除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途

本発明は、除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途に関し、特に、2,4−Dに耐性を有するタンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途に関する。

雑草は、土壌中の作物と他の目標植物が必要とする価値のある栄養素を高速に消費してしまう。現在、さまざまな除草剤で雑草を制御していて、その中で最も汎用されている除草剤はグリホサートである。例えばコーン、大豆、コットン、ビート、小麦、水稲等のグリホサートに耐性を有する作物が既に開発された。従って、グリホサート耐性作物を栽培する農耕地に、雑草を制御するためにグリホサートを噴射しても、作物を顕著に損害することはない。

グリホサートは、世界的に20年以上利用されていて、これにより、グリホサートやグリホサート耐性作物技術に過度の依存し、野生雑草種類からグリホサートに対して天然的にトレランスを有する、又はグリホサート対抗活性が既に発展された植物から選択しなければならなくなった。少数の雑草からグリホサートに対する耐性を発展されたことが報道されていて、例えばスイスライグラス、イタリアンライグラス、オヒシバ、ブタクサ、カナデンシス、イェジンハオトン、ヘラオオバコのような広葉雑草とイネ科雑草がある。そして、グリホサート耐性作物が汎用される前、農業問題以外の雑草も盛り上がっていて、これらはグリホサート耐性作物で制御することが難しく、これらの雑草は主に、例えば、アマランサス科、アカザ科、タンポポ科、ツユクサ科のような制御しにくい広葉雑草と一緒に出現する(しかし、これに限定されることはない)。

グリホサート耐性雑草又は制御しにくい雑草種類の地域において、栽培者は、ミキシング又は漏れ雑草を制御可能な他の除草剤を利用することでグリホサートの問題点に対応することができる。多くの場合、広葉雑草を制御する汎用されて有効なミキシングコンパニオンは、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)である。2,4−Dは、農業や非作物条件で広葉雑草の制御用として65年以上利用されていて、依然として世界的に最も汎用されている一つの除草剤である。2,4−Dの更なる応用は、双子葉植物(例えば、大豆又はコットン)中の選択性が低い特性の制限を受けているので、2,4−Dは、通常敏感性双子葉作物には応用されない(且つ、通常接近しない)。そして、2,4−Dは、イネ科作物中の用途が、出現する可能性のある作物損害特性の制限を受けている。2,4−Dとグリホサートとを組み合せしたものは、既に不耕起大豆やコットンを栽培する前の強烈な消滅処理に利用されているが、このような双子葉種類が2,4−Dに対して敏感であるので、このような消滅処理を栽培する14〜30日前に行わなければならない。

MCPA、4−クロロ−2−プロパン酸は、2,4−Dプロピオン酸と同様であって、2,4−Dはフェノキシ酢酸系除草剤である。2,4−Dは、大きな単子葉作物(例えば、コーン、小麦、水稲)から選択的に広葉雑草を制御しつつ目標作物を厳重に損害しない場合に利用される。2,4−Dは、合成されたオーキシン誘導体で、その作用は、正常なサイトカイン内安定状態を崩し、均一な成長を阻害することにある。

2,4−Dは、異なる植物に異なるレベルの選択性を示している(例えば、双子葉植物の方がイネ科植物より敏感である)。異なる植物による2,4−Dに対する代謝の違いが異なるレベルの選択性についての解釈である。通常、植物は2,4−Dを徐々に代謝するので、標的部位の異なる活性は植物による2,4−Dに対する異なる応答を一層解釈できる。2,4−Dの植物代謝は、通常、ヒドロキシル化後にアミノ酸又はグルコースと結合する二段階で代謝を実現する。

時間の経過に伴って、微生物群はすでに、当該特定の外来物を分解するに有効な入れ替えルートを発現し、前記ルートによると、2,4−Dが完全に石化される。微生物に除草剤を連続して適用すると、除草剤を炭素源として成長に貢献する(これにより、土壌中で競争優位に立つ)の微生物を選択できる。そこで、現在、2,4−Dを短い土壌半減期を有するように調製し、その後の作物に明確な残された問題がない。これにより、2,4−Dの除草剤の適用が一層促進された。

2,4−D分解能力を有する生物としてラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)を研究した。コーディング石化中の一番目の酵素触媒工程の遺伝子はtfdAである。TfdAは、αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによって反応して、2,4−D酸のジクロロフェノール(DCP)への変換を触媒する。DCPは、2,4−Dに比べ除草剤活性を殆ど有していない。TfdAはトランスジェニック植物において2,4−Dに敏感である双子葉植物(例えば、コットンやタバコ)に2,4−D耐性を入力する。

環境中で大量の2,4−Dを分解できるタンパク質をコーディングするtfdA型遺伝子を認定した。多くの同一系植物はtfdAに類似し(アミノ酸同一性>85%)、またtfdAに類似する酵素活性を有する。しかし、全てのTauD等の構造ドメインを有するタンパク質がいずれも2,4−D分解機能を有するのではなく、大量の同一系植物はtfdAに比べ明確に低い同一性(25−50%)を有するが、αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼFe⁺²ジオキシゲナーゼに関連する特定残基を有する。従って、このような異なるジオキシゲナーゼの基質特異性が何であるかは不明確である。tfdAと低相同性(アミノ酸同一性28%)を有する特定の実例はSphingobium herbicidovoransのrdpAからのものである。当該酵素は、(R)−2,4−Dプロピオン酸(と他の(R)−フェノプロフェン)及び2,4−D(フェノキシ酢酸)石化の第1段階に対する触媒することを示した。

グリホサート耐性雑草の出現や2,4−D除草剤の汎用によって、2,4−Dに敏感である目標植物に2,4−D耐性を入力する必要がある。現在、24DT22除草剤耐性タンパク質の植物中の発現レベル及び除草剤のトレランスに関する報道はなかった。

本発明は、除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途を提供することをその目的とし、本発明は、新規の24DT22遺伝子を提供することを目的とし、前記24DT22タンパク質は植物において除草剤に対して高いトレランスを有する。

上記目的を実現するため、本発明は、 (a)SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、 (b)(a)中のアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は追加され、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有する(a)から誘導されたタンパク質を含む除草剤耐性タンパク質を提供する。

上記目的を実現するため、本発明は、 (a)前記除草剤耐性タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、又は、 (b)厳密条件で(a)に限定されたヌクレオチド配列と交雑し、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、又は、 (c)SEQ ID NO:1で示されるヌクレオチド配列を含む除草剤耐性遺伝子を提供する。

前記厳密条件とは、6×SSC(クエン酸ナトリウム)、0.5%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)溶液中で、65℃で交雑し、その後2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1%SDSでそれぞれ膜を1回洗浄することを指す。

上記目的を実現するため、本発明は、有効に接続された調節配列によって調節された前記除草剤耐性遺伝子を含む発現カセットをさらに提供する。

上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットを含む組換えベクターを提供する。

上記目的を実現するため、本発明は、 前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットを含むトランスジェニック宿主生物の細胞を取得することと、 除草剤耐性タンパク質の発生を許可する条件で前記トランスジェニック宿主生物の細胞を培養することと、 前記除草剤耐性タンパク質を回収することと、を含む除草剤耐性タンパク質を発生する方法を提供する。

さらに、前記トランスジェニック宿主生物は、植物、動物、細菌、酵母、バキュロウイルス、線虫又は藻類を含む。

前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート又はサトウキビであることが好ましい。

上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性タンパク質又は前記発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質を植物中において少なくとも1種類の前記除草剤耐性タンパク質又は前記発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質と異なる第2種類のヌクレオチドと一緒に発現することを含む除草剤耐性範囲の拡大方法を提供する さらに、前記第2種類のヌクレオチドは、グリホサート耐性タンパク質、グルホシネート耐性タンパク質、4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、チトクローム類タンパク質又はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコーディングする。

本発明において、24DT22除草剤耐性タンパク質の1種類のトランスジェニック植物での発現は、一つ又は複数のグリホサート耐性タンパク質及び/又はグルホシネート耐性タンパク質の発現を伴うことができる。このような1種類以上の除草剤耐性タンパク質による同一のトランスジェニック植物での共通発現は、遺伝子工学によって植物に必要な遺伝子を含有させ発現させることで実現することができる。そして、1種の植物(第1親株)が遺伝子工学操作によって24DT22除草剤耐性タンパク質を発現し、第2種の植物(第2親株)が遺伝子工学操作によってグリホサート耐性タンパク質及び/又はグルホシネート耐性タンパク質を発現することができる。第1親株と第2親株の交雑によって第1親株と第2親株の全ての遺伝子を導入した子孫植物を取得する。

上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットで複数の植物細胞を転化し、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットの発現を許可する転化細胞で成長させ、そして、未転化の細胞は殺した又は未転化の細胞の成長を抑制した除草剤濃度で前記細胞を培養することを含み、前記除草剤はフェノキシオーキシンである転化した植物細胞の選択方法を提供する。

上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを含む作物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含む雑草を制御する方法を提供する。

前記除草剤が、フェノキシオーキシンであることが好ましい。

上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを植物に導入し、導入後の植物に除草剤の障害から保護するに充分な量の除草剤耐性タンパク質を発生させることを含む植物を除草剤による障害から保護する方法を提供する。

前記除草剤が、フェノキシオーキシン又はアリルオキシフェノキシアルカノエートであることが好ましい。前記植物は、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート又はサトウキビであることが好ましい。

上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを含むグリホサート耐性植物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含むグリホサート耐性植物の田畑においてグリホサート耐性雑草を制御する方法を提供する。

前記除草剤が、フェノキシオーキシンであることが好ましい。前記グリホサート耐性植物は、単子葉植物又は双子葉植物である。

上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを植物に導入することを含む作物に2,4−D除草剤耐性を付与する方法を提供する。

