Xanthomonas抵抗性のBrassica oleracea植物

本発明は農業の分野に関するものであり、さらに具体的にはXanthomonas campestris pv.campestrisに対する改善された抵抗性を示すBrassica oleracea植物を生産する方法及び組成物に関する。

配列表の組込み Microsoft Windows基本ソフトで測定したとき10キロバイトであり、2016年9月29日に作り出された「SEMB024USP1_ST25.txt」と名付けたファイルに含有されている配列表はここに電子出願し、参照によって本明細書に組み入れられる。

病害抵抗性は、農業において、特に食用作物の生産にとって重要な形質である。Brassicaでは病害抵抗性対立遺伝子が特定されているが、栽培品種の系統にこれらの対立遺伝子を導入する試みは、その対立遺伝子に連鎖する特異的なマーカーの欠如、許容できない植物品質をもたらす連鎖引きずり及びスペクトルの広い抵抗性の欠如によって妨げられている。植物の育種法におけるマーカー利用選抜(MAS)の使用によって対象とする形質に連鎖する遺伝子マーカーに基づいて植物を選抜することが可能になっている。しかしながら、形質に関連する遺伝子が特徴付けられているとしても、植物における望ましい形質を特定し、または追跡するための正確なマーカーは利用できないことが多い。これらの困難さは、たとえば、ポリジーン遺伝または量的遺伝、エピスタシス、及び多くは所望の表現型の表現の根底にある遺伝的背景の不完全な理解のような因子によってさらに複雑にされている。

本発明は、遺伝子移入を欠いている植物に比べてXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与するBrassica oleracea var.capitataの第3染色体由来の遺伝子移入を含むBrassica oleracea植物の栽培品種を提供し、その際、抵抗性は共優性であり、且つ相加的である。特定の実施形態では、遺伝子移入は、植物の生育遅延を付与するものに遺伝的に連鎖した対立遺伝子を欠く。さらなる実施形態では、遺伝子移入は、植物にてマーカーNH0265157(配列番号5)及びマーカーNH0266951(配列番号12)が隣接するBrassica oleracea var.capitataに由来する染色体セグメントを含む。他の実施形態では、遺伝子移入は、植物においてマーカーNH0265597(配列番号11)にてBrassica oleracea var.capitataに由来する染色体セグメントを含む。追加の実施形態では、遺伝子移入は約2cM以下のサイズである。さらに他の実施形態では、植物は遺伝子移入についてホモ接合体である。追加の実施形態では、遺伝子移入を含む種子の試料はATCC受入番号PTA−123409のもとで寄託された。

特定の態様では、スペクトルの広い抵抗性は複数のXanthomonas campestris pv.campestris病原型に対する抵抗性を含む。一例については、スペクトルの広い抵抗性はXanthomonas campestris pv.campestris病原型1及び4に対する抵抗性を含む。別の例については、スペクトルの広い抵抗性はXanthomonas campestris pv.campestris病原型1、4、6及び9に対する抵抗性を含む。他の実施形態では、植物は、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、またはポルトガルキャベツの植物である。さらに他の実施形態では、植物は白キャベツ植物ではない。

本発明はさらに、遺伝子移入を欠いている植物に比べてXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与するBrassica oleracea var.capitataの第3染色体由来の遺伝子移入を含むBrassica oleracea植物の栽培品種を生産する種子を提供し、その際、抵抗性は共優性であり、且つ相加的である。本発明はまた、遺伝子移入を欠いている植物に比べてXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与するBrassica oleracea var.capitataの第3染色体由来の遺伝子移入を含むBrassica oleraceaの栽培品種に由来する植物部位を提供し、その際、抵抗性は共優性であり、且つ相加的である。特定の実施形態では、植物部位は、細胞、種子、根、茎、葉、頭花、花または花粉である。

加えて、本発明は、マーカーNH0265157(配列番号5)及びマーカーNH0266951(配列番号12)が隣接するBrassica oleracea var.capitataに由来する染色体セグメントを含む遺伝子移入断片、マーカーNH0265597(配列番号11)におけるBrassica oleracea var.capitataに由来する染色体セグメントを含む遺伝子移入断片、及び断片がXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与し、植物の生育遅延を付与するものに遺伝的に連鎖した対立遺伝子を欠くBrassica oleracea var.capitataに由来する染色体セグメントを含む遺伝子移入断片を提供する。

本発明はまた、遺伝子移入を欠いている植物に比べてXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与するBrassica oleracea var.capitataの第3染色体由来の遺伝子移入を含むブロッコリー植物またはカリフラワー植物を提供し、その際、抵抗性は共優性であり、且つ相加的である。

本発明はさらに、遺伝子移入を欠いている植物に比べてXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与するBrassica oleracea var.capitataの第3染色体に由来する染色体セグメントを植物品種に遺伝子移入することを含む、Xanthomonas campestris pv.campestrisに対する改善された抵抗性を持つBrassica oleracea植物の栽培品種を生産する方法を提供し、その際、抵抗性は共優性であり、且つ相加的である。特定の実施形態では、遺伝子移入することは、染色体セグメントを含む植物をそれ自体とまたは異なる遺伝子型の第2のBrassica oleracea植物と交配して1つ以上の子孫植物を生産することと、染色体セグメントを含む子孫植物を選択することとを含む。特定の実施形態では、子孫植物を選択することは、マーカーNH0265157(配列番号5)及びマーカーNH0266951(配列番号12)が隣接する少なくとも1つの対立遺伝子を検出することを含む。他の実施形態では、子孫植物を選択することは、マーカーNH0265597(配列番号11)にて少なくとも1つの対立遺伝子を検出することを含む。さらなる実施形態では、子孫植物はF2〜F6の子孫植物である。選択された実施形態では、交配は戻し交配を含む。追加の実施形態では、戻し交配は2〜7世代の戻し交配を含む。

