

Solanum bulbocastanum是一种特别令人满意的野生物种，从该 物种中找到了有用的抗病性遗传性状，这是因为它表现出对包括线 虫、早疫、晚疫和轮枝孢属在内的若干种马铃薯病原体的抗性。由本 发明人和其它人已经生产出S.bulbocastanum与培养的马铃薯的抗 病害或抗虫害的体细胞杂种。在一个实例中，对抗线虫的S. bulbocastanum-马铃薯的体细胞杂种的BC1和BC2后代的分析揭示 出线虫抗性基因座可能存在于S.bulbocastanum的第11染色体上 (Brown等人，1996)。但是，S.bulbocastanum中晚疫抗性的染色 体定位迄今仍未被确定下来。

显然，对鉴定出诸如S.bulbocastanum这样的野生马铃薯物种 中的所述抗性存在着现时的需要，以便继续改进培养的马铃薯的抗病 特性。也存在着对鉴定出野生马铃薯物种中决定着抗病性的基因的需 要。一经分离后，然后可以通过分子遗传技术将这些基因引入除马铃 薯之外的物种当中，以便赋予对一种或多种植物病原体的抗性。

发明概述

本发明提供了新的种质、生殖原种、分子标记以及用于把晚疫抗 性引入培养的马铃薯植物中的方法。本发明进一步提供了来自S. bulbocastanum的基因组DNA区段，该区段对于把抗晚疫真菌蔓延疫 霉的抗性引入除马铃薯之外的物种中是很有用的。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种赋予抗晚疫真菌蔓延 疫霉以及抗包括早疫病、欧文氏软腐病和轮枝孢属在内的其它真菌病 原体的抗性的马铃薯原生质体。这种种质的最基本的形式是通过马铃 薯与S.bulbocastanum的体细胞杂交生产出的组织培养物。还提供 了从这些杂种再生出的能育的植物以及由与在农学上优选的栽培的 马铃薯物种杂交得到的后代。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种晚疫抗性马铃薯植 物，该植物包括来自Solanum bulbocastanum的含有赋予抗晚疫抗性 的基因的基因组的区段。在一个优选的实施方案中，S. bulbocastanum的基因组区段来自第8染色体并且与一个或多个下列 标记共分离：(1)本文称作GO2586的RAPD标记；(2)本文称作PO9587 的RAPD标记；以及(3)RFLP标记CT88、RFLP标记、RFLP标记CT148、 RFLP标记CT252和RFLP标记CT68。所述的马铃薯植物也可以对至少 一种其它的病害具有抗性，诸如马铃薯早疫、欧文氏软腐病以及轮枝 孢属萎蔫病。

在一个优选的实施方案中，通过马铃薯植物亲代细胞与Solanum bulbocastanum细胞之间的体细胞杂交，将前面提到的晚疫抗性基因 掺入到该马铃薯植物中。在另一实施方案中，通过用含有所述基因的 植物转化载体遗传转化所述植物的细胞，将晚疫抗性基因掺入到所述 植物中。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，该 核酸分子互补于Solanum bulbocastanum基因组0.6Kb区段的一部 分或全部，它与赋予抗晚疫抗性的基因共分离。在一个优选的实施方 案中，所述区段包括分别具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列的 RAPD标记GO2586或PO9587的部分或全部。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种在马铃薯与Solanum bulbocastanum的能育的体细胞杂种后代的杂交育种中监测晚疫抗性 的方法。该方法包括：(a)进行杂交；(b)从杂交的个体后代中分离 出基因组DNA；以及(c)在该基因组DNA中，检测预先确定与晚疫抗 性共分离的遗传标记的存在或是缺乏，遗传标记的存在或缺乏指示了 杂交育种的个体后代中晚疫抗性存在或缺乏。在一个优选的实施方案 中，所述标记选自以上所列举的RAPD和RFLP标记的组中。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种鉴定赋予抗晚疫抗性 的Solanum bulbocastanum基因的方法。该方法包括：(a)在Solanum bulbocastanum与马铃薯的体细胞杂种的后代中，克隆出与晚疫抗性 表型共分离的DNA区段；(b)提供Solanum bulbocastanum的基因组 的基因组文库；(c)分离出含有与共分离的DNA区段杂交的区段的基 因组文库的克隆；以及(d)鉴定出位于赋予晚疫抗性的分离基因组 克隆中的至少一种基因。在一个优选的实施方案中，与晚疫抗性共分 离的克隆的DNA区段包括以上所列的RAPD或RFLP标记之一的部分或 全部。

根据本发明的再一方面，本发明提供了由前面提到的方法生产的 来自Solanum bulbocastanum的晚疫抗性基因。本发明还提供了包括 该抗性基因的转基因植物。

鉴于以下所列举的详细描述和实施例，将会更好地了解本发明的 优点。

附图的简要描述

图1．S.bulbocastanum与马铃薯的体细胞杂种的RFLP分析。 在该分析中所用的探针为TG310、即一种特异于番茄和马铃薯的染色 体1的番茄的基因组探针。

图2．具有RAPD(随机扩增多态DNA)和RFLP(限制性片段长 度多态性)标记以及抗晚疫抗性的Solanum bulbocastanum的第8 染色体的MapMaker分析。圆括号中的百分数(左栏)表示重组频率， 它是通过用群体大小去除完全共遗传的偏差来计算的。百分数一栏以 右的数字表示以厘摩表示的标记间的距离。第8染色体的图表以右的 圆括号中的数字表示群体中的个体的任意的代码。最右一栏列出了 RAPD标记，它是由扩增的转录物(例如“GO2-586”或“PO9-587”) 和RFLP标记的十聚(decameric)引物和大小来命名的。抗性基 因座由“R”表示。图的比例为10.0cM/1.21cm。

