[0001] 本发明涉及具有针对猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)的防治(即预防和治疗)效果的融合蛋白、包含编码该蛋白的DNA的DNA构建体、包含编码PRRS病毒抗原的DNA的DNA构建体、包含这些的载体以及转化体。另外，本发明还涉及表达PRRS病毒抗原的方法和制造PRRS病毒抗原的方法。

[0002] 猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)是在养猪业中也最成问题的疾病，在日本国内的估计损失额被估算为一年达到280亿日元。PRRS会引起仔猪的繁殖障碍，并会导致母猪流产。成为PRRS的原因的PRRS病毒(PRRSV)由于具有感染作为免疫系统细胞的巨噬细胞的性质，因而，引起猪的基础免疫力的下降。因此，诱发其它病原细菌或病毒的感染，所以损害变得巨大。近年来，在以中国为首的外国，已报道有高病原性PRRSV的出现，该病毒即使在单独感染时也会引起严重的损害。目前，现状是，已市售有由国外厂家所生产的疫苗，但效果低。作为理由，可举出PRRSV的多样性。PRRSV大体上分为1型(欧洲型)和2型(北美型)，各型还进一步被分类为亚型。在日本国内已经市售有基于北美型病毒所制备的减毒疫苗，但对多型的有效性受到质疑。另外，在国外也市售有基于欧洲型病毒的疫苗，但对多型的效果低。此外，虽可以说已被减毒化，但使用病毒本身时，也存在无法否定病原性恢复的问题。

[0003] 非专利文献1中，通过使用基因重组植物(香蕉)生产PRRSV抗原的全长糖蛋白5(GP5)，并将其经口施予猪，从而确认PRRSV的预防效果。然而，GP5的蓄积量低至～250ng/g湿重(叶)左右，为了发挥疫苗效果，需要施予三次50g湿重的叶。非专利文献2中显示：通过制作表达M蛋白质的玉米，并将该玉米向小鼠经口施予，由此能诱导中和抗体。然而，非专利文献2中并未进行在作为实际对象动物的猪的效果确认试验，也未记载分别表达GP5和M蛋白质的情况。
专利文献1中公开了包含GP5和M蛋白质的非感染性的病毒样颗粒。另外，专利文献1中，病毒样颗粒中还包含有GP5和M蛋白质以外的包膜蛋白。此外，专利文献1中，蛋白质的表达谱不是GP5和M作为别的转录单位而被转录，而是从一个转录产物翻译出多种的PRRSV蛋白。
进一步地，专利文献1中，由于以哺乳类的培养细胞作为宿主来生产病毒样颗粒，因而，要作为疫苗进行商业化，在成本和生产率方面存在问题。
非专利文献3中，通过仅使用GP5的表位区域作为抗原，确认了具有PRRS疫苗效果。然而，GP5的蓄积量低，要发挥疫苗效果，存在需要大量生产的问题。
非专利文献4中，在烟草中表达融合了大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与全长GP5而成的疫苗抗原。然而，与仅表达全长GP5的烟草相比较，其性能并没有显著优异，而为了疫苗的高性能化，需要与LTB融合的GP5的最优化等的改良。
因此，为了PRRS疫苗的高性能化，需要GP5抗原的最优化、高蓄积化。
现有技术文献
专利文献

[0004] 专利文献1：欧洲专利公开第1156111号公报非专利文献

[0005] 非专利文献1：Chan et al.,Plant Biotechnology J.11(2013)315-324非专利文献2：Hu et al.,Vaccine(2012)68-74
非专利文献3：Ostrowski et al.,J.Virology 2002,4241-4250
非专利文献4：Min-Yuan  Chia  et  al.,Veterinary  Immunology  and 
Immunopathology 2011,140,215-225

[0006] 本发明的课题在于，为了PRRS疫苗的高性能化而对GP5抗原进行最优化和高蓄积化。用以解决课题的手段

[0007] 为了解决上述课题，本发明人经专心研究，结果发现：通过融合LTB和GP5病毒外区域(ectGP5)，能在植物体中有效地蓄积GP5抗原。另外，本发明人发现，通过使包含GP5病毒外区域的全长GP5蛋白和M蛋白作为各自的转录单位进行共表达，GP5抗原的蓄积量比单独表达时还得到显著改善。
本发明人如此实施而完成了本发明。

[0008] 也就是说，本发明如下所述。(1)一种融合蛋白，其包含猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)病毒的糖蛋白5(GP5)的病毒外区域(ectGP5)和佐剂蛋白。
(2)如(1)记载的融合蛋白，其中，所述病毒外区域具有：由SEQ ID NO.1的氨基酸序列中的第30位天冬酰胺至第53位的苏氨酸构成的氨基酸序列或，与该氨基酸序列的同一性为
80％以上的氨基酸序列；该病毒外区域能诱导针对PRRS病毒的预防效果。
(3)如(1)或(2)记载的融合蛋白，其中，所述GP5为欧洲型或北美型。
(4)如(3)记载的融合蛋白，其中，所述GP5为欧洲型Ⅰ、Ⅲ型以及北美型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型中的任一型。
(5)如(1)记载的融合蛋白，其中，所述病毒外区域具有：SEQ ID NO.3、6、21～34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO.6的同一性为80％以上的氨基酸序列；该病毒外区域能诱导针对PRRS病毒的预防效果。
(6)如(1)～(5)中的任一项记载的融合蛋白，其中，所述佐剂蛋白为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)和/或2型志贺毒素亚类e(Stx2e)的B亚单位(Stx2eB)。
(7)如(1)～(6)中的任一项记载的融合蛋白，其中，所述病毒外区域和所述佐剂蛋白通过肽接头连接。
(8)如(7)记载的融合蛋白，其中，所述肽接头的氨基酸个数为5～25个。
(9)如(7)或(8)记载的融合蛋白，其中，所述接头是PG12(SEQ ID NO.55)、PG17(SEQ ID NO.57)或PG22(SEQ ID NO.59)所示的氨基酸序列，或者是与SEQ ID NO.55、57或59的同一性为80％以上的氨基酸序列。
(10)如(9)记载的融合蛋白，其中，所述融合蛋白如SEQ ID NO.61的氨基酸序列或与SEQ ID NO.61的同一性为80％以上的氨基酸序列所示。
(11)一种DNA，其编码(1)～(10)中的任一项记载的融合蛋白。
(12)一种DNA构建体，其包含(11)记载的DNA。
(13)一种DNA构建体，其包含：编码猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)病毒的糖蛋白5(GP5)的DNA和编码基质蛋白(M)的DNA；各DNA各自与启动子和终止子相连接。
(14)如(13)记载的DNA构建体，其中，编码所述GP5的DNA是编码SEQ ID NO.1、7～20所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1的同一性为80％以上的氨基酸序列的DNA，所述GP5能诱导针对PRRS病毒的预防效果。
(15)如(13)或(14)记载的DNA构建体，其中，编码所述GP5的DNA包含编码以下氨基酸序列的DNA，该氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第32位丝氨酸被取代为丙氨酸且第33位的天冬氨酸被取代为丝氨酸的氨基酸序列。
(16)如(13)～(15)中的任一项记载的DNA构建体，其中，所述基质蛋白M为欧洲型或北美型。
(17)如(16)记载的DNA构建体，其中，所述基质蛋白M为欧洲型Ⅰ、Ⅱ型以及北美型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型中的任一型。
(18)如(13)～(15)中的任一项记载的DNA构建体，其中，所述基质蛋白M具有SEQ ID NO.35、37～50所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.35的同一性为80％以上的氨基酸序列；所述基质蛋白M能诱导针对PRRS病毒的预防效果。
(19)一种重组载体，其包含(12)～(18)中的任一项记载的DNA构建体。
(20)一种转化体，其是通过(19)记载的载体所转化的。
(21)如(20)记载的转化体，其中，所述转化体是植物。
(22)一种PRRS防治剂，其包含(21)记载的转化体或由该转化体获得的蛋白质。
(23)一种PRRS的治疗或预防方法，其特征在于，向猪施予(22)记载的防治剂。
(24)一种在真核生物的同一细胞内表达GP5和基质蛋白M的方法，其特征在于，用包含(13)～(18)中的任一项记载的DNA构建体的重组载体转化具有囊泡运输路径的真核生物。
(25)一种PPRS防治剂的制造方法，其包含以下操作：用包含(13)～(18)中的任一项记载的DNA构建体的重组载体转化具有囊泡运输路径的真核生物，从而在该真核生物的同一细胞内表达GP5和基质蛋白M。
发明效果

[0009] 与现有技术文献所记载的疫苗相比，通过使用包含编码本发明的融合蛋白的DNA的载体或包含本发明的DNA构建体的载体转化植物细胞，显著改善植物细胞内的抗原蓄积·防治(疫苗效果、免疫增强效果或治疗效果)性能。通过本发明的融合蛋白或编码该融合蛋白的DNA构建体，能预防或治疗PRRS。向健康状态的猪给予用包含编码本发明的融合蛋白的DNA的载体或包含本发明的DNA构建体的载体转化后的转化植物时，能期待疫苗效果或作为免疫增强剂的效果。
本发明中，由于使蛋白抗原以高水平蓄积在可食用植物并经口施予，因而与现有的疫苗相比，更能期待省成本化、省力化以及猪的压力减轻所引起的生产率的提高。
附图说明