前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート又はサトウキビであることが好ましい。

上記目的を実現するため、本発明は、 (a)SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、 (b)(a)中のアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸が置換及び/又は欠失及び/又は追加され、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有する(a)から誘導されたタンパク質を含む除草剤耐性タンパク質がフェノキシオーキシン類除草剤に耐える用途を提供する。

前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを植物に導入することを、本発明においては外因性のDNAを植物細胞に導入することであって、通常の転化方法は、アグロバクテリウムが仲介した転化、微量放射衝撃、直接にDNAをプロトプラストに摂取する方法、電気穿孔法又は珪素ホイスカーの仲介によるDNA導入方法を含むが、これらに限定されることはない。

本発明の前記2,4−D耐性遺伝子及びその後の耐性作物は、作物中でグリホサート耐性(又は、高耐性及び遷移した)広葉雑草種類の良好な選択に用いられる。2,4−Dは広スペクトルで、安価で強力な広葉除草剤で、双子葉や単子葉において同様に強い作物トレランスを提供すると、栽培者に良好な効果を提供できる。2,4−D耐性トランスジェニック双子葉植物は、適用時間や使用量でさらに高い柔軟性を有している。2,4−D除草剤耐性特性の他の用途は、2,4−Dのドリフト、揮発、転化(又は他の遠距離の移動現象)、使用ミス、破壊等の正常な敏感性作物に対する損害を予防することである。既に異なるフェノキシオーキシンを組み合せしたさまざまな混合物で異なる地域の特定の雑草スペクトルと環境条件を処理している。植物に24DT22遺伝子を使用すると、一層広スペクトルのフェノキシオーキシン除草剤を保護することができ、柔軟性と制御可能な雑草スペクトルを向上し、市販のフェノキシオーキシン全体のドリフト又は他の遠距離フェノキシ除草剤に対するダメージを防止することができる。

フェノキシオーキシン除草剤は通常、活性酸に調製されるが、一部の商品はさまざまな対応するエステル製剤の一つとして調製され、普通の植物エステラーゼは植物においてこれらのエステルを活性酸に変換するので、これらを植物中の24DT22酵素の基質とみなすことができる。類似するものとして、対応する酸の対応する有機又は無機塩がある。キラルプロピオン酸、プロピオン酸塩又はプロピオン酸エステル除草剤を示す時、異なるCAS番号であっても光学精製化合物に対応することもあって、これらの除草剤を命名する際にラセミ体(R、S)又は光学精製した(R又はS)エナンチオマーが同一である除草剤とみなす。可能な使用量範囲は、作物又は非作物用途において単独処理又は他の除草剤と組み合せであることができる。

現在、24DT22遺伝子が遺伝子改変されて植物を発現した後に植物でのフェノキシオーキシン除草剤の使用を許可する特性を有していることが認定され、前記植物には固有の耐性が存在しなく、又はこれらの除草剤の使用を許可するに不十分である。そして、24DT22遺伝子は、天然耐性が選択性を許可するに不十分である時、植物中でフェノキシオーキシン除草剤に対する保護を提供する。現在、1種類、2種類又は幾つかのフェノキシオーキシン除草剤と組み合せして連続又はミキシングに処理することのできるものは24DT22遺伝子の植物のみである。広スペクトル双子葉雑草の各種フェノキシオーキシン除草剤の使用量範囲は25〜4000g ae/haに制御され、通常は、100〜2000g ae/haである。同一の田畑において(連続又はミキシング組み合せ)これらの異なる化学類別と異なる作用モードと範囲を有する除草剤を組み合せると、殆どの除草剤制御を必要とする潜在的な雑草を制御できる。

グリホサートは、非常に広スペクトルの広葉とイネ科雑草種類を制御できるので汎用されている。しかし、グリホサート耐性作物と非作物にグリホサートを繰り返して使用することで、雑草が天然的に耐性を有する種類又はグリホサート耐性生物型になっている(そして継続されている)。大部分の除草剤耐性管理戦略として、有効使用量のミキシング除草剤コンパニオンを耐性雑草の出現を遅延する方法とし、前記除草剤コンパニオンは同一種に対する制御を提供するが、異なる作用モードを有する。24DT22遺伝子とグリホサート耐性特性(及び/又は他の除草剤耐性特性)を重ねて、同一作物にグリホサートとフェノキシオーキシン(例えば、2,4−D)を選択的に使用することで、グリホサート耐性作物中のグリホサート耐性雑草種類(1種類又は多様のフェノキシオーキシンにより制御される広葉雑草種類)に対する制御を実現する。これらの除草剤の適用は、作用モードの異なる2種類以上の除草剤のミキシング物で同時に使用したり、連続使用(例えば、栽培前、発芽前又は発芽後)中に単一の除草剤組み合せ物の単独使用(使用する間隔範囲は2時間〜3ヶ月)、又は任意の時間(作物を栽培してから7ヶ月内〜作物を収穫するまで(又は、単一除草剤の場合収穫前の間隔、最も短いのをとる))に、使用可能な化合類別を代表する任意数量の除草剤の組み合せを使用することができる。

広葉雑草を制御するにおいて柔軟性を有することは非常に重要で、即ち、使用時間、単一除草剤の使用量、頑固又は耐性雑草を制御する能力は非常に重要である。作物においてグリホサート耐性遺伝子/24DT22遺伝子と重ね合わされるグリホサートの適用範囲は、250〜2500g ae/haであることができる。フェノキシオーキシン除草剤(1種類又は多様)は、25〜4000g ae/haであることができる。このような適用の時間の最適な組み合せは、具体的な条件、種類、環境によって決められる。

除草剤製剤(例えば、エステル、酸又は塩レシピー又は可溶性濃縮物、乳剤濃縮物又は可溶性液体)とミキシング添加剤(例えば、アジュバント又は相溶剤)は、所定の除草剤又は1種類又は多様の除草剤の組み合せの雑草制御に明確な影響を与える。任意の上述した除草剤の任意の化学組み合せはいずれも本発明の範囲に含まれる。

当業者にとって周知な2種類以上の作用モードの組み合せによる、制御を受ける雑草スペクトル及び/又は天然的に耐性を有する種類又は耐性雑草種類における有益な効果は、ヒトによって(トランスジェニック又は非トランスジェニック)作物中でグリホサート耐性作物以外の除草剤耐性の化学物を発生するまで拡張できる。実質上、グリホサート耐性(例えば、耐性植物又は細菌EPSPS、GOX、GAT)、グルホシネート耐性(例えば、PAT、Bar)、アセト乳酸合成酵素(ALS)抑制性除草剤耐性(例えば、イミダゾリジノン、スルホニル尿素、トリアゾロ、スルホンアミドアニリン、ピリミジンチオベンゾエート、例えばAHAS、Csrl、SurA等の他の化学物耐性遺伝子)、ブロモキシニル耐性(例えば、Bxn)、HPPD(4−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ)酵素抑制剤に対する耐性、フィトエンデサチュラーゼ(PDS)抑制剤に対する耐性、光系II抑制性除草剤に対する耐性(例えば、psbA)、光系I抑制性除草剤に対する耐性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼIX(PPO)抑制性除草剤に対する耐性(例えば、PPO−1)、フェニル除草剤に対する耐性(例えば、CYP76B1)、ジカンバ分解酵素等を単独又は多様を重ね合わせてコーディングすることで、雑草による上述した任意の類別の除草剤耐性の能力を引き続くことを有効に制御又は防止する。

他の除草剤の場合、他の好適なALS抑制剤は、トリアゾロスルホンアミドアニリン(クロランスラムアミン、ジクロスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム)、ピリミジンチオベンゾエート、フルカルバゾンナトリウムを含む。好適なHPPD抑制剤は、メソトリオン、イソキサフルトール、スルコトリオンを含む。好適なPPO抑制剤は、フルミオキサジン、ブタフェナシル、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、ジフェニルエーテル(例えば、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、オキシフルオルフェン)がある。

そして、24DT22遺伝子を単独又は他の除草剤耐性作物の特徴を重ね合わせた後に1種類又は多様の他の輸入(例えば、害虫抵抗性、真菌抵抗又はストレス耐性等)又は輸出(例えば、向上された収量、改善された油量、向上された繊維品質等)特性と重ね合わされる。よって、本発明は、柔軟且つ経済的に任意数量の農学害虫を制御する能力及び作物品質を向上させる完璧な農学解決案を提供する。

本発明の24DT22遺伝子は2,4−Dを分解することができ、重要な除草剤耐性作物であって、標記物質特徴可能性を選択する基礎である。

本発明は、トランスジェニック発現を行うことができ、殆どの広葉雑草の除草剤組み合せを制御できる。24DT22遺伝子は、優れた除草剤耐性作物特性として、例えば他の除草剤耐性作物特性(例えば、グリホサート耐性、グルホシネート耐性、ALS抑制剤(例えば、イミダゾリジノン類、スルホニル尿素類、トリアゾロピリミジンスルホンアミド類)耐性、ブロモキシニル耐性、HPPD抑制剤耐性、PPO抑制剤耐性等)、害虫抵抗性特性(Cry1Ab、Cry1F、Vip3、他のバチルス・チューリンゲンシスタンパク質又は非バチルス由来の害虫抵抗性タンパク質等)と重ね合わされる。そして、24DT22遺伝子を、標記物を選択する補助選択用の他の遺伝子又は遺伝子群が遺伝子改変した植物の一次転化体とすることができる。

フェノキシアルカノエート基は、安定した酸官能基を除草剤に導入する。酸性基は「酸捕捉」によって師管部活性(除草剤作用に必須な属性である)を入力し、活性目的で新規の除草剤に統合される。24DT22基質である可能性のある市販と実験性除草剤がある。よって、本発明の遺伝子を用いると、他の除草剤の耐性を得ることができる。