图3．Tanksley等人(1992)公开的番茄的第8染色体的图谱， 该图谱显示出S.bulbocastanum的晚疫抗性基因在番茄第8染色体 上的大约对应的位置。

发明详述

根据本发明，已经鉴定出同来源于Solanum bulbocastanum与培 养的马铃薯(Solanum tuberosum)的体细胞杂种的晚疫抗性相连的 遗传标记。分析回交(BC2)群体抗晚疫的抗性以及随机扩增多态DNA (RAPD)和RFLP标记。三个测试群体来源于马铃薯与S. bulbocastanum的两种不同的体细胞杂种。将每个体细胞杂种均与栽 培品种Katahdin杂交以产生BC1亲代，所有的BC1亲代都对晚疫具有 抗性。将BC1后代与三种不同的马铃薯繁殖系(Norland,Atlantic 与A89804-7)杂交，其中所有的这三种繁殖系都对晚疫真菌敏感。 每种BC2群体各含有超过50个的个体，并且针对抗晚疫的性状出现以 分离。在每种群体中，晚疫抗性与RAPD标记(“GO2586”)的存在相关 (＞95％)，而该标记是S.bulbocastanum的第8染色体的关键。这 种新的分子标记的鉴定在实施例2中进行了更加详细的描述。

进一步的遗传分析已经导致鉴定出同样与S.bulbocastanum的 第8染色体的抗性基因或基因有关的另一种RAPD标记和几种RFLP标 记。这些标记例如包括RFLP标记CT88和RAPD标记PO9587，它似乎位 于抗性基因座的两侧(见图2)。其它紧密相连的RFLPs包括CT148、 CT252和CT68(见图2)。正如本文更加详细地讨论的那样，这些标记 共同限定了在S.bulbocastanum的第8染色体上的特定位置，其中 该染色体携带赋予抗晚疫和某些其它马铃薯病害的抗性的基因。在第 8染色体上的抗性基因的大概位置(如Tanksley等人(1992)所作 的图)示于图3中。

本发明提供了一种用于培育对晚疫具有抗性的马铃薯栽培品种 的新的和有用的种质和生殖原种。所述种质包括由S.bulbocastanum 与马铃薯的体细胞融合产生的能育的杂种及其后代，它们含有携带了 晚疫抗性的一个或多个基因的S.bulbocastanum基因组的一部分。 正如下面更加详细地描述的那样，通过紧密连锁的RAPD标记GO2586 或PO9587或者诸如CT88这样的紧密连锁的RFLP标记的存在来方便地 监测该基因组片段的存在。特别优选的生殖原种是通过将体细胞杂种 与具有所希望的农艺学品质的马铃薯栽培品种反复地回交来得到 的，其中通过检测一个或多个相关的RAPD或RFLP标记来监测S. bulbocastanum的赋予晚疫抗性的基因组区段的存在。

马铃薯-S.bulbocastanum的体细胞杂种的产生、能育的抗性 植物的选择以及包括一个或多个抗病性基因的接下来的回交世代的 产生都是通过为植物育种工作者和分子生物学家所熟知的方法来实 现的。在实施例1中更加详细地描述了优选的方法。

本发明还提供了新的分子标记以便在不必针对抗病性进行田间 或温室试验的情况下便于含有来自S.bulbocastanum的赋予所述抗 性的基因组区段的培育后代的选择。通过使用RAPD标记并使用商购 可得的寡核苷酸10-mers作为PCR扩增的引物制造出一种紧密连锁的 标记GO2586。通过在使所述寡核苷酸结合到基因组DNA中的任意互补 序列上的条件下，用多个10-mers温育所述的基因组DNA来生产RAPD 标记。通过PCR扩增介于束缚在一起的两组引物之间的DNA的长度， 由此产生了一个DNA区段，该区段是在基因组DNA中介于引物之间的 区段的拷贝、即一个RAPD片段。GO2586RAPD标记的核苷酸序列如本 文SEQ ID NO:1所示。

由此产生的RAPD片段是对种具有特异性的标记，该标记通过比 较RFLP分析可以为具体的染色体提供线索并且通过各种杂交可以归 结为显性标记。根据本发明，RAPD标记GO2586(它是由购自操纵子技 术公司的“GO2”十聚寡核苷酸引发的一个586bp的片段)为S. bulbocastanum的第8染色体提供线索。马铃薯-S.bulbocastanum 体细胞杂种的BC2后代的分析表明晚疫抗性与GO2586RAPD片段的存在 相关，其频率大于95％。晚疫抗性与所述标记的这种密切分离表明一 个或多个抗性基因存在于所述标记的位置上或其附近。因此，通过检 测该标记的存在或缺少便可以监测出在进一步的杂交中的晚疫抗 性。通过这种方式，不用针对抗病性进行长期的温室或田间试验便可 以选择出具有携带抗性基因的高度可能性的后代，从而使得育种过程 更为迅速和高效。

本发明还提供了第二种RAPD标记PO9587，该标记也与S. bulbocastanum中的抗性基因紧密连锁并且通过如上针对GO2586所述 的同样的方案加以鉴定。RAPD标记PO9587的核苷酸序列如本文SEQ ID NO:2所示。

本发明进一步提供了RFLP分子标记，所述标记在便于含有S. bulbocastanum赋予所述抗性的区段的生殖后代的选择中是有用的。 这些标记还可以协助确定所述抗性基因在染色体上的位置并且得到 含有所述基因的分离的基因组区段。来自三种不同来源的RFLP CT88 的核苷酸序列(由Tanksley等人出版 (http://probe.nalusda.gov:8300/cgi-bin/browse/solgenes)、 来自R4马铃薯以及来自S.bulbocastanum)分别如本文SEQ ID NOS:3, 4和5所示。