[0010] 图1是包含编码LTB融合ectGP5的DNA的载体的概略图。ER表示内质网，Apo表示质外体(Apoplast)，Vac表示被附加有信号序列，以运输到液泡。图2是包含编码PRRS病毒的全长包膜蛋白(GP5和M)的DNA的载体的概略图。
图3显示本发明的LTB融合ectGP5在烟草培养细胞或莴苣细胞中的瞬时表达(电泳照片)。
图4显示本发明的LTB融合ectGP5在烟草培养细胞的稳定转化体中的表达(电泳照片)。
图5显示由本发明的DNA构建体所编码的全长包膜蛋白(GP5、GP4和M)在烟草培养细胞的稳定转化体中的表达(电泳照片)。
图6显示莴苣中的LTB融合ectGP5和全长包膜蛋白(GP5和M)的蓄积(电泳照片)。
图7显示通过向猪经口施予转化莴苣所得到的PRRV预防效果。阴性对照中施予空载体莴苣。并显示从攻击第一天至剖检时(攻击后第3周)为止的体重增加率(％)。
图8显示PRRS病毒的亚类、病毒株的名称、发现地点、年份、全长GP5和ectGP5以及M的EMBL蛋白的编号和序列号的清单。
图9显示各种全长GP5的氨基酸序列的比对(alignment)。
图10显示各种ectGP5的氨基酸序列的比对。
图11显示各种全长M的氨基酸序列的比对。
图12是包含编码LTB融合ectGP5(NA为北美型，EU为欧洲型)的DNA的载体的概略图。2和
4以外的载体，附加有糖链。此外，8和9还附加有Stx2eB。
图13显示酵母中的LTB融合ectGP5的蓄积(电泳照片)。○表示未附加有糖链的重组蛋白的条带，星号表示附加了糖链的重组蛋白的条带。

[0011] <包含GP5病毒外区域和佐剂蛋白的融合蛋白以及编码该融合蛋白的DNA构建体(第1DNA构建体)>本发明的融合蛋白中，融合有PRRS病毒的糖蛋白5(GP5)的病毒外区域(ectGP5)与佐剂蛋白。
本发明的ectGP5与佐剂蛋白的融合蛋白，优选是一种如下的蛋白质：其是通过基因重组技术制备的蛋白质，是2种以上的蛋白质基因(编码区域)通过阅读框合并连接，并被连续地转录、翻译，从而形成一个蛋白质。本发明所使用的融合蛋白可为蛋白质之间直接融合，也可以通过肽接头结合。

[0012] 本发明中所使用的PRRSV可为1型(欧洲型)和2型(北美型)中的任一种。对于北美型，进一步被分为Ⅰ～Ⅵ型。在日本国内，优选使用2型(北美型)病毒。特别是，优选使用1型(欧洲型)的Ⅰ、Ⅲ型。另外，优选使用2型(北美型)的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病毒。GP5是PRRS病毒的包膜蛋白之一，GP5中包含病毒外区域(ectGP5)。对于ectGP5，例如记载于Ostrowski et al.,Journal of virology(2002)76:4241-4250。本发明中，ectGP5优选为能诱导针对PRRS病毒的中和抗体的表位区域。本发明中，ectGP5更优选包含从SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第30位天冬酰胺至第53位苏氨酸的区域。
ectGP5的氨基酸序列，例如是来自EDRD-Ⅰ株的SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，且其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。SEQ ID NO.3的第15位和22位的天冬酰胺上附加有N-结合型糖链。然而，本发明中，糖链附加位点的氨基酸可被取代成未被附加糖链。
ectGP5的氨基酸序列也可以是来自EDRD-Ⅰ株以外的病毒株的SEQ ID NO.21～34所示的序列。这些序列所来自的病毒株的名称等如图8所记载。另外，各种ectGP5的氨基酸序列的比对如图10所示。SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.21～34的同一性％分别为79％、83％、79％、
83％、79％、92％、86％、86％、75％、71％、86％、79％、86％、92％。

[0013] ectGP5只要能诱导针对PRRS病毒的预防效果，则包含从SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第30位天冬酰胺至第53位苏氨酸的区域或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸就可以被取代、缺失、插入或附加。关于ectGP5的说明中，作为所述“数个”，优选为2～10个，更优选2～5个，进一步优选2～3个。另外，所谓ectGP5包括如下的序列，该序列是：与上述序列的同一性为70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上，且保持诱导PRRS病毒的预防效果的功能的序列。本发明中，优选SEQ ID NO.3的第3位丝氨酸被取代为丙氨酸且第4位天冬氨酸被取代为丝氨酸的SEQ ID NO.6的氨基酸。另外，ectGP5也可以是以下的序列：具有与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上的同一性，且保持上述功能的序列。

[0014] 作为本发明中使用的佐剂蛋白，只要能辅助或增强诱导针对PRRS病毒的预防效果的功能的物质，就没有特别限定，例如，可举出成为大肠杆菌性腹泻的原因的产肠毒性大肠杆菌(ETEC)所产生的蛋白质性毒素的大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)。LT是由一分子作为毒性主体的A亚单位和5分子B亚单位构成的全毒素。LT的A亚单位(LTA)通过侵入到细胞质内，使细胞内cAMP浓度上升，并激活细胞膜氯离子通道，从而导致水向肠道内漏出、即腹泻病态。已知LT的B亚单位(LTB)是无毒的，且涉及LT毒素与肠道细胞的粘附，具有粘膜佐剂作用。
LTB只要具有粘膜佐剂作用，则SEQ ID NO.53所示的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸就可以分别被取代、缺失、插入或附加。作为所述“数个”，例如在LTB中，优选为2～10个，更优选2～5个，进一步优选2～3个。SEQ ID NO.53所示的氨基酸序列被登录为GenBank Accession No.AAL55672。
另外，LTB可以是具有与SEQ ID NO.53所示的氨基酸序列优选为85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的同一性且具有佐剂作用的亚单位。

[0015] 大肠杆菌不耐热肠毒素的B亚单位的第90位(即SEQ ID NO.53的第90位)为天冬酰胺，在使用真核生物的囊泡运输路径表达时，会被附加糖链。本发明中，使用第90位的天冬酰胺被取代为丝氨酸且未附加有糖链的亚单位。作为第90位为丝氨酸残基的LTB亚单位蛋白质的说明中，所谓“数个”是指在SEQ ID NO.53所示的氨基酸序列的第90位的丝氨酸残基以外的位置中优选为2～10个、更优选2～5个、进一步优选2～3个氨基酸可以被取代、缺失、插入或附加。另外，作为第90位为丝氨酸残基的LTB亚单位蛋白质也可以是以下的蛋白：除了对应于SEQ ID NO.53所示的氨基酸序列的第90位的位置为丝氨酸以外，具有与SEQ ID NO.53所示的氨基酸序列优选为85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的同一性的蛋白质。

[0016] 如上所述，本发明的融合蛋白为ectGP5和佐剂蛋白的融合蛋白，本发明的DNA构建体包含编码由ectGP5和佐剂蛋白的融合蛋白的DNA，因而能提高GP5病毒外区域的免疫原性。

[0017] 本发明中使用的疫苗中，针对PRRS病毒的预防效果的诱导是指，相对于未施予疫苗的动物，施予疫苗后的动物的针对PRRS的临床评分得到改善，例如体重增加1.2倍以上。本发明中，与LTB融合的ectGP5抗原，与融合了全长GP5和LTB的情况相比较，例如蓄积量增加10倍、100倍、400倍以上。

[0018] 另外，佐剂蛋白可以是WO2009/004842记载的志贺毒素的亚单位蛋白质。志贺毒素(Stx)是由肠出血性大肠杆菌(EHEC，STEC)所产生的蛋白质性毒素，分为1型(Stx1)和2型(Stx2)。Stx1被分类为a～d的亚类，Stx2被分类为a～g的亚类。志贺毒素是由1分子作为毒性本体的A亚单位和5分子对与肠道粘膜结合起作用的B亚单位所构成的全毒素，具有作用于真核细胞的核糖体而阻碍蛋白质合成的功能。其中，作为佐剂蛋白，特别优选Stx2e的B亚单位(Stx2eB)；作为B亚单位(Stx2eB)，可举出具有SEQ ID NO.187的氨基酸序列的蛋白质。另外，Stx2eB也可以是Asn73(即SEQ ID NO.187的氨基酸序列的第55位Asn残基)被取代为Ser的突变体或如日本专利特开2012-019719所公开的突变体。进一步地，Stx2eB还可以是以下的物质：具有与SEQ ID NO.187所表示的氨基酸序列优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的同一性且具有佐剂作用的物质。
佐剂也可以是LTB与Stx2eB的组合。

[0019] 在优选的实施方式中，本发明的融合蛋白中的GP5病毒外区域和佐剂蛋白是通过接头来连接的。本发明的融合蛋白中，GP5病毒外区域与佐剂蛋白的融合顺序可以是这两方中的任一方在先。

[0020] 本发明中使用的肽接头的氨基酸的个数优选为5～25个，更优选10～22个，进一步优选12～22个。另外，本发明所使用的肽接头中，优选脯氨酸的含有率为20～27％，更优选为20～25％。肽接头中，优选以每隔2个或3个地配置脯氨酸。然而，即使在这种情况下，肽末端中，脯氨酸以外的氨基酸可以在5个以内、优选在4个以内的范围中连续着。这种优选的肽接头，例如记载于国际公开WO2009/133882号小册子。
本发明中，肽接头优选是：由SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列构成的肽(PG12)或具有与SEQ ID NO.55(PG12)80％以上、更优选90％以上的同一性的肽；由SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列构成的肽(PG17)或具有与SEQ ID NO.57(PG17)80％以上、更优选90％以上的同一性的肽；以及由SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列构成的肽(PG22)或具有与SEQ ID NO.59(PG22)80％以上、更优选90％以上的同一性的肽。

[0021] 本发明的融合蛋白中，更优选GP5病毒外区域和佐剂蛋白通过PG12(SEQ  ID NO.55)而连接。本发明的融合蛋白的氨基酸序列，例如以SEQ ID NO.61表示。本发明的融合蛋白还可包含大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的A亚单位，但包含A亚单位时，优选A亚单位被施以无毒化。
通过将所述PG12、PG17和PG22等的肽作为用于连接所述融合蛋白的接头使用，由此该融合蛋白在植物细胞中的蓄积水平增大。

