[0001] 本发明涉及一种突变的蛋白质，一种制备所述突变的蛋白质的方法，编码所述突变的蛋白质的基因，携带所述基因的重组载体和植物，控制甲羟戊酸产量和类异戊二烯产量的方法，以及控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法。

[0002] 在类萜生物合成通路中，3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(以下也称之为HMGR或HMG-CoA还原酶)是异戊二烯单体(异戊烯基二磷酸)生物合成的限速酶。已知HMGR的酶活性受可逆的翻译后磷酸化控制，具体而言，众所周知，通过C端丝氨酸磷酸化灭活酶活性是动物中HMGR的翻译后调控机制。这在植物中也得到了确认，特别是在非专利文献1中，C端丝氨酸对应的第577位丝氨酸残基的磷酸化导致的酶活性降低在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中得到了确认。

[0003] 也存在增加类萜产量而无需基因重组的方法，例如通过使用胆固醇生物合成抑制剂来增加类萜产量的方法，但仍然存在改善增加类萜产量及其类似物的方法的空间，并存在进一步研发这些技术的需求。引用列表
非专利文献

[0004] 非专利文献1:Dale S.等，欧洲生物化学期刊233(2),506-513(1995)

[0005] 本发明的一个目的是解决这些问题，并提供一种通过突变HMGR的特定氨基酸残基而获得的突变的蛋白质，其为类萜生物合成通路中异戊二烯单体生物合成的限速酶。本发明的另一目的在于提供一种制备该突变的蛋白质的方法，编码该突变的蛋白质的基因，以及携带该基因的重组载体和植物，以及提供一种控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法。另一个目的是提供一种控制甲羟戊酸产量和类异戊二烯产量的方法。问题的解决方案

[0006] 本发明涉及一种突变的蛋白质，其中在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。

[0007] 与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：10所示的橡胶树(Hevea brasiliensis)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第70位、214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位氨基酸残基。

[0008] 与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：70所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第35位、94位、133位和198位氨基酸残基。

[0009] 与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：71所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第81位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基。

[0010] 与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：72所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第243位、275位、305位、357位、429位、
488位、527位和592位氨基酸残基。

[0011] 与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、287位、339位、411位、和470位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：73所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第73位、243位、305位、357位、429位和488位氨基酸残基。

[0012] 选自于由SEQ ID NO:1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。

[0013] 选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。

[0014] 选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。

[0015] 选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。

[0016] 本发明也涉及一种通过使用所述突变的蛋白质控制类异戊二烯产量的方法。本发明也涉及一种通过使用所述突变的蛋白质控制甲羟戊酸产量的方法。

[0017] 本发明涉及一种基因，其编码所述突变的蛋白质。本发明还涉及一种使用所述基因控制类异戊二烯产量的方法。
本发明还涉及一种使用所述基因控制甲羟戊酸产量的方法。
本发明还涉及一种携带所述基因的重组载体。

[0018] 本发明涉及一种携带所述基因的植物。本发明还涉及一种使用所述植物控制类异戊二烯产量的方法。
本发明还涉及一种使用所述植物控制甲羟戊酸产量的方法。

[0019] 本发明还涉及一种产类异戊二烯的植物，其携带所述基因。本发明还涉及一种使用所述产类异戊二烯的植物控制类异戊二烯产量的方法。
本发明还涉及一种使用所述产类异戊二烯的植物控制甲羟戊酸产量的方法。

[0020] 本发明还涉及一种控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法，其中在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代

[0021] 选自于由SEQ ID NO：1所示的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。

[0022] 选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失、或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。

[0023] 选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失、或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。

[0024] 选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。

[0025] 本发明还涉及一种生产突变的蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失、或被其它氨基酸残基取代。

