营养科学里的一项发现表明，抗性淀粉对肠的健康尤其是大肠的 健康有重要意义。抗性淀粉的这种良好效果来自于提供给大肠的一种 营养物质。在大肠内，肠内微生物菌丛获得的一种能源经过发酵，形 成特短链脂肪酸。这些短链脂肪酸为结肠粘膜细胞提供营养，提高大 肠内部一些营养物质的摄取量，增强结肠的生理活性。一般而言，如 果没有为结肠提供抗性淀粉或其他食用纤维，结肠的新陈代谢将变得 相对不活泼。
最近几年以来，从各种来源为解决肠的健康问题提供抗性淀粉已 经成为一种趋势。因此，有人发现高直链淀粉含量的淀粉存在一些谷 粒如玉米里面，并且可以作为一种改善肠健康的方法用在食物中。
淀粉的物理结构对制作食物产品的淀粉的营养特性和处理性能 有重要的影响。一些特征可以视为对淀粉结构的一种表示，其中包括 支链淀粉链长分布、结晶度和结晶的形式，如淀粉结晶的V复合形式。 这些特点的形式也可以视为对包含这些淀粉的食物所具有的营养特 性或处理性能的指示。因此，很短的支链淀粉链长可能是低结晶度和 低凝胶化作用的一种指示，也被认为和胶淀粉缩减退化有一种相互关 系。另外，更短的胶淀粉链长被认为可以对包含有大量淀粉的食物的 感官性能做出反应。一种淀粉的结晶度缩减也可能是该淀粉的凝胶温 度降低的一种指示，另外也被看作和提高了的感官性能有关。V复合 形式的结晶或其他与淀粉有关的脂质可以提高抗性淀粉的水平，并因 此提高食用纤维的水平。
在过去，直链淀粉含量很高的大麦种类就已经被鉴定出来。这些 大麦只是将直链淀粉含量相对地增加到了大约占总淀粉含量45％的水 平，如大麦品种高直链冰川号(简称AC38)。这种直链淀粉含量较 高的淀粉是有用的，但如果能获得直链淀粉含量更高的淀粉就更好， 人们正培育着一些种类的谷物，以期获得90％这样更高直链含量的淀 粉。这些淀粉对人体消化有很强的抵抗作用，将会带来更好的健康效 果。
提供直链淀粉含量高的淀粉时出现一个问题，即已知的直链淀粉 含量高的淀粉还有一个高凝胶化温度。凝胶化温度可以反映出加工这 些食物所需的粉碎能量。所以，在正常条件下，把谷粒或面粉进行加 工，使谷粒或淀粉制成食物需要更高的温度。另外，直链淀粉含量更 高的产品价格一般更高。同样，从消费者的角度看，生产制成食品可 能需要更长时间和更高温度，或者把含有直链淀粉含量高的淀粉的面 粉制成食物可能需要更长时间和更高温度。因此，直链淀粉含量高的 淀粉食物的供应处于一个重大的劣势。
谷物，特别是大麦的另一种营养成份是β-葡聚糖。β-葡聚糖 由通过β(1-4)和/或β(1-3)糖苷键结合的葡萄糖单元组成，不能被 人体消化酶降解，使之成为一种合适的食用纤维的来源。β-葡聚糖 能够部分地被内生结肠细菌消化，这种发酵过程产生的短链脂肪酸 (主要是醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐)对沿肠管和结肠排列的粘膜细胞 有益。(Sakata and Engelhard Comp.Biochem Physiol. 74a：459-462(1983))
β-葡聚糖的摄取还可以取得提高胆汁酸的排泄量并因此降低血 清胆固醇总量和低密度脂蛋白(LDL)水平以及降低冠心病危险的效 果。类似地，β-葡聚糖通过减弱饭后血糖浓度的偏移而发挥作用。 一般认为，这两种效果都是以胃肠内物质的粘性的增加为基础。
这些包含淀粉的食物的构成和这些淀粉与其他营养成份或别的 成份的密切关系，对这些食物的营养价值或食物的制作或结构中的功 能特性有重要的影响。
像改性淀粉或β-葡聚糖这样的物质可以用于能提供一般不能由 未改性物质提供的一种功能性的食物，而这种加工过程具有如下缺 点：或是改变其他有价值的成份，或是在改性过程中产生的不合需要 的感觉。因此，最好是提供一些能以未改性形式用于食物的成份来源。
大麦类型MK6827属于大麦种质系列(USDA-ARS全国小粒谷类作 物种质研究机构，美国爱达荷州阿伯丁市831290)。MK6827的谷粒 退缩，外壳的颜色鲜艳，呈细长的形状。在发明家的手中，这种谷粒 很难进行加工，其中包括非常地耐磨碎。MK6827谷粒的这些性能以 前还没有被确认，物种突变的本质也没有确定，也被认为不能用来进 行食品生产。

本发明起因于大麦植物的SSII突变变种的分离和表征，该大麦 植物的谷粒被发现含有一种淀粉，这种淀粉具有较少的支链淀粉含 量，因而具有相对含量水平较高的直链淀粉，并因此提高了食用纤维 的含量水平。
这一突变变种的谷粒和通过回交获得某些遗传背景的谷粒还含 有含量已经提高了的β-葡聚糖。含量已经提高了的β-葡聚糖和形 成含量高的食用纤维的抗性淀粉的结合被发明家们看作本发明的一 大特色。
另外，人们发现至少在一些遗传背景中源于这些突变变种的谷粒 含有的淀粉有相对水平高的直链淀粉和低凝胶化温度。这种淀粉在凝 胶化作用的同时以及在此之后的低膨胀特性在某些食用食物加工应 用中也具有优势。
另外，源于这些突变变种的谷粒被发现包含的淀粉含有相对水平 高的直链淀粉。所发现的直链淀粉的水平超过50％的淀粉含量，这种 水平以前从未在源于大麦的未改性淀粉中被发现过。
突变变种的淀粉和源于突变变种的回交种类(就已被测试的回交 而言)显示出一种抗性淀粉。该抗性淀粉具有一种由下列一个或一个 以上的具体物理特性指示的已改变的结构：相对含量水平较高的直链 淀粉、高β-葡聚糖含量引起的物理上的不易接近性、已改变的颗粒 形态、以及与淀粉有关的脂质，该抗性淀粉还具有一种由下列一个或 一个以上的特性指示的已改变的结构：低结晶度、缩减的支链淀粉的 链长分布和可观的与淀粉有关的脂质。
另外，迄今为止，源于突变变种大麦植物的谷粒可以容易地应用 于食品加工过程中。
一方面，本发明可以说是在于从一种大麦植物谷粒中获得的淀 粉，这种大麦植物具有较低的SSII活性水平，上述淀粉颗粒则因为 降低了支链淀粉含量而具有含量很高的直链淀粉。
从另一更广泛的方面，本发明可以说是在于从一种大麦植物中获 得的适合食品生产的一种谷粒。这种大麦植物具有降低了的SSII活 性水平，上述谷粒中的淀粉则因为降低了支链淀粉含量而具有含量很 高的直链淀粉。
从另一个更深更广的方面说，本发明在于一种具有降低了的SSII 活性水平的大麦植物。这种大麦植物能够结出谷粒，所述谷粒中的淀 粉则因为降低了支链淀粉含量而具有含量很高的直链淀粉，而所述谷 粒本身适合食品生产。
换言之，本发明可以说在于编码为SSII的大麦的蛋白质的一种 离析出来的核酸分子。该核酸能够在严格的条件下与SEQ ID NO 1. 或携带所述核酸分子可复制重组载体的细胞进行杂交。更进一步说， 本发明是一种能与SEQ ID NO 1.特定杂交的离析出来的核酸分子。
附图说明
为了便于理解，本发明将提供一些参照例子进行描述。
图1           在90％DMSO(二甲基亚砜)中的淀粉的HPLC(高
              性能液体色谱)分离测定的淀粉分子大小分布分析。
              (a)喜马拉雅(b)AC38(c)342(d)292
图2           显示突变变种和母本品种的颗粒形态的图片。(a) 
              喜马拉雅(b)AC38(c)292(d)Waxiro(e)342
              (f)坦坦加拉(g)MK6827(h)Sloop。颗粒的长度
              (L)，宽度(W)，厚度(T)的尺寸在照片(a)
              中用图解说明。
图3           采用荧光团辅助碳水化合物电泳(FACE)对各种突
              变变种和野生型淀粉的链长分布的分析。(a)正常
              化的链长分布(b)不同区的链长分布的对照。样
              品有342(■)，292(●)，坦坦加拉(s)，
              AC38 ，MK6827(◆)和喜马拉雅(+)。
图4           大麦淀粉样品的RVA分析。样品有喜马拉雅
              Namoi(△)，AC38(○)，342()，292(▲)和
              MK6827(■)。纵断面图中使用的温度曲线由一根
              连续的线条表示。
图5           突变变种和野生型的X-射线衍射数据
图6           离析出来的大麦淀粉扫描的电子显微照片。(a)
              喜马拉雅(b)Waxiro(c)AC38(d)292(e)342
              (f)MK6827  
图7           大麦染色体7H的位置图，显示nud1和sex6的
              位置相近( http：//wheat.pw.usda.gov/)大麦形
              态基因，7H图，作者：Franckowiak JD。
图8           292x坦坦加拉双倍单倍体类型的种子尺寸和淀
              粉链长分布的关系。(+)组成的线条表示喜马拉
              雅PCR，(○)组成的线条表示292 PCR。图(A)，
              DP(聚合度)在6和11之间淀粉链的百分率划分
              的种子长度与厚度之比；图(B)，DP(聚合度)
              在6和11之间淀粉链的百分率划分的种子重量。
图9           源于栽培变种植物喜马拉雅(Himalaya)的一种
              大麦SSII的cDNA序列(SEQ ID NO 1)。
图10          来自(1)T.tauschii(二倍体小麦)，(2)
              大麦栽培变种植物Morex的SSII基因结构。粗线
              条表示外显子，细线条表示内含子。每个样品下面
              的直线表示基因序列所处的区域。点线表示来自内
              含子7的大麦SSII基因的区域，该基因还未经过
              排序，但根据PCR分析确定长度大约为3kb。
图11          MK6827(SEQ ID NO 2)，Morex(SEQ ID NO 3)
              和292(SEQ ID NO 4)预知的SSII cDNAs，以及
              喜马拉雅(SEQ ID NO 1)的cDNA序列对比。预知
              的序列通过鉴定存在于喜马拉雅SSII cDNA中的
              染色体组序列所处的区域产生。ATG起始密码子和
              野生型终止密码子的表示方法和分别存在于
              MK6827(#)和292(&)中的额外终止密码子一样。
图12          从大麦类型292(SEQ ID NO 7)，Morex(SEQ ID
              NO 5)，MK6827(SEQ ID NO 8)，喜马拉雅(SEQ ID
              NO 8)中为SSII编码的基因推演出来的氨基酸序
              列的对比分析。存在于292 and MK6827中的额外
              终止密码子分别由符号(&)和(#)表示。
图13          MK6827(SEQ ID NO 2)和292(SEQ ID NO 4)
              中的大麦SSII基因突变的位置。
图14          对292突变的PCR化验的进展和用途。(a)被
              ZLSS2P4和ZLBSSIIP5两个引子放大的喜马拉雅的
              SSII区域图示。(b)被ZLSS2P4和ZLBSSIIP5放
              大的292的SSII基因区域图示，显示一个NlaIV
              点的缺失。(c)大麦经过消化后的NlaIV产物的
              琼脂糖凝胶体电泳现象；列M；DNA标记梯，列1
              是MK6824，列2是喜马拉雅；列3是坦坦加拉；列
              4是292；列5是342。
图15          淀粉粒蛋白质的SDS-PAGE电泳现象。图(A)中，
              8％的丙烯酰胺(37.5∶1 Acryl/Bis)SDS-PAGE凝胶
              体，用一种从小麦中产生的与纯净颗粒结合的SSII
              蛋白质相对的SSII抗体进行电吸和探测。图(B)
              中，12.5％丙烯酰胺(30∶0.135 Acryl/Bis)，
              涂银。确定质量的分子重量标准的迁移(单位为kd)
              于图表的每一面表示。
图16          DNA构成物的图示用来规范大麦稳定转变后的
              SSII表达。(1)核苷1至2972中的SSII基因(序
              列参见图表9)插于视觉方向的启动基因和终止基
              因之间。(2)核苷2972至1中SSII基因插于反
              定向觉的启动基因和终止基因之间(序列参见图表
              9)。(3)二重构成物中，Morex SSII染色体组
              序列的大麦SSII基因(核苷1559和2851之间)
              的内含子3插于喜马拉雅大麦SSII cDNA(图表9
              中核苷363至1157)的外显子2和3之间。

几个定义
糖血指标：一种受试验食物如白面包或葡萄糖对血糖浓度的偏移 的效果的对比。糖血指标是测量有关食物对饭后血清葡萄糖浓度的效 果一种量度标准，也是测量维持血糖动态平衡所需的胰岛素的一种量 度标准。
抗性淀粉：没有被健康人的小肠所吸收而是进入大肠的淀粉和淀 粉消化产物的总和。因此，抗性淀粉不包括消化掉的和被小肠吸收的 产物。
抗性淀粉可以分为四组。
抗性淀粉1，物理上难以获取的淀粉：这种形式的淀粉如存在 于淀粉残留在蛋白质或类似的胞间质内，或植物细胞壁内；或者存在 于谷粒的不完全碾碎颗粒中，或冷冻后的豆科植物中。
抗性淀粉2，抗性颗粒：这通常指粗淀粉，如产生于生土豆或绿 香蕉的粗淀粉，以及一些豆类植物和高直链淀粉含量的淀粉中。
抗性淀粉3，退化淀粉：这种淀粉产生于淀粉的热/湿处理中或 存在于如煮熟并冷却的土豆、面包和脆玉米片等淀粉食品中。
抗性淀粉4，经过化学改性的淀粉：这种淀粉的产生是由于化 学改性，如替代或交联的原因。这种形式的淀粉经常用于加工的食品 中。
食用纤维：在这里规定为没有被健康人的小肠所吸收而是进入大 肠的碳水化合物或碳水化合物消化产物的总和，包括抗性淀粉，β- 葡聚糖和其他可溶和不可溶的碳水化合物聚合体。食用纤维意味着包 含大肠微生物菌丛可发酵的至少是部分可发酵的碳水化合物。
胶凝作用：指淀粉粒内部的分子顺序的崩溃(瓦解)，同时伴随 着性质上不可逆转的改变，如颗粒膨胀，微晶熔化，双折射丧失，粘 性增加以及淀粉溶解。
本发明源于对SSII突变变种大麦植物的分离和表征。根据发现， 这种植物的谷粒所含的淀粉支链淀粉含量减少和由此产生的相对含 量水平高的直链淀粉，并含有很高水平的食用纤维。
根据发现，这些突变变种植物具有许多理想的十分喜人的特点， 而且已经证实：与其杂交生成的其他各种各样的基因背景仍然保持至 少部分所述理想特点。
这种突变变种的谷粒和杂交生成的一些基因背景的谷粒具有额 外的高水平的-葡聚糖含量，其所具有的-葡聚糖含量水平提高和 食用纤维含量水平提高两个特点的结合，被发明者们认为是本发明的 特色。
此外，至少在一些基因背景里人们发现源于这些突变变种的谷粒 所含的淀粉具有相对水平高的直链淀粉和低胶凝温度。这种淀粉胶凝 的膨胀特点有低膨胀的好处，这使得在一些食物和食物加工应用中具 有优势。
另外，源于这些突变变种的谷粒含的淀粉含有相对水平高的直链 淀粉，超过淀粉含量的50％，这种水平以前从未在源于大麦的未改性 淀粉中发现过。
根据对回交的测试，突变变种的淀粉表现出这样一种抗性淀粉， 该抗性淀粉具有一种由下列一个或一个以上的具体物理特性指示的 已改变的结构：相对含量水平较高的直链淀粉、高β-葡聚糖含量引 起的物理上的不易接近性、已改变的颗粒形态、以及与淀粉有关的脂 质，该抗性淀粉还具有一种由下列一个或一个以上的特性指示的已改 变的结构：低结晶度、缩减的支链淀粉的链长分布和可观的与淀粉有 关的脂质。
另外，迄今为止，从突变大麦植物的谷粒可以容易地应用于食品 加工过程中。
源于这些突变变种的一种形式的谷粒含的淀粉具有相对水平高 的食用纤维，尤其是直链淀粉和含量提高的β-葡聚糖。含量提高的 β-葡聚糖和高食用纤维相结合，被发明者当作本发明的一个特色， 同时是提供β-葡聚糖和抗性淀粉相结合的一个独特的来源，至少在 本发明广泛的形式范围内，不需将β-葡聚糖和可溶的食用纤维混合 起来，也不需对组成成分作出改性。