[0022] 本发明的融合蛋白，优选在其氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽。此处，所谓“附加”是包含所述分泌信号肽直接结合于经所述肽连接的融合蛋白的氨基酸末端的情况、也包含所述分泌信号肽通过其他肽结合于经所述肽连接的融合蛋白的氨基酸末端的情况的概念。分泌信号肽优选来自属于茄科(Solanaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、十字花科
(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，更优选来自属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、草莓属(Fragaria)、莴苣属(Lactuca)等的植物，进一步优选来自烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、荷兰草莓(Fragaria×
ananassa)、莴苣(Lactuca sativa)等。
另外，分泌信号肽优选来自烟草的β-D-葡聚糖外切水解酶(β-D-glucan 
exohydrolase)、烟草的38kDa过氧化物酶(GenBank Accession No.D42064)。作为所述分泌信号肽，例如可举出来自烟草的β-D-葡聚糖外切水解酶并具有SEQ ID NO.63所示的氨基酸序列的肽。编码烟草的β-D-葡聚糖外切水解酶的DNA的碱基序列，例如以SEQ ID NO.64来表示。
另外，在酵母中表达时，还可使用转化酶分泌信号等在酵母中发挥功能的分泌信号。

[0023] 进一步地，本发明融合蛋白也可以在其羧基末端上附加有内质网滞留信号肽、液泡运输信号肽等信号肽。此处，所谓“附加”是既包括信号肽直接结合在所述融合蛋白的羧基末端的情况、也包括信号肽介由其它肽结合在所述融合蛋白的羧基末端的情况的概念。本说明书中，将在氨基末端附加有分泌信号肽且在羧基末端附加有内质网滞留信号肽的融合蛋白又称为内质网型(ER)融合蛋白，将编码该内质网型融合蛋白的DNA构建体又称为内质网型DNA构建体。内质网型融合蛋白在真核生物中有效蓄积的报告例有很多。
本说明书中，将氨基末端附加有分泌信号肽且在羧基末端未附加内质网滞留信号肽或液泡运输信号肽中的任一种的融合蛋白又称为质外体型(Apo)的融合蛋白，将编码该质外体型的融合蛋白的DNA构建体又称为质外体型的DNA构建体。
本说明书中，将在氨基末端附加有分泌信号肽且在羧基末端附加了液泡运输信号肽的融合蛋白又称为液泡型(Vac)的融合蛋白，将编码该液泡型的融合蛋白的DNA构建体又称为液泡型的DNA构建体。
本发明的融合蛋白，优选在其羧基末端附加有内质网滞留信号肽或液泡运输信号肽。
优选的内质网滞留信号肽，例如记载于国际公开WO2009/004842号小册子和国际公开WO2009/133882号小册子中，但可以利用HDEL序列(SEQ ID NO.65)。优选的液泡运输信号肽，例如记载于国际公开WO2009/004842号小册子和国际公开WO2009/133882号小册子，但可利用VSD序列(SEQ ID NO.66)。

[0024] 本发明的融合蛋白既可以通过化学合成，也可以通过基因工程进行生产。对于通过基因工程进行生产的方法如后所述。

[0025] 本发明的第1DNA构建体，其特征在于，其包含编码本发明的融合蛋白的DNA。也就是说，本发明所使用的第1DNA构建体是编码PRRS病毒的GP5病毒外区域的DNA和编码佐剂蛋白的DNA(优选编码大肠杆菌不耐热肠毒素的B亚单位的DNA)。编码所述肽接头的DNA，例如由SEQ ID NO.56(PG12)、SEQ ID NO.58(PG17)、SEQ ID NO.60(PG22)所示。作为编码大肠杆菌不耐热肠毒素的DNA，例如可举出编码B亚单位(Asn90)的DNA(SEQ ID NO.54)。
编码所述GP5病毒外区域的DNA和编码大肠杆菌不耐热肠毒素等的佐剂蛋白的DNA，通过除了终止密码子外将阅读框合并而被连接。

[0026] 编码GP5病毒外区域的DNA和编码大肠杆菌不耐热肠毒素的DNA，例如可基于SEQ ID NO.34、54的碱基序列并通过一般性的基因工程学方法而获得。具体来说，由生产各蛋白质的病毒和细菌按照常规方法制备cDNA文库，使用基于上述碱基序列所制备的探针，从该文库选择所期望的克隆。另外，也可以通过基于上述碱基序列的化学合成、以上述碱基序列的5'和3'末端的碱基序列作为引物并将基因组DNA作为模板的PCR等来进行合成。编码本发明的融合蛋白的DNA，例如以SEQ ID NO.62所示。

[0027] 编码本发明的融合蛋白的DNA，也优选表示构成融合蛋白的氨基酸的密码子被适当改变，以根据产生该蛋白质的宿主细胞而使杂合蛋白的翻译量增大。作为改变密码子的方法，例如可参考Kang等人(2004)的方法。另外，可举出选择宿主细胞中使用频率高的密码子的方法、或选择GC含量高的密码子的方法，或者选择宿主细胞的看家基因中使用频率高的密码子的方法。

[0028] 另外，编码本发明的融合蛋白的DNA也可以是在严格的条件下与具有SEQ ID NO.62的碱基序列的DNA进行杂交的DNA。“严格的条件”是指形成所谓特异性杂交且不形成非特异性杂交的条件。例如，可举出同一性高的2个DNA(之间具有优选80％以上、更优选90％以上、特别优选95％以上同一性的2个DNA)进行杂交、但比该同一性低的2个DNA不会杂交的条件。例如可举出2×SSC(300mM NaCl、30mM柠檬酸)、42℃，优选地可举出0.1××SSC(15mM NaCl、1.5mM柠檬酸)、60℃。

[0029] <包含编码GP5和M的DNA的DNA构建体(第2DNA构建体)>本发明的DNA构建体的第2形态含有编码PRRV病毒的糖蛋白5(GP5)和基质蛋白(M)的DNA，且GP5和M各自与启动子和终止子的组件相连接，作为各自的转录单位被表达。
本发明的编码GP5和M的DNA构建体，由于各自与启动子和终止子的组件相连接，因而，GP5和M的蛋白质基因(编码区域)未被连接，分别被翻译，由此形成各自的蛋白质。
本发明的编码GP5和M的DNA构建体也可以成为以下的一个DNA构建体：编码GP5的DNA及其启动子和终止子的组件与编码M的DNA及其启动子和终止子的组件被连接而形成的DNA构建体。或者，本发明的编码GP5和M的DNA构建体也可以是编码GP5的DNA及其启动子和终止子的组件与编码M的DNA及其启动子和终止子的组件未被相连接的、各自的DNA构建体。

[0030] GP5是PRRS病毒的包膜蛋白之一，GP5中包含病毒外区域(ectGP5)。本发明中，GP5优选为全长蛋白质，但也可以是非全长蛋白质，也可以是部分序列。GP5的氨基酸序列，例如如来自EDRD-I株的SEQ ID NO.1所示，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。SEQ ID NO.1的第30位、第44位、第51位的天冬酰胺上可以附加有N-结合型糖链。
然而，本发明中，糖链附加位点的氨基酸也可以未被附加糖链地被取代。
GP5的氨基酸序列也可以是由来自于EDRD-I株以外的病毒株的SEQ ID NO.7～20所示的序列。这些序列所来自的病毒株的名称等如图8所记载。另外，GP5的氨基酸序列的比对如图9所示。SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.7～20的同一性％分别为89％、89％、89％、89％、88％、
91％、57％、56％、63％、55％、57％、60％、60％、57％。

[0031] GP5只要包含病毒外区域(ectGP5)，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸就可以被取代、缺失、插入或附加。GP5的说明中，作为所述“数个”，优选2～10个，更优选2～5个，进一步优选2～3个。另外，GP5也可以是具有与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列优选50％以上、更优选70％以上、进一步优选80％以上、更进一步优选90％以上的同一性且保持上述功能的蛋白。
进一步地，GP5也可以是以下的蛋白质：SEQ ID NO.1中的第33位的天冬氨酸被取代成丝氨酸或SEQ ID NO.1中的第32位的丝氨酸被取代成丙氨酸，且具有与第33位的天冬氨酸被取代成丝氨酸的序列(SEQ ID NO.5)优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的同一性并且保持上述功能的蛋白质。

[0032] 基质蛋白(M)是PRRS病毒的包膜蛋白之一，M中也包含有能诱导针对PRRS病毒的预防效果的区域。M与GP5形成二硫键。本发明中，M优选为全长蛋白质，但也可为非全长蛋白质，也可以是部分序列。M的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO.35所示，其碱基序列如SEQ ID NO.36所示。
M的氨基酸序列也可以是来自EDRD-I株以外的病毒株的SEQ ID NO.37～50所示的序列。这些序列所来自的病毒株的名称等如图8所记载。另外，M的氨基酸序列的比对如图11所示。SEQ ID NO.35与SEQ ID NO.37～50的同一性％分别为96％、96％、96％、96％、97％、
95％、81％、81％、81％、78％、82％、82％、82％、81％。
对于M，只要能诱导针对PRRS病毒的预防效果，优选只要能诱导针对PRRS病毒的预防效果且能与GP5以二硫键结合，则SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸就可以被取代、缺失、插入或附加。作为所述“数个”，例如，M中，优选2～10个，更优选2～5个，进一步优选2～3个。
另外，M也可以是以下的蛋白质：具有与SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的同一性且保持上述功能的蛋白质。

[0033] 如上所述，本发明的第2DNA构建体由于包含将GP5和M作为各自的转录单位而编码的DNA，因而，能有效地产生包含GP5病毒外区域的GP5和M。另外，本发明的第2DNA构建体由于不同于专利文献1的病毒颗粒，并未使用病毒颗粒，因而，不用担心病原性恢复。此外，不同于诱导M和GP5以外的抗体的可能性高的病毒颗粒，能选择性地表达M和GP5。因此，不同于被摄入至巨噬细胞后进行复制而赋予损伤的可能性高的病毒颗粒，本发明作为疫苗的效果很高。