本発明の除草剤耐性作物特性を他の除草剤耐性作物特性(グリホサート耐性を含むが、これに限定されることはない)との新規の組み合せに適用することもできる。除草剤(例えば、グリホサート)に対する新しく取得した耐性又は固有の耐性により、これらの特性組み合せによって雑草種類を制御する新しい方法を発生する。よって、除草剤耐性作物特性以外に、本発明の範囲は、除草剤で雑草を制御する新しい方法も含み、それにおいて、トランスジェニック作物中の前記酵素によって前記除草剤に対する耐性を発生する。

本発明は多様の植物に適用でき、例えばシロイヌナズナ、タバコ、大豆、コットン、米、コーン、アブラナに適用できる。本発明はさらに、多様の他の単子葉(例えば、牧草イネ科又は芝草イネ科)と双子葉作物(例えば、アルファルファ、クローバー、高木種類等)にも適用できる。類似して、2,4−D(又は、他の24DT22基質)は適切な耐性のイネ科作物に最も積極的に適用され、これにより、特性が向上された耐性により、栽培者に最も有効な使用量と一層広い投薬時間でこれらの除草剤を使用しつつ作物ダメージのリスクのない可能性を提供する。

本発明に上述した植物、植物組織又は植物細胞のゲノムとは、植物、植物組織又は植物細胞内のいずれかの遺伝物質を指し、且つ細胞核とプラスチドとミトコンドリアゲノムとを含む。

本発明に記載の「抵抗」は遺伝可能なもので、植物が、除草剤が所定の植物に一般的な除草剤有効処理を行っている状況下成長し繁殖することができる。当業者にとって周知なように、植物が除草剤処理によるダメージ程度が明確であっても、植物は依然として「抵抗」を有するとみなす。本発明において、用語「耐性」は用語「抵抗」よりその範囲が広く、「抵抗」と特定の植物が有する除草剤の誘導に抵抗して各程度のダメージの向上能力を含み、同様な除草剤使用量で、通常、同一の遺伝子型野生型の植物がダメージを受けることになる。

本発明に記載のポリヌクレオチド及び/又はヌクレオチドにより完璧な「遺伝子」を形成し、必要な宿主細胞においてタンパク質又はポリペプチドをコーディングする。当業者は、本発明のポリヌクレオチド及び/又はヌクレオチドを目標宿主中の調節配列により制御することを理解できる。

当業者にとって周知なように、DNAは典型的に二本鎖形式で存在する。このような配列において、一鎖と他の鎖が相補し、その反対も同じである。DNAが植物中で複製してDNAの他の相補鎖を発生する。このように、本発明は、配列表に示すポリヌクレオチド及びその相補鎖の使用を含む。本分野でよく使用される「コーディング鎖」とは、アンチセンス鎖と結合する鎖を指す。体内でタンパク質を発現するため、典型的に、DNAの一鎖を一mRNAの相補鎖に転写し、それをモデルとしてタンパク質を翻訳する。mRNAは、実際上、DNAの「アンチセンス」鎖から転写されたものである。「センス」又は「コーディング」鎖は一連のコドン(コドンは、三つのヌクレオチドで、1回で三つを読むと特定のアミノ酸を得ることができる)を有し、それをオープンリーディングフレーム(ORF)として読み取ることで標的タンパク質又はペプチドを形成する。本発明はさらに、例示したDNAに対応する機能を有するRNAとPNA(ペプチド核酸)も含む。

本発明において、核酸分子又はその断片は厳密条件で本発明の除草剤耐性遺伝子と交雑する。いずれかの常用の核酸交雑又は増幅方法は、いずれも本発明の除草剤耐性遺伝子の存在を鑑定できる。核酸分子又はその断片は一定の状況で、他の核酸分子と特異性交雑を行うことができる。本発明において、二つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することができることを、当該二つの核酸分子が互いに特異性交雑を行うことができると言う。二つの核酸分子が完全な相補性を示すことを、その中の一つの核酸分子が他の核酸分子の「相補物」であると称す。本発明において、一つの核酸分子の各ヌクレオチドがいずれも他の核酸分子の対応するヌクレオチドと相補すると、当該二つの核酸分子は「完全相補性」を有する。二つの核酸分子が充分な安定性で相互交雑して少なくとも常用の「低度厳密」条件でアニーリングして互いに結合すると、当該二つの核酸分子は「最低程度相補」と呼ばれる。類似して、二つの核酸分子が充分な安定性で相互交雑して常用の「高度厳密」条件でアニーリングして且つ互いに結合すると、当該二つの核酸分子は「相補性」を有する。完全相補性からの遷移は許可し、このような遷移が二つの分子による二本鎖構造の形成を完全に阻止するものでなければよい。一つの核酸分子をプライマー又はプローブとする場合、用いられる特定溶剤と塩濃度で安定した二本鎖構造を形成するように、配列で充分な相補性を有しなければならないわけではない。

本発明において、相同性に基づく配列は1区間の核酸分子で、該核酸分子は高度厳密条件でマッチする他の区間の核酸分子の相補鎖と特異性交雑を発生する。DNA交雑を促進するに適切な厳密条件は、例えば、約45℃条件で、6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)で処理し、その後、50℃条件で、2.0×SSCで洗浄することであって、これらの条件は当業者にとって周知なものである。例えば、洗浄工程での塩濃度として、低度厳密条件の約2.0×SSC、50℃〜高度厳密条件の約0.2×SSC、50℃から選ぶことができる。そして、洗浄工程での温度条件として、低度厳密条件の約22℃の室温から高度厳密条件の約65℃まで上昇させることができる。温度条件と塩濃度は変更可能であって、その中の一つを不変に保持し他の一つを変更させることもできる。本発明における厳密条件は、6×SSC、0.5%SDS溶液において、65℃で、SEQ ID NO:1と特異性交雑を行い、その後2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1%SDSでそれぞれ膜を1回洗浄することであることが好ましい。

よって、除草剤トレランス活性を有し、厳密条件で本発明の配列1と交雑する配列も本発明に含まれる。これらの配列は本発明の配列と少なくとも、40%〜50%相同性、約60%、65%又は70%相同性、ひいては少なくとも約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は更に大きい配列相同性を有する。

本発明で機能タンパク質を提供する。「機能活性」(又は「活性」)とは、本発明において、本発明の用途のタンパク質/酵素(単独又は他のタンパク質との組み合せで)が除草剤活性を分解又は削減する能力を有することを指す。本発明のタンパク質を発生する植物は「有効量」のタンパク質を発生し、除草剤で植物を処理する時、タンパク質が発現されるレベルが、植物に除草剤(特別な説明がない場合、普通の使用量である)に対する完全又は一部の抵抗又は耐性を付与するに充分である。通常の標的植物を殺す使用量で、正常な田畑使用量と濃度で除草剤を使用することができる。本発明の植物細胞と植物は、除草剤処理による成長抑制又はダメージを受けないように保護される。本発明の転化植物と植物細胞が、2,4−D除草剤の抵抗又は耐性を有することが好ましく、即ち、転化された植物と植物細胞は有効量の2,4−D除草剤が存在する雰囲気で成長可能である。

本発明に記載の遺伝子とタンパク質は、特定の例示配列を含む以外、前記特定に例示したタンパク質の除草剤耐性活性の特徴を保存した一部及び/断片(タンパク質全体に比べ内部及び/又は末端が欠失した)、変異体、突然変異体、置換物(アミノ酸を置換するタンパク質)、キメラ、融合タンパク質も含む。前記「変異体」又は「変異」とは、同一のタンパク質をコーディングする又は除草剤耐性活性を有する等価タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列を指す。前記「等価タンパク質」とは、請求項のタンパク質と同一又は基本的に同一の除草剤トレランスの生物活性を有するタンパク質を指す。

本発明に記載のDNA分子又はタンパク質配列の「断片」又は「切り捨て」とは、かかる原始DNA又はタンパク質配列(ヌクレオチド又はアミノ酸)の一部又はその人的改造形式(例えば、植物の発現に適合する配列)を指し、断片に接近し、分子全長に比べ内部及び/又は末端が欠失したものを含み、上述した配列の長さは変更可能であるが、その長さは(コーディング)タンパク質が除草剤耐性タンパク質であるように確保するに充分である。一部の状況において(特に、植物中の発現)、切り捨てタンパク質をコーディングする切り捨て遺伝子を利用することが有利である。好適な切り捨て遺伝子は、通常、タンパク質全体の40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%をコーディングする。

遺伝コドンが冗長性を有するので、多様の異なるDNA配列は同一のアミノ酸配列をコーディングすることができる。これらの同一又は基本的に同一のタンパク質をコーディングする入れ替え可能なDNA配列を発生することは当業者の技術レベル内のことである。このような異なるDNA配列も本発明の範囲に含まれる。前記「基本的に同一の」配列とは、アミノ酸の置換、欠失、追加又は挿入があるが、実質的には除草剤耐性活性に影響を与えていない配列を指し、除草剤耐性活性を保留した断片を含む。

本発明において、アミノ酸配列の置換、欠失又は追加は本分野の常用技術で、このようなアミノ酸が、タンパク質の折りたたみ及び/又は活性の保守に顕著な影響がないアミノ酸置換である小さい特性改変、通常約1〜30個のアミノ酸の欠失である小さい欠失、例えばアミノ末端から一つのメチオニン残基が延長された小さいアミノ基又はカルボキシル基末端延長、例えば約20〜25個の残基長さの小さい接続ペプチドに変化することが好ましい。