特定の実施形態では、植物品種はブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、またはポルトガルキャベツの植物品種である。他の実施形態では、抵抗性は複数のXanthomonas campestris pv.campestris病原型に対する抵抗性を含む。さらに他の実施形態では、抵抗性はXanthomonas campestris pv.campestris病原型1及び4に対する抵抗性を含む。さらに他の実施形態では、抵抗性はXanthomonas campestris pv.campestris病原型1、4、6及び9に対する抵抗性を含む。追加の実施形態では、染色体セグメントを含む種子の試料は、ATCC受入番号PTA−123409のもとで寄託された。

本発明はさらに、遺伝子移入を欠いている植物に比べてXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与するBrassica oleracea var.capitataの第3染色体に由来する染色体セグメントを植物品種に遺伝子移入することによって作出される、Xanthomonas campestris pv.campestrisに対する改善された抵抗性を持つBrassica oleracea植物の栽培品種を提供し、その際、抵抗性は共優性であり、且つ相加的である。本発明はまた、遺伝子移入を欠いている植物に比べてXanthomonas campestris pv.campestrisに対するスペクトルの広い抵抗性を付与するBrassica oleracea var.capitataの第3染色体に由来する遺伝子移入された染色体セグメントを含む、Xanthomonas campestris pv.campestrisに対する改善された抵抗性を持つBrassica oleracea植物またはその一部を得ることと、植物またはその一部から食料または飼料を生産することとを含む、食料または飼料を生産する方法も提供し、その際、抵抗性は共優性であり、且つ相加的である。

正常な生育及び遅延した生育の植物の例を示す図である。遅延した生育の植物はさらに小さく、大抵紫色の葉を有する。

C517のQTLが2cMのスケールで特定され、マーカーがQTL領域(5cM)で提供されることを示す図である。植物材料をスクリーニングするのに使用されるマーカーを矢印で示す。

植物の総重量と抵抗性との間の相関を示す図である。植物の総重量の平均をX軸上に提供し、Xccに対する平均抵抗性をY軸上に提供する。Xccに対する抵抗性は1(=抵抗性)〜9(=感受性)のスケールで測定し、植物の総重量はキログラム(kg)で測定する。最も密接に連鎖しているマーカーはこれらの系統で分離した。プラスはホモ接合体の抵抗性を示し、マイナスはホモ接合体の感受性を示し、点はヘテロ接合体の系統を示す。グラフの右上角の黒点はBRL51−99の系統である。右下の丸の中の植物は高レベルの抵抗性を持ち、植物重量に対する連鎖引きずりのない系統を示す。

黒斑病はXanthomonas campestris pv.campestris(Xcc)が原因で起きる十字花植物の細菌性の病気である。Xccは発生している種子の直接感染によって伝染する。Xccは広い地理的地域にわたって存在し、特に収量及び品質を下げることによってBrassica oleraceaの栽培品種に影響を及ぼす。黒斑病またはXccは、芽キャベツ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー及び緑葉カンランを含むが、これらに限定されないBrassica oleraceaの栽培品種において著しい経済的損害を引き起こす。Brassica oleraceaの抵抗性の品種を開発する及びBrassica oleraceaの栽培品種に抵抗性の遺伝子を組み込む以前の多数の試みがあるが、これらのどれを上手く使用してもB.oleraceaの栽培品種にてスペクトルの広い抵抗性は得られていないし、特にブロッコリー及びカリフラワーで抵抗性が提供されていない。

Xanthomonas campestris pv.campestrisの病原型または種類の分類は、種類または病原型の分類及び数における幾つかの多様性によって種々のグループにより行われている。Xccの少なくとも7つの病原型が特定されている:Vicente,et al.,Phytopathology,91:492−499,2001;Fargier and Manceau,Plant Pathology,56:805−818,2007;Jensen,et al.,Plant Disease,94:298−305,2010。これらの病原型は1つの優性の病原型と同時に生じることが多いであろう。種類1及び4は主に重要なものと見なされている。抵抗性の対立遺伝子、好ましくは単一遺伝子を特定すること及び対立遺伝子にとって2種類を超えるXccに対して抵抗性を提供することが重要である。加えて、複数の種類のXccに対して抵抗性(「スペクトルの広い抵抗性」)を有するBrassica oleracea植物の栽培品種を開発するのに使用することができる対立遺伝子を特定することが重要である。複数の種類のXccに対して抵抗性(「スペクトルの広い抵抗性」)を有するブロッコリー及びカリフラワーの栽培品種を開発するのに使用することができる対立遺伝子を特定することが特に重要である。

本発明は、Xccの少なくとも2つの病原型、さらに詳しくは少なくとも病原型1及び4に対して抵抗性を提供する単一の抵抗性QTLを提供するという点で重大な進歩を表す。このQTLはBrassica oleraceaの栽培品種の優良系統に遺伝子移入することができる。これらの品種には、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、またはポルトガルキャベツの栽培品種を挙げることができるが、これらに限定されない。加えて、本発明は、関連遺伝子座を欠いている植物に比べて生育遅延を付与する関連遺伝子のない抵抗性遺伝子座を提供する。そのような生育遅延には、速度の遅い植物生育と同様に成熟植物全体のサイズの低下が挙げられてもよい。

多数のグループがB.oleraceaの栽培品種にて抵抗性を提供するのに使用することができる、Xccに対する抵抗性のための供給源を特定することを試みているが、育種家達は、他の類型のB.oleraceaの商業上許容できる品種に抵抗性を上手く移すことはできていないし、またはXccの複数の病原型に対する抵抗性を持つ品種を得ることができていない。少なくとも種類1及び4に対する抵抗性を有するB.oleraceaの供給源は特定されていない。さらに、単一の共優性の相加対立遺伝子は特定されていない。そのようなものとして、本発明は、B.oleraceaの栽培品種、特にブロッコリー及びカリフラワーに組み込むことができるスペクトルの広い抵抗性を提供する新規の対立遺伝子を提供する。