[0026] 选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。

[0027] 选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。

[0028] 选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。

[0029] 选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。本发明的有益效果

[0030] 本发明的突变的蛋白质是通过将HMGR的特定氨基酸残基缺失，或被其它氨基酸残基取代而获得的突变的蛋白质，所述HMGR是类萜生物合成通路中异戊二烯单体生物合成的限速酶。结果，可以通过制备该突变的蛋白质或其内引入了编码该突变的蛋白质的基因的转化体来控制HMGR酶活性、以及甲羟戊酸和类异戊二烯产量。附图说明

[0031] 图1显示了类萜生物合成通路的一部分。

[0032] 本申请发明人进行了各种研究以增加类萜生物合成通路中生物合成的类萜的量。类萜生物合成通路的一部分如图1所示。如图1所示，类萜生物合成通路中涉及多种不同的酶，但是本申请发明人专注于3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMGR)，其为异戊二烯单体生物合成的限速酶，所述异戊二烯构成了类萜的基本骨架。

[0033] 众所周知，HMGR的C端丝氨酸，例如拟南芥HMGR的第577位丝氨酸，涉及调控它的活性。具体而言，当C端丝氨酸被磷酸化后，HMGR的活性丧失。基于该原因，将丝氨酸取代为丙氨酸以防止丝氨酸磷酸化的突变体(参见例如非专利文献1)是众所周知的。本领域广泛认为，上述突变体的活性将不被磷酸化控制。因此，在本申请之日，本领域普遍认为，当C端丝氨酸被丙氨酸取代时，HMRG的活性不再受磷酸化控制。

[0034] 尽管存在这种技术常识，但本申请发明人对HMGR氨基酸残基磷酸化的进一步研究结果发现，除了已知的丝氨酸残基，还有新的氨基酸残基涉及控制酶活性。

[0035] 具体而言，已经发现在表达根据非专利文献1已知的突变的HMGR的拟南芥植物转化体中，突变的HMGR的酶活性通过进一步磷酸酶处理而增加，其中所述HMGR的C端丝氨酸已被丙氨酸取代以使HMGR的酶活性不因丝氨酸的磷酸化而灭活。这表明，除了已知的丝氨酸残基，还有其它氨基酸残基作为磷酸化位点涉及控制HMGR酶活性。这是一个非常显著的发现，其与上述普通技术知识相反，而本领域技术人员不能预料到该发现。在活的拟南芥中，根据需要通过磷酸化酶(激酶)来进行磷酸化。

[0036] 基于该启示，本申请发明人接下来找到了用于控制HMGR酶活性的新的磷酸化位点。具体而言，我们筛选了除已知的丝氨酸残基(相当于如上所述的第577位丝氨酸)以外的涉及控制HMGR酶活性的氨基酸残基，我们从不同类型的HMGR的高度保守的序列或换言之其保守区域中包含的氨基酸残基中，识别了9种可以控制HMGR活性的氨基酸残基。然后，我们通过制备突变的蛋白质来证明可以升高、降低或维持HMGR酶活性，或换言之控制HMGR酶活性；其中，所述突变的蛋白质中，9个所识别的具体氨基酸残基被缺失或被替换。能够用作磷酸化位点的氨基酸残基的例子包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。

[0037] 因此，通过制备具有导入的编码如上所述的本发明中制备的突变的蛋白质的基因的转化体，可以控制转化体的HMGR酶活性，并因此控制甲羟戊酸产量和类异戊二烯产量。

[0038] 具体而言，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位的苏氨酸残基和第339位的丝氨酸残基取代为其它氨基酸残基，以及优选地取代为天冬氨酸或谷氨酸而制备的突变的HMGR具有增强的酶活性。而且，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第225位的酪氨酸残基、第257位的酪氨酸残基、第287位的丝氨酸残基、第411位的丝氨酸残基、第470位的苏氨酸残基、第509位的苏氨酸残基以及第574位的酪氨酸残基取代为其它氨基酸残基，以及优选地取代为丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸而制备的突变的HMGR也具有增强的酶活性。
因此，在导入了编码这些突变的HMGR的基因的植物中，酶活性增强以及下游代谢物含量增加。结果，通过将编码这种突变的HMGR的基因导入到例如橡胶树中，可以增强橡胶树中的酶活性以及增加作为下游代谢物生物合成的天然橡胶的量。