保守置換の実例は以下のアミノ酸組内で発生した置換である:アルカリ性アミノ酸(例えば、アルギニン酸、リジン酸、ヒスチジン酸)、酸性アミノ酸(例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸)、極性アミノ酸(例えば、グルタミン、アスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン)、芳香族アミノ酸(例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン)、及び小分子アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン)。通常、特定活性を変更しないアミノ酸置換は本分野の周知技術で、例えば、N. Neurath、R. L. Hillの1979年ニューヨーク学術出版社(Academic Press)が出版した《Protein》で記載された。最もよく見られる交換としてAla/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thu/Ser、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/GluとAsp/Gly、及びこれらに相反する交換がある。

当業者にとって周知なように、このような置換は分子機能に重要な作用を果たす領域以外で行い、且つ活性ポリペプチドを発生する。本発明のポリペプチドの場合、その活性が不可欠であるので置換されないアミノ酸残基を選択し、本分野で周知な方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発の方法で鑑定することができる(例えば、CunninghamとWells、1989、Science 244:1081−1085を参照)。後方の技術は、分子中の各正帯電した残基に突然変異を導入し、得られた突然変異分子の除草剤耐性活性を検出して、該分子活性にとって重要なアミノ酸残基を確定する。基質−酵素の相互作用部位もその三次元構造を分析して測定することができ、このような三次元構造は、NMR分析、結晶学又は光親和性標識等の技術で測定することができる(例えば、de Vos等の、1992、Science 255:306−312;Smith等の、1992、J. Mol. Biol 224:899−904;Wlodaver等の、1992、FEBS Letters 309;59−64を参照)。

よって、配列2で示されるアミノ酸配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列も本発明に含まれる。これらの配列と本発明配列との類似性/相同性は典型的に60%を超えていて、75%を超えることが好ましく、80%を超えることがさらに好ましく、90%を超えることが一層好ましく、95%を超えることもできる。そして、特定の相同性及び/又は類似性範囲に基づいて本発明の好適なポリヌクレオチドとタンパク質を定義することもできる。例えば、本発明に例示した配列と49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の相同性及び/又は類似性を有する。

本発明において、前記調節配列は、プロモーター、輸送ペプチド、ターミネータ、エンハンサー、リーダー配列、イントロン及び他の前記24DT22遺伝子に操作可能に接続される調節配列を含むが、これらに限定されることはない。

前記プロモーターは、植物で発現可能なプロモーターで、前記「植物で発現可能なプロモーター」とは、それに接続されるコーディング配列の植物細胞内での発現を確保するプロモーターを指す。植物で発現可能なプロモーターは、構成的プロモーターである。植物内の構成的発現を指導するプロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルスに由来する35Sプロモーター、コーンUbiプロモーター、水稲GOS2遺伝子のプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されることはない。そして、植物で発現可能なプロモーターは、組織特異性のプロモーターであることもでき、即ち例えばPEPカルボキシル化酵素プロモーターのような、該プロモーターが植物の一部の組織内、例えば緑色組織でコーディング配列の発現レベルが植物の他の組織(通常のRNA試験によって測定できる)以上であるように指導する。そして、植物で発現可能なプロモーターは創傷誘導性プロモーターであることもできる。創傷誘導性プロモーター又は創傷誘導を指導する発現モードのプロモーターとは、植物が機械的又は昆虫かじりによるダメージを受けた時、プロモーターの調節を受けたコーディング配列の発現が正常な成長条件より明確に向上されたことを指す。創傷誘導性プロモーターとして、ジャガイモとトマトのタンパク質酵素抑制遺伝子(pinIとpinII)とコーンタンパク質酵素抑制遺伝子(MPI)のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されることはない。

前記輸送ペプチド(分泌信号配列又はガイド配列とも呼ばれる)とは、トランスジェニック産物を特定の細胞小器官又は細胞コンパートメントにガイドすることを指し、受容タンパク質にとって、前記輸送ペプチドが非相同性なものであってもよく、例えば、コーディング葉緑体輸送ペプチド配列標的葉緑体を利用したり、又は「KDEL」保留配列標的小胞体を利用したり、又は大麦植物レクチン遺伝子のCTPP標的液胞を利用したりする。

前記リーダー配列は、EMCVリーダー配列(脳心筋炎ウイルス5’非コーディング領域)のような小RNAウイルスリーダー配列、MDMV(コーンド萎縮モザイクウイルスウイルス)リーダー配列のようなジャガイモYウイルス組リーダー配列、ヒト免疫グロブリンタンパク質重鎖結合タンパク質(BiP)、アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質mRNAの不翻訳リーダー配列(AMV RNA4)、タバコモザイクウイルス(TMV)リーダー配列を含むが、これらに限定されることはない。

前記エンハンサーは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)エンハンサー、ゴマノハグサモザイクウイルス(FMV)エンハンサー、カーネーションエッチドリングウイルス(CERV)エンハンサー、カッサバ葉脈モザイクウイルス(CsVMV)エンハンサー、ミラビリスモザイクウイルス(MMV)エンハンサー、ケストルムイエローリーフカーリングウイルス(CmYLCV)エンハンサー、Cotton leaf curlMultanウイルス(CLCuMV)、commelina yellow mottleウイルス(CoYMV)、Peanutchloroticstreakウイルス(PCLSV)エンハンサーを含むが、これらに限定されることはない。

単子葉植物の適用において、前記イントロンは、コーンhsp70イントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、Adhイントロン1、スクロースシンターゼイントロン又は水稲Act1イントロンを含むが、これらに限定されることはない。双子葉植物の適用において、前記イントロンは、CAT−1イントロン、pKANNIBALイントロン、PIV2イントロン、「スーパーユビキチン」イントロンを含むが、これらに限定されることはない。

前記ターミネータは、植物で作用を果たすポリアデニルの酸化に適合する信号配列であることができ、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)ノパリンシンターゼ(NOS)遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列、タンパク質酵素抑制剤II(pinII)遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列、エンドウssRUBISCO E9遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列、α−チューブリンタンパク質(α−tubulin)遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列を含むが、これらに限定されることはない。

本発明において、前記「有効接続」とは核酸配列の連結を指し、前記連結によって一つの配列が対応する配列にとって必要な機能を提供可能である。本発明において、前記「有効接続」は、プロモーターを関心のある配列に接続して、該関心のある配列の転写が該プロモーターに制御されたり調節されることができる。関心のある配列がタンパク質をコーディングし、また該タンパク質の発現を取得しようとする場合、「有効接続」は、プロモーターを前記配列に接続し、接続方式によって取得した転写物が効率的に翻訳されることを表す。プロモーターとコーディング配列の接続が転写物融合であってコーディングしたタンパク質の発現を実現しようとする場合、このような接続を行うことで、得られる転写物中の第1翻訳開始コドンがコーディング配列の開始コドンになる。そして、プロモーターとコーディング配列の接続が翻訳融合であってコーディングしたタンパク質の発現を実現しようとする場合、このような接続を行うことで、5’非翻訳配列に含まれた第1翻訳開始コドンがプロモーターに連結され、接続方式によって得られる翻訳産物と所要のタンパク質をコーディングする翻訳オープンリーディングフレームの関係はリーディングフレームに符合する。「有効接続」可能な核酸配列は、遺伝子発現機能を提供する配列(即ち、例えばプロモーター、5’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コーディング領域、3’非翻訳領域、ポリアデニル化部位及び/又は転写ターミネータ等の遺伝子発現素子)、DNA転移及び/又は整合機能を提供する配列(即ち、T−DNA境界配列、部位特異性組換え酵素識別部位、整合酵素識別部位)、選択性機能を提供する配列(即ち、抗生物質耐性標記物、生物合成遺伝子)、スコア可能標記物機能を提供する配列、体外又は体内協力配列操作する配列(即ち、ポリリンカー配列、部位特異性組換え配列)、複製機能を提供する配列(即ち、細菌の複製起点、自発的複製配列、セントロメア配列)を含むが、これらに限定されることはない。

本発明によると、植物に新しい除草剤耐性特性を付与し、また、収量を含む表現型に対する不良影響は見られていない。本発明において、植物は、少なくとも1種類の試験対象除草剤2×、3×、4×又は5×普通適用レベルに耐性を有する。これらの耐性レベルの向上は本発明の範囲に含まれる。例えば、本分野で周知の多様な技術に予見可能の最適化を行ったり一層改善させて、所定の遺伝子の発現を増加することができる。

本発明において、前記除草剤耐性タンパク質は24DT22アミノ酸配列であって、配列表でSEQ ID NO:2で示すとおりである。前記除草剤耐性遺伝子は24DT22ヌクレオチド配列で、配列表でSEQ ID NO:1で示すとおりである。前記除草剤耐性遺伝子は植物に用いられて、24DT22ヌクレオチド配列によりコーディングしたタンパク質のコーディング領域を含む以外、例えば輸送ペプチドをコーディングするコーディング領域、選択性標記タンパク質又は害虫抵抗性を付与するタンパク質をコーディングするコーディング領域等の他の素子も含む。

本発明において、24DT22除草剤耐性タンパク質は、殆どのフェノキシオーキシン除草剤に対して耐性を有する。本発明中の植物は、そのゲノムに外因性のDNAを含み、前記外因性のDNAは24DT22ヌクレオチド配列を含み、有効量の該タンパク質を発現することで、除草剤の脅威から保護される。有効量とは、ダメージのない又はダメージが軽い使用量を指す。同時に、植物は、その形状が正常であって、且つ通常の方法で培養して産物の消費及び/又は成長に利用される。

植物材料における除草剤耐性タンパク質の発現レベルは、本分野で周知の多様な方法で検出することができ、例えば、特異性プライマーを用いて組織内に発生された除草剤耐性タンパク質をコーディングするmRNAの量を固定したり、又は直接に発生された除草剤耐性タンパク質の量を特異性検出することができる。