多重抵抗性遺伝子座はキャベツで特定されている(Brassica oleracea var.capitata;Camargo,et al.,Genetics,85:1296−1300,1995(“Carmargo,1995”);Camargo,et al.,The Journal of Heredity,88:57−60,1997(“Carmargo,1997”))。Camargoら,1995年によって報告されたQTLは別々の連鎖群で当初特定された。しかしながら、Camargo、1997年の公開されたマップからのデータを用いたこれらのデータのその後の解析によってこれら2つのQTLは連鎖している(30cMの距離)ことが明らかにされた。2つの遺伝子座は連鎖しているので、育種家達は最も抵抗性の植物を選抜する過程で、抵抗性遺伝子座だけでなく、園芸学上及び商業上許容できない類型のBrassica oleraceaをもたらす、間にある望ましくない領域も供与側キャベツ植物から受入側植物に移している。この領域は戻し交配からの選抜の間に取り除かれない。加えて、2つの劣性抵抗性遺伝子座もキャベツで特定されている(米国特許第9,000,258号)。しかしながら、有効な抵抗性表現型を得るにはこれら抵抗性対立遺伝子の双方が存在しなければならない。

複数のXcc単離体(Taylor,2002)に抵抗性であるBrassica oleracea宿主が特定されているが、これらの抵抗性はあまり一般的ではない種類に限定されることが見いだされており、どれも種類1及び4に対する抵抗性を提供していない。他の場合では、抵抗性は部分的であり、且つ定量的であることが見いだされた(Lema,et al.,Plant Breeding 131:607−613,2012(“Lema,2012”))。種類に特異的ではない抵抗性はそのそれぞれが小さな効果を有する種々の遺伝子の組み合わせ作用に左右される。従って、これらの抵抗性は管理し、品種間で移行させるのが難しい。出版物のほとんどが、抵抗性は遺伝子対遺伝子モデルに従い、提供される抵抗性は種類に特異的であると結論付けている。それぞれの異なる抵抗性遺伝子は1つの病原型に対して抵抗性を提供すると一般に考えられている。Saha,et al.(Plant Breeding,133:268−274,2014)はカリフラワー供給源から単一の優性の抵抗性QTLを特定した。しかしながら、これは種類1に対してのみ抵抗性を有することが示された。

本発明の単一の抵抗性QTLは第3染色体(O3)にて特定された。特定された当初の抵抗性対立遺伝子は生育遅延植物型遺伝子座と堅く関連することが見いだされた。しかしながら、本発明はまた連鎖を壊す小さな遺伝子移入断片も提供する。驚くべきことに有害な生育遅延植物型を欠いている組換え染色体断片を生成できることが見いだされた。マーカー利用育種法を用いて組換え遺伝子移入断片を特定し、生成された遺伝子移入断片は約2センチモルガン(cM)のサイズを有した。この染色体セグメントのマッピングはXanthomonas抵抗性のためのQTLがマーカーNH0265597(76.45cM)に位置することを見いだした。さらに、QTLにはマーカーNH0265157(74.98cM)及びNH0266951(77.14cM)が隣接する。このQTLは、有害な生育遅延植物型がない状態で、病原型1及び4を含む幾つかの異なるXccの病原型に対して抵抗性を生じる。

組換え遺伝子移入に基づく抵抗性は相加的である。従って、交雑植物において、特に商業的な交雑種についてはQTLがホモ接合性であることが好ましい。他の関連対立遺伝子のホモ接合性の存在が有害な劣性形質の発現を生じ得るので、Xanthomonas抵抗性を含む最小の遺伝子移入断片を使用することも一般に好ましい。

本発明によって提供される組換え遺伝子移入は、幾つかの分類されていない単離体と共に現在流行している病原型1、4、6及び7を含む種々の異なる病原型に対する抵抗性を提供することが示されている。世界中の地域から特定されたBrassica oleracea作物(ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ)に由来する157のXcc単離体に対して抵抗性QTLを調べた。科学界では現在の標準であるVicente、2001の改善された差異植物シリーズを用いて単離体を分類し、単離体のほとんどは病原型グループ1、4、6及び9に分類することができた。しかしながら、単離体の一部は分類することができなかった。Vicenteの差異セットは様々なBrassica植物の種から成り、適合性(感受性)及び非適合性(抵抗性)の相互作用に基づく病原型の区別を可能にする。従って、このセットを用いて本発明によって付与されるスペクトルの広い病害抵抗性を表現型で確認することができる。

I.Brassica oleracea植物 Brassicaは、brassicaceae(以前はcruciferaeと呼ばれた)の科の植物の属である。この属のメンバーはキャベツまたはカラシとしても知られる。Brassica属は多数の商業上及び農業上重要な種を含む。これらの種すべてのうちでBrassica oleraceaは、ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、及びポルトガルキャベツを含む少なくとも10種の異なる商業上の栽培品種を含有する最も多様なものである。これらの類型の間での繁殖は、これらの類型が表現型上高度に多様である一方で、遺伝的な種の壁を克服する必要もなく異なる類型間の交配を行うことができることを意味する同一種であるので、一般的であり、且つ容易に行われる。しかしながら、特に(遺伝的に)遠い品種間で交配する(たとえば、キャベツとブロッコリーまたはカリフラワーとの交配)場合、品種間交配については重大な連鎖引きずりが依然として発生し得る。従って、種の壁が存在しないことはあらゆる品種間で行われる交配を可能にする一方で、連鎖引きずりがそのような交配に関連する可能性がある。

II.Brassica oleracea植物における黒斑病(Xcc)抵抗性に関連するゲノム領域、対立遺伝子及び多型 黒斑病は、Xanthomonas campestris pv.campestris(Xcc)が原因で起きるBrassica oleraceaにおける細菌性の病気である。黒斑病抵抗性の幾つかの供給源は特定されているが、この抵抗性はBrassica oleraceaの栽培品種、特にブロッコリー及びカリフラワーには上手く移行されていない。加えて、単一の共優性の相加QTLはこれまでに特定されていない。

従って、所望の黒斑病(Xcc)抵抗性を付与する特異的なゲノム領域を特定することが望ましい。単一遺伝子による抵抗性を提供すること及びさらに耐久性の抵抗性を有する遺伝子を提供することも望ましい。そのような領域は有害形質に関連する対立遺伝子を含むべきではない。加えて、単一遺伝子に関連する抵抗性は育種の間に破壊される可能性が低く、さらに耐久性の抵抗性を生じる。本明細書で特定されている遺伝子移入または低下した遺伝子移入サイズによる遺伝子移入はこれまでに達成されていない。さらに、抵抗性に密接に連鎖する有効なマーカーは記載されていない。