一旦生成后，可以在任何适合的克隆载体中维持有用的RAPD或 RFLP片段。例如，在由商购可得的PCR试剂盒(Invitrogen公司) 提供的质粒载体中维持根据本发明产生的GO2586标记。应当指出的是 通过使用商购可得的十聚物以及实施例2中所述的方法和其中所引用 的对比文献，获得RAPD应当可以由本领域的任何普通技术人员重现。 另一方面，本文所述的RAPD片段可以通过核苷酸的合成、使用标准 的方法加以复制。

通过将RAPD片段或其部分或者以上讨论的或图2中所示的任何 相连的RFLPs标记为探针以便与S.bulbocastanum基因组中的互补 序列杂交，从而将它们用于监测晚疫抗性基因的存在或缺乏。可以根 据任何标准的方法来标记克隆的片段，其中许多方法都示于《现代分 子生物学方案》(Frederick M.Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons, 1997)。互补的基因组DNA是由几种标准方法之一进行检测的，所述 方法包括、但不限于：(1)原位杂交；(2)Southern杂交；(3)“斑 点”杂交；以及(4)相配的扩增反应、诸如聚合酶链式反应(PCR)。 正如以上所讨论的那样，互补的基因组DNA的检测表示出赋予晚疫抗 性的基因的存在，这是由于R基因与RAPD标记或RFLPs紧密连锁。

使用为分子生物学家所熟知的方法，同样可以将RAPD片段或其 部分或者任何前面提到的RFLP片段用于鉴定和分离S. bulbocastanum的紧密连锁的晚疫抗性基因。在一个优选的实施方案 中，采用合适的克隆载体构建S.bulbocastanum的基因组文库，所 述载体例如为粘粒、酵母人工染色体(YAC)或细菌人工染色体(BAC)。 然后通过与克隆的RAPD片段和/或一个或多个RFLP标记杂交来筛选 文库，并分离出杂交克隆。然后例如通过作图、测序和转录物分析来 进一步分析杂交克隆，以便鉴定出编码所述抗性因子的候选的开放读 框。一旦鉴定出候选的开放读框后，为了确定所述抗性基因及其所编 码的蛋白的特征，又可以对它们进行进一步的分析(例如通过构建和 体外表达cDNA分子)。

通过分子遗传技术，可以使用由此鉴定出的赋予抗病性的克隆来 把晚疫抗性引入培养的马铃薯中。例如，可以使用二元细菌人工染色 体(BIBAC)载体来将BAC基因组插入片段转移到马铃薯中(已经使 用载体BIBAC2(Hamilton等人，1996)来将大的(＞150kb)DNA插 入片段转移到烟草中)。可以将含有来自S.bulbocastanum的有关的 基因组插入片段的BIBAC载体转移到根癌农杆菌中并用于转化所选择 的马铃薯栽培品种。另一方面，可以通过BIBAC克隆的biolistic送 递来转化马铃薯细胞。然后通过标准的方法可以评价推定的转基因克 隆，以测定转化是否已经成功。

也可以使用赋予了抗病性的克隆来把抗性引入除马铃薯之外的 物种中的蔓延疫霉中，所述的物种对该生物体的感染敏感。这些物种 包括、但不限于番茄、茄子以及其它茄属的种。而且，有可能S. bulbocastanum的晚疫抗性基因可以为除晚疫之外的病害赋予抗性， 从而对于在马铃薯以及其它植物物种中引入抗病性而言可以有更加 广阔的用途。对把抗性引入导致葡萄、鳄梨、果树和坚果树生病的其 它疫霉属的种来说，该基因可能特别有用。而且，所述基因的功能一 经确定后，这就可以导致在其它物种中抗性的新机理的识别。

提供下列实施例来更加详细地描述本发明。它们的目的是举例、 而并非限制本发明的范围。

                            实施例1

在Solanum bulbocastanum与马铃薯

的体细胞杂种及其后代中对晚疫的抗性

墨西哥州野生物种S.bulbocastanum对晚疫具有高度的抗性。 但是，S.bulbocastanum是一种1EBN物种，因此直接与马铃薯杂交 是及其困难的。

体细胞杂交可以提供一种回避在茄属的种之间的性不亲和性的 方式，这就导致产生了在育种计划中可以直接使用的能育的植物。列 于本实施例中的实验结果表明可以捕获到S.bulbocastanum中的抗 性并且通过使用体细胞杂交可以将所述的抗性传递到马铃薯的繁殖 系中。 材料与方法

用于体细胞杂交的马铃薯及其有关的物种得自John Bamberg博 士及其同事的位于WI Sturgeon海湾4312公路42的内部区域马铃薯 引入站(NRSP-6)。这些物种包括S.bulbocastanum、PI243510和 马铃薯PI23900(马铃薯)。马铃薯栽培品种(Katahdin,Atlantic) 的原种拷贝得自威斯康星州的马铃薯证明计划。所有的栽培品种和野 生物种以及测试材料都如Haberlach等人(1985)所述通过在体外克 隆的方法进行常规的维持。在体外增殖单个的克隆以便进行分析。

如Haberlach等人(1985)所述，从体外枝条的叶子中分离出原 生质体。采用聚乙二醇(PEG)方案用原生质体进行体细胞杂交。在 大多数情况下，接下来使用Austin等人(1985)的方法。但是，在 融合尝试后加入PEG、稀释以及使细胞成为小片之后，将所述细胞悬 浮在0.3M的蔗糖中、而不是在0.6M的甘露糖醇中。轻轻地振荡(40 RPM)细胞悬浮液45分钟，然后在巴布科克瓶中于1300rpm下离心 (HNII离心机，IEC)10分钟。这一改进导致活的原生质体和融合的 细胞浓缩在瓶中蔗糖溶液的表面，从而使活细胞与成为小片的碎片分 离开来。