据发明者所知，本发明的大麦植物是首次发现，在该大麦谷粒的 抗性淀粉中，相对提高了直链淀粉的含量水平，相对提高了食用纤维 的含量水平，也提高了β-葡聚糖的含量水平，其β-葡聚糖含量处 于一般的β-葡聚糖含量的高位或者高于这个水平。β-葡聚糖含量 更高的谷粒属于蜡质表现型，因此它的直链淀粉水平低。
已知大麦中的β--葡聚糖含量的变化幅度很大，以大麦重量计 算，在4％左右到18％左右之间的范围，不过更普遍的是在4％到8％左 右之间(Izydorcyk等人，2000农艺和食品化学杂志48，982-989； Zheng等人，2000谷物化学77，140-144 Elfverson等人，1999谷 物化学76，434-438；Andersson等人，1999食品农艺科学杂志79， 979-986；Oscarsson等人；1996谷物科学杂志24，161-170； Fastnaught等人；1996作物学36，941-946)。改良后的大麦品种 已经研制出来，如Prowashonupana，所含β-葡聚糖的重量占15％左 右到18％左右，但它属于一种蜡质表现型。这些改良品种以 SustagrainTM的名称进行销售，(ConAgraTM特殊谷类产品公司，美 国内布拉斯加奥马哈)。
本发明预期的β-葡聚糖含量水平可能依赖于遗传背景，支链淀 粉合成酶的活性在该遗传背景中被降低。然而支链淀粉合成酶活性的 降低又被认为能够提升食用纤维的相对水平以及β-葡聚糖水平，食 用纤维部分表现为直链淀粉。对于相对直链淀粉水平升高后β-葡聚 糖水平的伴随升高的一种解释是，这种升高可能是胚乳减少后浓度效 应的结果，也可能是通过由淀粉合成到β-葡聚糖合成的碳转换，β- 葡聚糖含量水平进一步升高。
这样，大麦谷粒的β-葡聚糖比较适宜的含量是大于未脱壳谷粒 重量的6％，甚至7％，最好是能超过8％，然而蜡质突变变种中的β- 葡聚糖水平经测量高达15％到18％，而本发明大麦预期β-葡聚糖含 量水平与蜡质突变变种相比可达同样高的水平，甚至更高。
在第二种可取形式中，除了具有相对高的直链淀粉含量之外，大 麦谷粒的凝胶作用温度也更低(通过差示扫描量热法测定)。在为用 于例证的大麦所显示的资料中，此凝胶作用温度不只是在跟直链淀粉 含量稍微升高的大麦所产生的淀粉相比时降低了，跟具有正常直链淀 粉含量的淀粉相比时，凝胶作用温度也降低了。因此本发明预期较低 的凝胶化温度既是相对于直链淀粉含量高的淀粉而言，也是相对于直 链淀粉含量正常的淀粉而言，
另外迄今为止，在遗传背景中，已校验的淀粉还有一个明显特征， 即在加热的过剩的水中的膨胀性比其它所测试淀粉的膨胀性要低。
在第三种可取形式中，淀粉的直链淀粉水平高于淀粉含量的50％， 在源自于大麦的非改性淀粉中，这种水平以前是从未有过的。
本发明的大麦淀粉相对直链淀粉含量很高，并且比SSII基因或 其它淀粉合酶基因突变变种可以预料的含量高得多。SSII中的小麦 突变变种导致直链淀粉水平约为达淀粉的35％。普通大麦谷粒淀粉中 的直链淀粉含量大约为25％，当含量大大超过25％时(如30％)，淀 粉中的直链淀粉含量可以认为被提高了。被认为是高直链淀粉的已知 大麦的含量为35-45％。然而，本发明提供了直链淀粉含量大于50％ 的大麦，这在源自于大麦的非改性淀粉来说是一个前所未有的水平。
相对直链淀粉含量可能大于60％甚至70％。还可以指望它为更高 水平，这样就可能通过繁殖单个变异在其它植物中达到更高水平，此 类水平接近90％。这样本发明的直链淀粉水平可以大于80％，甚至大 于90％。
在第四可取形式中，淀粉具有改变了的结构，这种结构改变产生 了抗性淀粉。这可能因高直链淀粉含量而引起。抗性淀粉还可能由于 β-葡聚糖处于一个较高的水平而产生，并且很可能由于β-葡聚糖 跟淀粉粒的联合而产生的保护作用，紧密的联合潜在地为淀粉提供了 保护作用，从而提供抵抗力，该抵抗力可能由RS1形式特征化，一定 程度上不易消化。同样道理，由V-复合结度测量的淀粉跟脂质的联 合也可能对抵抗性淀粉的水平有所作用。既然这样，因为脂质的存在， 淀粉变得难以接近，从而很可能产生抵抗性，因而这可能被看作是 RS1淀粉。已经知道V复杂结构的退化淀粉极不易于消化，从而估计 构成V复杂结晶结构一部分的支链淀粉也会极不易于吸收。由于淀粉 粒结构，例示的大麦谷粒的淀粉可能难于吸收，从而可能有RS2淀粉。 这些特性可能个别出现，也可能两个或多个同时出现。
提高的食物纤维最少也可能部分地表现为抗性淀粉形式，该淀粉 可能含有很高的以上提到的淀粉粒的直链淀粉。
直链淀粉相对含量可能大于60％甚至70％。还可望是更高水平， 这样就可能通过单突变繁殖其他植物以达到更高水平，此类水平接近 90％。这样本发明的直链淀粉水平可能大于80％，甚至大于90％。
可望大麦还能够表达一种或多种直链淀粉合成酶或其它酶的活 性水平改变，从而进一步提高直链淀粉的相对水平。这样大麦可能携 带另一种能够进一步降低或改变支链淀粉生物合成的突变，或者携带 能够增加直链淀粉生物合成的突变或遗传背景。例如，大麦可能显示 一种直链淀粉添加物基因型，如携带有amo1突变的大麦。此类植物 的例子有AC38品种(即冰川号高直链淀粉)。
可以理解，在此所提到的直链淀粉的相对水平跟淀粉整体含量有 关，因而淀粉剩余物可能主要是淀粉的中间型，或支链淀粉，或两者 的混合物。在所分析的大麦中，提高的直链淀粉水平是由降低的支链 淀粉水平产生的，因而直链淀粉相对水平不是由提高的合成直链淀粉 产生的。
已经知道β-葡聚糖具有减慢小肠中的消化作用的效果，只要有 它和另一种食物成分存在即可。同样地，已经知道跟淀粉粒紧密毗邻 的具有抵抗力的分子有助于掩蔽淀粉，并使其难以接近从而增强其抵 抗性。因为跟脂质的结合使直链淀粉和其他形式淀粉的抗性水平得到 提高，通过具有抵抗力的分子与淀粉粒的物理毗邻性将进一步提高。 这样就大大增强了抗性淀粉的效果，并提供了由高β-葡聚糖水平产 生的其它有益效果。
另外已经知道抗性淀粉及β-葡聚糖的有益效果有一个剂量反 应，因而认为β-葡聚糖的提高水平加之抗性淀粉增强水平将增强对 健康的好处。
至少是本发明可选形式的β-葡聚糖及抗性淀粉高含量水平的结 合以前未被发现过，当然不是来自于一个没有修改或净化的来源，这 样本发明的这种形式为这些好处提供了单一的实用来源。
此淀粉的另一个可贵方面就是，尽管直链淀粉相对含量高，由差 示扫描量热法测量的凝胶作用温度仍然很低。这和普通发现形成对 比，即高直链淀粉趋向于具有较高的凝胶作用温度，该温度限制了利 用高直链淀粉的淀粉的方法。在针对例示大麦所显示的资料中，凝胶 作用温度不仅和直链淀粉含量稍微提高的淀粉相比降低了，而且跟具 有正常直链淀粉水平的淀粉相比，凝胶作用温度也降低了。同时，本 发明的一个可取方面预期了相对于高直链淀粉淀粉具有较低的凝胶 作用温度，它还可以预期相对于具有正常直链淀粉水平的淀粉具有较 低的凝胶作用温度。对于高直链淀粉淀粉，加工方面需要更高的温度 及更多的能量输入，这不仅需要较高成本，而且可能损害其它食物成 分的功能性。同样地，从最终消费者的角度来说，高直链淀粉淀粉食 物还可能更不方便，因为准备时需要更高的温度及更长的时间。这样， 例如，在本发明的这种可选形式中，现在可以提供一种产品如面条， 需要向容器如茶杯中加入开水或热水，而不需要再加热一段时间，即 可将抵抗性淀粉及其它有营养价值的成分提供给大肠。
这些淀粉的低凝胶温度的主要作用体现在食物的低温度要求以 及食物粉碎的能量要求低。其必然结果是，食物加工及混合可在室温 下进行，然后对混合物进行加热，低凝胶温度还缩短了达到凝胶所需 要的时间。另外，当温度低于正常淀粉完全凝胶所需温度时，本发明 将比常规淀粉有更完整的凝胶。
凝胶能力的测定之一反映在由DSC(差示扫描量热法)测量的热 性能上。DSC第一顶点(凝胶顶点)的开始可能低于53摄氏度，低 于50摄氏度更好，最好是低于47摄氏度。第一顶点的开始可以看作 是凝胶作用的开始。由大麦谷粒产生的淀粉第一顶点可能大约低于 60摄氏度，低于55摄氏度更好，最好是低于52摄氏度。第一顶点 的H(焓)可能低于3.5，低于1.0更好，最好是低于0.5。
包含本发明的淀粉的面粉的凝胶作用的另一发现是它们表现了 较低的膨胀性。膨胀性典型的测量方法是把淀粉或面粉跟过剩的水混 合，加热升高温度，通常大于90摄氏度。然后通过离心过滤法收集 样品，膨胀量用沉淀物的质量除以样品干重的值来表示。源于蜡质的 和普通的大麦的淀粉的膨胀量约大于5.5。由直链淀粉含量高的谷粒 (AC38)制成的面粉的膨胀量大约为3.75。然而，所测验的突变变 种和杂交体的谷粒的膨胀量小于3.2，小于3.0的更多，但通常大于 2。
在提高食物制备特别是含水食物制备中淀粉的含量时，凝胶作用 的低膨胀性特别有用。在当前的情况下，它可能要用于升高溶胶或其 它液体制备中的食物纤维的含量，对食物制备的输送可能另有限制。
如果需要快速制备食物如方便汤，方便面等，此特性跟淀粉所显 示的降低的凝胶温度相结合，就可以大大增强食物的营养效果。
假定凝胶温度效果是谷粒胚乳中支链淀粉结构变化的结果，对该 结构的度量方法之一就是由异淀粉酶去枝后的淀粉分子的链长分布 (聚合程度)。例示SSII突变变种淀粉中的支链淀粉的链长分析显 示，在去枝后，它们的链长分布为5到60，比去枝后无突变变种所 产生的淀粉的长度分配更短。链长更短的淀粉的分支频率也将适当增 加。这样淀粉还可能有更短的支链淀粉链长分布。聚合度为6至11 的淀粉链的比例可能大于25％，大于30％更好，最好大于35％。聚合 度为12-30的淀粉链的比例可能低于65％，低于60％更好，最好低于 大约55。聚合度为31-60的淀粉链的比例可能低于10％，低于8％更 好，而且高于5％，最好是高于约6％。三种链长范围比例综合考虑更 胜于单独考虑，并可用于判断一类淀粉是否符合本发明。
链长分布的降低很可能会造成更低的凝胶作用温度。链长减小还 被认为可以增强淀粉的器官感觉性，尤其是口感，这样就可以达到更 滑溜的产品。另外，支链淀粉链长减小还被假定可能降低支链淀粉退 化的程度，这种退化对食物质量造成影响，例如，它被认为对面包老 化起非常重要作用。
另外，例示淀粉中的淀粉结构又显示出结晶度的变化，因为和从 大麦中分离出来的普通淀粉相比结晶度降低了。当和降低了的支链淀 粉链长分布相结合时，降低了的颗粒结晶度可能显示凝胶温度将会更 低。淀粉降低了结晶度还被认为跟加强器官感觉性相关，而且更短的 支链淀粉链长可以使滑溜的口感更好。这样，由于一个或多个支链淀 粉合成酶的活性水平降低了，淀粉可能还会表现出更低的结晶度。淀 粉表现出的结晶度的比例可能低于约20％，最好是低于15％。
还有一种测量淀粉的性能的方法就是测量其粘性。通过使用快速 粘性分析器(RVA)发现，本发明的淀粉的粘性和得自于大麦的普通 淀粉，蜡质淀粉，及高直链淀粉的粘性大不一样。这些测量是用粗面 粉做的，淀粉的这种特性将在这些测量中占支配地位。普通及蜡质淀 粉的最高粘性约为900到500RVA单位，已知的高直链淀粉的最高粘 性大于200，而根据本发明大麦的最高粘性低于100，多数低于50， 在有些植物中还只有10RVA单位。擅长此技术的人都能理解，引用的 实验单元参数及引用的结果都是用于通过RVA(快速粘性分析器)或 类似的仪器如粘焙力测量器显示这些淀粉的相对性能。
除了以上提到的结晶度，淀粉还可能由于淀粉以V综合形式存在 而表现出明显特性。发明者认为这是第一次淀粉以这种形式和可感知 的数量显示在谷物的淀粉粒中。淀粉的这种形式通常跟退化的淀粉相 关联，尤其是在跟脂质有接触的情况下。在本发明中，假定淀粉结构 允许植物脂质和淀粉之间亲密关系的形成，这就导致了V综合结构。 淀粉的这种形式还被认为具有保健效果，因为它降低了消化性，因而 可能形成抗性淀粉。
其它结构形式也可以由脂质淀粉相互作用产生，且包括非结晶脂 质淀粉联合体。这样本发明也可以说是在于，大麦植物中，由于一个 或多个支链淀粉合成酶的活性水平降低了，该大麦植物在谷粒胚乳淀 粉含量中展示了可感知数量的淀粉脂质联合体。包含淀粉脂质联合体 的淀粉，包括那些表现V综合结构的淀粉，通常对消化也有抵抗性， 因而可以提高食物纤维的水平。表现淀粉脂质联合体的结晶形式的结 晶淀粉的比例最好是大于50％，大于80％更好。
具有V综合形式的淀粉也可能不展示可感知数量的淀粉的A综合 形式。如果没有A综合形式，可能表明本发明淀粉的存在。 还发现由本发明的谷粒制成的淀粉及产品的粘合温度大大升高了。已 知淀粉的粘合温度低于70摄氏度，这适合于普通直链淀粉含量及高 直链淀粉含量的淀粉。然而本发明的淀粉表明的粘合温度高于75摄 氏度，高于80摄氏度更好。要注意这些都是实验式测量，相对于其 它淀粉的测量法。
发现例示大麦的淀粉有大量的食物纤维及抗性淀粉，这种增长可 能至少部分地是因为直链淀粉的相对含量水平高的结果，然而也可能 有食物纤维的作用，由于淀粉脂质联合体的存在，包括V型综合结构， 或因为直链淀粉或支链淀粉和β-葡聚糖的紧密联合。同样地，升高 的β-葡聚糖水平也可能对食物纤维的升高起了重大作用。
所举大麦的胚乳中的直链淀粉相对水平的升高十有八九是因为 支链淀粉生成变化造成的，而支链淀粉的生成变化又是SSII酶的活 性降低的结果。
具有上述编码酶的基因中的突变可能会显示出升高的直链淀粉 含量，和/或降低的支链淀粉水平。如果只有支链淀粉合成降低了， 淀粉会表现出相对升高的直链淀粉水平。
支链淀粉合成酶的活性降低可以通过相应基因内适当的突变或 基因的调节序列来达到。基因被抑制的程度将在一定程度上确定所制 出的淀粉的特性。作为大麦中的SSII突变，本发明的例示突变是截 断突变体，而且已经知道这些对淀粉的性质有重大影响，然而遗漏突 变体也可能改变支链淀粉的结构，该遗漏突变体能有效降低支链淀粉 合成酶活性以提供大麦的淀粉或颗粒中的有益特性。其它染色体重排 也可能有效，包括缺失，倒位，重复，或点突变。
此类突变可以引入到想要的遗传背景中，通过诱变有益品种，更 可靠的是通过把突变变种和具有想要的遗传背景的植物杂交，并进行 适当数量的回交，以去除本不想要的母体背景。可通过对诱变植物进 行筛选来实现突变分离。
分子生物法可作为传统方法的替补选择性方法。SSII序列呈现 在此规格中。携带有想要的突变的载体以及可选择的标志物可能被导 入到组织培养植物或适当的植物系统中，如原生质体。对于突变已经 被结合到染色体以替代现有的野生型等位基因的植物，可以使用适当 的专用于突变及表型观测的核酸探测器来进行筛选。单子叶植物(如 大麦)的转化方法以及源于原生质体或植物未成熟的胚胎的植物再生 方法在此技术中非常有名，见Nehra提出的《加拿大专利申请 2092588》，加拿大国家研究委员会提出的《澳大利亚专利61781/94 号申请》，日本烟草公司提出的《澳大利亚专利667939》，和Monsanto (孟山都)公司提出的《国际专利PCT/US97/10621号申请》，其它 方法在《WO99/14314专利说明》中作了描述。
除了使用突变，也可以采用其它知道的方法来改变支链淀粉合成 酶的活性。这样，例如，通过适当的反义分子的表达，可以干挠对支 链淀粉合成酶进行编码的单个或多个基因的转录和处理。这些可能基 于在此为大麦SSII基因所说明的DNA序列。这些反义序列可用于结 构基因或对基因表达及粘接活动进行控制的序列。这些序列在上文中 已经提到。设计反义序列的方法在此技术中非常有名，可提供例子的 有《美国5190131专利》，《欧洲0467349AI专利说明》，《欧洲 0223399AI专利说明》，及《欧洲0240208专利说明》，在此根据它 们提供执行反义技术的方法的情况把它们合成一体。在植物中导入及 维护此类序列的方法已经出版，因而是已知的。
反义技术的变化就是利用核糖酶。核糖酶是带有酶功能的RNA分 子，可以在反义序列指定的位置切割其它的RNA分子。RNA切割妨碍 目标基因的表达。参考文件包括《欧洲0321201专利说明》及 《WO97/45545说明》。
另一个可能用到的分子生物方法就是共同抑制。共同抑制的机制 不是很好理解，但它涉及把额外的基因复制放入到正常倾向的植物 中。在有些情况下，额外的基因复制会干涉目标植物基因表达。对于 执行共同抑制的方法，参考文件包括《WO97/20936专利说明》及《欧 洲0465572专利说明》。
另一种可能用到的使用DNA序列的方法是双链RNA中介基因抑 制。在该方法中，DNA用于指引双链RNA产品的合成。双链分子的存 在引发了植物防卫系统的反应，破坏了双链RNA及来自于目标植物基 因的RAN，有效地降低或消除了目标基因的活性。关于执行此技术的 方法，参考文件包括《澳大利亚99。292514-A专利说明》及 《WO99/53050专利说明》。
可以认为，本发明可能产生于使用分子生物方法降低两个或两个 以上提到的基因的活性水平的结果。
一种被特别正视为高直链淀粉及高β-葡聚糖含量结果的重要产 品是降低了糖血指数的低热量产品。低热量产品可能基于由碾碎了的 颗粒制成的面粉的内含物。然而，人们也许希望首先对谷粒进行颗粒 化加工，除去谷粒总重量的10％或20％，因此清除糊粉层，同时以更 大的程度消除胚。颗粒化加工的效果是降低脂质含量，从而降低食物 的热量值。此类食物将可以充饥，增强肠胃健康，降低餐后血清葡萄 糖水平以及脂质浓度，并提供低热量食物。使用颗粒化产品将降低由 糊粉层及胚提供的营养成分。由颗粒化产品制成的面粉很可能具有更 好的外观，因为这样制成的产品总是看起来更白。