[0034] 本发明所使用的第1和第2DNA构建体中，优选的是编码所述融合蛋白的DNA或编码所述GP5和M的DNA可表达地连接于增强子上。此处，“可表达”是指本发明所使用的DNA构建体插入到包含适当的启动子的载体中，当该载体被导入至适当的宿主细胞时，在宿主细胞内生产所述融合蛋白或GP5和M。另外，“连接”是既包括2个DNA直接结合的情况也包括介由其它碱基序列而结合的情况的概念。作为增强子，可举出Kozak序列或来自植物的醇脱氢酶基因的5'-非翻译区。特别优选的是，编码所述杂合蛋白的DNA可表达地连接于来自植物的醇脱氢酶基因的5'-非翻译区。

[0035] 醇脱氢酶基因的5'-非翻译区是指包含从编码醇脱氢酶的基因的转录起始点至翻译起始点(ATG、蛋氨酸)前为止的碱基序列的区域。该区域具有翻译量增大功能。“翻译量增大功能”是指被结构基因所编码的信息在被转录后、翻译而产生蛋白质时，使通过翻译产生的蛋白质量增大的功能。所述区域只要来自植物即可，但优选来自属于茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，更优选来自属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、草莓属(Fragaria)、莴苣属(Lactuca)等的植物，进一步优选来自烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、荷兰草莓(Fragaria×ananassa)、莴苣(Lactuca sativa)等。作为所述醇脱氢酶基因的5'-非翻译区，例如，可使用来自烟草(Nicotiana tabacum)的醇脱氢酶基因的5'-非翻译区(NtADH5'UTR)(SEQ ID NO.67)，通过使用改变翻译起始点上游三个碱基后的NtADH5'UTR区域(NtADHmod 5'UTR)(SEQ ID NO.68)，能进一步期待高翻译。
获得来源于植物的醇脱氢酶基因的5'-非翻译区的方法，例如记载于日本专利特开
2012-19719号公报和国际公开WO2009/133882号小册子中。

[0036] 另外，如SEQ ID NO.68的碱基序列所示的所述NtADHmod 5'UTR，只要保持翻译量增大功能，则也可以具有1个或数个碱基的取代、缺失、插入或附加。作为所述“数个”，优选2～10个，更优选2～5个，特别优选2～3个。另外，还可使用具有与所述NtADHmod 5'UTR优选85％以上、特别优选90％以上的同一性且保持翻译量增大功能的DNA。

[0037] 关于所述区域是否具有作为目标的翻译量增大功能，例如可通过在烟草培养细胞中将GUS(β-葡萄糖醛酸酶)基因或荧光素酶基因作为报告基因的瞬间表达分析、重组于染色体的转化细胞中的分析等进行确认。

[0038] 编码本发明所使用的融合蛋白的第1DNA构建体，例如具有SEQ ID NO.69～71所示的碱基序列(图1)。具有SEQ ID NO.69(ER LTB-ectGP5)所示的碱基序列的DNA构建体是在NtADHmod5'UTR(SEQ ID NO.68)上连接编码以下融合蛋白的DNA的DNA构建体，所述融合蛋白中，LTB蛋白质(突变型Asn90Ser)和ectGP5蛋白介由PG12被连接，在氨基末端附加有分泌信号肽，在羧基末端附加有HA标记和内质网滞留信号肽。
具有SEQ ID NO.70(Apo LTB-ectGP5)所示的碱基序列的DNA构建体是在NtADHmod5'UTR(SEQ ID NO.68)上连接编码以下融合蛋白的DNA的DNA构建体，所述融合蛋白中，LTB蛋白质(突变型Asn90Ser)和ectGP5蛋白介由PG12被连接，在氨基末端附加有分泌信号肽，在羧基末端附加有HA标记。
具有SEQ ID NO.71(Vac LTB-ectGP5)所示的碱基序列的DNA构建体是在NtADHmod5'UTR(SEQ ID NO.68)上连接编码以下融合蛋白的DNA的DNA构建体，所述融合蛋白中，LTB蛋白质(突变型Asn90Ser)和ectGP5蛋白介由PG12被连接，在氨基末端附加有分泌信号肽，在羧基末端附加有HA标记和液泡运输信号肽。
具有SEQ ID NO.72(ER LTB)所示的碱基序列的DNA构建体是在NtADHmod5'UTR(SEQ ID NO.68)上连接编码以下融合蛋白的DNA的DNA构建体，所述融合蛋白中，LTB蛋白质(突变型Asn90Ser)和PG12连接，在氨基末端附加有分泌信号肽，在羧基末端附加有HA标记和内质网滞留信号肽。

[0039] 包含编码本发明所使用的全长包膜蛋白的DNA的第2DNA构建体，例如，具有SEQ ID NO.73～78所示的碱基序列(图2)。具有SEQ ID NO.73(GP5-HA)所示的碱基序列的DNA构建体是在NtADHmod5'UTR(SEQ ID NO.68)上连接了编码在羧基末端附加HA标记的GP5蛋白的DNA的DNA构建体。
具有SEQ ID NO.74(GP5-Flag)所示的碱基序列的DNA构建体是在NtADHmod5'UTR(SEQ ID NO.68)上连接了编码羧基末端附加Flag标记的GP5蛋白的DNA的DNA构建体。
具有SEQ ID NO.75(M-YFP-HA)所示的碱基序列的DNA构建体是在NtADHmod5'UTR(SEQ ID NO.68)上连接了编码在羧基末端附加YFP标记和HA标记的M蛋白的DNA的DNA构建体。
具有SEQ ID NO.76(GP5-HA/M-YFP-HA)所示的碱基序列的DNA构建体是对上述GP5-HA和M-YFP-HA分别使用下述的花椰菜花叶病毒35S启动子和HSPT878终止子作为转录单位并相互连接而成的重组载体。
具有SEQ ID NO.77(GP5-Flag/M-YFP-HA)所示的碱基序列的DNA构建体是对上述GP5-Flag和M-YFP-HA分别使用下述的花椰菜花叶病毒35S启动子和HSPT878终止子作为转录单位并相互连接而成的重组载体。
具有SEQ ID NO.78(GP5-Flag/GP4-YFP-HA)所示的碱基序列的DNA构建体是对上述
GP5-Flag和GP4-YFP-HA分别使用下述的花椰菜花叶病毒35S启动子和HSPT878终止子作为转录单位并相互连接而成的重组载体。

[0040] 本发明所使用的第1DNA构建体和第2DNA构建体可按照一般的基因工程学方法进行制备，可通过以下方式构建：通过用适当的限制性内切酶分别切断来源于植物的醇脱氢酶基因的5'-非翻译区、编码来源于植物的分泌信号肽的DNA、编码融合蛋白的DNA、编码内质网滞留信号肽或液泡运输信号肽的DNA等各种DNA，并用适当的连接酶进行连接。

[0041] 本发明中使用的重组载体，其特征在于，包含所述第1DNA构建体或第2DNA构建体。本发明所使用的重组载体只要是编码所述融合蛋白的DNA或编码GP5和M的DNA以能在导入有载体的宿主细胞中表达地插入到载体内即可。载体只要是能在宿主细胞中复制的载体，就没有特别限定，例如可举出质粒DNA、病毒DNA等。另外，载体优选包含耐药性基因等选择标记。质粒DNA可通过自大肠杆菌或农杆的碱提取法(Birnboim,H.C.&Doly,J.(1979)Nucleic acid Res 7:1513)或其改变的方法等而制备。另外，作为市售的质粒，例如也可使用pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101和pIG121Hm等。作为病毒DNA，例如可使用pTB2等(参照Donson J.,Kerney CM.,Hilf ME.,Dawson WO.Systemic expression of a 
bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector.Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)88:7204-7208)。

[0042] 载体内使用的启动子可根据被导入载体的宿主细胞而适当选择。例如，优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell et al.1985Nature 313：810)、水稻的肌动蛋白启动子(Zhang et al.1991Plant Cell 3：1155)、玉米的泛素启动子(Cornejo et al.1993Plant Mol.Biol.23：567)、莴苣的泛素启动子(Hirai et al.2011Plant Cell Rep.30:2255-65)等。另外，载体内使用的终止子也同样地可根据被导入载体的宿主细胞而适当选择。例如，优选使用胭脂碱合成酶基因转录终止子、花椰菜花叶病毒的35S终止子、拟南芥热休克蛋白18.2基因的终止子(HSPT)等。本发明所使用的优选终止子，例如是Matsui et al.,2014所记载的如SEQ ID NO.79所示的HSPT878。

[0043] 本发明的重组载体，例如，可按照以下进行制备。首先，对于所述第1或第2DNA构建体，用适当的限制性内切酶进行切断或通过PCR附加限制性内切酶位点，插入到载体的限制性内切酶位点或多克隆位点。

[0044] 本发明所使用的转化体，其特征在于，是用所述重组载体进行转化而得的。转化中所使用的宿主细胞可以是真核细胞和原核细胞中的任一种，但优选具有囊泡运输路径的真核细胞。作为真核细胞，优选使用植物细胞，其中，优选使用属于莴苣属(Lactuca)等的菊科(Asteraceae)、茄科、十字花科、蔷薇科(Rosaceae)、藜科的植物的细胞。进一步地，优选使用属于莴苣属(Lactuca)的植物的细胞(其中，优选莴苣(Lactuca sativa)细胞)、属于草莓属(Fragaria)的植物的细胞(其中，优选荷兰草莓(Fragaria×ananassa))。当使用莴苣细胞作为宿主细胞时，作为载体，可使用花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子或莴苣的泛素启动子(Hirai  et al.2011Plant Cell Rep.30:2255-65)等。另外，也可使用酵母
(Saccharomyces cerevisiae)、曲霉(Aspergillus)等微生物。
作为原核细胞，可使用大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸菌(Lactobacillus)、枯草菌(Bacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)等。

[0045] 本发明所使用的转化体可通过采用一般的基因工程学方法将本发明所使用的载体导入至宿主细胞来制备。例如，可使用利用农杆菌的导入方法(Hood,et al.,1993,Transgenic,Res.2：218，Hiei,et al.，1994Plant J.6：271)、电穿孔法(Tada,et al.,1990,Theor.Appl.Genet,80：475)、聚乙二醇法(Lazzeri,et  al.,1991,
Theor.Appl.Genet.81：437)、基因枪法(Sanford,et al.,1987,J.Part.Sci.tech.5：27)、聚阳离子法(Ohtsuki)等方法。