以类似于Haberlach等人(1985)报道的方法，将得到的融合细 胞再生成完整的植株。一开始，把细胞平铺到培养基(CUL,Haberlach 等人，1985)上，当在显微镜中的愈伤组织已经出现时，将愈伤组织 转移到分化培养基(DIF,Haberlach等人，1985)上。2-3周后， 将愈伤组织转移到由Lam(1977)研制的分化培养基上。在芽已经形 成后，将愈伤组织转移到发育培养基(PM,Haberlach等人，1985) 中。然后切下所形成的枝条并使其在标准的繁殖培养基(PROP, Haberlach等人，1985)上生根，并且在体外在试管中加以维持。针 对实验，制备出参比拷贝的克隆拷贝。

如Williams等人(1990)所述进行DNA的提取以及限制性片段 长度多态性(RFLP)的分析。染色体特异性的番茄基因组(TG)和cDNA (CD)探针得自康奈尔大学的Steve Tanksley博士。通过这种方法 分析四种推定的体细胞杂种。为了完成杂种性的分析，如实施例2中 更加详细地描述的那样进行随机扩增多态DNA(RAPD)的分析。挑选 出总共109种引物(从测试的380种引物中)，它们都给出了在马铃 薯与S.bulbocastanum之间可以清楚地计分的多态性。与推定的体 细胞杂种的每一种一起使用这些引物中的若干种引物。

在进一步的实验中已经广泛地使用了所述杂种中的三种。这些杂 种被称作J101、J103和J138。在杂交中，马铃薯亲代被称作K(对 于Katahdin)或A(对于Atlantic)。因此，例如J101K1是由从J101 和Katahdin杂交得到的浆果萌发的第一代种子。类似地，J101K6和 J101K27是由分别来自所述杂交的种子6和种子27得到的幼苗。BC2 后代是通过在所述杂交中加上种子号码和栽培品种系来命名的。因 此，命名为J101K6A22的杂交是来自品系J101K6与Atlantic杂交的 第22代幼苗。这一简洁的称呼避免使用可以应用到该个体的或长或 短的提供信息的术语((S.bulbocastanum+马铃薯)×Katahdin) ×Atlantic。

在田间比较易感的和抗性植株。对这些研究而言，在生长季节过 程中的不同时间里，记录下显示出晚疫损害的叶子的百分数。对详细 的温室研究来说，采用改进的Horsfall-Barret评定方案来估计受蔓 延疫霉感染的叶子的百分数。与这些分数有关的感染％的评定和范围 如下：9，看不出感染；8,<10％；7,11-25％；6,26-40％；5, 41-60％；4,61-70％；3,71-80％；2,81-90％；1,>90％； 0,100％感染。 结果

从23个愈伤组织中总共得到了80根植株。这些植物(来自5个 愈伤组织)中的24株显示出与亲代物种的任何一方有着明显的形态 差异。其它的56株植物看起来与马铃薯非常类似。一开始，使用染 色体特异性的限制性片段长度多态性(RFLP)标记来证明来源于S. bulbocastanum与马铃薯细胞融合的植物中的四株的确是体细胞杂 种。除了鉴别的S.bulbocastanum带之外，所述杂种还保留着显著 的马铃薯带(图1)。用RAPD探针评价其余的潜在的杂交植物(见实 施例2)。通过这些技术证实总共13个以上的体细胞杂种。被证实的 杂种来源于四个不同的愈伤组织薄片，因此可能来源于四个不同的融 合事件。

检查亲代植株与具有代表性的体细胞杂种的叶子和主干的外 观。和许多的我们的其它杂种的情况一样，在所述杂种中可以看到亲 代物种双方的性状。在这种情况下，在杂种中表现出S. bulbocastanum主干的紫色。但是，所述杂种的叶子是混合色的、而 不是如野生物种那样是单色的。

用马铃薯栽培品种“Katahdin”和“Atlantic”进行四种体细胞 杂种的杂交，以便测试所述杂种的生育力。每个测试的杂种都产生了 活的种子以及有性后代。由这些后代品系选出的个体的进一步杂交也 是成功的。因此，亲代系以及两代连续的回交群体对抗病性的评价都 是可以利用的。

用离脱叶或叶盘进行抗蔓延疫霉抗性的初级实验室实验，该实验 表明体细胞杂种和一些后代至少保留了一些S.bulbocastanum亲代 所示的对晚疫的抗性。

这些初级实验室结果是在第一生长季节过程中在田间试验中得 到证实的。S.bulbocastanum与马铃薯之间的体细胞杂种以及来自 所述体细胞杂种的后代显示出明显的抗性并且在试验田中在死马铃 薯品系的褐色背景中作为“绿岛”显然是很引人注意的。尽管栽培品 种Atlantic、Russet Burbank和Snowden被杀死，但11个不同的 实验系显示出低于10％的感染。在每种情况下，活的测试植物被易感 的栽培品种Russet Burbank包围着，其中该栽培品种已在生长季节 中的8月9日被所述真菌杀死。比较起来，J101K27和J101K6A22在 8月15日的叶感染％分别为5.0％和7.8％。

在墨西哥州的Toluca，在第二生长季节和接下来的夏季中测试十 四株BC1和BC2系。用在去年夏季中在威斯康星州具有抗性的所有品系 同样在Toluca田间试验中获得了良好的抗性。

在第三生长季节中，在威斯康星州的Hancock进行了额外的田间 试验。在试验田中再次得到了几种天然的晚疫流行病，而且普通栽培 品种的产量也受到了晚疫流行病的严重抑制。例如，在维持有效的杀 真菌剂喷洒方式的地块中，Russet Burbank的产量高达1.7kg/植 物。在不使用杀真菌剂的产量试验中，该产量几乎减少了一半、达到 0.86kg/植物。在Hancock的第三生长季节中，一株来源于S. bulbocastanum的品系J103K7以1.36kg/植物的产量在所有的90 个测试系中名列第一，而J138A12则以1.32kg/植物的产量排名第 四。