本发明的某些方面也来源于糊粉层和胚的结合以及高水平的食 物纤维。特别是来源于存在于所给例子谷粒中的相对较高的糊粉层及 胚。首先，大麦有比其它商业谷物高得多的糊粉层，这是因为它有三 细胞糊粉层。其次，例子大麦颗粒会收缩，这就意味着胚乳数量减少， 这就导致糊粉层及胚的相对数量增大。这样在抗性淀粉输送系统中的 混合中，大麦就有相对高水平的特定的有益元素或维生素，包括二价 阳离子(如生物可提供的Ca++)，维生素(如叶酸)，及抗氧化剂 (如维生素E和生育三烯酚)。这样，在为骨头及其它钙化组织的生 长及沉积提供材料时就确定了钙，从而降低了晚年得骨质疏松症的危 险。当叶酸只是以接近概念式的方式消耗时，它能够针对神经管缺陷 提供保护作用，降低心血管病的危险，从而提高抵抗性淀粉和β-葡 聚糖结合的效果。叶酸还被认为能够降低特定癌症的风险。维生素E 及生育三烯粉携带有抗氧化剂的好处，因而被认为能够降低得癌症及 心脏病的风险，并且具有降低食物成分中不想要的氧化作用的效果， 例如能导致臭败的脂肪酸。当大麦颗粒或由其制成的产品的这种可选 形式的这些成分和一种颗粒构成一种便利包装时，碾磨过的产品的一 种特殊形式可能就是糊粉层包括在碾磨过的产品之中。可能采取特殊 的碾磨方法以提高碾磨过产品中的糊粉层的数量。此类方法在Fenech 以及其他人((1999)J Nutr 129：1114-1119)中提到。这样，源于 碾磨过的或其它形式加工的谷物的任何产品都将包括糊粉层和胚，从 而具有额外的营养成分，而不需要从其它来源再向产品加入这些元 素。
要知道，本发明的大麦植物是具有更适合于生产食物，尤其适合 于商品食品生产的谷物。这种生产可包括面粉或其它用于商品食品生 产的配料产品。低一级的用途是其含量大约12％或超过15％的淀粉。 或者，这种生产类似地包括可把谷物磨成粉；因此，虽然大多数形状 的谷物均可磨成珠状大麦产品，而某些谷物的结构则特别不适合磨成 粉。影响谷物的商业加工品种的另一个特点是，生产出来的产品会变 色。因此，谷物的表皮或其它部分明显地显色，比如紫色，而这些与 产品混在一起，并限制其适当的商业应用，比如，其带颜色的粗面粉 用作面包的配料。一般来说，无皮的大麦用起来也更方便，因为，大 麦谷物上的表皮给谷物加工造成更大的困难。提高大麦植物的价值的 另一个方面是，从谷物中提取淀粉，而提取率越高，越有用。谷物的 形状是影响谷物的商业用途的另一个特征，而谷物的形状可影响加工 难度，或使其很难磨成粉。例如MK6827的谷粒形状异常地长，以至 于很难磨成粉或加工。这种拉长的形状及其可用性的简便的量度标准 是谷物的两个形态特征长度与其厚度的比例(L/T比例)。该比例 往往由淀粉的特性决定。发明人发现，MK6827所具有的L/T比例大 于6。因此，所筛选的具有突变变种SSII基因的大麦植物的L/T比 例在大约4至5的范围之内，尽管预计其范围扩大到更大的比例，也 许到小于5.8或至少5.5之后，仍可使用。
理想的基因背景将包括考虑商业收益及其它特性。这种特性可包 括是否要冬季或春季大麦品种，农耕性能，抗病能力及对非生物性压 力的抵抗能力。在澳大利亚，人们可能要斯鲁普(Sloop)、斯库尼 尔(Schooner)、魁北克(Chebec)、弗兰克林(Franklin)、阿拉 派尔斯(Arapiles)、坦坦加拉(Tantangara)、加里恩(Galleon)、 盖尔德尼尔(Gairdner)或皮考拉(Picola)等大麦杂交栽培变种。 上述品种适合于澳大利亚产区，而其它品种适合其它产区。
要想获取更大的收益，就需要更饱满的谷粒，而本项发明的某些 效益也可由此获得，例如，生产直链淀粉含量高的淀粉或改变链条长 度分布的淀粉。而本项发明的其它方面，则可通过不饱满的谷粒得到 更好的实现。由于不饱满的谷粒中，糊粉层或胚与淀粉之间的比例可 能更高，所以，可提供糊粉层的有效组成成分含量更高的大麦面粉或 其它产品。这种糊粉层含量高的产品可能具有更高的叶酸等维生素含 量，或者更高的钙等矿物质含量，而这些维生素和矿物质与更高的抗 性淀粉含量和/或更高的β-葡聚糖含量相结合，就可提供配合的效 果，例如在大肠中促进矿物质的吸收等。
为了使直链淀粉达到最大数量，也可以使大麦植物具有其它的补 充显型特征，以便降低一个或多个支链淀粉合成酶的活性，使其遗传 背景具有更高的直链淀粉显型，例如AC38中的amo1变种(因果基因 未知)和蜡质变种(例如瓦克希罗品种中的变种)。另外，在因果基 因不详的其它收缩胚乳大麦突变变种中可进行双重突变。
进而，本发明还在于所述大麦的谷粒。
本项发明还包括经过加工的谷粒，其中包括磨成粉、磨碎、粗磨、 颗粒化或碾轧的谷粒，以及在加工过程中所获得的其它产品和上述完 整的谷粒。这些产品可用于各种食品，例如面包、蛋糕、饼干等含有 谷粉的产品，或浓缩济等添加剂，或制成麦芽或其它大麦饮料、面条 和方便汤。
本项发明也可包括从上述大麦植物的谷粒中分离出的淀粉。淀粉 可通过已知的技术分离出来。
本项发明的一个优点是提供具有特殊营养的一个或多个产品，而 且不需要对大麦谷物的淀粉或其它成分进行改性。
但是，也可能有必要改变谷粒的淀粉、-葡聚糖或其它成分， 本项发明中包括这些改性内容。
改性方法采用已知的方法，包括用传统的方法提取淀粉、-葡 聚糖或其它成分，以及将淀粉改性，使其具有所要的抵抗性。
因此，淀粉或-葡聚糖可单独或多重地通过选用的处理方法来 改性，这种处理包括而且不局限于：热和/或水分处理、物理处理(例 如球磨粉)、酶处理(例如采用或-葡聚糖、pullalanase等)、 化学水解(用液体或气体试剂弄湿或弄干)、氧化、双官能的试剂的 交叉结合(例如三偏磷酸钠、氯氧化磷)，或羧基甲基化。
例示大麦谷粒中的食物纤维含量并不只是因为相对提高了胚乳 直链淀粉含量而提高。其首要原因是，高含量的-葡聚糖对食物纤 维含量的影响很大。-葡聚糖与淀粉颗粒的结合也很可能具有保护 作用，其结合密度对淀粉具有潜在的保护作用，以至于像RS1的结构 特性具有抵抗性，使其无法消化。其次，通过V-复合结晶测量的淀 粉-脂质的结合也很可能具有抵抗性的碳水化合物。在这种情况下， 抵抗性很可能是由于脂质的存在所引起的物理上的不易接近性而产 生的，并由此可断定一个RS1淀粉。因此，具有V-复合结构的退化 淀粉对消化具有很高的抵抗性，并由此预计，构成具有V-复合结晶 结构的淀粉粒的部分的支链淀粉提高了消化抵抗性。再次，例示大麦 植物的淀粉可能由于其淀粉粒结构中具有RS2淀粉而对消化具有抵 抗性。
虽然对本项发明的各个方面进行了各种说明，但是，本项发明还 在于上述两个或更多方面的结合。
实例1
背景
高级植物胚乳中的淀粉合成是通过一组酶来完成的，其过程共分 4个关键性的步骤。第一步，ADP葡萄糖通过从G-1-P和ATP的ADP 葡萄糖的合成来激活淀粉的单体前体。第二步，被激活的葡萄糖供体 ADP葡萄糖通过淀粉合成转化成预先存在的1-4联接的非还原性末 端。第三步，淀粉分叉酶通过1，4联接的葡萄糖的一个区域的分裂 而产生分叉点，进而从分裂链条转化成受体链条，形成一个新的1，6 联接。最后，遗传学研究表明，在高级植物中，淀粉去枝酶对淀粉的 正常数量的合成是最为重要的，但是，去枝酶的作用机理尚未得到解 答(麦尔斯等，2000)。
高级植物的正常淀粉粒合成显然需要上述4种活动，而在高级植 物的胚乳中发现了这4种活动的每一种的多重异构体，每一个异构体 在突变分析上(王氏等，1998；布里恩等，1998)或通过转基因方法 的基因符号的变化上(阿贝尔等，1996；乔布林等，1999；斯科沃尔 等，2000)所起的作用是不同的。但是，每一种活动中的每一个异构 体对淀粉的生物合成所起的准确的作用尚不可知，也不知道其作用在 不同物种之间的区别有多大。在谷类的胚乳中，存在两种ADP葡萄糖 热磷酸化酶异构体，一个在淀粉质里，另一个在细胞质里(德尼尔等， 1996；陶尔波乔尔森等，1996)。每一种异构体均有两个分支形态。 玉米的收缩突变变种(sh2)和易碎突变变种(bt2)各自代表大小分 支的变异(基罗兹和哈纳，1994)。在谷类的胚乳中发现了4类的淀 粉合成，一个专门位于淀粉颗粒里面的异构体、颗粒范围的淀粉合成 (GBSS)、介于颗粒与可溶性部分之间的两种形式(SSI，李氏等， 1999a；SSII，李氏等，1999b)和完全位于可溶性部分的第四种形式， SSIII(曹氏等，2000；李氏等，1999b；李氏等，2000)。据显示， GBSS是直链淀粉合成的基本要素(苏尔等，1983)，而SSII和SSIII 中的突变可改变支链淀粉结构(高氏等，1998；克雷戈等，1998)。 SSI活动所起的突变作用尚无描述。
谷类的胚乳中表现出三种形式的分支酶，分支酶I(BEI)、分 支酶Iia(BEIIa)和分支酶IIb(BEIIb)(海德曼和包耶，1982；包耶 和普雷斯，1978；米朱诺等，1992；孙氏等，1997)。在玉米和水稻 中，高直链淀粉显型已显示出BEIIb基因里的变异结果(包耶和普雷 斯，1981；米朱诺等，1993)。在这些突变变种中，直链淀粉含量显 著地提高，而剩余支链淀粉的分支频率却减少了。另外，定义为直链 淀粉和支链淀粉之间的“中间体”的物质明显地堆积了(包耶等，1980； 塔克达等，1993)。明确说明BEIIa和BEI的突变尚无描述，尽管在 马铃薯中，仅仅BEI的降低会引起淀粉结构的极微影响(费尔普斯等， 1996)。但是，在马铃薯中，BEII和BEI的降低的结合比单单BEII 的降低产生更高的直链淀粉含量(斯科沃尔等，2000)。在高级植物 中，存在两种类型的去枝酶，其定义是基于其酶作用物特性、异淀粉 酶类型去枝酶和pullulanase类型去枝酶做出的(麦尔等，2000)。 玉米和水稻中的Sugary-1突变与缺少两种去枝酶有关(詹姆斯等， 1995；库伯等，1999)，但是，其因果突变图的位置与异淀粉酶类型 去枝酶基因相同。在衣藻sta-7突变(谋伊勒等1996)，玉米Sugary-1 突变的相似体中，只有异淀粉酶的活性降低了。
在大麦淀粉结构中的已知的变种与玉米的变种相比是有限的。最 具特色的突变是叫做AC38的蜡质高直链淀粉突变。也培育并分析了 双突变变种(斯肯德尔梅尔等，1992；富士田等，1999)。对淀粉结 构及特征(促察骄瓦斯卡等，1992；斯肯德尔梅尔等，1992；瓦山坦 和巴蒂，1995；默利森等，1984；格林和德哈斯，1974；邦克斯等， 1971；皮尔森和克里斯蒂尔森，1997；瓦山坦和巴蒂，1998；促察骄 瓦斯卡等，1998；宋氏和简，2000；安德里夫等，1999；Yoshimoto 等，2000)和谷物特征(斯万森，1992；阿克卡斯，1979；奥斯卡尔 森等，1997；奥斯卡尔森等，1998；安德森等，1999；埃尔夫佛森等， 1999；巴蒂，1999；郑氏等，2000；伊基多尔基克等，2000；安德森 等，2000)都进行了广泛的变种特性报告，并对突变变种在动物饲料 中试验(薛氏等，1996；牛曼等，1978；卡尔佛特等，1976；维尔森 等，1975；山德伯格等，1998；伯格等，1999)，人类食品(斯万森 等，1995；法斯特诺特等，1996；皮尔森等，1996；坡默兰茨等，1972) 和人类营养(坡默兰茨，1992；格兰菲尔德等，1994；奥斯卡尔森等， 1996；阿克伯格等，1998)中的应用进行了研究。
在本实例中，我们从大麦中分离出了神奇级别的高直链淀粉突变 变种。该突变变种品种所具有的直链淀粉含量(65％-70％)超过那些 已知的高直链淀粉突变变种冰川(AC38)(45％-48％)(沃尔克等， 1968)，而且具有淀粉分支频率提高的支链淀粉结构的淀粉，这与玉 米的直链淀粉扩展突变变种相关的分支频率的减少形成对照(塔克达 等，1993)。
对本项发明的突变变种的谷粒和淀粉特性进行了具体的研究并 绘制了因果突变图。分离出的变种与已知的大麦收缩突变变种sex6 是等位基因的，而且显示因果突变位于淀粉合成II基因里。这一突 变的结果为淀粉的生物合成过程提供了新的提示，并显示不同物种的 具体基因中的突变对淀粉结构有什么不同的影响。
材料及方法
突变的诱发及筛选
无皮大麦品种“喜马拉雅”是根据兹瓦尔和山德勒(1995)的方 法，用叠氮化钠诱发突变的。变化谷物形状的品种是根据格林等 (1997)的方法选择的。根据格林等(1997)的方法识别并保留了总 计75个具有收缩胚乳显型的品种。
淀粉的分离
淀粉采用斯库尔曼等(1991)的方法从大麦谷物中分离出来。
直链淀粉的确定方法
直链淀粉/支链淀粉比例的确定是根据巴铁和克尔廷(1996)描 述的方法，采用HPLC方法进行去枝淀粉的分离，并采用了碘控制方 法。直链淀粉/支链淀粉比例的分析是根据凯斯等(1998)的方法， 通过分析非去枝淀粉方法进行的。
淀粉含量的测定
淀粉采用大酶(Megazyme)(布雷，科维克楼，爱尔兰共和国) 所提供的总淀粉分析工具包来确定的。
蛋白质含量
氮采用凯氏法确定，蛋白质含量采用5.7的系数来计算。
β-葡聚糖含量
β-葡聚糖采用大酶(Megazyme)(布雷，科维克楼，爱尔兰共和 国)所提供的工具包来确定的。
淀粉链长度分布
淀粉根据默来尔等(1998)的方法，采用荧光团辅助碳水化合物 电泳(FACE)，用毛细管电泳进行去枝和链条长度分布分析。
DSC
胶化采用一个Pyris1差别扫描热量仪(坡尔金 埃尔玛，美国挪 斯沃克CT)进行测量。淀粉按2份水∶1份淀粉的比例用水搅拌，将 混合物(40-50mg，精确称重)放置在不锈钢锅里，然后密封钢锅。 样品从20℃至140℃，按每分钟10℃进行扫描，并与空的不锈钢锅 进行了比较。采用Pyris软件确定了胶化温度和热函。
RVA分析
粘度采用快速粘度分析器(RVA，新港科学Pty有限公司，悉尼 沃利武德)，用巴铁等(1997)报告的粗面粉条件进行测量。为了抑 制-淀粉酶，在所有的化验中都加入了浓度为12mM的硝酸银。所测 量的参数为高峰粘度(热面团的最高粘度)、保持粘度、最终粘度和 面团温度。另外，计算了下降粘度(高峰粘度减去保持粘度)和反弹 粘度(最终粘度减去保持粘度)。
面粉的膨胀
面粉的膨胀量是根据科尼克-罗斯等(2001)的方法进行确定的。
X-射线数据
X-光衍射数据是采用标准工艺(布里恩等，1998)收集的。
电子显微镜扫描
用Joe1 JSM 35C仪器进行了电子显微镜扫描。对纯化的淀粉进 行了镀金喷涂，并在室温下以15kV进行了扫描。
双单倍体的生产
从292与坦坦加拉(澳大利亚阿德来得维特学院的P戴维斯博士 的Hordeum culgare cv Tantanjara)之间和342与坦坦加拉之间的 杂交所产生的F1植物中生产出了双单倍体。
关系分析
用Map Manager计算了遗传关系数据。
大麦cDNA库的建立
从开花10、12、15天后的大麦胚乳组织中分别收集了5毫克的 polyA+mRNA，用来进行按照规定(“生命技术”)的cDNA合成。 NotI-(dT)18引子(Pharmacia Biotech)用于第一步的cDNA合成。 在cDNA与NotI接合并产生大小分别(SizeSep 400 spun Column of Pharmacia Biotech)之后，将双链cDNA与SalI-XhoI接合济 (Stratagene)轧接并克隆到ZipLox(“生命技术”)的SalI-NotI 臂上。扎接的cDNA用GigapackIII黄金包装提取物(Stratagene) 进行包扎。用E.coli的Y1090(ZL)应变测试的文库滴定度为2×106 pfu。
用PCR克隆大麦淀粉合酶II的具体cDNA区域
为了筛选大麦的cDNA文库，采用了cDNA克隆wSSIIp1。cDNA克 隆wSSIIp1，是由PCR，采用引子ssIIa(TGTTGAGGTTCCATGGCACGTTC SEQ.ID.NO 9)和ssIIb(AGTCGTTCTGCCGTATGATGTCG SEQ.ID.NO 10)， 放大wSSIIA(基因库，接入号：AF155217)的核苷位1,435和1,835 之间区域来引发的。
放大采用了一个FTS-1热定序器(科贝特，澳大利亚)，95℃中 1次循环2分钟，95℃中35次循环30秒，60℃中1分钟，72℃中2 分钟，25℃中1次循环1分钟。碎片wSSIIp1克隆到一个pGEM-T矢 量(Promega)里。
大麦cDNA库的筛选
对从大麦变异系数(cv)喜玛拉雅的胚乳的RNA中建立起来的 cDNA文库，采用已描述过(拉合曼等，1998)的347-bp cDNA碎片 wSSIIp，在杂交条件下进行了筛选。通过50％甲酰胺，6×SSPE，0.5％ SDS，5×Denhardt’s，和1.7μg/mL鲑鱼精子DNA，在42℃进行16 小时杂交，然后在65℃下进行3洗×2×SSC(含0.1％SDS)，每次洗 1小时。
大麦基因组库的筛选
基本按照顾布勒等(2000)描述的方法，采用大麦SSII cDNA作 为试样建立并筛选了大麦(大麦变异系数(cv)Morex)基因组文库。
基因组克隆的定序
Morex SSII基因亚克隆到质体矢量里并进行了定序。292和 MK6827基因采用根据Morex顺序设计的引子，通过基因重叠区域的 PCR放大进行定序。PCR碎片要么直接定序，要么进行亚克隆之后， 从质体定序。