[0046] 可以将本发明所使用的载体导入至宿主细胞后，根据选择性标记的表现型来筛选所述转化体。另外，通过培养筛选后的转化体，可生产所述融合蛋白或GP5和M。用于培养的培养基和条件可根据转化体的种类适当地选择。此外，宿主细胞为植物细胞时，通过按照常规方法培养筛选后的植物细胞，从而可以使植物细胞再生，可以使所述GP5蛋白在植物细胞内或植物细胞的细胞膜外蓄积。例如，根据植物细胞的种类而有所不同，若是马铃薯，则可举出Visser等人(Theor.Appl.Genet 78：
594(1989))的方法，若是烟草，则可举出Nagata和Takebe(Planta 99：12(1971))的方法。

[0047] 宿主为莴苣时，例如，用包含0.1mg/L NAA(萘乙酸)、0.05mg/L BA(苄基腺嘌呤)和0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮的MS培养基能使新芽(shoot)再生，通过将再生的新芽在包含0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮的1/2MS培养基中进行培养，能使其生根。
另外，本发明所使用的种子可通过从如上所述地再生的植物体收集种子而获得。本发明所使用的种子可通过适当的方法进行播种栽培，从而能作为生产所述GP5蛋白的植物体，该植物体也包括在所述转化体中。

[0048] 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)通过植物伤口进行感染，运输被称为肿瘤诱发性的Ti(tumor-inducing)质粒的大染色体外因子。在许多研究所中，经数年专心研究后，通过农杆菌系的开发，能将各种植物组织按照惯例进行转化。作为用该技术转化后的代表性植物，有烟草、番茄、向日葵、棉花、油菜、马铃薯、白杨、以及大豆、草莓、水稻等。对于各种植物，证实了从用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行转化后的组织再生植物的情况。作为这种植物，可举出向日葵、番茄、白三叶草、油菜、棉花、烟草、马铃薯、玉米、草莓、水稻、其它许多蔬菜作物。
本发明中，优选用农杆菌Ti载体转化以上述莴苣为首的可食用植物。

[0049] 本申请说明书中，存在将GP5病毒外区域与佐剂蛋白的融合蛋白、GP5病毒外区域与佐剂蛋白通过肽接头连接而成的融合蛋白、包含编码该融合蛋白的DNA的第1DNA构建体、包含编码PRRS病毒的GP5和M的DNA的第2DNA构建体以及用包含该第1和第2DNA构建体的载体进行转化后的植物等总称为PRRS防治剂的情况。另外，本发明的PRRS防治剂，只要包含上述融合蛋白，或者只要分别包含编码PRRS病毒的GP5和M的DNA，就可以是疫苗或免疫增强剂等药品和饲料中的任意形态。本发明中，所谓防治是预防和治疗中的任一种都包含的概念。本发明的PRRS防治剂具有防治(疫苗效果、免疫增强效果或治疗效果)PRRS的效果。本发中明所称的PRRS症状中包括仔猪的免疫力下降、体重减少、呼吸系统疾病以及母猪的繁殖障碍(流产)。PRRS通过感染巨噬细胞而使免疫力下降，因而，提高由其它疾病(支原体、圆环病毒等)所导致的二次感染的风险，但广义上，由其它疾病所致的症状也可视为PRRS病毒所引起的症状。另外，近年来以中国为中心流行的高病原性PRRS存在单独感染也致死的情况。

[0050] 本发明的PRRS防治剂也可包含所述转化体。本发明的PRRS防治剂可包含所述融合蛋白或含有GP5和M的转化体的全部，也可包含所述融合蛋白或含有GP5和M的转化体的一部分。另外，也可直接使用转化体，也可将其干燥、粉碎等后再使用。此外，本发明的PRRS防治剂中还可混入提高融合蛋白或GP5和M的免疫原性的其它佐剂。一般情况下，作为佐剂，使用氢氧化铝、霍乱毒素(CTB)、细菌鞭毛(例如，沙门氏菌鞭毛蛋白)等。

[0051] 本发明的PRRS防治方法，其特征在于，向动物施予以所述DNA构建体进行转化后的植物体或者其干燥物或粉碎物。作为本发明的PRRS防治剂的防治对象，可举出猪。作为向猪施予本发明的PRRS防治剂的方法，可举出在猪饲料中混合以所述DNA构建体进行转化后的植物体或者其干燥物或粉碎物并施予猪的方法、对猪进行滴鼻的方法等。这种情况下的施予量，以融合蛋白或GP5和M的质量计，每日优选为0.2mg以上，更优选为0.5mg以上。本发明的PRRS防治剂优选以一定的间隔施予多次。例如，可举出每隔4～7天合计施予
2～3次的方法。
以下，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不局限于这些实施例。
実施例

[0052] 实施例1.植物表达用疫苗基因的构建将已知是PRRS病毒的中和表位的GP5的病毒外区域(ectGP5)(Ostrowski et al.,
2002)作为疫苗抗原使用，将其融合到已知具有粘膜佐剂活性的LTB上。作为植物细胞内的蓄积部位，设计成输送到内质网、质外体和液泡。另外，为了PRRS病毒的全长包膜蛋白的表达，构建GP5、M和GP4的各自的蛋白质基因。作为检测用标记，融合了YFP、HA、Flag标记。详细情况如下所述。

[0053] 包含编码本发明的融合蛋白的DNA构建体的载体的制备按照以下要点制备LTB(Asn90Ser突变体)片段(除了向周质分泌的分泌信号肽外，从Ala22到Asn124的区域)。通过3'互补末端，将以下的2个寡核苷酸退火后，用T4DNA聚合酶(Toyobo，Fukui，Japan)进行延伸反应。在第一阶段，使用LTB-A与LTB-B、LTB-C与LTB-D、LTB-E与LTB-F、LTB-G与LTB-H、LTB-IN90S与LTB-J，分别制作A+B、C+D、E+F、G+H、IN90S+J的片段。在第二阶段的反应中，使用A+B与C+D、E+F与G+H，制作A+B+C+D以及E+F+G+H的片段。最后，采用A+B+C+D与E+F+G+H与IN90S+J，制作全长的A+B+C+D+E+F+G+H+IN90S+J的片段。

[0054] LTB-A:5'-ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac-3'(SEQ ID NO.80)LTB-B：5'-cgttgatggtgtagatttgggtgttgcggtactcgctgc-3'(SEQ ID NO.81)
LTB-C：5'-ccatcaacgacaagatcctcagctacaccgagagcatgg-3'(SEQ ID NO.82)
LTB-D：5'-cttgaaggtgatgatcaccatctccctcttgccggccatgctc-3'(SEQ ID NO.83)
LTB-E：5'-atcaccttcaagagcggcgagaccttccaggtcgaggtc-3'(SEQ ID NO.84)
LTB-F：5'-cttctggctgtcgatgtgctggctgccggggacctcgacctggaa-3'(SEQ ID NO.85)LTB-G：5'-gacagccagaagaaggccatcgagaggatgaaggacaccctcaggatc-3'(SEQ ID 
NO.86)
LTB-H：5'-gcagagcttgtcgatcttggtctcggtgaggtaggtgatcctga-3'(SEQ ID NO.87)LTB-IN90S：5'-aagctctgcgtctggaacagcaagaccccc-3'(SEQ ID NO.88)
LTB-J：5'-aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt-3'(SEQ ID NO.89)

[0055] 将所得的LTB(Asn90Ser)片段用BamHI和BglII切断后，将其插入到经Plasmid14(Matsui et al.,2009,Biosci.Biotechnol.Biochem.,73,1628-34)的脱磷酸化后的BamHI-BglII间隙内。将所得的质粒用BglII处理后，脱磷酸化，插入磷酸化后的PG12片段。另外，PG12片段是通过以下方法制备的：将PG12-F引物(5'-gatcccctggttctggtcctggttctccta-3')(SEQ ID NO.90)和PG12-R引物(5'-gatctaggagaaccaggaccagaaccaggg-3')(SEQ ID NO.91)退火后，用T4多核苷酸激酶(PNK)(New England Biolabs,Hitchin,UK)进行磷酸化。
将所得的质粒用BglII处理后，进行脱磷酸化，插入磷酸化后的HA片段(LTBN90S-PG12-H A ) 。另外 ，H A 片 段 是 通 过以 下 方 法 制 作 的 ：将 H A - F 引 物 (5 '-gatcttatccttatgattatcctgattatgctg-3')(SEQ ID NO.92)和HA-R引物(5'-
gatccagcataatcaggataatcataaggataa-3')(SEQ ID NO.93)退火后，用T4多核苷酸激酶(PNK)进行磷酸化。
PRRSV的ectGP5片段是基于EDRD-1株(Yoshii et al.,Arch Virol,2005,150:2313-
24)的氨基酸序列，将Ser32取代为Ala、Asp33取代为Ser的合成人工基因。通过3'互补末端将ectGP5-2(5'-tcg tcc tcc tcg cac ctc cag ctc atc tac aac ttg acc ctc-3')(SEQ ID NO.95)和ectGP5-3(5'-tt agatct ggt gcc gtt cag ctc gca gag ggt caa gtt gta-
3')(SEQ ID NO.96)退火后，用T4DNA聚合酶(Toyobo，Fukui，Japan)进行延伸反应。对所得的ectGP5-2+3片段进行热变性后，与ectGP5-1(5'-aa gcatgc ggatcc aac gcc gcc tcc tcg tcc tcc tcg cac-3')(SEQ ID NO.94)退火后，用T4DNA聚合酶进行延伸反应。用BamHI和BglII对所得的ectGP5-1+2+3片段处理后，插入到用BglⅡ处理上述LTBN90S-PG12-HA质粒并脱磷酸化后的载体内。
用BamHI和SacI从所得的质粒中切出LTBN90S-PG12-ectGP5-HA-HDEL片段，插入到2BH质粒(Matsui et al.,Transgenic Res.,2011,20；735-48)的BamHI-SacI间隙内。用SacI和EcoRI从所得的质粒中除去拟南芥热休克蛋白基因的转录终止子(HSPT)，插入长链版的HSPT(HSPT878,Matsui et al.,2014)的SacI-EcoRI片段。由此，构建pRI909ER LTBN90S-PG12-ectGP5(SEQ ID NO.69)质粒(图1)。
此外，对于pRI909Apo LTBN90S-PG12-ectGP5(SEQ ID NO.70)和pRI909Vac LTBN90S-PG12-ectGP5(SEQ ID NO.71)，除了分别使用Plasmid 13和15(Matsui et al.,2009,Biosci.Biotechnol.Biochem.,73,1628-34)来代替ER LTB-ectGP5的构建中所使用的Plasmid14以外，其它同样地制备(图1)。