本発明の遺伝子マーカー及びアッセイを用いて、驚くべきことに本出願者らは、公知のキャベツ系統C517と優良なブロッコリー系統(BRL51−99sc)との間での交配で特定されたBrassica oleracea var.capitataから新規のXcc抵抗性領域を特定することができた。この遺伝子移入のマッピングによってXcc抵抗性のQTLはマーカーNH0265597(76.4cM)に位置し、マーカーNH0265157(74.98cM)及びNH0266951(77.14cM)が隣接することが示された。当業者は、区間値は、たとえば、使用される参照マップ、配列決定範囲及びアセンブリソフトウエアの設定のような因子に基づいて変化してもよいことを理解するであろう。しかしながら、そのようなパラメータ及びマッピングのプロトコールは当該技術で既知であり、当業者は本明細書で提供されるマーカー配列を使用して、本明細書に記載されている遺伝子移入をそのような方法を用いた所与のマップに物理的に且つ遺伝的に固定することができる。本発明の新規の遺伝子移入は、以前開示されたXcc抵抗性の遺伝子移入を超える独特の著しく改善された農学上の特性を付与する。

III.病害抵抗性に関連するゲノム領域の遺伝子移入 マーカー利用の遺伝子移入には、1つ以上のマーカーによって定義される染色体領域の第1の遺伝的背景から第2の遺伝的背景への移行が関与する。遺伝子移入されたゲノム領域を含有する交配の子孫は、第1の遺伝的背景に由来する所望の遺伝子移入されたゲノム領域に特徴的であるマーカーと、第2の遺伝的背景に特徴的である連鎖した及び連鎖していないマーカー双方との組み合わせによって特定することができる。

本発明は、本明細書で開示されているキャベツ系統C517(公開された供給源)と優良なブロッコリー系統(BRL51−99sc)との間での交配で当初特定されたBrassica oleracea var.capitataに由来するゲノム領域の1つ以上の栽培されたBrassica oleracea系統への遺伝子移入を特定し、追跡するための新規のマーカーを提供する。本発明はさらに、マーカーNH0265597(76.45cM)、NH0265157(74.98cM)及びNH0266951(77.14cM)を含む、植物育種の間に本明細書で開示されている新規の遺伝子移入を特定し、追跡するためのマーカーを提供する。

本発明のゲノム範囲のいずれかの範囲内でのまたはいずれかに連鎖したマーカーは、病害抵抗性に関連するゲノム領域の所望の遺伝的背景への遺伝子移入を含む種々の育種の試みで使用することができる。たとえば、本明細書に記載されている病害抵抗性に関連するマーカーの20cM、15cM、10cM、5cM、2cM、または1cMの範囲内でのマーカーは、耐病性の表現型に関連するゲノム領域のマーカー利用遺伝子移入に使用することができる。

残りのゲノム配列の少なくとも10%、25%、50%、75%、90%または99%が遺伝資源に特徴的なマーカーを保有する所望の表現型に関連する1つ以上の遺伝子移入領域を含むBrassica oleracea植物も提供される。本明細書で提供され、且つXcc病害抵抗性に関連するゲノム領域及びマーカーに密接に連鎖するまたは隣接する領域を含む遺伝子移入された領域を含むBrassica oleracea植物も提供される。

IV.病害抵抗性Brassica oleracea品種の開発 ほとんどの育種目的については、商業育種家は「栽培種」または「優良」である遺伝資源の範囲内で作業する。この遺伝資源は、園芸上の実績で評価すると一般に上手く行くので、育種し易い。ブロッコリー、カリフラワー、発芽ブロッコリー、芽キャベツ、白キャベツ、赤キャベツ、サボイキャベツ、カーリーケールキャベツ、カブカンラン、またはポルトガルキャベツを含むが、これらに限定されない多数の優良なBrassica oleracea作物の栽培品種(品種)が開発されている。しかしながら、栽培されたまたは優良な遺伝資源が提供する実績の利点は対立遺伝子多様性の欠如によって相殺することができる。遺伝的に多様性の供給源で育種する場合よりも栽培された材料で作業する場合の方が進行は速いので、育種家はこの矛盾を一般に受け入れる。

連鎖引きずりまたは低い遺伝率による課題を回避しながら、望ましい抵抗性遺伝子を非栽培系統から優良な栽培系統に遺伝子移入する過程は、長く、達成が難しいことが多い過程である。従って、野生型近縁種に由来する対立遺伝子を展開することにおける成功は、有害効果を欠く最小限のまたは切り詰めた遺伝子移入及び表現型選抜に取って代わる信頼できるマーカーアッセイに強く依存する。成功はさらに、病害抵抗性のような量的形質についての遺伝獲得量に焦点を当てることができる重要な特質について遺伝学的特徴を簡略化することによって定義される。さらに、非栽培系統からのゲノム領域を遺伝子移入する過程は、情報伝達マーカーの利用性によって大きく促進することができる。

従って当業者は、本発明によって提供される対立遺伝子、多型及びマーカーは、Brassica oleracea種を交配することができる任意の遺伝的背景への本明細書で特定されるゲノム領域のいずれか追跡及び導入を可能にすることを理解することになる。加えて、本明細書で開示されている病害抵抗性に関連するゲノム領域は1つの遺伝子型から別の遺伝子型に遺伝子移入することができ、表現型でまたは遺伝的に追跡することができる。従って、病害抵抗性の選抜のための本出願者らの開発マーカーは有益な表現型を有するBrassica oleracea植物の開発を促進する。たとえば、所望の病害抵抗性を含む品種を開発するために、本発明のマーカーを用いて植物及び種子の遺伝子型を決定することができる。さらに、マーカー利用選抜(MAS)によって所望の遺伝子移入についてホモ接合性またはヘテロ接合性である植物の特定が可能になる。