表达区域的识别
参考喜玛拉雅的cDNA顺序和Morex基因组顺序，定义了预计存 在于cDNA里的292和MK6827基因组顺序的区域。
SSII基因中G至A的突变的PCR分析
设计了放大292中识别的含有G至A的转移突变区域的PCR引子。 该引子的顺序是：ZLSS2P4(CCTGGAACACTTCAGACTGTACG SEQ.ID.NO 11) 和ZLBSSII5(CTTCAGGGAGAAGTTGGTGTAGC SEQ ID NO 12)。采用一个 FTS-1热定序器(科贝特，澳大利亚)，95℃中1次循环2分钟，95 ℃中35次循环30秒，60℃中1分钟，72℃中2分钟，25℃中1次循 环1分钟。
大麦胚乳蛋白的SDS-PAGE分析
从成熟过程中和成熟的大麦和小麦胚乳中提取了淀粉，并按照描 述(拉合曼等，1995)，用蛋白酶K去除了表面蛋白。用含有50mM Tris， pH6.8，10％SDS和10％2-巯基乙醇的0.5毫升提取缓冲济，从20毫 克的干淀粉中提取了淀粉粒蛋白。经过煮10分钟的胶化之后，每一 道上放置15毫升的上层清液来进行离心分离，并收集了淀粉。
双单倍体的生产
从292与坦坦加拉(澳大利亚阿德来得维特学院的P戴维斯博士 的Hordeum culgare cv Tantanjara)之间和342与坦坦加拉之间的 杂交所产生的F1植物中生产出了双单倍体。
逆交策略
292和Hordeum vulgare cv Sloop之间进行杂交而产生F1种子。 对F1种子长出的植物进行近亲繁殖来产生F2种子的种群。采用PCR 化验，测试F2种子长出的植物，而同型结合成292突变的植物与Sloop (BC1)进行逆交。从BC1中产生的F1植物又用PCR测试，挑选了同型 结合成292突变的植物，并与Sloop(BC2)进行回交。从BC2长出 的F1植物又一次进行PCR分析，并挑选了同型结合成292突变的植 物。这些植物要么进行近亲繁殖以便产生BC2F2种群，要么与Sloop (BC3)进行再次杂交。从BC3中产生的F1植物再一次进行PCR分析， 并挑选同型结合成292突变的植物。这些植物进行近亲繁殖以便产生 BC3F2种群。这些种子长出的植物进行了PCR测试，挑选了同型结合 成292突变的植物，用作单一种子系和种子扩大。
结果
突变变种的选择 兹沃(Zwar)和禅德勒(Chankler)已报告(1995)了用叠氮化钠从无 壳或无皮大麦品种“喜马拉雅”中导出各种突变变种的辨别方法。发 明家们辨认出了一组75种收缩的谷物突变变种，而收缩的种子中， 淀粉的直链淀粉含量是用HPLC(图1)来确定的。两个种类，292和 342，发现各自含有71％和62.5％的直链淀粉含量(图1)。292和342 的直链淀粉含量明显高于以前特性良好的AC38种类(直链淀粉47％， 见图1)。这项研究明确说明292和342表现出的奇高的直链淀粉表 现形态的基因基础，并说明谷粒和淀粉结构及功能上的因果突变结 果。
谷粒特性
谷粒大小及形态：
谷粒重量和形态上的突变结果是显著的(表2)。谷粒重量从母 种“喜马拉雅”的51毫克减少到292的32毫克和342的35毫克。 突变变种保留了野生品种的长度和宽度，但相比之下，变得扁平(从 喜马拉雅的2.82毫米平均厚度变成292的1.58毫米和342的1.75 毫米)，而且中央部分基本不饱满。图2表示突变变种和野生品种谷 粒的照片。其大小采用常规方法测量的，图2中显示谷粒长度(L)， 最宽点的谷粒宽度(W)和厚度(T)。谷粒长度(L)与厚度(T)之 间的比例有助于辨别物种突变，发现292或342物种突变的种子一般 具有的值＞3.5，而非突变变种大麦的值＜3.5。
谷粒成分：
突变变种的淀粉含量从喜马拉雅的49.0％减少到292的17.7％和 342的21.9％(见表1)。谷粒总重量中的淀粉重量的减少以提供谷 粒的非淀粉总含量，表明淀粉含量的损失相当于谷粒重量的损失，喜 马拉雅、292和342的非淀粉重量分别为26.0、26.3和27.3毫克。
292和342的蛋白质含量比母种喜马拉雅提高了(表1)，而这 一结果是由于谷粒损失淀粉引起的，而不是由于每一颖果的蛋白质合 成的提高引起的。
292和342突变变种的β-葡聚糖水平也提高了，而且从淀粉含 量的减少(表1)的结果所预期的要高。在两种情况下，每颖果的β- 葡聚糖含量提高了约20％，这可能表示一小部分碳从淀粉合成转移到 了β-葡聚糖的合成。
淀粉成分及功能
直链淀粉及支链淀粉含量
直链淀粉的含量是用两种技术确定的，第一种是90％(v/v)DMSO (二甲基亚砜)中的尺寸排除法，第二种是碘蓝色值法。用两种方法 确定的直链淀粉含量很接近，HPLC(高性能液体色谱)数据列在表1 中。
从突变变种和野生品种的谷粒重量和直链淀粉含量数据中，可以 算出每粒中淀积的直链淀粉数量。该分析表明，每粒的直链淀粉从喜 马拉雅的6.2毫克/颖果减少到292的4.0毫克/颖果和342的4.8毫 克/颖果。相比之下，每粒颖果的支链淀粉合成显著减少，从喜马拉 雅的18.7毫克减少到292的1.6毫克和342的2.9毫克。
链长分布
经异淀粉酶去枝的淀粉链长分布采用荧光团辅助碳水化合物电 泳(膜面)进行。292、342突变变种和喜马拉雅的链条长度分布列 在图3a中。图3b表示一个差别图表，其中292和342突变变种的标 准化链条长度分布是从喜马拉雅的标准化分布中减去的。从DP6-11， DP12-30和DP31-65中算出的链条长度百分比列在表3。292和342 突变变种的链条长度分布有明显的变化，以致于DP6-11的区域中比 DP12-30有更高的链条百分比。
差示扫描量热法测定
采用差示扫描量热法测定方法研究了突变变种的胶凝温度，并将 数据列在表4。292和342所产淀粉的胶凝温度在胶凝最高峰的开始、 最高峰及最终温度方面都明显比喜马拉雅低。292和342突变变种的 胶凝最高峰的热函也明显低于野生品种。292和342突变变种的直链 淀粉/脂质最高峰开始温度也降低了，但是，热函却提高了，与突变 变种的直链淀粉含量的提高相一致。
依据RVA的淀粉粘性
为了观察糊状粘性，进行了大麦粗面粉样品的RVA分析。以前的 研究已表明，粗面粉样品的分析与分离的淀粉的分析紧密相关(贝蒂 等，1997)。分析显示，所研究的大麦基因型之间存在着较大的差异 (见表5和图4)。含有野生品种淀粉的喜马拉雅和纳莫伊两种大麦 品种显示出了典型的RVA曲线，有一个突出的粘性高峰，其次是粘性 下降到固定的强度，最后，随着温度的下降，粘性提高到最终粘度。 与一般观察到的大麦淀粉一样，野生品种淀粉的最终粘度相当于，或 低于高峰粘度(表5)。在AC38中，得到了突出的高峰粘度，但是， 由于该品种的高直链淀粉含量，所以，所得到的最终粘度比高峰粘度 要大。然而，在292、342和MK6827中得到了很不相同的曲线。没有 得到与其它大麦淀粉的高峰粘度相应的明显的粘性初始提高，因此， 无法计算细分值。表5所列的292、342和MK6927的高峰粘度值是喜 马拉雅(Himalaya)高峰粘度时所记录的粘度。与其它粗面粉样品相 比，292、342和MK6827的粘度是在整个分析过程中一直提高，直到 最终粘度。如果根据淀粉含量进行标准化，292和342的淀粉具有很 高的最终粘度(见图5)。
膨胀性是测量面粉和淀粉特性的方法，用以探索材料接触热和过 剩的水分时的表现。通过在规定温度下，把样品与水搅拌成胶状材料 前后，对其分别称重来测量其增加的吸水量。分析表明，控制样品喜 马拉雅和坦坦加拉(Tantangara)膨胀至干燥重量的6至8倍，相比 之下，292和342只膨胀至干燥重量的2-3倍(表9)。
结晶性
通过X-射线结晶照相，进一步研究了淀粉的结构(见表6)。喜 马拉雅(Himalaya)显示了预期的谷物淀粉的图案，具有占优势的“A” 型结晶性，而AC38和瓦克希罗(Waxiro)都显示了很相似的X-光衍 射图案，只不过AC38的结晶性水平较低，而瓦克希罗(Waxiro)的 结晶性水平较高。292和342突变变种的X-光衍射图案则变成V型和 B型的混合型。除了衍射图案的变化之外，292和342突变变种的结 晶数量急剧下降，分别为9％和12％。这与292和342淀粉的低支链淀 粉含量相一致。
颗粒形态
用电子扫描显微镜观察了淀粉的颗粒形态(图6)。喜马拉雅 (Himalaya)(图6，A栏)，腊质大麦(Waxiro，图6，b栏)和 AC38(图6，c栏)的颗粒大小和形状与以前发表的正常大麦品种的 淀粉颗粒观察相一致。突变变种292(图6，d栏)，342(图6，e 栏)和MK6827(图6，f栏)的“A”型淀粉颗粒形状发生了明显的 变化，与正常大麦光滑的小扁豆似的形状相比，其颗粒表面变得复杂。
食物纤维
按照AOAC程序，进行了食物纤维分析，发现292和342具有增 加的食物纤维，增加的食物纤维是由于不能溶解的食物纤维的增加所 导致的，而不是由于可溶性食物纤维的增加所导致的(表1)，这与 食物纤维为抵抗性淀粉和β-葡聚糖相一致。值得注意的是，食物纤 维的这种测量方法是化学确定方法，从营养学的角度看，与生理学的 方法相比更加清楚。
突变变种的基因基础
分离比率
大麦品种的突变杂交不显示收缩的292和342胚乳显型，证明突 变是直接的逆行突变，显示异型杂交种群的F2种子的收缩率为3∶1 (正常∶收缩)，而沿着单异型杂交发展的双单倍体种群种子的收缩 率为1∶1(正常∶收缩)(见表6)。正常的定义为种子的L/T(长度/ 厚度)＜3.5，收缩的定义为种子的L/T＞3.5。
突变变种的等位基因特性
通过292和342的杂交后代的分析，292和342的突变显示出具 有等位基因。通过逆向杂交得到的所有F1种子的谷粒重量和形状都 在母系292和342品种的大小及形状范围之内，却在母系喜马拉雅 (Himalaya)种子的大小及形状范围之外。另外，通过292×342 F1 植物得到的所有F2种子均表现出了292和342突变变种的典型的收 缩种子显型。
大麦种质集(USDA-ARS，国家小谷物种质研究机构，美国爱达荷 州83210，阿伯迪因)中所找到的收缩谷粒突变变种系列的谷粒形状 和淀粉特性的分析表明，具有sex6突变的品种MK6827(BGS31，也 称GSHO2476)显示了一组与292和342突变很相似的淀粉和谷粒特 性。292和MK6827之间进行杂交之后，所有的F1谷粒在谷粒重量和 收缩种子显型方面均显示出了典型的292显型。292×MK6827 F1植 物所得的F2种子均显示出了L/T比例＞4的收缩的胚乳显型。相比 之下，292和商用大麦栽培突变斯鲁普(Sloop)杂交所得的F2种子 产生了两种方式的分布，收缩和饱满的种子变异比例为3∶1(表6)。 292与其它5种收缩胚乳显型(BGS 380，收缩胚乳4，7HL(扎维等， 1975)；BGS 381，收缩胚乳5，7HS(扎维等，1975)；BGS 382，sex1，6HL (埃斯里克和莱斯，1976)；BGS 396，收缩胚乳6，3HL(拉马智和 埃斯里克，1975)；BGS 397，收缩胚乳7，未绘制，(拉马智和埃 斯里克，1975))之间杂交所得的F1种子均产生了饱满谷粒形状。 基于此，可认定292、342和MK6827突变为等位基因的，而基于以前 发表的sex6位置图，292和342突变预测为大麦染色体7H的短臂， 从着丝点约4cM(尼茨维塔夫，1990；尼茨维塔夫和克里斯丁科夫， 1993；比亚谢夫等，1986；尼茨维塔夫，1992)。
连锁分析
通过292与拥有90个后代品种的商用大麦品种坦坦加拉 (Tantangara)之间杂交，产生了双单倍体种群(表8)。
这些品种按种子形状(饱满或收缩)，依据膜面的链条长度分布 (具有DP6-11的链条的百分比)，种子外部(裸的或去壳的)，以 及PCR标记(见下)做了记录。其数据列在表8。在这一种群中，收 缩的种子特性和292的膜面分布准确地发生了相同变异，这与谷粒大 小和形状的变化是淀粉堆积变化的结果的预期是相同的。特性的相同 变异在图8中列出。A栏表示淀粉链条长度(用DP6-11之间的链条 百分比列出)与长度比厚度的比例之间的关系。打开的圆圈表示具有 292突变PCR标记的品种，十字型表示具有野生品种PCR标记的品种。 这两个品种之间，存在明显的区别。图8的B栏表示淀粉链条长度与 种子重量之间的关系，并表示突变的种子重量比长度对厚度的比例更 难辨别。
大麦有没有皮取决于位于染色体7H的nud部位，而由于坦坦加 拉(Tantangara)为有皮大麦，而292为无皮大麦，这一特性可以记 录在双单倍体后代里。对无皮/有皮特性与膜面数据之间的联系的分 析表明，在这一杂交中，292突变绘制在nud部位的16.3cM以内。 这一位置符合以前绘制的等位基因sex6突变的数据(尼茨维塔夫， 1990，尼茨维塔夫和克里斯丁科夫，1993，比亚谢夫等，1986，尼茨 维塔夫，1992)。
因果基因的识别
据显示，nud基因位于大麦染色体7H(图8，菲达克等，1972)。 在小麦中，3个淀粉合酶(GBSS，SSI和SSII)和一个异淀粉酶型去 枝酶(S.拉赫曼，个人通讯)位于染色体7(同源染色体)的短臂 上(山森和恩多，1996；李氏等，1999a；李氏等，1999b；李氏等， 2000)。Nud部位的紧密的关联性暗示了最为可能的候选基因为SSII 基因。小麦的SSII基因是在cDNA级别(李氏等，1996b；基因库添 加号AF155217)和染色体组级别(李氏等，个人通讯)上无性繁殖， 而一个大麦的cDNA是独立并无性繁殖的(图9)。大麦和小麦的SSII 染色体组顺序排列表明，其基因有很相似的编码顺序/基因内区结构， 但是，顺序之间的基因内区长度有所不同(图10)。喜马拉雅 (Himalaya)的摩力克斯(Morex)染色体组顺序与cDNA顺序的对照 (图9)导致从摩力克斯(Morex)、292和MK2827演绎出的cDNA顺 序的识别。
图11表示从对应于1829排列位置的292的SSII基因中发现的 G至A的过渡突变。该突变将一个停止基码导入292的SSII开放阅 读结构(图12)。坦坦加拉和喜马拉雅的顺序分析表明，两种野生 品种的基因在该区域是相同的，而且292和342都包含了相同的G至 A的过渡突变。导入的停止基码截短基因成分，使整个淀粉合酶II 基因的C-终端接触反映的范围无法解释，因此，所有的SSII的活动 很可能被这个突变取消。
图11表示，G至A的过渡也存在于MK6827的排列位置242，而 喜马拉雅的cDNA顺序列在图9。该突变也把一个停止基码导入292 的SSII开放阅读框架(图12)，并防止超过90％的SSII基因的解释， 取消由该基因编码的SSII活性。
292中的G至A的过渡中断了大麦SSII基因中的限制部位 (NlaIV)。辨别NlaIV部位的位置列在图14，(a)栏和(b)栏。 图14c表示大麦的NlaIV分类成分的琼脂糖凝胶体电泳，表明292突 变的辨别图案是在292和342，却不在MK6827、喜马拉雅(Himalaya) 或坦坦加拉(Tantangara)。
对292×坦坦加拉(Tantangara)双单倍体种群的90个品种记 录了G至A的过渡的PCR标记，而且发现与收缩种子和膜面链条长度 分布显型准确地相同变异，表明292突变完全与该淀粉显型相连，并 且，这一突变很可能是潜伏在292显型下面的因果突变。图14d表示 源自292×坦坦加拉(Tantangara)双单倍体种群的品种的分析。
SSII活性降低的生化证明
用一系列的凝胶体电泳技术，研究了突变变种和正常大麦品种的 淀粉生物合成酶的成分。发育着的胚乳可溶性部分分析证明，所有的 品种都含有BEI、BEIIa、BEIIb、SSI和SSIII，而且，这些BE和SS 的相同形态的内容在本质上都没有改变。但是，淀粉颗粒的分析表明， 缺少几个带。首先，SDS-PAGE分析(图16，B栏)表明，292、342 或MK6827都没有90kD的一个带，而喜马拉雅(Himalaya)、坦坦加 拉(Tantangara)和AC38则都有。免疫吸收法显示，该带拥有SSII(图 16，B栏)、BEIIa和BEIIb。发现BEIIa和BEIIb存在于可溶性部分， 而不存在于颗粒中，这表明292、342和MK6827突变变种中的这些酶 的分布有所改变，而不是取消表达的突变。相比之下，在可溶性或颗 粒部分(图16，A栏和B栏)中都没有发现有SSII表达的证据，这 与292、342和MK6827中可直接把SSII突变与所观察到的显型相连 的基因证据相一致。
具有292突变的品种的栽培
为了把292突变转变成选择性的大麦基因型，采用了两种策略。
在第一个例子中，从292和坦坦加拉(Tantangara)的杂交中产 生了双单倍体品种。表8中列出了包括种子重量、L∶T比例、链条长 度分布及SSII DNA标记状态数据。表9对这些品种做出了更综合性 的分析，包括RVA分析，β-葡聚糖含量及面粉膨胀体积。数据显示， 具有292突变的品种具有明显不同的RVA参数(例如，高峰/最终粘 度比例)，更高的β-葡聚糖含量和面粉膨胀体积变化。