本発明は、除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途を提供し、以下のメリットを有する: 1、除草剤に対する耐性が強い。本発明の除草剤耐性タンパク質24DT22は除草剤に対する耐性が強く、特に、フェノキシオーキシン除草剤、2,4−Dに対する耐性が強い。

2、除草剤に対する耐性が広い。本発明の除草剤耐性タンパク質24DT22タンパク質は、多様なフェノキシオーキシン除草剤に対して高い耐性を示すので、植物に汎用される見込みがある。

以下、図面と実施例によって、本発明の技術案を一層詳しく説明する。

本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターDBN01−Tの構築を示すフローチャートである。

本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターDBN100301の構築を示すフローチャートである。

本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の対照配列を含有する組換え発現ベクターDBN100301Nの構築を示すフローチャートである。

本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途のトランスジェニックシロイヌナズナT

₁植物の除草剤耐性効果を示す図である。

本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途のトランスジェニック大豆T

₁植物の除草剤耐性効果を示す図である。

本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターDBN100764の構築を示すフローチャートである。

本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の対照配列を含有する組換え発現ベクターDBN100764Nの構築を示すフローチャートである。

以下、具体的な実施例によって本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の技術案をさらに説明する。

第1実施例、24DT22遺伝子配列の取得と合成 1、24DT22遺伝子配列の取得 24DT22除草剤耐性タンパク質のアミノ酸配列(292個のアミノ酸)は、配列表でSEQ ID NO:2で示すとおりである。植物の好みコドンに基づいて、前記24DT22除草剤耐性タンパク質に対応するアミノ酸配列(292個のアミノ酸)をコーディングするヌクレオチド配列(879個のヌクレオチド)を取得し、配列表でSEQ ID NO:1で示すとおりである。

2、上記24DT22ヌクレオチド配列の合成 前記24DT22ヌクレオチド配列(例えば、配列表でSEQ ID NO:1で示す)を南京金斯瑞生物科学技術有限会社で合成し、合成された前記24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)の5’末端にSpeI酵素切断部位が接続され、前記24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)の3’末端にKasI酵素切断部位が接続されている。

第2実施例、シロイヌナズナと大豆組換え発現ベクターの構築 1、24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターDBN01−Tの構築 合成した24DT22ヌクレオチド配列をクローンベクターpGEM−T(Promega、Madison、USA、CAT:A3600)に接続し、その操作工程はPromega会社の製品pGEM−Tベクターの説明書に従って行い、組換えクローンベクターDBN01−Tを得て、その構築フローは図1に示す(ここで、Ampはアンピシリン耐性遺伝子を、f1はファージf1の複製起点を、LacZはLacZ開始コドンを、SP6はSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを、T7はT7 RNA ポリメラーゼプロモーターを、24DT22は24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)を、MCSは複数のクローン部位をそれぞれ示す)。

その後、組換えクローンベクターDBN01−Tをヒートショック法で大腸菌T1受容性細胞(Transgen、Beijing、China、CAT:CD501)に転化し、そのヒートショック条件は、50μL大腸菌T1受容性細胞、10μLプラスミドDNA(組換えクローンベクターDBN01−T)で、42℃で30秒水浴し、37℃で1時間振動培養し(回転速度100rpmでシェーカーで揺れ動く)、表面にIPTG(イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド)とX−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド)のアンピシリン(100mg/L)が塗布されたLB板(トリプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、NaCl10g/L、寒天15g/L、NaOHでpHを7.5まで調節)で一夜成長させた。白色コロニーを選択し、LB液体培地(トリプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、NaCl10g/L、アンピシリン100mg/L、NaOHでpHを7.5まで調節)で温度37℃条件で一夜培養した。そのプラスミドをアルカリ抽出し、即ち菌液を回転速度12000rpmで1min遠心処理し、上清液を除去し、沈殿菌体を100μLの氷で予備冷却した溶液I(25mM Tris−HCl、10mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、50mMグルコース、pH8.0)に懸濁し、その後、200μLの新しく調製した溶液II(0.2M NaOH、1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム))を添加し、チューブを4回倒して混合し、氷の上に3〜5min放置する。150μLの冷たい溶液III(3M 酢酸カリウム、5M 酢酸)を添加して直ちに充分に混合し、氷の上に5〜10min放置する。温度4℃、回転速度12000rpmの条件で5min遠心処理し、上清液に2倍体積の無水アルコールを添加し、均一に混合した後、室温に5min放置する。温度4℃、回転速度12000rpmの条件で5min遠心処理し、上清液を除去し、沈殿物を濃度(V/V)が70%であるアルコールで洗浄して乾燥する。30μLのRNase(20μg/mL)含有TE(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)を添加して沈殿物を溶解し、温度37℃で30min水浴し、RNAを消化する。温度−20℃に保存する。

抽出したプラスミドをSpeIとKasIによる酵素切断鑑定を行った後、陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターDBN01−Tに挿入された前記24DT22ヌクレオチド配列は、配列表でSEQ ID NO:1で示されるヌクレオチド配列であって、即ち24DT22ヌクレオチド配列が正確に挿入された。

2、24DT22ヌクレオチド配列を含有するシロイヌナズナと大豆組換え発現ベクターDBN100301の構築 制限エンドヌクレアーゼSpeIとKasIとでそれぞれ、組換えクローンベクターDBN01−Tと発現ベクターDBNBC−01(ベクター骨格:pCAMBIA2301(CAMBIA機構が提供可能である))に酵素切断を行って、切断した24DT22ヌクレオチド配列断片を発現ベクターDBNBC−01のSpeIとKasIの部位間に挿入し、通常の酵素切断方法でベクターを構築することは当業者にとって周知なものであって、組換え発現ベクターDBN100301を構築し、その構築フローは図2に示す(Kan:カナマイシン遺伝子;RB:右境界;AtUbi10:シロイヌナズナUbiquitin(ユビキチン)10遺伝子プロモーター(SEQ ID NO:3);24DT22:24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1);Nos:ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ(SEQ ID NO:4);prCaMV35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(SEQ ID NO:5);PAT:グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子(SEQ ID NO:6);tCaMV35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネータ(SEQ ID NO:7);LB:左境界)。

組換え発現ベクターDBN100301を、ヒートショック法で大腸菌T1受容性細胞に転化し、そのヒートショック条件は、50μL大腸菌T1受容性細胞、10μLプラスミドDNA(組換え発現ベクターDBN100301)であって、42℃で30秒水浴する。37℃で1時間振動培養する(回転速度100rpmでシェーカーで揺れ動く)。その後、50mg/Lカナマイシン(Kanamycin)含有LB固定板(トリプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、NaCl10g/L、寒天15g/L、NaOHでpHを7.5まで調節した)上で温度37℃の条件で12時間培養し、白色コロニーを選択し、LB液体培地(トリプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、NaCl10g/L、カナマイシン50mg/L、NaOHでpHを7.5まで調節した)で温度37℃条件で一夜培養した。そのプラスミドをアルカリ抽出した。抽出したプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼSpeIとKasIで酵素切断して鑑定し、陽性クローンに測定鑑定を行った結果、組換え発現ベクターDBN100301は、SpeIとKasI部位間のヌクレオチド配列が配列表でSEQ ID NO:1で示すヌクレオチド配列であって、即ち24DT22ヌクレオチド配列である。

3、対照配列を含有するシロイヌナズナと大豆組換え発現ベクターDBN100301Nの構築 本発明の第2実施例中の1に記載の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターDBN01−Tを構築する方法に従って、対照配列(SEQ ID NO:8)で対照配列を含有する組換えクローンベクターDBN01R−Tを構築した。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターDBN01R−Tに挿入された対照配列は配列表でSEQ ID NO:8で示されるヌクレオチド配列であって、即ち、対照配列が正確に挿入された。

本発明の第2実施例中の2に記載の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターDBN100301を構築する方法に従って、対照配列で対照配列を含有する組換え発現ベクターDBN100301Nを構築し、そのベクター構造は図3に示す(ベクター骨格:pCAMBIA2301(CAMBIA機構が提供可能である)、Kan:カナマイシン遺伝子;RB:右境界;AtUbi10:シロイヌナズナUbiquitin(ユビキチン)10遺伝子プロモーター(SEQ ID NO:3);mN:対照配列(SEQ ID NO:8);Nos:ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ(SEQ ID NO:4);prCaMV35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(SEQ ID NO:5);PAT:グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子(SEQ ID NO:6);tCaMV35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネータ(SEQ ID NO:7);LB:左境界)。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100301Nに挿入された対照配列は配列表でSEQ ID NO:8で示されるヌクレオチド配列であって、即ち対照配列が正確に挿入された。

第3実施例、24DT21ヌクレオチド配列に移転したシロイヌナズナ植物の取得 1、組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム 既に正確に構築した組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)を、液体窒素法でアグロバクテリウムGV3101に転化し、その転化条件は、100μLアグロバクテリウムGV3101、3μLプラスミドDNA(組換え発現ベクター)である。液体窒素中に10分放置し、37℃温度で10分水浴する。転化後のアグロバクテリウムGV3101をLB試験管に接種し、温度28℃、回転速度が200rpmである条件で2時間培養し、50mg/Lのリファンピシン(Rifampicin)と50mg/Lのカナマイシンを含有するLB板に陽性モノクローナルが出るまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ SmaIとPstIでDBN100301を酵素切断した後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ SmaIと BglIでDBN100301N(対照配列)を酵素切断した後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)の構造は完全に正確であった。