[0039] 另一方面，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位的苏氨酸残基和第339位的丝氨酸残基取代为其它氨基酸残基或优选地取代为丙氨酸或苯丙氨酸而制备的突变的HMGR具有降低的酶活性。而且，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第225位的酪氨酸残基、第257位的酪氨酸残基、第287位的丝氨酸残基、第411位的丝氨酸残基、第470位的苏氨酸残基、第
509位的苏氨酸残基以及第574位的酪氨酸残基取代为其它氨基酸残基，以及优选地取代为天冬氨酸或谷氨酸而制备的突变的HMGR具有降低的酶活性。
因此，在导入了编码这些突变的HMGR的基因的植物中，酶活性下降并且下游代谢物含量也下降。结果，通过将编码这种突变的HMGR的基因导入到植物中，可降低植物中可食用部分中的HMGR酶活性，并降低作为下游代谢物的有害的甾体生物碱或类倍半萜烯的量；其中，所述植物在例如马铃薯(茄碱)、番茄(番茄苷)、莴苣(山莴苣素)或大豆(A组大豆皂苷)等植物的可食用部分中积累有害的物质或更苦的物质。

[0040] 提高植物中HMGR功能的传统方法主要是通过基因过表达，没有人想到该酶的多个氨基酸涉及其活性。基于基因重组，可以预测基因过表达，但是在本发明中，该活性可以通过氨基酸取代来控制。这意味着，没有重组的该修饰是可能的，允许获得比重组更容易的处理和更大的工业实用性。

[0041] 在说明书中，HMGR涉及一种将羟甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)催化还原为甲羟戊酸(MVA)的酶，HMGR的酶活性代表了该还原反应的活性，不同的生物物种均含有该酶。而且，不同的HMGR类型可能存在于一个生物物种中。磷酸化是通过生物体含有的激酶，根据需要在体内执行的反应；在体内用作酶等作用的蛋白质中，这些作用的存在与否、以及力度等受磷酸化和去磷酸化控制。

[0042] (突变的蛋白质)在HMGR中，通过将选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、
287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失、或被其它氨基酸残基取代而获得本发明的突变的蛋白质。

[0043] SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基以及与前述相当的位置的氨基酸残基是指，不论HMGR类型如何，HMGR中高度保守的序列中的氨基酸残基或换言之HMGR中保守区域中包含的氨基酸残基。保守区域是指具有类似的序列(结构)的位点；针对蛋白质，推测它是一种具有类似功能的位点。当SEQ ID NO：1所示的源于拟南芥的HMGR和另一种HMGR具有共同的保守区域时，可以推测后者同时拥有相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位或574位氨基酸残基的氨基酸残基，以及保守区域中的氨基酸残基起到与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR中的氨基酸残基类似作用。在本发明中，通过多序列比对事先选择HMGR的保守区域，以及从被确定为高度保守的那些中选择氨基酸残基的位置。在说明书中，可以根据下述实施例进行多个序列比对。

[0044] 包含与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域没有特别地限定，只要它们是分别包含与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域即可，但是它们与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的保守区域序列的序列相似度为优选至少
60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少
88％、最优选至少90％、甚至最优选至少92％，最优选至少95％，特别是更优选至少98％，并且没有上限。

[0045] 包含SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的特定氨基酸残基的保守区域如下所示：包含第48位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：2的第48至58位氨基酸残基的序列；
包含第91位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：3的第85至91位氨基酸残基的序列；包含第225位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：4的第222至235位氨基酸残基的序列；包含第
257位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：5的第256至269位氨基酸残基的序列；包含第
287位氨基酸的保守区域是SEQ ID NO：91的第282至299位氨基酸残基的序列；包含第339位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：6的第331位至339位氨基酸残基的序列；包含第411位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：7的第401位至416位氨基酸残基的序列；包含第470位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：8的第468至481位氨基酸残基的序列；包含第509位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：9的第497位至521位氨基酸残基的序列；以及包含第574位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：92的第570至578位氨基酸残基的序列。上述序列相似性是指相对于这些保守区域的序列的序列相似性。