在第二个例子中，通过进行从292到具有正常淀粉特性的一个栽 培变种(cv Sloop)的两个回交来转变了突变。收集了产自三个回交 2F1植物的F2种子，以供分析。F2种子分成L∶T比例＞3.5和L∶T 比例＜3.5。两类种子的分布符合单一隐性基因的要求。产自每一种 植物的种子类型的面粉膨胀体积列在图10，表明通过具有平均75％ 的斯鲁普(Sloop)背景的品种栽培过程，淀粉的膨胀特性得到了明 显的转变。
讨论
我们描述具有收缩的胚乳显型的大麦的神奇突变变种292和342 的变异。谷粒成分的分析证明，收缩的显型是由于淀粉含量的显著的 减少，而淀粉成分的分析表明，这种减少是以因减少支链淀粉的合成 所导致的高直链淀粉的显型来表现的。
292和342突变变种具有独特的谷粒和淀粉特性的结合，含有更 多的β-葡聚糖和抵抗性淀粉。该品种的β-葡聚糖含量大约提高了 15％，这是淀粉含量的减少所导致的预期的结果，表明不能转化成淀 粉的碳转化为β-葡聚糖的合成。食物纤维含量的确定表明，突变变 种的谷粒有更多的食物纤维，而这种增加是由于不能溶解的食物纤维 的增加所导致的。
这种特性的组合表明，这种突变变种可能具有成为人类食物的组 成部分的很有趣的潜力。首先，较高的β-葡聚糖含量意味着这些品 种可能有助于通过精心安排β-葡聚糖的作用来降低胆固醇的含量。 其次，抵抗性淀粉的存在意味着这些品种可能有助于肠道健康，利用 其抵抗性淀粉的功能来提高结肠内的发酵(托平等，1997；托平， 1999)。再次，谷粒的成分表明，这些品种会有较低的能量密度，消 化速度可能较慢，意味着它们可能会提供低糖类食物。
例示品种的淀粉特性也很独特，有较高的直链淀粉，而直链淀粉 又有较低的胶化温度。这一点与通过突变分枝酶IIb来提高直链淀粉 含量时胶化温度一般升高的其它变种形成对照，比如，增加直链淀粉 的玉米变种(Ng等，1997；卡茨等，1993；科鲁格等，1987；弗瓦 等，1999)。虽然292的直链淀粉含量相当于其它增加直链淀粉的品 种，但其淀粉的支链淀粉结构却明显不同(王氏等，1993)。在292 和342中，支链淀粉的链条长度分布朝着低聚合程度方向变化，而在 增加直链淀粉的品种中，链条长度分布是朝着高聚合程度方向变化。 这意味着，不是直链淀粉的含量，而是支链淀粉才是确定胶化温度重 要因素，而这一效果是通过支链淀粉分子的外部链条之间的相互作用 力来获得的。简等人于1999年注意到了多种淀粉的类似的效果。
RVA分析的粘度数据表明，SSII突变变种的淀粉与正常大麦和 AC38有所不同。SSII突变变种没有像一般品种那样，随着温度提高 到95℃时，在RVA温度曲线的开头部分出现粘度高峰。相反，这些 突变变种的粘度是逐渐上升的，直至最终粘度。这些数据与其颗粒的 低支链淀粉含量、颗粒中的低支链淀粉结晶量，以及用差别扫描热量 计所观察到的低胶化温度和热函是相一致的。在水中加热、搅动，使 其颗粒中的直链淀粉被释放出来时，可达到较高的最终粘度。这种 RVA特性在谷物淀粉中是独特的，可为需要低糊状粘度和高最终粘度 的食品及工业应用提供神奇的淀粉来源。
DSC的胶化温度的观察是从X-光衍射研究结果中反映出来。292 和342的颗粒的结晶量减少了，而晶体形状从谷物淀粉的典型的A型 变成V型和B型的混合型。V型是直链淀粉的典型的形状，反映出淀 粉中与脂肪酸合成的直链淀粉的成分，而B型衍生自支链淀粉，预计 反映出淀粉的残留支链淀粉含量(布里恩等，1998)。
对292和342突变变种的基因基础的分析表明，突变是简单的逆 向突变，在异型杂交实验中，表现出典型的孟德尔比率。杂交研究表 明，292和342是等位基因的。对292与其它收缩胚乳变种之间在杂 交实验中的相互作用的进一步的分析表明，292/342变种与MK6827 品种的Sex6也是等位基因。这一变种以前已经绘制出来，表明其位 置在染色体7H短臂上，离着丝点3cM以内的位置(尼茨维塔夫，1990； 尼茨维塔夫和克里斯丁科夫，1993；比亚谢夫等，1986；尼茨维塔夫， 1992)。
在有皮大麦坦坦加拉(Tantangara)与无皮的292突变变种之间 建立了双单倍体种群，其收缩胚乳变种绘制在染色体7H的短臂上， 离nud基因16cM之内的位置，该位置与Sex6变种的绘制位置相一致。
在染色体7H短臂上，靠近着丝点的基因定位表明，因果突变 (sex6)是在一个不同的基因里，朝着引起绘制在染色体1H(斯肯德 尔梅尔等，1992)的AC38(amo1)的高直链淀粉显型的突变。绘图位 置暗示着sex6/292变种中中断的一个基因候选是淀粉合酶II，小麦 的淀粉合酶II也位于染色体的该相同位置(山森和恩多，1996；李 氏等，1999b)。292和342变种的排列分析表明，在基因中有G至A 的过渡突变，引起基因的切断，使含有酶的活性部位的C-端区无法 解读，可能导致完全不活跃的蛋白合成。另外，MK6827的SSII基因 排列显示了在242位置上的G至A的过渡突变，这也会引起基因的切 断。这一结果确认292和MK6827变种的等位基因特性。
SSII基因中的突变的识别引发了292中突变的PCR标记辨别的 发展。这一PCR标记的记录穿过292×坦坦加拉种群的91后代，而 且发生了与淀粉的收缩胚乳显型和减少链条长度分布显型百分之百 地相同的变异。在不同背景的大麦(292和MK6827)的SSII基因中发 现引起相似的显型的等位基因突变，以及发现变种与收缩谷粒显型的 密切关系，有力地证明292、342和MK6827的SSII基因中存在的突 变是导致收缩胚乳特征的因果突变。
在此观察的大麦中SSII突变的显型，在某些方面，与其它植物 的SSII突变显型很相似，但是，SSII突变没有像292/342中所发现 的突变那样显著地提高了直链淀粉的含量。发现豌豆(rug5，克雷戈 等，1998)和衣藻(方泰因等，1993)也有SSII突变，而且，正如 在此观察到的一样，提高了支链淀粉含量，减少的链条长度分布。也 有证据表明，玉米的收缩-2突变是通过SSII基因的突变产生的，但 这一结论尚未得到证明(哈恩等，1998；奈特等，1998)。玉米的收 缩-2突变产生具有胶化温度降低的淀粉(坎贝尔等，1994)。山森 在小麦中培育出了缺少Sgp-1蛋白的三无品种(山森，1998)，而李 氏等人(李氏等，1996b)证明了该品种为SSII基因产品。在小麦中， 直链淀粉含量提高到约35％，并观察到了不正常淀粉颗粒，结晶变化 以及胶化温度变化(山森，1998)。大麦的SSII突变与其它物种的 SSII突变之间的特征差异非常出人意外。
SSII突变说明可通过栽培从一个基因背景转化成另一个，并产 生原有292、342和MK6827的典型的辨别颗粒形状和成分。表9的 292×坦坦加拉(Tantangara)双单倍体品种的数据中，L/T比率、 β-葡聚糖含量、链条长度分布、RVA和面粉膨胀体积参数证明，具 有292突变的品种表现出典型的292母种的显型。进而，292与斯鲁 普(Sloop)的第二次逆向杂交的近亲繁殖后代所产生的种子的变异 显示了正常显型(74粒种子的L/T比例＜3.5)和收缩显型(21粒种 子的L/T比例＞3.5)变异的3∶1变异率。
SSII基因排列和大麦转化体系的获得，提供了用基因抑制技术 打开SSII基因所需的工具，用来产生可与SSII突变相媲美的显型。 最近开发的高效策略是，生产一种发夹结构用以产生一个能够抑制内 源性SSII活性的双链RNA。虽然在此描述的类似突变的突变变种的 完全打开会令人感兴趣，但具有不同促进济的DNA结构的使用及具有 不同水平的发夹结构表达的基因转移的恢复，使得采用滴定法测量从 正常水平到完全打开水平的基因的表达影响可以得到评估。
突变表示，能够从292转移至其它大麦基因背景，同时保留原始 292突变的基本特征。表9和表10中列出了292×坦坦加拉 (Tantangara)双单倍体后代和与斯鲁普(Sloop)逆向杂交二代种 子的显型数据，表明显型是在栽培过程中转移的。
                                              表1
                                          大麦谷粒成分   淀粉含   量   (％)a     按照     HPLC     的直链     淀粉含     量     (％)b            按照碘  胶合的  直链淀  粉含量  (％)     蛋白质     含量     (％)a     β-葡     聚糖     (％)a     总食物     纤维a     (％)     不可溶     性食物     纤维a     (％)     可溶     性食     物纤     维a     (％) 冰川   n.d.     31.0   .n.d.     11.5     4.3     21.6     16.6     5 AC38   47     47.4   60.6     10.4     5.8     24.9     28.8     6.1 喜马拉 雅   49     25   25.4     10.0     4.8     27.1     18.1     9 292   17.7     71   68.9     15.0     9.5     30.3     21.4     8.9 342   21.9     62.5   71.7     15.7     8.3     28.3     19.4     8.9 MK6827   10.2     n.d.   44.4     21.3     n.d.     n.d.     n.d.     n.d. 瓦克希 罗   42.8     n.d.   5.0     14.6     n.d.     19.8     12.7     7.1. 坦坦加 拉   51.6     n.d.   29.5     14.6     n.d.     17.2     12.7     4.5. a％谷粒重量，14％水分 b％淀粉总含量的 n.d.未确定
                          表2
                        谷粒规格  谷粒重量  (mg)  谷粒长度  (mm)  谷粒宽度  (mm)  谷粒厚度  (mm)  L/T比率 喜马拉雅  51.01  6.63a  7.01  0.51  3.58  0.34  2.82  0.36  2.48 坦坦加拉  50.40  6.51a  7.22  0.98  3.60  0.25  2.73  0.21  2.64 瓦克希罗  45.71  5.21  7.54  0.47  3.40  0.20  2.67  0.19  2.82  AC38  50.79  8.22  7.62  0.65  3.35  0.27  2.64  0.25  2.89  292  32.13  4.67a  7.05  0.49  3.63  0.55  1.58  0.20  4.46  342  35.45  6.01  7.28  0.55  3.76  0.38  1.75  0.18  4.16  MK6827  44.89  3.78  11.20  0.58  3.63  0.27  1.77  0.33  6.33 N＝50，除非标明a，n＝200
                                   表3
                         异淀粉酶去枝淀粉的链长分布 Dpa   喜马拉雅   ％b     坦坦加拉     ％b     AC38     ％b     342     ％b     292     ％b   MK6827   ％b DP6-11   24.15     22.40     26.33     38.18     38.96   37.98 DP12-30   69.12     67.59     67.62     54.14     53.42   55.60 DP31-60   6.73     10.01     6.05     7.68     7.62   6.42 a聚合度 b以摩尔表示的低聚糖分布比例
                                       表4
                             用DSC测量的大麦淀粉温度特征         最高峰1         最高峰2     开始     最高峰     最终     H     开始     最高峰     最终     H  冰川     55.4     59.3     65.3     4.2     93.9     101.4     107.7     0.87  AC38     55.0     62.2     68.2     3.9     89.3     100.1     106.9     1.195  喜马拉雅     56.8     60.9     68.0     4.5     93.1     101.8     108.3     0.78  292     46.0     51.2     58.1     0.29     88.7     97.7     104.9     1.34  342     45.2     50.4     56.8     0.47     86.5     97.0     105.0     1.59
                                    表5 
                             大麦淀粉的RVA参数   高峰粘度    破裂  持续强度   逆转     最终粘度     标准化的最     终粘度*     糊状温     度     (C) 喜马拉雅   871.5     653.1   218.4   235.8     454.2     926     64.9 纳摩伊 Namoi   621.7     367.5   254.2   375.3     629.5     1284     65.9 AC38   226.7     87.3   139.4   188.4     327.8     697     68.9 292   92.1**     ***   133.9   230     363.9     2055     89.5 342   110.9**     ***   144.9   264.5     409.4     1869     87.9 MK6827   18.2**     ***   25.7   43.3     69     676     n.d. *    粗面粉的淀粉含量来区分的最终粘度 **   在高峰粘度时记录的喜马拉雅数值 ***  数值小于零 n.d. 未确定
                            表6 
                         淀粉结晶数据 样品     ％H2O     (W.B)     结晶     ％*     A     ％*     B     ％*     V     ％* 292     29.6     9     -     13     87 342     35.8     12     -     18     81 AC38     26.1     19     93     7    (微量) 喜马拉 雅     27.7     27     93     7    (微量) 瓦克希 罗     29.7     41     94     6    - (*  ±5％)
                           表7
                        后代分析  杂交  收缩  饱满     计算的2值c  292×斯鲁普a  45  155    2(3∶1)＝1.0  292×坦坦加拉b  45  46    2(1∶1)＝0.01 a   标准杂交产生的后代 b   双单倍体后代 c   在每一种情况下，2(0.05)，df＝1＝3.84，因此，292×斯鲁普种群符合
3∶1变异，而292×坦坦加拉双单倍体种群符合1∶1变异。
                            表8
                   292×坦坦加拉双单倍体品种记录
品种号a   表皮b    种子重量  L/T比率c DP6-11  直链淀粉    PCRf
                      (mg)                (％)d   含量e
  1         N          26        3.8       35.87    50.2      292
  2         N          24        4.21      36.87    56.2      292
  3         H          43        3.32      25.45    18.3      Wt