[0056] 包含编码全长GP5、M、GP4的DNA构建体的载体的制备根据EDRD-1株(Yoshii et al.,Arch Virol,2005,150:2313-24)的氨基酸序列，用以下的要点制备全长GP5、M、GP4蛋白。对于GP5，如同ectGP5，将Ser32取代为Ala以及将Asp33取代为Ser。糖蛋白4(GP4)是PRRS病毒的包膜蛋白之一。GP4的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO.51所示，而其碱基序列如SEQ ID NO.52所示。
以下2根寡核苷酸链通过3'互补末端退火后，用T4DNA聚合酶(Toyobo，Fukui，Japan)进行延伸反应，与LTB的构建同样地进行各全长基因的合成。

[0057] GP5-1：5'-aatgcatgttgggca agtgcttgac cgccggctgc-3'(SEQ ID NO.97)GP5-2：5'-gcaccacaagaaggggagcctggagcagcagccgg-3'(SEQ ID NO.98)GP5-3：5'-tctt gtggtgcatc gtgcccttct gcttggccgc c-3'(SEQ ID NO.99)
GP5-4：5'-ggaggacgaggaggcggcgttcaccaaggcggcca-3'(SEQ ID NO.100)
GP5-5：5'-tcg tcc tcc tcg cac ctc cag ctc atc tac aac ttg acc ctc-3'(SEQ ID NO.101)
GP5-6：5'-accagtcggtgccgttcagctcgcagagggtcaag-3'(SEQ ID NO.102)
GP5-7：5'-ccg actggttggc cgacaagttc gactgggccg tg-3'(SEQ ID NO.103)
GP5-8：5'-tcaacacggggaagatcacgaagctctccacggcc-3'(SEQ ID NO.104)
GP5-9：5'-ccgtgttga cccacatcgt gagctactgc gccttg-3'(SEQ ID NO.105)
GP5-10：5'-cacggtgtccaagaagtggctggtggtcaaggcgc-3'(SEQ ID NO.106)
GP5-11：5'-gacacc gtgggcttgg tggccgtgag caccgccgg-3'(SEQ ID NO.107)
GP5-12：5'-gctcaacacgtatctgccgtggtagaagccggcgg-3'(SEQ ID NO.108)
GP5-13：5'-cgt gttgagcagc atctacgccg tgtgcgcctt gg-3'(SEQ ID NO.109)
GP5-14：5'-gcctgatcacgaagcacaccaaggcggccaaggcg-3'(SEQ ID NO.110)
GP5-15：5'-tgatcaggct caccaagaac tgcatgagct ggaga-3'(SEQ ID NO.111)
GP5-16：5'-agttggtgtatctggtgcagctgtatctccagctc-3'(SEQ ID NO.112)
GP5-17：5'-ga tacaccaact tcttgttgga caccaagggc agg-3'(SEQ ID NO.113)
GP5-18：5'-tgatcacggggctcctccatctgtagagcctgccc-3'(SEQ ID NO.114)
GP5-19：5'-cccgtgatc atcgagaagg gcggcaaagt ggaagt-3'(SEQ ID NO.115)
GP5-20：5'-tcaagtcgatcaagtggccctccacttccactttg-3'(SEQ ID NO.116)
GP5-21：5'-tcgacttgaa gagggtggtg ttggacggca gcgcc-3'(SEQ ID NO.117)
GP5-22：5'-ggtgatgggggtggcggcgctg-3'(SEQ ID NO.118)
GP5-23：5'-ccccatcacc aaagtgagcg ccga-3'(SEQ ID NO.119)
GP5-24：5'-ttagatctggggtggccccactgctcggcgctc-3'(SEQ ID NO.120)

[0058] M-1：5'-aatgcatg ggcagca gcttggacga cttctgccac-3'(SEQ ID NO.121)M-2：5'-acactttctggggggcggtgctgtcgtggcagaag-3'(SEQ ID NO.122)M-3：5'-ccagaa agtgttgttg gccttcagca tcacctaca-3'(SEQ ID NO.123)
M-4：5'-caaggcgtagatcatgatgggggtgtaggtgatgc-3'(SEQ ID NO.124)
M-5：5'-ctacgcct tgaaagtgag caggggcagg ctcttgg-3'(SEQ ID NO.125)
M-6：5'-caagaagatcaacaagtgcaacaagcccaagagcc-3'(SEQ ID NO.126)
M-7：5'-gttgatcttc ttgaactgcg ccttcacctt cggct-3'(SEQ ID NO.127)
M-8：5'-gctctggaagtgcacgaaggtcatgtagccgaagg-3'(SEQ ID NO.128)
M-9：5'-cttccagag caccaacaaa gtggccttga ccatgg-3'(SEQ ID NO.129)
M-10：5'-cccacaacaaggccaccacggcgcccatggtcaag-3'(SEQ ID NO.130)
M-11：5'-gttgtggg gcgtgtacag cgccatcgag acctgga-3'(SEQ ID NO.131)
M-12：5'-agcctgcatctgctggtgatgaatctccaggtctc-3'(SEQ ID NO.132)
M-13：5'-gatgcagg ctctgcttgt tgggcaggaa gtacatc-3'(SEQ ID NO.133)
M-14：5'-ctccacgtggtgggcgggggccaagatgtacttcc-3'(SEQ ID NO.134)
M-15：5'-cacgtgga gagcgccgcc ggcttccacc ccatcgc-3'(SEQ ID NO.135)
M-16：5'-accacgaaggcgtggttgtcgctggcggcgatggg-3'(SEQ ID NO.136)
M-17：5'-ccttcg tggtgaggag gcccggcagc accaccgtg-3'(SEQ ID NO.137)
M-18：5'-gccgggcaccaaggtgccgttcacggtggt-3'(SEQ ID NO.138)
M-19：5'-tgcccggc ttgaagagct tggtg-3'(SEQ ID NO.139)
M-20：5'-tcttcacggccttcctgccgcccaacaccaagctc-3'(SEQ ID NO.140)
M-21：5'-gccgtgaaga ggggcgtggt gaacttg-3'(SEQ ID NO.141)
M-22：5'-ttagatctcttggcgtacttcaccaagttcaccac-3'(SEQ ID NO.142)

[0059] GP4-1：5'-aatgcatg gccgcca gcttgttgtt cttgttggtg-3'(SEQ ID NO.143)GP4-2：5'-ggctcaccaagaagcactcgaagcccaccaacaag-3'(SEQ ID NO.144)GP4-3：5'-ggt gagccaggcc ttcgcctgca agccctgctt c-3'(SEQ ID NO.145)
GP4-4：5'-gtcttgatgtcgctcaagctgctgctgaagcaggg-3'(SEQ ID NO.146)
GP4-5：5'-gaca tcaagaccaa caccaccgcc gccgccagct t-3'(SEQ ID NO.147)
GP4-6：5'-agcagctgatgtcctgcaacacggcgaagctggcg-3'(SEQ ID NO.148)
GP4-7：5'-catc agctgcttga ggcacggcga cagcagcccc c-3'(SEQ ID NO.149)
GP4-8：5'-ctgcactgcctgctcttcctgatggtctgggggct-3'(SEQ ID NO.150)
GP4-9：5'-gcagtgcagg accgccatcg gcacccccgt gtaca-3'(SEQ ID NO.151)
GP4-10：5'-tcggtcacgttggcggtgatggtgatgtacacggg-3'(SEQ ID NO.152)
GP4-11：5'-cgtgaccga cgagaactac ttgcacagca gcgact-3'(SEQ ID NO.153)
GP4-12：5'-gaacaagcagctgctcaacatcaacaagtcgctgc-3'(SEQ ID NO.154)
GP4-13：5'-gctgcttgt tctacgccag cgagatgagc gagaag-3'(SEQ ID NO.155)
GP4-14：5'-cgttgccgaacaccactttgaagcccttctcgctc-3'(SEQ ID NO.156)
GP4-15：5'-cggcaac gtgagcggca tcgtggccgt gtgcgtga-3'(SEQ ID NO.157)
GP4-16：5'-acgtgctgcacgtagctggtgaagttcacgcacac-3'(SEQ ID NO.158)
GP4-17：5'-gcagca cgtgagggag ttcacccaga ggagcttgg-3'(SEQ ID NO.159)
GP4-18：5'-gtgcaagagcctcacgtggtccaccaccaagctcc-3'(SEQ ID NO.160)
GP4-19：5'-gctct tgcacttcat gacccccgag accatgag-3'(SEQ ID NO.161)
GP4-20：5'-acggtggcccatctcatggtctc-3'(SEQ ID NO.162)
GP4-21：5'-gccaccgt gttggcctgc ttgttcgcca-3'(SEQ ID NO.163)
GP4-22：5'-ttagatctgatggccaacaagatggcgaacaagc-3'(SEQ ID NO.164)