減数分裂性組換えは、遺伝的背景全体にわたる好都合な対立遺伝子の移行、有害なゲノム断片の除去及び遺伝的に堅く連鎖しているピラミッド化形質を可能にするので、植物育種には必須である。正確なマーカーの非存在下では、限定された組換えが育種家に子孫選抜のための分離集団を大きくするように強要する。さらに、表現型の評価は、時間がかかり、資源集約的であり、且つあらゆる環境で、特に病害抵抗性のような形質について再現性がない。本発明によって提供されるマーカーは効果的な代替を提供するので、当該技術で大幅な進歩を表す。

V.分子利用育種法 本発明の実践で使用することができる遺伝子マーカーには、制限断片長多型(RFLP)、増幅断片長多型(AFLP)、単純配列反復(SSR)、単純配列長多型(SSLP)、単一ヌクレオチド多型(SNP)、挿入/欠失多型(挿入欠失)、変数縦列反復(VNTR)、及び無作為増幅多型DNA(RAPD)、当業者に既知のアイソザイム及び他のマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。植物育種家は分子マーカーを使用して作物のゲノムを調べ、表現型の差異ではなく遺伝的差異に基づいて材料を分類する。進歩したマーカー技術はゲノム配列、異なるヌクレオチド順、種内の多型遺伝子型に基づく。そのような構築基盤は、ゲノム全体を通して無作為に分布するマーカーを用いた遺伝資源の組織化に加えて、好都合な対立遺伝子に連鎖したマーカーによる園芸形質の選抜を可能にする。これまで、ゲノムの演繹的知識は、今や配列決定されている主要な野菜作物を欠いていた。科学者らは既知の多型現象ではなく、配列相同性を活用してマーカーの基盤を開発した。DNAポリメラーゼ酵素の存在下で対ごとにハイブリッド形成させる場合、人工的なDNA分子を使用してゲノム断片の複製を準備する。ポリメラーゼ鎖反応(PCR)にてDNA鎖のハイブリッド形成及び複製を制御して、各プライマー対間の距離に応じた長さのDNA断片を増幅する熱サイクル条件によって調節される、この合成。次いでこれらの断片はマーカーとして検出され、一般に知られる例にはAFLP及びRAPDが挙げられる。第3の技法であるRFLPはDNA増幅工程を含まない。増幅断片長多型(AFLP)法はゲノムの複雑さを低下させる。先ず、消化酵素を介して配列特異的にDNA鎖を切断すること。次いでサイズについて断片を選択し、それぞれゲノム断片のサブセットに相同の選択されたオリゴヌクレオチドを用いて最終的に複製させる。その結果、AFLP技術は遺伝子型、実験及び研究室の至る所でDNA断片を一貫して増幅する。

たった1つのヌクレオチドの変化を含む多型は多数の方法でアッセイすることができる。たとえば、一本鎖配座多型(Orita,et al.,Genomics,8:271−278,1989)、変性勾配ゲル電気泳動(Myers,EP0273085)、または切断断片長多型(Life Technologies,Inc.,Gathersberg,MD)を含む電気泳動法によって検出を行うことができるが、DNA配列決定の幅広い利用性によって、増幅産物を単に直接配列決定することがさらに容易になることが多い。いったん多型配列の差異が分かると、特定の対立遺伝子のPCR増幅(PASA;Sommer,et al.,Biotechniques,12:82−87,1992)または複数の特定の対立遺伝子のPCR増幅(PAMSA;Dutton and Sommer,Biotechniques,11:700−702,1991)の幾つかのバージョンが通常関与する、後代検定のための迅速なアッセイを設計することができる。

多型マーカーは、系統または品種の同一性の程度を判定するために植物をアッセイするための有用なツールとして役立つ(米国特許第6,207,367号)。これらのマーカーは表現型との関連を判定する基準を形成し、遺伝獲得量を決めるのに使用することができる。本発明の方法の特定の実施形態では、多型の核酸を用いて、Brassica oleracea植物にて病害抵抗性に関連する遺伝子型を検出し、病害抵抗性に関連する遺伝子型を持つBrassica oleracea植物を特定し、病害抵抗性に関連する遺伝子型を持つBrassica oleracea植物を選択することができる。本発明の方法の特定の実施形態では、多型の核酸を用いて、そのゲノムに病害抵抗性に関連する遺伝子移入された遺伝子座を含むBrassica oleracea植物を生産することができる。本発明の特定の実施形態では、多型の核酸を用いて、病害抵抗性に関連する遺伝子座を含む子孫Brassica oleracea植物を育種することができる。

遺伝子マーカーには「優性の」または「共優性の」マーカーが含まれてもよい。「共優性の」マーカーは2つ以上の対立遺伝子(二倍体個体当たり2つ)の存在を明らかにする。「優性」はたった1つの対立遺伝子の存在を明らかにする。二倍体遺伝子座での双方の対立遺伝子、または三倍体もしくは四倍体の遺伝子座における複数の対立遺伝子の存在が容易に検出できるようにマーカーは好ましくは共優性の様式で遺伝し、それらは環境変異を含まない、すなわち、その遺伝率は1である。マーカーの遺伝子型は通常、二倍体生物における各遺伝子座で2つのマーカー対立遺伝子を含む。各遺伝子座のマーカー対立遺伝子の組成はホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。ホモ接合性は遺伝子座における双方の対立遺伝子が同一ヌクレオチド配列を特徴とする状態である。ヘテロ接合性は遺伝子座での対立遺伝子の異なる状態を指す。

遺伝子多型の存在または非存在を判定するための(すなわち、遺伝子型決定のための)核酸に基づく解析を特定、選抜、遺伝子移入等のための育種プログラムで使用することができる。遺伝子多型の解析のための多種多様な遺伝子マーカーが利用でき、当業者に既知である。解析を用いて、Brassica oleracea植物における病害抵抗性に連鎖するまたは関連する遺伝子マーカーを含むまたはそれに連鎖する遺伝子、遺伝子の一部、QTL、対立遺伝子またはゲノム領域を選択してもよい。