  5         N          40        4.58      39.47    55.5      292
  7         N          34        4.28      19.63    43.0      292
  8         H          48        3.02      21.6     46.7      Wt
  9         N          31        2.76      22.89    25.9      Wt
  10        N          26        3.02      27.56    21.1      Wt
  11        N          34        3.55      37.90    44.7      292
  12        H          50        2.94      26.37    32.8      Wt
13       N        27      4.29      38.68      48.4     292
14       H        56      3.07      22.98      20.8     Wt
15       H        46      2.74      24.88      22.9     Wt
16       H        43      2.78      25.40      18.3     Wt
17       N        31      3.8       37.37      54.2     292
18       N        31      4.51      37.46      57.5     292
19       H        26      3.1       29.57      22.7     Wt
20       H        53      3.04      25.42      23.8     Wt
21       N        31      4.5       38.51      59.1     292
22       N        27      4.63      37.25      27.2     292
23       H        47      2.73      24.11      21.2     Wt
24       N        27      4.58      36.89      42.0     292
26       H        35      3.57      19.50      15.1     Wt
27       H        22      4.3       36.81      48.6     292
28       N        31      4.34      38.88      37.0     292
30       N        30      4.04      38.05      48.4     292
31       N        23      4.25      37.07      51.7     292
32       H        48      2.62      20.67      13.0     Wt
33       N        25      4.92      35.68      33.3     292
34       N        31      4.01      38.34      46.1     292
35       H        43      3.16      20.07      23.6     Wt
36       N        26      4.33      36.93      29.7     292
38       H        38      3.01      21.11      9.1      Wt
39       H        33      2.92      20.49      23.5     Wt
40       H        36      2.99      19.57      2.2      Wt
41       N        30      4.05      37.82      40.9     292
42       H        47      2.95      20.80      11.9     Wt
43       N        40      3.24      21.97      18.1     Wt
45       H        52      2.78      19.97      14.5     Wt
46       N        29      4.44      35.87      32.1     292
47       N        35      3.69      36.34      92.9     292
48       H        31      2.54      20.27      13.4     Wt
49       H        54      2.94      22.29      19.3     Wt
50       H        50      2.94      21.92      20.6     Wt
51       H        43      3.73      20.59      18.1     Wt
53       N        31      4.12      36.52      55.3     292
54       N        34      4.02      35.17      57.1     292
55       H        32      4.19      41.35      60.4     292
56       N        29      3.17      21.48      18.1     Wt
57       H        30      4.85      36.66      46.3     292
58       N        32      2.97      23.83      13.8     Wt
59       N        46      2.91      24.15      9.2      Wt
60       H        44      2.74      22.39      13.5     Wt
61       N        31      4.47      35.67      61.3     292
63       N        32      4.3       36.94      39.4     292
64       H        39      2.93      21.95      20.5     Wt
65        N      26      3.87      37.51        20.7      292
66        N      30      4.03      36.89        48.7      292
67        H      36      3.17      20.24        14.4      Wt
68        N      43      2.65      22.53        8.4       Wt
69        N      32      3.93      36.34        54.7      292
70        H      43      2.77      22.28        17.6      Wt
71        N      29      3.73      38.73        31.5      292
72        H      47      2.65      22.00        20.8      Wt
73        N      36      4.09      39.58        49.0      292
74        N      24      4.18      36.15        47.8      292
75        H      34      2.99      24.42        14.2      Wt
76        N      31      4.35      35.95        49.9      292
77        H      49      3.19      21.22        17.0      Wt
78        H      33      2.78      21.27        15.6      Wt
79        H      31      2.85      23.04        21.2      Wt
80        H      38      3.18      19.88        18.9      Wt
81        H      37      2.84      24.22        16.2      Wt
82        H      33      4.64      39.99        45.3      292
84        N      28      3.62      36.98        28.9      292
85        N      26      6.44      44.43        41.3      292
86        H      32      2.87      30.73        16.1      Wt
88        N      26      4.62      46.12        39.3      292
89        H      38      2.88      31.25        16.3      Wt
90        H      32      3.19      31.11        13.8      Wt
91        N      31      4.17      42.86        37.3      292
92        N      27      3.99      45.30        44.6      292
93        H      37      2.99      30.77        12.5      Wt
94        H      43      3.67      29.46        21.9      Wt
96        N      33      5.69      47.34        52.2      292
97        N      23      3.41      31.36        17.1      Wt
98        N      32      5.95      45.27        52.4      292
99        N      19      3.68      38.36        1.7       292
100       H      36      3.1       31.92        15.4      Wt
101       N      58      3.29      24.71        2.9       Wt a  292×坦坦加拉双单倍体品种 b  表皮显型。N表示无皮；H表示有皮。 c  L/T比率：长度与厚度比率。 d  DP6至DP11的去枝淀粉中，链条的百分比，以摩尔基础作为DP6与DP65之间    的链条百分比，通过DP6与DP65之间的洗提来计算的。 e  通过碘蓝色值确定直链淀粉含量 f  PCR记录。292，PCR反应产生可在NlaIV煮解上生成169bp带，加上103bp 的带；Wt，PCR反应产生可在NlaIV上生成111bp，103bp和57bp的带。
                                                  表9
                                         双单倍体品种的具体分析  品种     L/T比率     膜面     RVA高峰粘     度     (RVA单位)     RVA最终粘     度     (RVA单位)     高峰/最终     粘度比率    β-葡聚糖    含量     (％)     面粉膨胀量  控制  斯鲁普(Sloop)     2.78     23.5     535.8     483.5     1.11     2.3     7.54  坦坦加拉  (Tantangara)     2.64     22.4     507     395.1     1.28     5.16     5.97  喜马拉雅  (Himalaya)     2.48     24.2     873.9     449.3     1.94     8.53     8.18  AC38     2.89     26.33     226.7     327.8     0.69     5.8     3.75  292     4.46     38.9     92.1     363.9     0.25     13.09     2.00  MK6827     6.33     37.98     18.2     69     0.26     n.d.     2.11  双单倍体品种  野生品种  8     3.02     21.6     527.9     431.3     1.22     8.9     6.47  43     3.24     25.4     566.6     527.4     1.07     7.77     6.04  56     3.17     24.9     703.1     523.5     1.34     7.81     6.95  58     2.97     27.9     726.8     588.8     1.23     9.65     6.23  59     2.91     27.0     655     435.8     1.50     7.16     7.21  68     2.65     22.5     876.3     465.5     1.88     8.87     8.63  101     3.29     34.71     471.3     410.3     1.15     6.54     6.26  突变变种SSII   5     4.58     39.5     68.7     316.6     0.217     9.87     2.55   11     3.55     48.2     51.5     240.8     0.21     8.36     2.58   13     4.29     38.7     43.7     265.5     0.16     11.13     2.92   27     4.30     36.8     20.3     96.6     0.21     13.11     2.71   30     4.04     38.05     57.3     251.1     0.23     10.56     2.27   31     4.25     37.1     17.6     124.5     0.14     11.35     2.48   33     4.92     35.7     11.7     83.5     0.14     7.22     2.13   36     4.33     36.9     14.5     93.6     0.15     7.20     2.20   46     4.44     35.9     31.3     175.8     0.18     10.02     2.32   91     4.17     42.9     35.8     189.5     0.19     11.3     2.43 n.d.未确定 