[0046] 与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的每个保守区域的序列的序列相似度如上所述，但是更优选如下所述。针对包含与第91位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第91位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：3)的序列相似度优选为至少71％，更优选至少85％，特别优选100％。
针对包含与第225位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第225位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：4)的序列相似度优选为至少64％，更优选至少71％，更优选至少78％，特别优选至少85％，最优选至少92％，最优选100％。
针对包含与第257位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第257位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：5)的序列相似度优选为至少64％，更优选至少71％，更优选至少78％，特别优选至少85％，最优选至少92％，最优选100％。
针对包含与第287位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第287位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：91)的序列相似度优选为至少60％，更优选至少71％，更优选至少78％，特别优选至少82％，最优选至少
87％，最优选100％。
针对包含与第339位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第339位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：6)的序列相似度优选为至少66％，更优选至少77％，还更优选至少88％，特别优选100％。
针对包含与第411位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第411位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：7)的序列相似度优选为至少62％，更优选至少68％，还更优选至少75％，特别优选至少81％，进一步特别优选至少87％，最优选至少93％，甚至最优选100％。
针对包含与第470位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第470位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：8)的序列相似度优选为至少64％，更优选至少71％，还更优选至少78％，特别优选至少85％，最优选至少
92％，甚至最优选100％。
针对包含与第509位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第509位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：9)的序列相似度优选为至少68％，更优选至少72％，还更优选至少76％，特别优选至少84％，最优选至少
96％，甚至最优选100％。
针对包含与第574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第574位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：92)的序列相似度优选为至少71％，更优选至少85％，还更优选100％。

[0047] 第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基优选丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸，并且更优选丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。可以推测这些氨基酸残基极大地参与了控制HMGR酶活性，因为它们是可能在体内被磷酸化的氨基酸。

[0048] 具体而言，SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第91位为苏氨酸，第225位为酪氨酸，第257位为酪氨酸，第287位为丝氨酸，第339位为丝氨酸，第411位为丝氨酸，第470位为苏氨酸，第509位为苏氨酸以及第574位为酪氨酸。

[0049] 针对与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基，在SEQ ID NO：10所示的源于橡胶树的HMGR(HMG1)的情况下，例如，第91位的苏氨酸相当于第70位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第214位酪氨酸，第257位酪氨酸相当于第246位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第276位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第400位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第459位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第498位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第563位酪氨酸，以及没有相当于第339位丝氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于包含第339位丝氨酸的保守区域的保守区域。而且，在SEQ ID NO：11所示的源自橡胶草(Taraxacum koksaghyz)的HMGR的情况下，第
91位苏氨酸相当于第81位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第223位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第285位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第409位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第468位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第507位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第572位酪氨酸，并且没有相当于第257位酪氨酸和第339位丝氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于分别包含第257位酪氨酸和第339位丝氨酸的保守区域的保守区域。
而且，在SEQ ID NO：70所示的源自橡胶树的HMGR(HMG2)的情况下，第411位丝氨酸相当于第35位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第94位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第133位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第198位酪氨酸，并且没有相当于第91位、225位、257位和第
339位的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于分别包含第91位、225位、257位和第339位氨基酸残基的保守区域的保守区域。
而且，在SEQ ID NO：71所示的源自橡胶树的HMGR(HMG3)的情况下，第91位苏氨酸相当于第81位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第225位酪氨酸，第257位酪氨酸相当于第257位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第287位丝氨酸，第339位丝氨酸相当于第339位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第411位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第470位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第509位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第574位酪氨酸。
而且，在SEQ ID NO：72所示的源自橡胶树的HMGR(HMG4)的情况下，第225位酪氨酸相当于第243位酪氨酸，第257位酪氨酸相当于第275位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第305位丝氨酸，第339位丝氨酸相当于第357位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第429位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第488位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第527位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第592位酪氨酸，并且没有相当于第91位的苏氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于包含第91位苏氨酸的保守区域的保守区域。
而且，在SEQ ID NO：73所示的源自橡胶树的HMGR(HMG5)的情况下，第91位苏氨酸相当于第73位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第243位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第305位丝氨酸，第339位丝氨酸相当于第357位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第429位丝氨酸，以及第
470位苏氨酸相当于第488位苏氨酸，并且没有相当于第257位酪氨酸和第509位苏氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于包含第257位酪氨酸和第509位苏氨酸的保守区域的保守区域。
包含前述实施例的具体实施例如下面表1所示。