[0060] 通过以ADH-221(Sato et.al.,2004)为模板并采用ADH XbaI-F引物(5'-aatctagagtctatttaactcagtattcagaaacaacaaaa-3')(SEQ ID NO.165)和ADHmod NsiI-R引物(5'-aaatgcatcttttttcttgatttccttcac-3')(SEQ ID NO.166)的PCR，对起始密码子邻近序列改变型烟草醇脱氢酶基因的5'非翻译区域(NtADHmod 5'-UTR)进行扩增。用XbaI和NsiI对所得的DNA片段处理，与用NsiI和BglⅡ处理GP5片段而得的片段一起插入到Plasmid 
14(Matsui et al.,2009,Biosci.Biotechnol.Biochem.,73,1628-34)的XbaI-BglII间隙内。将所得的质粒用NsiI切断后，进行自我连接，融合成NtADHmod 5'-UTR的起始密码子(atg)与GP5的起始密码子一致的形式。将所得的质粒用BglII切断，插入HA片段。将所得的质粒用作模板，并采用ADH KpnI-F引物(5'-aaggtacctatttaactcagtattcagaaacaacaaaa-
3')(SEQ ID NO.167)和NOST-R引物(5'-tgccaaatgtttgaacgatc-3')(SEQ ID NO.168)进行PCR，扩增NtADHmod 5'-UTR-GP5-HA片段，将所得的片段插入到pRI909ER LTBN90S-PG12-ectGP5的KpnI-Sac间隙内(GP5-HA)(SEQ ID NO.73)(图2)。对于GP5-Flag，通过插入Flag片段来代替上述HA片段而制得。另外 ，Flag片段是通过将Flag-F(5 '-
gatctgattataaggatgacgatgacaagg-3')(SEQ  ID  NO.171)和Flag-R(5'-
gatcccttgtcatcgtcatccttataatca-3')(SEQ ID NO.172)进行退火而制备的。
将上述的NtADHmod 5'-UTR用XbaI和NsiI处理，与用NsiI和BglⅡ处理M或GP4片段而得的片段一起插入到Plasmid 14(Matsui et al.,2009,Biosci.Biotechnol.Biochem.,73,
1628-34)的XbaI-BglII间隙内。将所得的质粒分别用NsiI切断后，进行自我连接，融合成NtADHmod 5'-UTR的起始密码子(atg)与M或GP4的起始密码子一致。用YFP-F(5'-tttggatcc agcaagggcgaggagctgttca-3')(SEQ  ID  NO.169)和YFP-R(5'-tttagatct 
cttgtacagctcgtccatgccgag-3')(SEQ ID NO.170)扩增YFP基因片段(pEYFP，Clontech)后，用BamHI和BglⅡ切断，插入到用BglII切断后进行脱磷酸化处理而得的上述GP4或M质粒中。
将所得的质粒用BglⅡ切断，插入HA片段。将所得的片段用作模板，并采用ADH KpnI-F引物(SEQ ID NO.167)和NOST-R引物(SEQ ID NO.168)进行PCR，扩增NtADHmod 5'-UTR-M/GP4-YFP-HA片段，将所得的片段插入到pRI909ER LTBN90S-PG12-ectGP5的KpnI-Sac间隙内(M-YFP-HA(SEQ ID NO.75)，GP4-YFP-HA)(图2)。
以以下的要点构建GP5与M或GP4的共表达盒。用SpeI和EcoRI处理GP5-HA，切断HSPT878的下游，插入35Spro-NtADHmod 5'-UTR-M/GP4-HA-HSPT878的XbaI-EoRI片段(GP5-HA/M-YFP-HA)(SEQ ID NO.76)。同样地，采用GP5-Flag，制备GP5-Flag/M-YFP-HA(SEQ ID NO.77)和GP5-Flag/GP4-YFP-HA(SEQ ID NO.78)。

[0061] 实施例2.使用原生质体的瞬时表达实验使用原生质体的瞬时表达是按照Matsui et al.,2011,Transgenic Res.20(4):735-
48所实施的。
对于3种LTB融合ectGP5，在烟草培养细胞(Nicotiana tabacumL.cv.BY2)(理研生物资源中心)和莴苣原生质体(Lactucasativa L.cv.greenwave)(タキイ种苗)中进行瞬时表达。其结果，在BY2和莴苣的两个宿主中，在内质网、质外体和液泡中都确认有蓄积(图3)。

[0062] 实施例3.将基因导入到烟草培养细胞中烟草培养细胞的转化是按照Nakayama et al.,2000,Plant Physiol.122:1239-47实施的。
在烟草培养细胞的稳定转化体中表达各疫苗。在内质网、质外体、液泡中都确认有LTB融合ectGP5的蓄积(图4)。
在全长包膜蛋白的表达中，在GP5-HA、M-YFP-HA、GP4-HA也都确认有蓄积。另外，与单独表达相比，与M共表达的方式中，发现了GP5蓄积上升。但该累积量上升效果并未在与GP4的共表达中观察到(图5)。

[0063] 实施例4.通过农杆菌将基因导入莴苣如下所述，针对ER LTB-ectGP5、GP5-HA和GP5-HA/M-YFP-HA这3种类型，制备基因重组莴苣。
将莴苣(Lactuca sativa L.)品种Green wave(タキイ种苗)在MS培养基[1/2×
Murashige·Skoog培养基用混合盐类(MS盐，和光纯药工业)、1×Murashige·Skoog维生素溶液(MS维生素，Sigma-Aldrich)、3％蔗糖、0.8％琼脂，pH5.8]中进行无菌播种后，将第10～16天的本叶切割成5mm见方程度，将该切片浸渍于保持双元质粒(pRI909)的农杆菌(Agrobacterium tumefacience EHA105)悬浮液中10分钟，其中，该双元质粒具有载体构建，然后，着床于共存培养基[1×MS盐、1×MS维生素、0.05mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)、
0.1mg/L 1-萘基乙酸(NAA)、0.1M乙酰丁香酮、3％蔗糖、0.8％琼脂，pH5.8]，在25℃、暗处培养2天。用灭菌水洗涤切片后，将其着床于选择培养基[1×MS盐、1×MS维生素、0.05mg/L BA、0.1mg/L NAA、0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、50mg/L卡那霉素(Km)、250mg头孢噻肟(Cef)、3％蔗糖、0.8％琼脂，pH5.8]中，在25℃、荧光灯下(2000～3000lux)培养。然后，以3～4天1次(2次/周)的间隔移植到新的选择培养基，直到获得不定芽。将由不定芽形成的再分化固体移植到生根培养基[1/2×MS盐、1×MS维生素、0.5g/L PVP、250mg Cef、3％蔗糖、
0.8％琼脂，pH5.8]中，在该条件下进行培养。然后，以3～4天1次(2次/周)的间隔移植到新的生根培养基。将生根后的再分化固体进行盆栽，在该条件下进行栽培。

[0064] 实施例5.从植物中提取蛋白质按照TCA-丙酮法(Shultz et al.Plant Mol Biol Rep,2005,23:405)，使用在液氮冷冻后保存于-80℃的基因导入莴苣本叶进行蛋白质提取。用TissueLyzer II(QIAGEN)破碎
100～200mg样品后，添加样品的5倍量的TCA-丙酮(10％三氯乙酸、90％丙酮、0.07％2-巯基乙醇)，混合，-20℃静置1小时后，在16000╳g、4℃下进行离心操作30分钟，去除上清，得到包含蛋白质的沉淀。进一步地，为了去除夹杂物，添加样品的5倍量的丙酮/BME(100％丙酮、
0.07％2-巯基乙醇)，混合，在16000╳g、4℃下进行离心操作10分钟，去除上清。本杂质去除操作再进行2次。对沉淀在减压干燥后，悬浮于样品的2倍量的提取I缓冲液[0.5M氯化钠、
5mM咪唑、6M尿素、20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，pH7.9]中，在16000╳g、4℃下进行离心操作10分钟，回收上清，得到蛋白质溶液。采用Protein Assay Kit II(Bio-Rad)进行蛋白质浓度的测定。

[0065] 实施例6.Western分析在微型管中放入适量的所得的蛋白质溶液，加入同等量的样品缓冲液(EZ Apply，ATTO制造)混合，在沸水中加温5分钟，进行样品的SDS化。采用纯化LTB(LTB(Asn90))作为蛋白质定量时的标准物质。通过用提取I缓冲液将该标准物质稀释2倍并重复进行，做成系列稀释，将这些系列稀释用作标准。
采用电泳槽(Mini Protean Tetra cell)和Mini Protean TGX-gel(BIO RAD)进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)。放入电泳缓冲液(EZ Run，ATTO制造)，在孔内加入5μl SDS化的样品，在200V恒定电压下电泳40分钟。
用Trans blot transfer pack(BIO RAD)，以Trans blot Turbo(BIO RAD)，对电泳后的凝胶进行印迹(blotting)。
将印迹后的膜浸于封闭溶液(TBS系，pH7.2，ナカライテスク)中，室温下振荡1小时或4℃下静置16小时后，将其置于TBS-T(137mM氯化钠、2.68mM氯化钾、1％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、25mM Tris-HCl，pH7.4)中，室温下5分钟的振荡进行3次，洗涤。
重组蛋白的检测中，一抗用TBS-T稀释10,000倍后使用。通过将膜浸于该稀释液中，室温下振荡2小时，从而进行抗原抗体反应，TBS-T中室温下振荡5分钟的操作进行3次，洗涤。
二抗用TBS-T稀释10,000倍，通过将膜浸于该稀释液中，室温下振荡1小时，从而进行抗原抗体反应，在TBS-T中室温下振荡5分钟的操作进行3次，洗涤。
抗HA标记：
一抗：抗HA抗体(Roche，Cat No.11-867-423-001)
二抗：抗鼠IgG(Anti-Rat IgG)，AP-conjugate(Promega，Cat No.S3831)
抗Flag标记：
一抗：抗Flag抗体(SIGMA,Cat No.F1804)
二抗：抗兔IgG(Anti-Rabbit IgG)，连接了AP的抗体(AP-linked Antibody)(Cell Signaling TECHNOLOGY，Cat No.7054S)
由碱性磷酸酶所引起的显色反应是如下进行的：将膜浸于显色液(0.1M氯化钠、5mM氯化镁、0.33mg/ml硝基四氮唑蓝、0.33mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸、0.1M Tris-HCl，pH9.5)中，室温下振荡7分钟，由此进行显色反应，用蒸馏水洗涤膜后，常温下干燥。通过扫描仪(PM-A900，爱普生)，在分辨率600dpi下，对显色后的膜进行成像，用图像分析软件(CS Analyzer ver.3.0，ATTO)进行抗原蛋白质的定量。作为抗原，使用全长GP5-LTB时(对应于非专利文献4)、使用全长GP5时(对应于比较例)、使用全长GP5/M时(对应于本发明2)、使用LTB-ectGP5时(对应于本发明1)的抗原蓄积量的比较如表1所示。可知：与仅表达全长GP5的情况相比，同时表达全长GP5和M的情况中，抗原的蓄积量多2.5倍以上。另外，可知：与非专利文献4(全长GP5-LTB)相比，LTB-ectGP5的情况中，抗原(ectGP5)的蓄积量多400倍以上。