                 表10
      BC2F2种子的面粉膨胀数据 品种     膨胀体积 C5/1植物1 L∶T＞3.5     2.118 C5/1植物1 L∶T＜3.5     6.913 65/2植物1 L∶T＞3.5     2.382 65/2植物1 L∶T＜3.5     7.565 65/2植物2 L∶T＞3.5     2.409 65/2植物2 L∶T＜3.5     6.707
实例2
载体的设计及构造
把大麦SSII基因区域(图15中确定)克隆到载体里进行 转化。根据基因抑制策略，为每一个基因对象准备三种结构成 分，(1)感觉联合抑制，(2)抗感觉，(3)双重调节抑制。
图16列出了为抑制内源性对象基因表达而设计的DNA结构 成分的排列配置。促进济可选用胚乳专用启动子(例如，高分 子重量麦谷蛋白启动子，小麦SSI启动子，小麦BEII启动子) 或者非胚乳专用启动子(例如，ubiquitin或者355)。结构成 分中还可含有提高转换的其它成分，例如OCS的nos3成分。将 所列DNA区域混入含有适当、可选的标记基因排列和其它成分 的载体里面，或者与含有这些排列的载体共同转化的载体里面。
谷物的转化
对大麦(廷吉等，1997；万氏等，1994)，燕麦(萨默斯 等，1992，1994；格里斯等，1998；张氏等，1999；草氏等， 1999)和黑麦(卡斯蒂罗等，1994；皮娜等，1984)的转化方 法进行了描述，可用以转化产生转基因植物的DNA结构成分。
转基因的分析
通过PCR或南方杂交的DNA结构成分的DNA的辨别，进行 了转基因植物的辨别。通过分别进行北方杂交和西方吸取等标 准工艺，在mRNA和蛋白水平，测量了个别大麦淀粉生物合成基 因的标记水平。用实例1中例示的标准的工艺等测量了淀粉和 谷粒含量及成分。
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                             顺序列表 <110>联邦科学和工业研究机构， <120>降低了SSII活性的大麦和降低了支链淀粉含量的淀粉和淀粉制品 <160>12 <210>1 <211>2920 <212>DNA <213>Hordeum vulgare <220> <223>SSII cDNA <400>1 cctcgaggtg cgtttacccc acacagagta cactccaact ccagtccaat ccagcccact     60 gccgcttctg cccgcccatc gtaccgtcgc ccgccccgat cccggccgcc gccatgtcgt    120 cggcggtcgc gtcccccgcg tccttcctcg cgctcgcgtc cgcctcgccc gggagatcat    180 cacggaggag ggcgagggtg ggcgcgtcgc caacccgcgc tggggccggc aggctgcaat    240 ggcggccgtc gccgctgcag cgcacggctc gcgacggagc ggtggccgcg cgcgccgccg    300 ggatcgacga cgccgcgccc ggtaggcagc cccgcgctcg ccgctatggc gccgccacca    360 aggtcgcgga tcccgtcaag acgctcgatc gcgacgccgc ggaaggtggt gggccgtccc    420 cgccggcacc gaggcaggac gccgcccgtc tgccgagtaa gaacggcacg ctgatcaacg    480 gtgagaacaa acctaccggc ggcggtggcg cgactaaaga cagcgggctt gccacacccg    540 cacgcgcgcc ccatctgtca atccaaaaca gagtaccggt gaacggtgaa aacaaacata    600 aggtcgcctc gccgccgacc agcatagtgg atgtcgcgtc tccgggttcc gcagctaaca    660 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<400>2 gtgcgtttac cccacacaga gtacactcca actccagtcc agtccagccc actgccgctt     60 ctgcccgccc atcgtaccgt cgcccgcccc gatcccggcc gccgccatgt cgtcggcggt    120 cgcgtccccc gcgtccttcc tcgcgctcgc gtccgcctcg cccgggagat catcacggag    180 gagggcgagg gtgggcgcgt cgccaacccg cgctggggcc ggcaggctgc aatgacggcc    240 gtcgccgctg cagcgcacgg ctcgcgacgg agcggtggcc gcgcgcgccg ccgggatcga    300 cgacgccgcg cccggtaggc agccccgcgc tcgccgctat ggcgccgcca ccaaggtcgc    360 ggatcccgtc aagacgctcg atcgcgacgc cgcggaaggt ggtgggccgt ccccgccggc    420 accgaggcag gacgccgccc gtctgccgag taagaacggc acgctgatca acggtgagaa    480 caaacctacc ggcggcggtg gcgcgactaa agacagcggg ctgcccacac ccgcacgcgc    540 gccccatctg tcaatccaga acagagtacc ggtgaacggt gaaaacaaac ataaggtcgc    600 ctcgccgccg accagcatag tggatgtcgc gtctccgggt tccgcagcta acatttccat    660 cagtaacaag gtgccgccgt ccgttgtccc agccaagaag acgccgccgt cgtccgtttt    720 cccggccaag aaggcgccgc cgtcgtccgt tgtcccggcc aagaagacgc tgccgtcgtc    780 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caccgagttg cctgagcact acctggaaca cttcagactg tacgaccccg tcggcggtga    1680 gcacgccaac tacttcgccg ccggcctgaa gatggcggac caggttgtcg tcgtgagccc    1740 cgggtacctg tgggagctga agacggtgga gggcggctgg gggcttcacg acatcatacg    1800 gcagaacgac tggaagaccc gcggcatcgt gaacggcatc gacaacatgg agtggaaccc    1860 tgaggtggac gtccacctga agtcggacgg ctacaccaac ttctccctga agacgctgga    1920 ctccggcaag cggcagtgca aggaggccct gcagcgcgag ctggggctgc aggtccgcgg    1980 cgacgtgccg ctgctcgggt tcatcgggcg gctggacggg cagaagggcg tggagatcat    2040 cgcggacgcg atgccctgga tcgtgagcca ggacgtgcag ctggtgatgc tgggcacggg    2100 gcgccacgac ctggagagca tgctgcagca cttcgagcgg gagcaccacg acaaggtgcg    2160 cgggtgggtg gggttctccg tgcgcctggc gcaccggatc acggcgggcg ccgacgcgct    2220 cctcatgccc tcccggttcg agccgtgcgg gctgaaccag ctctacgcga tggcctacgg    2280 caccatccct gtcgtgcacg ccgtcggcgg cctgagggat accgtgccgc cgttcgaccc    2340 cttcaaccac tccgggctcg ggtggacgtt cgaccgcgcc gaggcgcaca agctgatcga    2400 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ctgcccgccc atcgtaccgt cgcccgcccc gatcccggcc gccgccatgt cgtcggcggt    120 cgcgtccccc gcgtccttcc tcgcgctcgc gtccgcctcg cccgggagat catcacggag    180 gagggcgagg gtgggcgcgt cgccaacccg cgctggggcc ggcaggctgc aatggcggcc    240 gtcgccgctg cagcgcacgg ctcgcgacgg agcggtggcc gcgcgcgccg ccgggatcga    300 cgacgccgcg cccggtaggc agccccgcgc tcgccgctat ggcgccgcca ccaaggtcgc     360 ggatcccgtc aagacgctcg atcgcgacgc cgcggaaggt ggtgggccgt ccccgccggc     420 accgaggcag gacgccgccc gtctgccgag taagaacggc acgctgatca acggtgagaa     480 caaacctacc ggcggcggtg gcgcgactaa agacagcggg ctgcccacac ccgcacgcgc     540 gccccatctg tcaatccaga acagagtacc ggtgaacggt gaaaacaaac ataaggtcgc     600 ctcgccgccg accagcatag tggatgtcgc gtctccgggt tccgcagcca acatttccat     660 cagtaacaag gtgccgccgt ccgttgtccc agccaagaag acgccgccgt cgtccgtttt     720 cccggccaag aaggcgccgc cgtcgtccgt tgtcccggcc aagaagacgc tgccgtcgtc     780 cggctcaaat tttgtgtcct cggcctctgc tcccaggctg gacactgtca gcgatgtgga     840 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caccgagttg cctgagcact acctggaaca cttcagactg tacgaccccg tcggcggtga    1680 gcacgccaac tacttcgccg ccggcctgaa gatggcggac caggttgtcg tcgtgagccc    1740 cgggtacctg tgggagctga agacggtgga gggcggctgg gggcttcacg acatcatacg    1800 gcagaacgac tggaagaccc gcggcatcgt gaacggcatc gacaacatgg agtgaaaccc    1860 tgaggtggac gtccacctga agtcggacgg ctacaccaac ttctccctga agacgctgga    1920 ctccggcaag cggcagtgca aggaggccct gcagcgcgag ctggggctgc aggtccgcgg    1980 cgacgtgccg ctgctcgggt tcatcgggcg gctggacggg cagaagggcg tggagatcat    2040 cgcggacgcg atgccctgga tcgtgagcca ggacgtgcag ctggtgatgc tgggcacggg    2100 gcgccacgac ctggagagca tgctgcagca cttcgagcgg gagcaccacg acaaggtgcg    2160 cgggtgggtg gggttctccg tgcgcctggc gcaccggatc acggcgggcg ccgacgcgct    2220 cctcatgccc tcccggttcg agccgtgcgg gctgaaccag ctctacgcga tggcctacgg    2280 caccatccct gtcgtgcacg ccgtcggcgg cctgagggat accgtgccgc cgttcgaccc    2340 cttcaaccac tccgggctcg ggtggacgtt cgaccgcgcc gaggcgcaca agctgatcga    2400 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Ser Ala Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Gly
            20                  25                  30 Ala Ser Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gln Trp Arg Pro
            35                  40                  45 Ser Pro Leu Gln Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Arg
            50                  55                  60 Ala Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Pro Gly Arg Gln Pro Arg Ala
            65                  70                  75 Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Asp Pro Val Lys Thr
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            380                 385                 390 Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe Ile Asp
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            545                 550                 555 Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys
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            575                 580                 585 Glu Val Asp Val His Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser
            590                 595                 600 Leu Lys Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu
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            50                  55                  60 Ala Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Pro Gly Arg Gln Pro Arg Ala