为了测试潜在分离的BC1和BC2群体的抗性，在威斯康星州 Biotron大学的新的研究温室中建造了一套设备。在其中，对湿度和 温度密切地控制以使均一的流行病成为可能。对于来自四个不同的体 细胞杂种的六个BC1的每一个而言，都获得了抗性和易感性的分离。 来自这些品系之一的具有代表性的实验示于表1。将这些品系中的三 个品系进一步与Atlantic或Norland杂交。在表2中包括了关于这 些BC2品系的具有代表性的结果。借助这些品系再次获得了抗性的明 显的分离以及亲代双方的易感性和抗性的最大程度的恢复。

 表1．来自针对晚疫抗性的BC1系的Biotron试验的代表性数据 植物品系     平均的疫病的得分     5天     8天     12天  J101K09  J101K27  J101K06  J101K10  J101K30  J101K16  J101K25  J101K02  J101K20  J101K33  J101K19  J101K11  J101K12  J101K18  J101K21  S.bulbocastanum 体细胞杂种J101 马铃薯 PI203900 马铃薯 cv″Kathadin″     9.0±0.0     9.0±0.0     8.8±0.5     9.0±0.4     9.0±0.0     8.8±1.0     8.6±1.1     8.6±0.4     8.6±0.7     7.4±1.8     6.8±2.4     6.0±1.3     7.2±2.5     6.8±1.8     5.2±1.3     9.0±0.0     8.6±0.5     7.0±0.0     4.8±0.4     9.0±0.0     9.0±0.0     9.0±0.0     8.8±0.4     9.0±0.0     8.8±0.5     8.4±0.9     8.0±1.2     7.4±0.9     5.4±0.9     5.6±2.7     4.6±1.1     5.2±2.4     4.6±1.3     2.2±1.3     9.0±0.0     7.8±0.8     5.8±1.3     2.0±0.7     9.0±0.0     9.0±0.0     8.8±0.4     8.6±0.9     8.4±0.9     7.8±1.0     8.2±1.1     7.8±0.4     7.0±0.7     6.2±1.8     5.2±2.4     4.2±1.3     3.8±2.5     3.6±1.8     0.6±1.3     9.0±0.0     8.2±0.0     5.6±1.9     1.0±1.2

表2.在BC1系J101K6与马铃薯cv.Atlantic之间杂交的BC2 后代中针对晚疫抗性的分离的实例 植物品系     平均的疫病的得分 7天     10天     15天 J101K6A21 J101K6A4 J101K6A22 J101K6A2 J101K6A3 J101K6A10 J101K6A50 J101K6A24 S.bulbocastanum PI243510 马铃薯 PI203900 J101* Kathadin* J101K6** Atlantic** *生成BC1系的杂交的系 **生成BC2系的杂交的系 9.0±0.0 8.8±0.4 9.0±0.0 9.0±0.0 5.2±3.1 3.4±2.1 5.6±3.4 2.6±0.9 9.0±0.0 4.0±1.0 7.8±1.1 4.4±0.5 9.0±0.0 3.6±0.5     9.0±0.0     8.8±0.4     9.0±0.0     9.0±0.0     5.4±3.6     3.0±2.0     3.4±3.6     1.4±0.5     8.8±0.4     4.0±1.0     8.6±0.5     4.2±0.8     9.0±0.0     3.0±0.0     9.0±0.0     9.0±0.0     8.8±0.4     8.8±0.4     2.0±3.9     1.4±1.9     0.0±0.4     0.0±0.0     9.0±0.0     0.6±0.9     8.4±0.9     3.4±1.8     9.0±0.0     1.8±1.8

这些结果表明S.bulbocastanum与马铃薯的体细胞杂种是抗晚 疫的非常有效的抗性的来源。而且，通过常规的性杂交可以将该性状 传递到马铃薯的繁殖系中。该抗性至少在两代有性后代中携带着，并 且通过刚刚得到的第三季的结果，所述抗性在几个不同的地方已经稳 定了4个不同的年份。由于目前没有北美的栽培品种具有抵抗该病害 的足够的抗性，因此对于向商业品系中引入抗性而言，这些品系将会 是非常有用的。

来自S.bulbocastanum的抗蔓延疫霉的抗性似乎比来源于S. demissum的具有种族特异性的抗性(Black&Gallegly,1957)更 为普通。已知几乎所述真菌的每个种族都是在墨西哥州的Toluca发 现的，并且它们实际上是从其中体细胞杂种的后代显示出良好的抗性 的田地中分离出来的。在Toluca，在两个不同的生长季节中对叶的观 察表明实质上形成了一些损伤并且芽胞形成受到限制也发生了。尽管 抗病性非常有效，但参与的基因的数目仍是不清楚的。对每种测试的 体细胞杂种来说，BC1系的抗病性似乎分离开来。因此，看起来晚疫抗 性基因在体细胞杂交中所用的S.bulbocastanum的克隆中是杂合的。

实施例2

与来源于Solanum bulbocastanum-马铃薯的体细胞

杂种的晚疫抗性连锁的RFLPs和RAPD标记的鉴定

实施例1描述了马铃薯-S.bulbocastanum的体细胞杂种及其 后代的产生，它们对马铃薯的晚疫具有抗性。本实施例描述与这些后 代中的抗病性共分离的DNA标记的鉴定。

由于Bonierbale等人(1988)完成了马铃薯中限制性片段长度 多态性(RFLP)的图谱，因此马铃薯中性状的详细的遗传作图已经成 为可能。通过使用事先已在番茄中作图的番茄的克隆，通过二倍体种 间杂交来确立马铃薯的图谱。番茄的图谱和马铃薯的图谱显示出几乎 同线的基因顺序(Tanksley等人，1992)。