本明細書で使用されるとき、核酸解析法には、PCRに基づく検出法(たとえば、TaqManアッセイ)、マイクロアレイ法、質量分光分析に基づく方法、及び/またはゲノム全体の配列決定を含む核酸配列決定法が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、DNA、RNAまたはcDNAの試料における多型部位の検出は、核酸増幅法の使用を介して円滑にされてもよい。そのような方法は具体的に、多型部位にわたる、またはその部位及びそれに遠位でもしくは近位で位置する配列を含むポリヌクレオチドの濃度を高める。そのような増幅された分子は、ゲル電気泳動、蛍光検出法、または他の手段によって容易に検出することができる。

そのような増幅を達成する方法の1つは、その二本鎖形態での多型を定義する近接配列とハイブリッド形成することができるプライマー対を用いたポリメラーゼ鎖反応(PCR)(Mullis,et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263−273,1986;欧州特許第50,424号;欧州特許第84,796号;欧州特許第258,017号;欧州特許第237,362号;欧州特許第201,184号;米国特許第4,683,202号;米国特許第4,582,788号;及び米国特許第4,683,194号)を採用する。質量分光分析に基づいてDNAをタイピングする方法も使用することができる。そのような方法は米国特許第6,613,509号及び同第6,503,710号及びその中に見いだされる文献にて開示されている。

DNA配列における多型は、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第5,468,613号、同第5,217,863号;同第5,210,015号;同第5,876,930号;同第6,030,787号;同第6,004,744号;同第6,013,431号;同第5,595,890号;同第5,762,876号;同第5,945,283号;同第5,468,613号;同第6,090,558号;同第5,800,944号;同第5,616,464号;同第7,312,039号;同第7,238,476号;同第7,297,485号;同第7,282,355号;同第7,270,981号及び同第7,250,252に開示されているものを含むが、これらに限定されない当該技術で周知の種々の有効な方法によって検出するまたはタイピングすることができる。しかしながら、本発明の組成物及び方法は、ゲノムDNA試料における多型をタイピングする多型タイピング法と併せて使用することができる。使用されるこれらのゲノムDNA試料には、植物から直接単離されたゲノムDNA、クローニングされたゲノムDNA、または増幅されたゲノムDNAが挙げられるが、これらに限定されない。

たとえば、DNA配列における多型は米国特許第5,468,613号及び同第5,217,863号で開示されたように対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド(ASO)プローブとのハイブリッド形成によって検出することができる。米国特許第5,468,613号は、ヌクレオチド変異を含む配列を増幅し、膜上でスポットにし、標識された配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブで処理される方法によって、核酸配列における単一のまたは複数のヌクレオチド変異を核酸にて検出することができる対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を開示している。

標的核酸配列はまた、たとえば、対象とする配列が増幅され、プローブとハイブリッド形成させ、その後、ライゲーションを行ってプローブの標識された部分を検出する、米国特許第5,800,944号で開示されたようなプローブライゲーション法によっても検出することができる。

多型検出にマイクロアレイを使用することもでき、その際、1つの点での標的配列における差異が部分的なプローブのハイブリッド形成を生じるように、オリゴヌクレオチドプローブのセットを重複する方法で集合させて単一の配列を表す(Borevitz,et al.,Genome Res.13:513−523,2003;Cui,et al.,Bioinformatics,21:3852−3858,2005)。どれか1つのマイクロアレイ上で、各標的配列が単一プローブによってではなく、一連の重複するオリゴヌクレオチドによって表される遺伝子及び/または非コーディング領域を表してもよい、複数の標的配列があることが予想される。この構築基盤は複数の多型の高処理能力スクリーニングを提供する。マイクロアレイに基づく方法による標的配列のタイピングは米国特許第6,799,122号;同第6,913,879号;及び同第6,996,476号にて開示されている。

SNP及び挿入欠失を検出する他の方法には単一塩基伸長(SBE)法が挙げられる。SBEの例には、米国特許第6,004,744号;同第6,013,431号;同第5,595,890号;同第5,762,876号;及び同第5,945,283号にて開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。

多型を検出する別の方法では、オリゴヌクレオチドプローブがプローブの5’末端及び3’末端に共有結合された5’蛍光レポーター色素及び3’消光色素を有する米国特許第5,210,015号;同第5,876,930号;及び同第6,030,787号にて開示された方法によってSNP及び挿入欠失を検出することができる。プローブがインタクトであれば、レポーター色素の消光色素への近接は、たとえば、Forster型のエネルギー移動によってレポーター色素蛍光の抑制を生じる。PCRの間、順行及び逆行のプローブは多型に隣接する標的DNAの特異的な配列とハイブリッド形成する一方で、ハイブリッド形成プローブは増幅されたPCR産物内の多型含有配列とハイブリッド形成する。その後のPCRサイクルでは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼがプローブを切断し、消光色素からレポーター色素を分離してレポーターの蛍光の上昇を生じる。

別の実施形態では、核酸配列決定法を用いて対象とする遺伝子座(単数)または遺伝子座(複数)を直接配列決定することができる。核酸の配列決定のための方法は、当該技術で既知であり、それには、454 Life Sciences(Branford、CT)、Agencourt Bioscience(Beverly、MA)、Applied Biosystems(Foster City、CA)、LI−COR Biosciences(Lincoln、NE)、NimbleGen Systems(Madison、WI)、Illumina(San Diego、CA)、及びVisiGen Biotechnologies(Houston、TX)によって提供される技術が挙げられる。そのような核酸配列決定法は、たとえば、平行ビーズアレイ、ライゲーションによる配列決定、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」、マイクロアレイ、平行マイクロチップ及び単一分子アレイのような構成を含む。

定義 本発明をさらに良好に定義するために、且つ本発明の実践で当業者を導くために以下の定義が提供される。言及されない限り、用語は関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。

本明細書で使用されるとき、用語「植物」には、植物細胞、植物プロトプラスト、Brassica oleracea植物を再生することができる組織培養の植物細胞、植物カルス、植物凝集塊、及び植物または植物の一部、たとえば、花粉、花、種子、葉、茎等にてインタクトである植物細胞が含まれる。