2、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の取得 野生型シロイヌナズナ種子を0.1%(w/v)アガロース溶液に懸濁させる。懸濁した種子を4℃で2日保存して休眠の需要を満たし、種子の同期発芽を保証する。バーミキュライトを馬糞と混合し、湿るまで水で地下灌漑し、土壌混合物を24時間排出する。前処理後の種子を土壌混合物に植えて、保湿カバーで7日覆う。種子が発芽し、恒温(22℃)、恒湿(40〜50%)、光強度が120〜150μmol/m²秒である長日照条件(16時間光照射/8時間暗所)で温室で植物を培養した。初期はホーグランド栄養溶液で植物を灌漑し、その後はイオン交換水で灌漑し、土壌の湿りは保持するもののずぶぬれにしない。

花浸漬法でシロイヌナズナを転化する。選択したアグロバクテリウムコロニーで1部又は複数部の15−30mLのカナマイシン(50mg/L)とリファンピシン(10mg/L)含有YEP培養液の予備培養物を接種する。220rpmで培養物を28℃で一定速度で揺れ動きながら1夜孵化する。各予備培養物で2部の500mLのカナマイシン(50mg/L)とリファンピシン(10mg/L)含有YEP培養液の培養物を接種し、培養物を28℃で継続して揺れ動きながら1よる孵化する。室温で約8700×gで沈殿細胞に10分遠心処理し、得られた上清液を除去する。細胞沈殿を500mL浸透培地に軽く懸濁し、前記浸透培地は1/2×MS塩/B5ビタミン、10%(w/v)蔗糖、0.044μMベンジルアミノプリン(10μL/L(1mg/mL DMSO中の原液))と300μL/L Silvet L−77を含有する。約一ヶ月の植物を培地に15秒浸漬し、最新の花序を浸漬させる。次に、植物を側面倒して、24時間覆い(透明又は非透明)、その後水で洗浄して縦方向に置く。22℃で16時間光照射/8時間暗所の光周期で植物を培養した。約4週間浸漬した後種子を収穫した。

新しく収穫した(24DT22ヌクレオチド配列と対照配列)T₁種子を室温で7日乾燥した。種子を26.5×51cm発芽トレイに植えて、各トレイに200mgT₁種子(約10000個の種子)を植えていて、前記種子は予め40mL 0.1%(w/v)アガロース溶液に懸濁して4℃で2日保存して休眠の需要を満たして種子の同期発芽を保証した。

バーミキュライトに馬糞を混合し、湿るまで水で地下灌漑し、重力によって排水した。ピペットで前処理した後の種子(各40mL)を土壌混合物に均一に植えて、保湿カバーで4〜5日覆った。発芽後にグルホシネート(共同転化したPAT遺伝子を選択)を噴射し初期転化体を選択する1日前にカバーを除去する。

7日栽培後(DAP)、11DAPで再びDeVilbiss圧縮空ノズルで10mL/トレイ(703L/ha)の噴射体積用Liberty除草剤(200g ai/Lのグルホシネート)の0.2%溶液をT₁植物(それぞれ、子葉期と2〜4葉期である)に噴射し、毎回280g ai/ha有効量を適用したグルホシネートを提供した。最後に噴射した後、4〜7日後に生存したもの(成長が活躍である植物)を鑑定し、それぞれ馬糞とバーミキュライトからなる7cmx7cmの四角形鉢に移植した(鉢ごとに3〜5株)。保湿カバーで移植した植物を3〜4日覆い、22℃の培養室に放置するか、又は直接に温室に移動する。その後、カバーを除去し、24DT22遺伝子によるフェノキシオーキシン除草剤耐性の能力をテストする前の少なくとも1日前に植物を温室(22±5℃、50±30%RH、14時間光照射:10時間暗所、最小500μE/m²s¹天然+補充光)に移植した。

第4実施例、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の除草剤耐性効果の検出 24DT22遺伝子で第1回のシロイヌナズナ転化を行った。まず、グルホシネート選択方案で、未転化種子背景からT₁転化体を選択した。約20000個のT₁種子を選別し、314株T₁陽性形質転換体(PAT遺伝子)を鑑定した結果、約1.6%の転化率であった。24DT22ヌクレオチド配列に移入したシロイヌナズナT₁植物、対照配列に移入したシロイヌナズナT₁植物、野生型シロイヌナズナ植物(栽培した18日後)それぞれの2,4−Dジメチルアンモニウム塩とMCPAに対する除草剤耐性効果を検出した。

24DT22ヌクレオチド配列に移入したシロイヌナズナT₁植物、対照配列に移入したシロイヌナズナT₁植物、野生型シロイヌナズナ植物をそれぞれ、2,4−Dジメチルアンモニウム塩(560g ae/ha、1倍田畑濃度)、MCPA(560g ae/ha、1倍田畑濃度)、空白溶剤(水)で噴射した。噴射した7日と14日後に、植物の耐性状況を統計した:7日後の成長状況が空白溶剤(水)と一致するものを高抵抗植物と、7日後にロゼット葉曲げがあるものを中抵抗植物と、14日後にも抽出が不可能であるものを低抵抗植物と、14日後に死亡したものを不抵抗植物とした。各シロイヌナズナT₁植物が独立して転化したので、所定の使用量で各T₁による応答の明確な差異を予見できる。その結果を表1と図4に示す。

シロイヌナズナの場合、560g ae/ha 2,4−DとMCPAは、敏感植物と平均耐性レベルを有する植物とを区別する有効量であった。表1と図4の結果によると、24DT22遺伝子は個別のシロイヌナズナ植物に除草剤耐性を与え(ただ一部の植物が耐性を有する原因は、T₁の植物挿入部位がランダムであるので、耐性遺伝子の発現レベルが異なっていて、耐性レベルの差異を示す)、特に、フェノキシオーキシン除草剤の方が顕著である。野生型シロイヌナズナ植物と対照配列に移入したシロイヌナズナT₁植物は、いずれもフェノキシオーキシン除草剤耐性を有していない。

第5実施例、トランスジェニック大豆植物の取得及び検証 1、組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム 既に正確に構築された組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)を、液体窒素法でアグロバクテリウムLBA4404(Invitrgen、Chicago、USA、CAT:18313−015)に転化し、その転化条件は、100μLアグロバクテリウムLBA4404、3μLプラスミドDNA(組換え発現ベクター)である。液体窒素中に10分放置し、37℃温度で10分水浴した。転化後のアグロバクテリウムLBA4404をLB試験管に接種し、温度28℃、回転速度が200rpmである条件で2時間培養し、50mg/Lのリファンピシン(Rifampicin)と50mg/Lのカナマイシンを含有するLB板に、陽性モノクローナルが成長するまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ SmaIとPstIでDBN100301を酵素切断した後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ SmaIと BglIでDBN100301N(対照配列)を酵素切断した後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100301とDBN100301N(対照配列)の構造は完全に正確であった。

2、トランスジェニック大豆植物の取得 通常に利用されるアグロバクテリウム侵入法で、無菌培養した大豆種類中の黄13の子葉節組織を本実施例中の1に記載のアグロバクテリウムと共同培養し、第2実施例中の2と3で構築した組換え発現ベクターDBN100301やDBN100301N中のT−DNA(シロイヌナズナUbiquitin10遺伝子のプロモーター配列、24DT22ヌクレオチド配列、対照配列、Nosターミネータ、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネータを含む)を大豆染色体組に移入し、24DT22と対照ヌクレオチド配列に移入された大豆植物を得て、同時に、野生型大豆植物を対照物とした。

アグロバクテリウムが仲介した大豆の転化について、要約すると、成熟した大豆種子を大豆発芽培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、蔗糖20g/L、寒天8g/L、pH5.6)で発芽させ、種子を発芽培地に接種し、以下の条件で培養した:温度が25±1℃で、光周期(光/暗い)は16/8hである。発芽した4〜6日後に、新緑の子葉節で膨張した大豆無菌苗を取って、子葉節の下方の3〜4mmで胚軸を切って、子葉を縦方向に切断し、頂部芽、側面芽、種子根を除去した。解剖カットの峰で子葉節を傷つけ、アグロバクテリウム懸濁液を傷つけた子葉節組織に接触し、その中、アグロバクテリウムは前記24DT22ヌクレオチド配列を傷つけた子葉節組織に伝達することができ(工程1:侵入工程)、当該工程において、子葉節組織がアグロバクテリウム懸濁液(OD₆₆₀=0.5−0.8、侵入培地(MS塩2.15g/L、B5ビタミン、蔗糖20g/L、グルコース10g/L、アセトシリンゴン(AS)40mg/L、2−モルホリノ−エタンスルホン酸(MES)4g/L、ゼアチン(ZT)2mg/L、pH5.3)に浸漬されて接種を開始することが好ましい。子葉節組織をアグロバクテリウムと一定期間(3日)共同培養した(工程2:共同培養工程)。子葉節組織を、侵入工程後に固体培地(MS塩4.3g/L、B5ビタミン、蔗糖20g/L、グルコース10g/L、2−モルホリノ−エタンスルホン酸(MES)4g/L、ゼアチン2mg/L、寒天8g/L、pH5.6)で培養した。当該共同培養段階後に、選択的な「回復」工程を行うことが好ましい。「回復」工程において、回復培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、2−モルホリノ−エタンスルホン酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、ゼアチン(ZT)2mg/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、グルタミン酸100mg/L、アスパラギン酸100mg/L、pH5.6)には少なくとも1種類の、周知のアグロバクテリウム成長を抑制する抗生物質(セファロスポリン)が存在し、植物転化体の選択剤を添加しない(工程3:回復工程)。子葉節に再生した組織ブロックを、抗生物質はあるが選択剤はない固体培地で培養し、アグロバクテリウムを除去し、侵入細胞に回復期間を提供する。次に、子葉節に再生した組織ブロックを選択剤(グルホシネート)を含有する培地で培養し、成長中の転化カルス組織を選択する(工程4:選択工程)。子葉節に再生した組織ブロックを選択剤のある選別固体培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、2−モルホリノ−エタンスルホン酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、6−ベンジルアデニン(6−BAP)1mg/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、グルタミン酸100mg/L、アスパラギン酸100mg/L、グルホシネート6mg/L、pH5.6)で培養し、転化した細胞を選択的に成長させることが好ましい。その後、転化した細胞を植物に成長させ(工程5:再生工程)、ここで、選択剤を含有する培地で成長した子葉節に再生した組織ブロックを固体培地(B5分化培地とB5発根培地)で培養して植物を再生させることが好ましい。