用于产生标记的一种可供选择的方法为使用随机扩增多态DNAs (RAPDs)。该技术在PCR热循环仪中使用混合在一起的DNA聚合酶、 合成的寡核苷酸(10-mers)和基因组DNA以生成泳带，所述泳带是 以混合的形式存在的基因组DNA序列的拷贝(J.G.K.Williams等人， 1990)。该步骤通常产生于大约5种与8种特异性泳带之间，其中作 为显性标记可以使其在不同的杂交过程中均出现。此外，如果特异性 泳带可以与特性(诸如抗病性)或与具体的染色体或与上述两者相关 的话，那么可以切下并扩增所述条带，然后将其用作标准的RFLP。对 于评价来自野生物种的DNA渐渗现象延伸到培养的物种中来说，该方 法很奏效。但是，RAPDs是对种具有特异性的，因此必须针对每个不 同的物种开发出一套方法，这与其中种间同线性适用的RFLPs不同。 材料与方法

正如实施例1中详细的描述的那样，通过Austin等人(1985和 1993)的方法生产出S.bulbocastanum(PI243510)和马铃薯(PI 203900)的体细胞杂种。植物来源于能育的杂种，并将这些品系中的 三个品系分别称作J101、J103和J138。将所述的体细胞杂种的植株 作为母本与马铃薯cv Katahdin(KAT)杂交，以便产生BC1后代。将 三个BC1后代作为种子亲本与三种不同的马铃薯繁殖系(Norland, Atlantic和A89804-7)杂交，以便产生BC2群体。

对RFLP和RAPD分析来说，仅仅从体外无菌培养中维持的植物中 分离出DNA。如McGrath等人(1994)所述的那样，进行针对RAPD 标记的DNA操作和PCR扩增方案(Williams等人，1990)以及通过 参照RFLP标记为S.bulbocastanum的染色体分配RAPD标记，其中 例外的是使用了如McGrath等人(1996)所述的改进的热循环分布。 RAPD标记是由十聚-核苷酸引物(由操纵子技术公司得到)和以下标 表示的扩增片段的大小来命名的(例如由引物GO2扩增的586bp的 片段表示为GO2586)。

同样用包含在MapMaker计算机程序包(Lander等人，1987)中 的最大似然算法分析RAPD标记的分离。使用MacIntosh的MapMaker 2.0版。将数据编译成代码，并在“数据类型”选项下以“单倍体” 群体进行分析。对于种间体细胞杂种的分析而言，MapMaker的使用是 不标准的并且不提供三点连接的数据。但是，重组频率在本文中是特 别有意义的。显示出等同分离的标记具有的重组频率为0.0％。由单 个的变化偏离了完全共遗传的标记(例如有一个标记存在于一个额外 的个体中)表明重组频率与群体的大小成正比；在本例中为1/101个 个体或为1.0％。因此，该数值的倍数表明在任何一对的标记之间观 察到的不同的数目。

结果

使用RAPD标记分析，针对S.bulbocastanum确立了12个同线 性的小组，这对应于所述物种中染色体的基数。通过比较RFLP分析 将所述小组与染色体相关联。S.bulbocastanum的同线性小组A(第 8染色体)的RFLPs和RAPD片段的MapMaker分析示于图2中。该同 线性小组含有RAPD标记GO2586和PO9587以及RFLP CT88。看起来CT88 和GO2586位于抗性区域(R)的一侧、而PO9587位于该抗性区域的另一 侧(图2)。

GO2586的核苷酸序列如本文SEQ ID NO:1所示。PO9587的核苷酸 序列如本文SEQ ID NO:2所示。CT88的三个核苷酸序列示于本文中。 SEQ ID NO:3是由Tanksley等人出版的序列 (http://probe.nalusda.gov.8300/cgi-bin/browse/solgenes)； SEQ ID NO:4来自R4马铃薯；而SEQ ID NO:5来自S.bulbocastanum (PT29)。在这三个序列中注意到了轻微的差别。R4马铃薯的标记长 度为589bp，而S.bulbocastanum RFLP为592bp,Tanksley等人 的序列为596bp。此外，S.bulbocastanum CT88的同系物拥有两 个TaqI位点，而其它的两种仅仅具有一个所述的位点。

马铃薯与S.bulbocastanum的融合产生了17个经证实的体细胞 杂种。所述的体细胞杂种对早疫和晚疫都有相当的抗性。对于既抗早 疫又抗晚疫的高度的抗性而言，发现一些杂交的后代发生了分离。所 述后代中的一些甚至对致病性非常强的种族复杂的真菌株系都有高 度的抗性。选出几种具有高度抗性的克隆并将它们与马铃薯进一步杂 交。通过与马铃薯栽培品种的杂交已经产生了三套BC2作图的群体。 首先在威斯康星州的田间研究表明在这些材料中对轮枝孢属、早疫和 晚疫的抗性。在北达科他州、爱德华王子岛、华盛顿州、纽约州、缅 因州、西弗吉尼亚州和墨西哥州的Tuloca进行关于晚疫抗性的后续 研究。重复墨西哥州和威斯康星州的第二季和第三季的研究，在这些 材料中的晚疫抗性似乎是持久的。

在实施例1、表1和表2中显示出在所选择的BC1和BC2群体中晚 疫抗性的分离。以下的表3显示出与针对S.bulbocastanum第8染 色体的RAPD标记GO2586的存在或是缺乏有关的关于晚疫抗性的BC2后 代的分离分析的结果。表3中所示的数据是通过PCR扩增、接下来通 过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色以观察扩增的586bp条带的存在 或是缺乏来产生的。