[0066] 【表1】

[0067] 其结果，无论使用哪种构建体时，都确认有重组抗原的蓄积。另外，与烟草培养细胞同样地，与单独表达相比，表达GP5和M时，GP5的蓄积上升(图6)。

[0068] 实施例7.PRRS病毒感染防御试验对于ER LTB-ectGP5(疫苗1)和GP5-HA/M-YFP-HA(疫苗2)这两种，进行疫苗莴苣的经口施予所产生的PRRS病毒预防效果确认试验。作为阴性对照，使用空载体(pRI909)重组莴苣。
在分娩后第9、16、29、30、31、36、37、38、43、44、45、51、52天，将冷冻干燥后的疫苗莴苣或空载体莴苣的冷冻干燥粉末(0.5g/次)悬浮于水中，用连接了管的注射器强制施予。
用感染病毒使MA-104株(非洲绿猴肾细胞)(ATCC保藏号CRL-2378)感染，在CO2培养箱内37℃下培养6天，其中，该MA-104株已用DMEM(10％灭活的胎牛血清，添加100U/ml青霉素、
100U/ml链霉素)增殖至汇合。培养后，进行离心分离(3000rpm，15分钟)，将上清作为病毒悬浮液。使用Canyon喷雾器，向65日龄的猪的两鼻腔内施予病毒稀释液。施予病毒量为每头猪
8.89×108个拷贝。
攻击后，测定体重、饲料摄取量、体温。另外，定期采血，通过ELISA测定PRRSV特异性抗体效价。在以STEC攻击第21天处以安乐死，进行剖检，用肉眼观察各脏器和组织的异常。制作主要脏器的病理标本，观察病理组织学的发现。
其结果，对于呼吸症状和体温，在组之间没有确认有差异。对于体重增加，在疫苗接种期间，组之间没有差异，但攻击后3周内，疫苗施予组中看到具有体重增加良好的倾向(图
7)。

[0069] 实施例8.重组蛋白在酵母中的表达准备如图12所示的用于在酵母中表达重组蛋白的基因构建体。首先，为了将重组蛋白运输至酵母的囊泡输送路径，利用酵母转化酶的分泌信号肽(SUCSP,Hashimoto et al.,Protein Engineering,1998 2；75-77)。如下制备SUCSP的DNA片段。将HindⅢ-SUCSP-F引物(5'-aaagcttaagatgcttttgcaagccttccttttcctcttggctggtttcgccgccaag-3'(SEQ ID NO .173) ，下划线为HindIII位点)和BamHI-SUC2SP-R引物(5 '-
aaggatccggcagaaatcttggcggcgaaaccagccaagag-3'(SEQ ID NO.174)，下划线为BamHI位点)进行退火后，用T4DNA聚合酶处理。接着，用HindIII和BamHI切断。用BamHI和SacI从ER LTB-ectGP5(SEQ ID NO.69)上切出相当于LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)的DNA片段(NA意味着北美人，+表示具有N-结合型糖链附加位点)。将SUCSP和LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)通过BamHI位点连接，并插入到pYES2(Invitrogen)的HindIII-SacI间隙内，制备pYES2SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)。对于所得的质粒的碱基序列，用T7启动子引物(T7pro F)(5'-taatacgactcactataggg-3'(SEQ  ID  NO.175))和pYES2-R引物(5'-
gtaagcgtgacataactaattacatga-3'(SEQ ID NO.176))进行确认。

[0070] 欧洲型病毒株的ectGP5(ectGP5(EU)(+)；DGSGSSSTYQYIYNLTICELNGT(SEQ ID NO.177)，以下划线表示N-结合型糖链添加位点)是通过使用EURO type-F引物(5'-aaggatccgacggctccgggtcctcctcgacctaccagtacatctacaacttgaccatctgc-3'(SEQ ID NO.178)，下划线为BamHI位点)、HDEL-SacI-R引物(5'-aagagctcacaattcatcatgttcaga-3'(SEQ ID NO.179)，下划线为SacI位点)以及作为模板的LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)进行PCR反应而制得。将所得的ectGP5(EU)(+)片段用BamHI和SacI切断，并融合至LTB-PG12或LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)的C末端，制备LTB-PG12-ectGP5(EU)(+)或LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)-ectGP5(EU)(+)。

[0071] LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)-PG12-ectGP5(EU)(+)的构建是通过将LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)-ectGP5(EU)(+)作为模板的反向PCR(Inverse PCR)，将PG12插入到ectGP5(NA)(+)与ectGP5(EU)(+)之间而进行的。

[0072] 用以下的要点制备将附加了N-结合型糖链的天冬酰胺取代为丝氨酸的LTB-PG12-ectGP5(NA)(-)。以LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)为模板，并使用LTB 1F引物(5'-ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac-3'(SEQ ID NO.180)，下划线为BamHI位 点 ) 和 e c t G P 5 ( N A ) 去 糖 基 化 - R 引 物 ( 5 ' -
tttagatctggtgccggacagctcgcagagggtcaaggagtagat-3'(SEQ ID NO.181)，下划线为BglⅡ位点)进行PCR。将扩增的DNA片段用BamHI和BglⅠ切断，插入到pYES2SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)的脱磷酸化后的BamHI-BglII间隙内，制备LTB-PG12-ectGP5(NA)(-)。

[0073] 如下实施在LTB的N末端附加了ectGP5(NA)的融合抗原的构建。使用HindⅢ-S U C S P - F 引 物 和 P G G P 5 - R 引 物 ( 5 ' -gagaaccaggaccagaaccaggggatctggtgccgttcagctcgcagagggtcaagtt-3'(SEQ ID NO.182)，以下划线表示的是PG12的N末端侧序列，下划线之后的部分表示ectGP5的序列)以及作为模板的pYES2SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)进行PCR，扩增附加了PG12的N末端侧序列的e c t G P 5 ( N A ) 。另 外 ，使 用 P G L T B - F 引 物 ( 5 ' -
cctggttctggtcctggttctcctagatccgccccccagaccatcaccga-3'(SEQ ID NO.183)，以下划线表示的是PG12的C末端侧序列，下划线之后的部分表示LTB区域的序列)和LTB-BglⅡ-R引物(5'-aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt-3'(SEQ ID NO.184)，下划线为BglⅡ位点)以及作为模板的pYES2SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)进行PCR，扩增附加了PG12的C末端侧序列的LTB。混合两个PCR产物，在PG12区域退火，使用NA ectGP5-F引物(5'-aagcatgcggatccaacgccgcctcctcgtcctcctcgcac-3'(SEQ ID NO.185)，下划线为BamHI位点)和LTB-BglⅡ-R引物进行第二次PCR。将所得的DNA片段用BamHI和BglⅡ切断，插入到pYES2SUCSP-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)的脱磷酸化后的BamHI-BglII间隙内，制备ectGP5(NA)(+)-PG12-LTB。

[0074] 对于在N-结合型糖链附加位点导入了突变的ectGP5(NA)(-)-PG12-LTB，也以基本相同 的方 法进 行 构建 。但 是 ，使 用PG GP 5m i nu sG ly -R 引物 (5 '-gagaaccaggaccagaaccaggggatctggtgccggacagctcgcagagggtcaaggagtagat-3'(SEQ ID NO.186)，下划线表示的是PG12的N末端侧序列，该下划线之后的部分表示ectGP5区域的序列)代替PGGP5-R引物。

[0075] 如下构建对LTB和Stx2eB的融合蛋白进一步融合了ectGP5而得的Stx2eB-PG12-LTB-PG12-ectGP5(NA)(+)与LTB-PG12-Stx2eB-PG12-ectGP5(NA)(+)。用日本专利特愿2013-243932记载的方法制备Stx2eB-PG12-LTB-PG12和LTB-PG12-Stx2eB-PG12的DNA片段。
将各片段融合至ectGP5(NA)(+)，并插入到pYES2中。

[0076] 将各基因构建体导入至酵母中，使其表达。酵母(Saccharomyces cerevisiaeINVSc1，Invitrogen)的转化是按照S.c.EasyCompTM Transformation Kit(Invitrogen)所附的方法进行实施的。通过半乳糖处理12小时，表达诱导LTB融合蛋白。半乳糖诱导后，混合酵母培养液200μl和2×SDS-PAGE样品缓冲液(EZ Apply，ATTO)200μl，在95℃下热处理5分钟。将所得的样品4μL供于SDS-PAGE。使用抗HA抗体(No.11867423001，Roche)或抗LT毒素抗体实施Western分析。对于各构建体，分析独立的2个克隆。其结果，如图13所示，可确认各重组蛋白的表达，也可确认对应于糖链附加产物的条带，但在糖链附加位点导入突变的构建体，未见到糖链附加产物。在ectGP5(NA)(+)与ectGP5(EU)(+)的融合中，通过将PG12附加到这两者之间，使蓄积量上升。
产业上的利用可能性

[0077] 本发明的融合蛋白在畜产领域是有用的。