本明細書で使用されるとき、用語「集団」は共通する親起源を共有する植物の遺伝的に不均一の収集を意味する。

本明細書で使用されるとき、用語「品種」及び「栽培品種」は、その遺伝的家系及び性能によって同一種内で他の品種から特定することができる類似の植物の群を意味する。

本明細書で使用されるとき、「対立遺伝子」は染色体上の所与の遺伝子座でのゲノム配列の2つ以上の代替形態の1つを指す。

「量的形質遺伝子座(QTL)」は表現型の表現度に影響を与える少なくとも第1の対立遺伝子をコードする染色体の位置である。

本明細書で使用されるとき、「マーカー」は生物間を識別するのに使用することができる検出可能な特徴を意味する。そのような特徴の例には、遺伝子マーカー、生化学マーカー、代謝産物、形態的な特徴、及び農学的な特徴が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、用語「表現型」は遺伝子発現によって影響を受けることができる細胞または生物の検出可能な特徴を意味する。

本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子型」は植物の特定の対立遺伝子組成を意味する。

本明細書で使用されるとき、「優良な系統」または「栽培系統」は優れた農学性能のための育種及び選抜の結果生じている任意の系統を意味する。「優良植物」は優良な系統に属する植物を指す。多数の優良な系統が利用でき、Brassica oleracea育種の当業者に既知である。「優良な集団」は、たとえば、Brassica oleracea系統のような所与の作物種の農学的に優れた遺伝子型という点で当該技術の状況を表すのに使用することができる優良な個体または系統の仕分けである。同様に、「優良な遺伝資源」または遺伝資源の優良な系統は農学的に優れた遺伝資源である。Brassica oleraceaの栽培品種はC517白キャベツの供給源を包含するように意図されない。

本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子移入された」は遺伝子座を参照して使用される場合、たとえば、戻し交配を介して新しい遺伝的背景に導入されている遺伝子座を指す。遺伝子座の遺伝子移入は、植物育種法及び/または分子遺伝学的手法を介して達成することができる。そのような分子遺伝学的手法にはマーカー利用選抜が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、用語「連鎖した」は、核酸マーカー及び/またはゲノム領域の文脈で使用される場合、マーカー及び/またはゲノム領域が減数分裂で一緒に分離する傾向があるようにそれらが同じ連鎖群または染色体に位置することを意味する。

本明細書で使用されるとき、「抵抗性遺伝子座」は病害に対する抵抗性または耐性に関連する遺伝子座を意味する。たとえば、本発明に係る抵抗性遺伝子座は一実施形態では、黒斑病に対する抵抗性または感受性を制御してもよい。

本明細書で使用されるとき、「抵抗性対立遺伝子」は病害に対する抵抗性または耐性に関連する核酸配列を意味する。

本明細書で使用されるとき、植物における病害状態に対する「抵抗性」または「改善された抵抗性」は、あまり抵抗性ではなく、「感受性」の植物に比べて、収量、生存性及び/または他の関連する農業評価基準に関して植物が病害状態にあまり影響を受けないという表示である。抵抗性は相対的な用語であり、「抵抗性の」植物は類似の病害状態で生育する異なる(あまり抵抗性ではない)植物に比べて病害状態で生き延び、及び/または良好な収量を生産することを示す。当該技術で使用されるとき、病害「耐性」は病害「抵抗性」と相互交換可能に使用されることがある。当業者は、病害状態に対する植物の抵抗性は広く変化し、さらに抵抗性である、またはあまり抵抗性ではない表現型のスペクトルを表し得ることを十分に理解するであろう。しかしながら、単純な観察によって当業者は一般に、病害状態のもとで異なる植物、植物系統または植物群の相対的な抵抗性または感受性を判定することができ、さらに「抵抗性」の表現型の漸次的変化も認識するであろう。

用語「約」は、値が値を決定するのに採用されている装置または方法について誤差の標準偏差を含むことを指し示すのに使用される。クレームにおける用語「または」の使用は、本開示が代替物のみを指し、且つ「及び/または」を指す定義を支持するけれども、代替物のみを指すことが明白に示されない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「及び/または」を意味するように使用される。クレームにおいて単語「comprising」または他の開放言語と併せて使用される場合、単語「a」及び「an」は具体的に言及されない限り、「1つ以上」を意味する。用語「comprise」、「have」及び「include」は非制限連結動詞である。これらの動詞の1つ以上の形態または時制、たとえば、「comprises」、「comprising」、「has」、「having」、「includes」及び「including」も非制限である。たとえば、1つ以上の工程を「comprises」、「has」または「includes」方法はそれら1つ以上の工程だけを持つことに限定されず、他のリストにされていない工程も取り扱う。同様に、1つ以上の形質を「comprises」、「has」または「includes」植物はそれら1つ以上の形質だけを持つことに限定されず、他のリストにされていない形質も取り扱う。

VI.寄託情報 本明細書に記載されているようなBrassica oleracea var.capitataに由来する遺伝子移入を含むカリフラワー系統C517×BRL51−99の少なくとも2500の種子の寄託を行った。寄託は、American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110−2209 USAで行った。寄託はATCC受入番号PTA−123409を割り当てられ、寄託の日付は2016年8月4日だった。寄託へのアクセスは、要請の際、それに対して権利のある人が本出願の未決の間に利用できるであろう。寄託は、30年の期間、または最も新しい要請後5年間、または特許の実施できる有効期限の間のいずれか長い方、公的預託機関であるATCC預託機関にて維持されるであろう、またはその期間の間、生きられないのであれば、置き換えられるであろう。本出願者は、本特許または植物新種保護法(7U.S.C.2321以下参照)を含む品種保護の他の形態のもとで許諾されたその権利の侵害を放棄しない。