表3.与RAPD标记GO2586的存在或是缺乏有关的BC2后代的分离 克隆     晚疫的评定     标记     7天     10天    15天 PI245310(BLB) PI203900(TBR) J101 Kathadin J101K6 Atlantic J101K6A22 J101K6A50 J101K6A32 J101K6A38 J101K6A21 J101K6A07 J101K6A12 J101K6A03 J101K6A19 J101K6A18 J101K6A02 J101K6A54     9.0     4.0     7.8     4.4     9.0     3.6     9.0     5.6     8.6     2.8     9.0     6.2     9.0     5.2     9.0     7.0     9.0     5.0     8.8     4.0     8.6     4.2     9.0     3.0     9.0     3.4     8.4     3.4     9.0     7.0     9.0     5.4     9.0     7.7     9.0     3.2     9.0     0.6     8.4     3.4     9.0     1.8     8.8     0.0     9.0     1.4     9.0     5.3     9.0     2.0     8.8     5.3     8.8     1.0     +     -     +     -     +     -     +     -     +     -     +     -     +     -     +     -     +     -

正如可以从表3中(以及其它未显示出的结果)看到的那样，BC2 克隆中的晚疫抗性与RAPD标记GO2586的存在非常相关(＞95％)，而 所述的标记已为S.bulbocastanum的第8染色体提供了线索。抗性 表型与所述标记的这种高度的相关性表明决定着赋予晚疫抗性的基 因存在于染色体上的GO2586标记处或者其附近。因此，可以将所述标 记用作分子标记，以便使抗性在整个育种计划中一直维持下去并且鉴 定和分离出抗病性的生殖原种。此外，已知所述抗性基因相当接近所 述的标记，因此将会便于所述基因的分离。

也可以将以上讨论的RFLP和RAPD标记CT88和PO9587用作分子标 记，从而使抗性在整个育种计划中维持下去。使用与抗性有关的RAPD 和RFLP标记的组合可以为接下来的育种过程中的分离以及最终在决 定着赋予抗晚疫和其它病害的抗性的S.bulbocastanum基因的分离 和克隆中提供额外的优点。

本发明并不局限于以上所述的和例举的实施方案，但是在不偏离 所附权利要求的范围的情况下能够进行变化和改动。

本中请要求以在1997年7月30日提交的系列号为60/054,267 的美国临时申请为优先权，其中将其全部内容插入本文仅供参考。

依据35U.S.C.§202(c)，大家公认美国政府拥有本文所述的 发明的某些权利，其中本发明部分借助来自美国农业部的资金得以进 行。

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                              序列表 (1)一般信息：

(ⅰ)申请人：Helgeson,John P.

 Austin,Sandra

 Naess,Sara K.

(ⅱ)发明名称：针对马铃薯中抗病性的种质与分子标记

(ⅲ)序列数：5

(ⅳ)通信地址：

 (A)收信人：Dann,Dorfman,Herrell&Skillman

 (B)街道：1601市场街，Suite720

 (C)城市：费城

 (D)州：PA

 (E)国家：美国

 (F)邮政编码：19103

(ⅴ)计算机可读形式：

 (A)存储媒体类型：软磁盘

 (B)计算机：IBM兼容机

 (C)操作系统：DOS

 (D)软件：FastSEQ1.5版

(ⅵ)目前申请的资料：

 (A)申请号：尚未给定

 (B)申请日：1998年7月27日

(ⅶ)在先申请的资料：

 (A)申请号：US60/054,267

 (B)申请日：1997年7月30日

(ⅷ)律师/代理人的信息：

 (A)姓名：Janet E.Reed

 (B)登记号：36,252

 (C)文献/案件目录号：P98003WO

(ⅸ)电信信息：

 (A)电话：215-563-4100

 (B)电传：215-563-4044 (2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：586个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：

(ⅵ)最初来源：Solanum bulbocastanum

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1: GGCACTGAGG GGTAGTAAGC CTCCTGCATG TACTAAGTAT GGTAGATCCA CTCAGGGTTG            60 TGCCATGATG GCTTAACTGG TTGTTTCAAG TATGGCCAGA ACGGTTATTT TATGAGAGAG           120 TTTCCAAAGA ACATGCAGGG TAATGGTAAT GGGGATAATA GAACCCAGTC TTCTTCAGTG           180 ACTCCACCAG ACAGAGCTGC ATCTAGAGGA GCTACTTCGA GGCAGGCGGA GGATCGAACG           240 TCTTTATGCT ATCACTAGTC GCCAAGAGAA AGAGGATTCG CCAGATGTTG TCACTGGTAT           300 GATCCAAGTC TTTAACTTTG ATTTTATACT TTTCTAGATC CAGGAGCGAG TTTATCCTTT           360 GTAACTCCTT ATGTTGCGGT TAATTTTGAT GTTCTTCCTA AGAAACTTAT TGAGCCCTTC           420 AGTGTTTCTA CACTTGTTGG TCTATTATAG TAGAGAGAGT CTGTTATGAT TGTACCGTTT           480 TCGTCAATCA CAAGAGCACC ATGGTTGATT TAGTTGAGTT AGACATGGTA GAATTTGATG           540 TTATTCTTGG TATGGACTGA CTTCATTCTT GTTATGCCTC AGTGCC                          586 (2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：587个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：cDNA (ⅲ)假设：无 (ⅳ)反义：无 (ⅴ)片段类型： (ⅵ)最初来源：Solanum bulbocastanum (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2: GTGGTCCGCA TATAACTCAA GAACTTGTAA TGCATGTATC GGATATATGT ATACATGTTG            60 TCTTTTGCAA AGTTTACTTT TTTATTANTT AATCTTGTTT GTGTCTGGAG GTGGTGGTGG           120 GGTGGGATAG TGGTGAAGCT AGAAATTTAG TTAAGTGTGT TCAAGATTTA AATATACATA           180 TGAAAAATAA TTTTTGATCT ATATATATAG TTATAATTTT NTGATGAAGG TAGTTCAACT           240 GACCACCCGT NACTACATGT GGCTACCGTA CTGGGTGGGG TGGAAGGTCN TGGTGTTTAC           300 AGTGATGTGG GGGCCTCTGA AATGCTTTTG TGGGCAATGT GGGAATTACT GTTTATCTTT           360 TCTTTATTGA AGTCATTGAG TGTTTGAGTT ATTTAACTAT GAAAGGTAGC TAGTGGGTAA           420 TGTTATTGAT GACTTTGTGT GAAGAACAAA ATGTCAATCA TTCAGAGCGT TCAATGGGGG           480 CACGTGCTGG AGTCCCATTT GGATTATTGG GTTTAGGGGT TGCCTAGGTG GTGGTGGTGG           540 TGGTTGGTAA TGGATAATAA TGTTGGTGAA ATATGGGTGC GGAGGAG                         587 (2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：596个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：