選別して得た耐性組織ブロックを前記B5分化培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、2−モルホリノ−エタンスルホン酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、ゼアチン(ZT)1mg/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、グルタミン酸50mg/L、アスパラギン酸50mg/L、ジベレリン1mg/L、オーキシン1mg/L、グルホシネート6mg/L、pH5.6)に転移し、25℃で培養分化した。分化した苗を前記B5発根培地(B5塩3.1g/L、B5ビタミン、2−モルホリノ−エタンスルホン酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、寒天8g/L、セファロスポリン150mg/L、インドール−3−酪酸(IBA)1mg/L)に転移し、発根培地で、25℃で約10cm高さまで培養し、温室に移動して丈夫になるまで培養した。温室において、毎日26℃で16時間培養し、そして20℃で8時間培養した。

3、TaqManでトランスジェニック大豆植物を検証 24DT22ヌクレオチド配列に移入した大豆植物と、対照ヌクレオチド配列に移入した大豆植物の葉をそれぞれ約100mgとってサンプルとし、QiagenのDNeasy Plant Maxi KitでそのゲノムDNAを抽出し、Taqmanプローブ蛍光定量PCR方法で、PAT遺伝子コピー数を検出して、24DT22遺伝子のコピー数を確定した。同時に、野生型大豆植物を対照物とし、上記方法で検出分析を行った。実験を3回繰り返し、その平均値をとった。

PAT遺伝子コピー数を検出する具体的な方法は以下のとおりである:

工程11において、24DT22ヌクレオチド配列に移入した大豆植物、対照配列に移入した大豆植物、野生型大豆植物の葉をそれぞれ100mg取って、それぞれ、モルタル中で液体窒素を利用して均等質を形成し、各サンプルから3個選択して繰り返した。

工程12において、QiagenのDNeasy Plant Mini Kitを用いて、上記サンプルのゲノムDNAを抽出し、具体的な方法はその製品の説明書を参照することができる。

工程13において、NanoDrop 2000(Thermo Scientific)で上記サンプルのゲノムDNA濃度を測定した。

工程14において、上記サンプルのゲノムDNA濃度を同一の濃度値に調節し、前記濃度値の範囲は80〜100ng/μLである。

工程15において、Taqmanプローブ蛍光定量PCR方法で、サンプルのコピー数を鑑定し、鑑定を経てコピー数を分かったサンプルを基準とし、野生型大豆植物のサンプルを対照とし、各サンプルから3個選択して繰り返し、その平均値をとる。蛍光定量PCRプライマーとプローブ配列はそれぞれ以下のとおりである:

以下のプライマーとプローブでPATヌクレオチド配列を検出した: プライマー1:GAGGGTGTTGTGGCTGGTATTG、配列表でSEQ ID NO:11で示す; プライマー2:TCTCAACTGTCCAATCGTAAGCG、配列表でSEQ ID NO:12で示す; プローブ1:CTTACGCTGGGCCCTGGAAGGCTAG、配列表でSEQ ID NO:13で示す; PCR反応体系は以下のとおりである:

JumpStart(商標) Taq ReadyMix(商標) (Sigma) 10μL 50×プライマー/プローブ混合物 1μL ゲノムDNA 3μL 水(ddH₂O) 6μL 前記50×プライマー/プローブ混合物は、1mM濃度の各種プライマーを各45μL、100μM濃度のプローブ50μL、860μL 1×TE緩衝液を含み、4℃で、アンバー試験管に貯蔵されている。

PCR 反応条件は以下のとおりである:

工程 温度 時間 21 95℃ 5分 22 95℃ 30秒 23 60℃ 1分 24 工程22に戻る、40回繰り返す SDS2. 3ソフトウェア(Applied Biosystems)でデータを分析する。

PAT遺伝子コピー数を分析した実験結果、24DT22ヌクレオチド配列は全て、検出した大豆植物の染色体組に整合されていて、24DT22ヌクレオチド配列に移入した大豆植物と対照配列に移入した大豆植物もいずれも、シングルコピーのトランスジェニック大豆植物を取得した。

第6実施例、トランスジェニック大豆植物の除草剤耐性効果の検出 24DT22ヌクレオチド配列に移入した大豆植物、対照配列に移入した大豆植物、野生型大豆植物(幼苗期)それぞれの2,4−Dジメチルアンモニウム塩とMCPAに対する除草剤耐性効果を検出した。

24DT22ヌクレオチド配列に移入した大豆植物、対照配列に移入した大豆植物、野生型大豆植物をそれぞれとって、2,4−Dジメチルアンモニウム塩(2240g ae/ha、4倍田畑濃度)、MCPA(2240g ae/ha、4倍田畑濃度)、空白溶剤(水)で噴射した。それぞれ噴射してから6時間(6HAT)、2日(2DAT)、7日(7DAT)及び14日(14DAT)後に、葉の巻き程度と成長点ダメージ程度に基づいて、各植物の除草剤によるダメージ程度を統計した。ここで、葉が野生型のように平坦し、成長点が完璧であるものを0%と、葉が巻かれてしなびて成長点が死亡したものを100%とした。24DT22ヌクレオチド配列に移入したものは合計3個の株系(S1、S2、S3)、対照配列に移入したものは合計2個の株系(S4、S5)、野生型の(CK1)ものは合計1個の株系を選択した。各株系から10〜15株を選択してテストした。結果を表2及び図5に示す。

大豆の場合、2240g ae/ha 2,4−DとMCPAは、敏感植物と平均耐性レベルを有する植物とを区別する有効量である。表2と図5の結果によると、24DT22遺伝子はトランスジェニック大豆植物に高レベルの除草剤耐性を付与し、特に、フェノキシオーキシン除草剤の方が顕著である。野生型大豆植物と対照配列に移入した大豆T₁植物は、いずれもフェノキシオーキシン除草剤耐性を有していない。

第7実施例、コーン組換え発現ベクターの構築及び組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム 1、24DT22ヌクレオチド配列を含有するコーン組換え発現ベクターDBN100764の構築 制限エンドヌクレアーゼSpeIとKasIでそれぞれ、組換えクローンベクターDBN01−Tと発現ベクターDBNBC−02(ベクター骨格:pCAMBIA2301(CAMBIA機構が提供可能である))に酵素切断し、切断した24DT22ヌクレオチド配列断片を発現ベクターDBNBC−02のSpeIとKasI部位間に挿入し、通常の酵素切断方法でベクターを構築することは当業者にとって周知なものであって、発現ベクターDBNBC−02中のSpeIとKasIの酵素切断部位も、通常の酵素切断方法によるものであって、組換え発現ベクターDBN100764を構築し、その構築フローは図6に示す(Kan:カナマイシン遺伝子;RB:右境界;Ubi:コーンUbiquitin(ユビキチン)1遺伝子プロモーター(SEQ ID NO:9);24DT22:24DT22ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1);Nos:ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ(SEQ ID NO:4);PMI:リン酸マンノースメラーゼ遺伝子(SEQ ID NO:10); LB:左境界)。

組換え発現ベクターDBN100764を、ヒートショック法で大腸菌T1受容性細胞に転化し、そのヒートショック条件は、50μL大腸菌T1受容性細胞、10μLプラスミドDNA(組換え発現ベクターDBN100764)、42℃で30秒水浴する。37℃で1時間振動培養した(回転速度100rpmでシェーカーで揺れ動く)。その後、50mg/Lカナマイシン(Kanamycin)を含有するLB固定板(トリプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、NaCl10g/L、寒天15g/L、NaOHでpHを7.5まで調節した)上で、温度37℃の条件で12時間培養し、白色コロニーを選択し、LB液体培地(トリプトン10g/L、酵母抽出物5g/L、NaCl10g/L、スペクチノマイシン50mg/L、NaOHでpHを7.5まで調節した)で、温度37℃の条件で一夜培養した。そのプラスミドをアルカリ抽出した。抽出したプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼSpeIとKasIで酵素切断して鑑定し、陽性クローンに測定鑑定を行った結果、組換え発現ベクターDBN100764は、SpeIとKasI部位間のヌクレオチド配列が配列表でSEQ ID NO:1で示すヌクレオチド配列であって、即ち24DT22ヌクレオチド配列であった。

2、対照配列を含有するコーン組換え発現ベクターDBN100764Nの構築 本発明の第2実施例中の1に記載の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターDBN01−Tを構築する方法に従って、対照配列(SEQ ID NO:8)を利用して、対照配列を含有する組換えクローンベクターDBN02R−Tを構築した。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターDBN02R−Tに挿入された対照配列は配列表でSEQ ID NO:8で示されるヌクレオチド配列であって、即ち対照配列が正確に挿入された。

本発明の本実施例中の1に記載の24DT22ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターDBN100764を構築する方法に従って、対照配列を利用して、対照配列を含有する組換え発現ベクターDBN100764Nを構築し、そのベクター構造は図7に示す(ベクター骨格:pCAMBIA2301(CAMBIA機構が提供可能である);Kan:カナマイシン遺伝子;RB:右境界;Ubi:コーンUbiquitin(ユビキチン)1遺伝子プロモーター(SEQ ID NO:9);mN:対照配列(SEQ ID NO:8);Nos:ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ(SEQ ID NO:4);PMI:リン酸マンノースメラーゼ遺伝子(SEQ ID NO:10);LB:左境界)。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100764Nに挿入された対照配列は配列表でSEQ ID NO:8で示されるヌクレオチド配列であって、即ち対照配列が正確に挿入された。