            65                  70                  75 Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Asp Pro Val Lys Thr
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            95                  100                 105 Pro Arg Gln Asp Ala Ala Arg Leu Pro Ser Lys Asn Gly Thr Leu
            110                 115                 120 Ile Asn Gly Glu Asn Lys Pro Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys
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            155                 160                 165 Ser Pro Pro Thr Ser Ile Val Asp Val Ala Ser Pro Gly Ser Ala
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            185                 190                 195 Ala Lys Lys Thr Pro Pro Ser Ser Val Phe Pro Ala Lys Lys Thr
            200                 205                 210 Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Val Ser Ser Ala Ser Ala Pro
            215                 220                 225 Arg Lau Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Leu Ala Gln Lys Lys Asp
            230                 235                 240 Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Ala
            245                 250                 255 Pro Ala Ala Pro Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys
            260                 265                 270 Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Ser
            275                 280                 285 Ala Val Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His
            290                 295                 300 Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val Met Asn Val Val Val
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            320                 325                 330 Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg Gly His
            335                 340                 345 Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu Ala
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            395                 400                 405 Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe
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            425                 430                 435 Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp
            440                 445                 450 His Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp
            455                 460                 465 His Gly Leu Met Gln Tyr Ser Arg Ser Val Met Val Ile His Asn
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            335                 340                 345 Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val
            350                 355                 360 Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly
            365                 370                 375 Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn
            380                 385                 390 Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Val Asp Phe Val Phe Ile Asp
            395                 400                 405 Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Gln Asp Ile Tyr Gly Gly Ser
            410                 415                 420 Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala Ala
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            440                 445                 450 Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Lau
            455                 460                 465 Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly Leu Met
            470                 475                 480 Gln Tyr Ser Arg Ser Val Met Val Ile His Asn Ile Ala His Gln
            485                 490                 495 Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu
            500                 505                 510 His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu
            515                 520                 525 His Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val
            530                 535                 540 Val Val Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu
            545                 550                 555 Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys
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            590                 595                 600 Leu Lys Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu
            605                 610                 615 Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln Val Arg Gly Asp Val Pro Leu Leu
            620                 625                 630 Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile
            635                 640                 645 Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gln Asp Val Gln Leu Val
            650                 655                 660 Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser Met Leu Gln His
            665                 670                 675 Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly Trp Val Gly Phe
            680                 685                 690 Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Ala Leu
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            710                 715                 720 Ala Met Ala Tyr Gly Thr Ile Pro Val Val His Ala Val Gly Gly
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            20                  25                  30 Ala Ser Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gln *** Arg Pro
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            65                  70                  75 Arg Arg Thr Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Asp Pro Val Lys Thr
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            95                  100                 105 Pro Arg Gln Asp Ala Ala Arg Leu Pro Ser Lys Asn Gly Thr Leu
            110                 115                 120 Ile Asn Gly Glu Asn Lys Pro Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys
            125                 130                 135 Asp Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Leu Ser Ile
            140                 145                 150 Gln Asn Arg Val Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys His Lys Val Ala
            155                 160                 165 Ser Pro Pro Thr Ser Ile Val Asp Val Ala Ser Pro Gly Ser Ala
            170                 175                 180 Ala Asn Ile Ser Ile Ser Asn Lys Val Pro Pro Ser Val Val Pro
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            200                 205                 210 Pro Pro Ser Ser Val Val Pro Ala Lys Lys Thr Leu Pro Ser Ser
            215                 220                 225 Gly Ser Asn Phe Val Ser Ser Ala Ser Ala Pro Arg Leu Asp Thr
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            245                 250                 255 Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Ala Pro Ala Ala Pro
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            305                 310                 315 Leu Ala Gly Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu
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