(ⅵ)最初来源：番茄

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3: GTTGGGCAGA AGAGCTAGGA AGAGTAAGCA TGTCAAGTGA TAGTTGCAGC CACTGGTGTT     60 ATAGTTGTAG ACAACCCGTG AATCTCAGGA GACAAAATGA TGTTTGCCCC AATTGCGGTG    120 GTGGATTTGT TCAAGAGCTT GAAGACATAA CGAGTAGTAG TGTAGATAAT CAGACCCAGA    180 GGCCGAGATT CATGGAATCC GTCTCAAACT TTTTAAGACG ACAAATCTCA GCTACAAGTA    240 ATACTTCTGA GAGAGGGAGA TCTGATGGGG GTGCTGAACG AGGAAATTTG TGGAATCCGT    300 TGCTGATTTT CAGTGGTGAT ACGCCTGTTC ATATGCCTGG GGATGGTGGA GTTTTGGAGT    360 TTCTTAATGA GGCACCTTGG ATTCCGAGCA AGAAAATGGT GGTGATTATT TTGTTGGTCC    420 AGGAGTGGAG GAATTTTTTG AAGAAATTGT AAATAGAAAT CAGCGTGGTG CTCCTCCTCC    480 TGTCTCGAGA TGTTCAATTG ATTCCCTACC AACAGTCAAG ATATCAAAAA AGGATGTTAG    540 ATCGGATTCG CACTGCCCTG TTTGTAAGGA GAAATTTGCT CTGGGGACTA AGGCAA        596 (2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：589个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：

(ⅵ)最初来源：马铃薯

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4: GTTGGGCAGA AGAGCTAGGA AGAGTAAGCA TGTCAAGTGA CAGTTGCAGC CACTGGTGTT            60 ATAGTTGTAG ACAACCCGTG AATCTCAGGA GACAAAATGA TGTTTGCCCC AATTGCAGTG           120 GTGGATTTGT TCAAGAGCTT GAAGACATAA CGAGTAGTAG TGTAGATAAT CAGAGCCAGA           180 GGCCGAGATT TATGGAATCC GTCTCAAACT TTTTAAGACG ACAAATCGCT ACAAGTAATA           240 CTTCTGAGAG AGGGAGATCT GATGGGGGTG CTGAACGAGG AAATTTATGG AATCCATTGC           300 TGATTTTCAG TGGTGATACG CCTGTTCAAG ATGCCTGGGG ATGGTGGAGT TTTGGAGTTT           360 CTTAATGAGG CTCTTGGCTT CCGACAAGAA AATGGTGGTG ATTATTTTGT TGGTCCAGGA           420 GTGGAGGAAT TTTTTGAAGA AATTGTAAAT AGAAATCAGC GTGGTGCTCC TCCTGCCTCA           480 AGATGTTCAA TTGATTCCCT ACCAACAGTC AAGATATCGA AAAAAGATGT TAGATCGGAT           540 TCTCACTGCC CTGTTTGTAA AGAGAAATTT GCTCTGGGGA CTAAGGCAA                       589 (2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：592个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：双链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA (ⅲ)假设：无 (ⅳ)反义：无 (ⅴ)片段类型： (ⅵ)最初来源：Solanum bulbocastanum (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5: GTTGGGCAGA AGAGCTAGGA AGAGTAAGCA TGTCAAGTGA CAGTTGCAGC CACTGGTGTT            60 ATAGTTGTAG ACAACCCGTG AATCTCAGCA GACAAAATGA TGTTTGCCCC AATTGCGGTG           120 GTGGATTTGT TCAAGAGCTT GAAGACATAA CGAGTAGTAG TGTAGATAAT CAGAGCCAGA           180 GGCCGAGATT CATGGAATCC GTCTCAAACT TTTTAAGACG ACAAATCCCA ACTACAAGTA           240 ATACTTCTTG AGAGAGGGAG ATCTGATGGG GGTGCTGAAC GAGGAAATTT GTGGAATCCG           300 TTGCTGATTT TCAGTGGTGA TACACCTGTT CGGATGCCTG GGGATGGTGG AGTTTTGGAG           360 TTTCTTAATG AGGCTCTTGG CTTTCGACAA GAAAATGGTG GTGANTATTT TGTTGGCCCA           420 GGAGTGGAGG AGTTTTTTGA AGAAATTGTA AATAAAAATC AGCGTGGTGC TCCTCCTGTC           480 TCAAGATGCT CAATTGATTC CCTACCAACA GTCAAGATAT CGAAAAAGGA TGTTAGATCG           540 GATTCTCACT GCCCTGTTTG TAAAGAGAAA TTTGCTCTGG GGACTAAGGC AA                   592