3、コーン組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム 既に正確に構築された組換え発現ベクターDBN100764とDBN100764N(対照配列)を、液体窒素法でアグロバクテリウムLBA4404(Invitrgen、Chicago、USA、CAT:18313−015)に転化し、その転化条件は、100μLアグロバクテリウムLBA4404、3μLプラスミドDNA(組換え発現ベクター)である。液体窒素中に10分放置し、37℃温度で10分水浴した。転化後のアグロバクテリウムLBA4404をLB試験管に接種して温度28℃、回転速度200rpmの条件で2時間培養し、50mg/Lのリファンピシン(Rifampicin)と50mg/Lのカナマイシンを含有するLB板に陽性モノクローナルが成長するまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼSmaIとEcoRVでDBN100764に酵素切断を行った後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ StyIとBglIでDBN100764N(対照配列)に酵素切断を行った後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターDBN100764とDBN100764N(対照配列)の構造は完全に正確であった。

第8実施例、24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物の取得及び検証 通常に利用されるアグロバクテリウム侵入法で、無菌培養したコーン種類中の綜31(Z31)の未熟胚を第7実施例中の3に記載のアグロバクテリウムと共同培養し、第7実施例中の1と2で構築した組換え発現ベクターDBN100764とDBN100764N(対照配列)中のT−DNA(コーンUbiquitin1遺伝子のプロモーター配列、24DT22ヌクレオチド配列、対照配列、PMI遺伝子、Nosターミネータ配列を含む)をコーン染色体組に移入して、24DT22ヌクレオチド配列を移入したコーン植物と対照配列に移入したコーン植物を取得した。同時に野生型コーン植物を対照物とした。

アグロバクテリウムが仲介したコーン転化について、要約すると、コーンから未成熟の未熟胚を分離し、アグロバクテリウム懸濁液を未熟胚に接触させ、その中、アグロバクテリウムは24DT22ヌクレオチド配列を未熟胚の中の少なくとも一つの細胞に伝達できる(工程1:侵入工程)。当該工程において、未熟胚がアグロバクテリウム懸濁液(OD₆₆₀=0.4−0.6、侵入培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、蔗糖68.5g/L、グルコース36g/L、アセトシリンゴン(AS)40mg/L、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)1mg/L、pH5.3))に優先して侵入して接種を開始する。未熟胚をアグロバクテリウムと一定期間(3日)共同培養した(工程2:共同培養工程)。未熟胚を、侵入工程後に、固体培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、蔗糖20g/L、グルコース10g/L、アセトシリンゴン(AS)100mg/L、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)1mg/L、寒天8g/L、pH5.8)で培養することが好ましい。当該共同培養段階後に、選択的な「回復」工程を行うことが好ましい。「回復」工程において、回復培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、蔗糖30g/L、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)1mg/L、植物ゲル3g/L、pH5.8)には少なくとも1種類の、周知のアグロバクテリウム成長を抑制する抗生物質(セファロスポリン)が存在し、植物転化体の選択剤を添加しない(工程3:回復工程)。未熟胚を、抗生物質はあるが選択剤はない固体培地で培養し、アグロバクテリウムを除去し、侵入細胞に回復期間を提供する。次に、接種した未熟胚を選択剤(マンノース)を含有する培地で培養し、成長中の転化カルス組織を選択する(工程4:選択工程)。未熟胚を選択剤のある選別固体培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、蔗糖30g/L、マンノース12.5g/L、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)1mg/L、植物ゲル3g/L、pH5.8)で培養して、転化した細胞を選択的に成長させることが好ましい。その後、カルス組織を植物に成長させ(工程5:再生工程)、ここで、選択剤を含有する培地で成長したカルス組織を固体培地(MS分化培地とMS発根培地)で培養して植物を再生させることが好ましい。

選別して得た耐性カルス組織を前記MS分化培地(MS塩4.3g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、蔗糖30g/L、6−ベンジルアデニン2mg/L、マンノース5g/L、植物ゲル3g/L、pH5.8)に転移し、25℃で培養分化した。分化された苗を前記MS発根培地(MS塩2.15g/L、MSビタミン、カゼイン300mg/L、蔗糖30g/L、インドール−3−酢酸1mg/L、植物ゲル3g/L、pH5.8)に転移し、25℃で約10cm高さまで培養し、温室に移動して丈夫になるまで培養した。温室において、毎日28℃で16時間培養し、その後20℃で8時間培養した。

2、TaqManで24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物を検証 24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物と、対照配列に移入したコーン植物の葉をそれぞれ約100mgとってサンプルとし、QiagenのDNeasy Plant Maxi KitでそのゲノムDNAを抽出し、Taqmanプローブ蛍光定量PCR方法でPMI遺伝子コピー数を検出して、24DT22遺伝子のコピー数を確定した。同時に、野生型コーン植物を対照とし、上記方法で検出分析を行った。実験を3回繰り返し、その平均値をとった。

PMI遺伝子コピー数を検出する具体的な方法は以下のとおりである:

工程31において、24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、対照配列に移入したコーン植物、野生型コーン植物の葉をそれぞれ100mgとって、それぞれ、モルタル中で液体窒素を利用して均等質を形成し、各サンプルから3個選択して繰り返した。

工程32において、QiagenのDNeasy Plant Mini Kitで上記サンプルのゲノムDNAを抽出し、具体的な方法は製品説明書を参照することができる。

工程33において、NanoDrop 2000(Thermo Scientific)で上記サンプルのゲノムDNA濃度を測定した。

工程34において、上記サンプルのゲノムDNA濃度を同一の濃度値に調節し、前記濃度値の範囲は80〜100ng/μLである。

工程35において、Taqmanプローブ蛍光定量PCR方法でサンプルのコピー数を鑑定し、鑑定を経てコピー数を分かったサンプルを基準とし、野生型コーン植物のサンプルを対照とし、各サンプルから3個選択して繰り返し、その平均値をとった。蛍光定量PCRプライマーとプローブ配列はそれぞれ以下のとおりである:

以下のプライマーとプローブでPMIヌクレオチド配列を検出した: プライマー3:GCTGTAAGAGCTTACTGAAAAAATTAACA、配列表でSEQ ID NO:14で示す; プライマー4:CGATCTGCAGGTCGACGG、配列表でSEQ ID NO:15で示す; プローブ2:TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCC、配列表でSEQ ID NO:16で示す; PCR反応体系は以下のとおりである:

JumpStart(商標) Taq ReadyMix(商標) (Sigma) 10μL 50×プライマー/プローブ混合物 1μL ゲノムDNA 3μL 水(ddH₂O) 6μL 前記50×プライマー/プローブ混合物は、1mM濃度の各種プライマーを各45μL、100μM濃度のプローブ50μL、860μL 1×TE緩衝液を含み、4℃で、アンバー試験管に貯蔵されている。

PCR 反応条件は以下のとおりである:

工程 温度 時間 41 95℃ 5分 42 95℃ 30秒 43 60℃ 1分 44 工程42に戻る、40回繰り返す SDS2. 3ソフトウェア(Applied Biosystems)でデータを分析した。

PAT遺伝子コピー数を分析した実験結果、24DT22ヌクレオチド配列は全て、検出したコーン植物の染色体組に整合されていて、24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物と対照配列に移入したコーン植物もいずれも、シングルコピーのトランスジェニックコーン植物を取得した。

第9実施例、トランスジェニックコーン植物の除草剤耐性効果の検出 24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、対照配列に移入したコーン植物、野生型コーン植物(V3−V4時期)それぞれの、2,4−Dジメチルアンモニウム塩とMCPAに対する除草剤耐性効果を検出した。

24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、対照配列に移入したコーン植物、野生型コーン植物をそれぞれ、2,4−Dジメチルアンモニウム塩(8960g ae/ha、16倍田畑濃度)、MCPA(8960g ae/ha、16倍田畑濃度)、空白溶剤(水)で噴射した。噴射してから21日後に、支持根の発育状況を統計した。24DT22ヌクレオチド配列に移入したものは合計3個の株系(S6、S7、S8)、対照配列に移入したものは合計2個の株系(S9、S10)、野生型の(CK2)ものは合計1個の株系を選択した。各株系から10〜15株を選択してテストした。結果を表3に示す。

表3によると、24DT22遺伝子はトランスジェニックコーン植物に除草剤の高レベル耐性を付与し、特に、フェノキシオーキシン除草剤の方が顕著である(単子葉植物自体がフェノキシオーキシン除草剤に一定の耐性を有するので、高レベル耐性を示した)。野生型コーン植物と対照配列に移入したコーン植物はいずれも高レベルのフェノキシオーキシン除草剤耐性を有していない。

上述のように、24DT22ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、大豆植物、シロイヌナズナ植物はいずれも、高い除草剤耐性能力を有する。本発明の24DT22除草剤耐性遺伝子は、植物の好みのコドンを利用し、本発明の除草剤耐性遺伝子が植物での発現に特別に適合し、本発明の24DT22除草剤耐性タンパク質は除草剤に対する耐性が広く、特に、フェノキシオーキシン除草剤に対して耐性を有する。

最後に、以上の実施例は本発明の技術案を制限するものではなく説明するものであって、好適な実施例を参照して本発明を詳しく説明しているが、本発明の技術案の精神や範囲を離脱せずに本発明の技術案に修正又は同等交換を行うことができることは当業者が理解できることである。