実施例1 Xcc抵抗性対立遺伝子の特定及びマッピング 倍加半数体(DH)集団を構築して抵抗性対立遺伝子を特定した。キャベツ育種系統(C517)をSeminis Vegetable Seeds,Inc.に由来する優良なブロッコリー系統(BRL51−99sc)と交配して交雑種を生産した。交雑種を用いてDH植物を生産した。これらのDH0植物を自家受粉させ、その後のDH1集団を用いて温室条件下で黒斑病試験を実施した。手短には、黒斑病試験には以下の手順が関与する。5〜6の本葉段階のBrassica苗を試験材料として用いる。土入り12cmポットにて通常の温室条件下で苗を生育させる。1×10⁶個の細胞/mLの濃度でのXanthamonas campestris campestrisの浮遊液を用いて苗に植菌する。注射器を用いて2つの異なる点で茎に0.2mLのXcc浮遊液を注入することによって苗に細菌を感染させる。対照が予想された反応を示し始めると苗の応答を記録し、それは一般に感染後14日前後である。症状は、症状無し(抵抗性)の1つ及び多数の壊疽斑点及び/または植物の死である(感受性)9による1〜9のスケールでスコア化する。中間的な表現型は、2:植物全体で約2つの小さな斑点が見える(植物の全体的印象は抵抗性である);3:葉の上での非常に少ない萎黄病斑点(植物の全体的印象は抵抗性である);4:葉の表面及び植物全体の約30%における萎黄病斑点(植物の全体的印象はIRである);5:葉の表面の約40%における萎黄病斑点(植物の全体的印象はIRである);6:葉及び植物全体の約50%における萎黄病斑点及び壊疽斑点(IR);7:葉表面の約60%における萎黄病斑点及び壊疽斑点(感受性);8:葉の表面及び植物全体の約70%を超える部分での壊疽斑点(感受性)である。各実験には試験苗に対して比較するための対照が含まれるであろう。これらの対照にはマッピング集団の元々の親が含まれてもよい。

SSR遺伝子座を用いて分子マーカーマップを構築した。マップ及び定量的病害データを組み合わせることによって染色体O3における黒斑病抵抗性のための1つの主要なQTLの検出を生じた(図2)。

実施例2 複数の単離体への抵抗性 157のXccの単離体を世界中からのBrassica oleracea作物(ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ)から収集した。この収集では、改善された差異植物シリーズ(Vicente,2001)を用いて単離体はほとんど病原型1、4、6及び9として分類された。一部の単離体はVicente、2001の方法に従って病原型の群に分類することができなかった。以前の知見(Vicente,2001;Taylor,2002)に相当する世界中の病原型の分布は地理的に関連していなかった。主要な病原型はすべてあらゆる大陸に存在することが見いだされた。このことは世界中の生産地域すべてにおいてXccの変異があることを示唆している。次いで実施例1に記載されているプロトコールに従って単離体すべてを抵抗性QTLに対して調べた。抵抗性QTLは調べた単離体すべてに対して抵抗性を提供することが見いだされた(表1)。 表1.異なる国々から収集された単離体を用いてC517に人工的に感染させた。結果は、C517について感受性(S)、中間抵抗性(IR)及び抵抗性(R)の反応の数として示す。NP=非病原性

実施例3 ブロッコリーにて連鎖引きずりを除くこと Xcc抵抗性の育種系統(C517)とブロッコリー系統(BRL51−99sc)の間での当初の交配は抵抗性遺伝子座に関連する連鎖引きずりを生じた。これらの植物は遅延した生育及び/または小型の植物を示した(図1)。元々のDH1集団をBRL51−99scとさらに戻し交配し、その後自家受粉させて、Xcc抵抗性遺伝子座の精細マッピング及び連鎖引きずりの除去に使用することができるさらなる組換え体を生成した。これらの家系の種子を無加温温室の苗トレイに播き、6週間生育させた。苗を試験圃場における無作為完全ブロック計画(試験区当たり2回の折り返しと20本の植物)で植えた。ほぼ3ヵ月後、植物を評価した。主要部の品質及び葉の型について試験区内で植物は無作為に分離した。試験全体では、生育遅延についての分離があった(図1を参照)。この試験については植物は、1=生育遅延、3=正常生育、2=中間の生育、及び0=観察なし、によってスコア化した。

次いで、QTLの付近に位置する図2で示されるような6つのマーカーについて植物をスクリーニングした。生育遅延について分離していない試験区から得た4つの植物を試料にし、生育遅延について分離している試験区では植物すべてを試料にした。生育遅延の形質は、マーカーNH0267115からNH0267108までの抵抗性QTLと高度に相関し、劣性であると思われる(表2)。NH0267115からsN10957までのホモ接合性O3遺伝子移入を伴った組換え体及びNH0265157及びNH0267108についての反復親(HP99)は生育遅延を示さない。

QTLのマッピング(図2)及び連鎖引きずりの結果(表2)に基づき、sN10957とNH0265157との間での組換えに基づいて植物を選択した。抵抗性はsN10957から左に位置し、引きずりはsN10957から右に位置する。24の組換え植物及び一部のチェックを特定し、温室に持ち込んで実験用の種子を作出した。これらの種子から生成された植物をXanthomonas抵抗性及び植物重量について圃場で調べた。植物重量と抵抗性レベルの相関にて連鎖引きずりのない植物を選択した(図3)。これらの植物すべてが第3染色体上にてC517に由来する小さな遺伝子移入を有することが見いだされた。この遺伝子移入のマッピングによって、Xanthomonas抵抗性のためのQTLは最大でも2cMのサイズであり、マーカーNH0265597(76.45cM)に位置することが見いだされた。さらに、QTLにはマーカーNH0265157(74.98cM)及びNH0266951(77.14cM)が隣接する。

表2におけるプローブ、プライマー及びマーカーの配列を表3に示す。

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本明細書で開示され、請求されている組成物及び/または方法のすべては、本開示の観点で過度の実験を行うことなく行い、実行することができる。本発明の組成物及び方法は好まれる実施形態という点で記載されている一方で、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物及び/または方法に対して及び方法の工程または工程の順序において多様性が適用されてもよいことが当業者に明らかであろう。さらに具体的には、化学的及び生理学的の双方で関連する特定の作用物質が本明細書に記載されている作用物質に置き換えられてもよい一方で、同一のまたは類似の結果が達成されることになることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置き換え及び改変のすべては添付のクレームによって定義されるような本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内にあると見なされる。