[0050] 本发明的突变的蛋白质是通过氨基酸残基修饰得到的，其中选自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。通过该修饰，可以根据需要在体内人工地控制特定氨基酸残基的可逆的磷酸化，从而控制HMGR的酶活性以及甲羟戊酸产量。也可以控制类异戊二烯的产量，因为HMGR是类萜生物合成通路的限速酶。

[0051] 该取代的其它氨基酸残基没有特别的限定，只要它与取代前的氨基酸不同即可，但是其优选为丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。当丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸被取代时，磷酸化变得不可能；然而通过取代为天冬氨酸或谷氨酸，可以模拟磷酸化以及得到组成性磷酸化状态。缺失或取代的方法没有特别地限定，可以使用已知的方法。例如，可以通过聚合酶链反应(PCR)缺失或取代特定氨基酸残基，所述PCR使用与缺失或取代位点的核苷酸序列重叠的引物；其中编码缺失或取代位点的氨基酸残基的三个核苷酸全部被缺失，或被编码要取代的其它氨基酸的核苷酸(1至3个核苷酸取代)所取代。

[0052] 优选地，在HMGR中，选自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。通过将氨基酸残基取代为天冬氨酸或谷氨酸，可以模拟磷酸化状态，或换言之获得组成性磷酸化状态，从而控制HMGR的酶活性。

[0053] 而且，在HMGR中，优选选自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。通过使该氨基酸残基缺失或者将其取代为丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸，可以防止磷酸化，或换言之去除磷酸化位点，从而控制HMGR的酶活性。
所述缺失、丙氨酸取代、苯丙氨酸取代和半胱氨酸取代在去除磷酸化位点方面具有类似的效应，但是考虑到原始氨基酸残基对蛋白质的作用，优选取代的氨基酸残基具有与原始氨基酸残基类似的结构(三维大小、占用面积等)。具体而言，当原始氨基酸残基是酪氨酸时，优选苯丙氨酸取代；当它为丝氨酸或苏氨酸时为丙氨酸取代或半胱氨酸取代。

[0054] 具体地，选自于由第91位和339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代；更优选，选自于由第91位和339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。HMGR的酶活性可以通过这种取代而改善。

[0055] 具体地，选自于由第91位和339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。通过该取代，HMGR的酶活性将被抑制或维持，由于磷酸化可以被抑制，因此也可抑制磷酸化导致的酶活性的增加。

[0056] 具体地，选自于由第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位的氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。通过这种取代，可以降低或消除HMGR的酶活性。

[0057] 具体地，优选选自于由第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。通过这种取代，可以维持HMGR的酶活性；由于磷酸化可以被抑制，因此也可以抑制由磷酸化导致的酶活性劣化。

[0058] 因为即便是在保守区域含有不同的氨基酸残基的HMGR也具有上述类似的功能，故HMGR没有特别的限定，只要其具有相当于选自下组的至少一个保守区域的保守区域即可：由含有SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基的保守区域构成的组；并且对其与SEQ ID NO:1所示的拟南芥HMGR的氨基酸序列的序列相似度没有特定下限，但是该序列相似度优选为至少50％，更优选至少60％，还更优选至少75％，更优选至少78％，最优选至少80％。低于50％，其与上述各保守区域的序列相似度不在上述范围之内。

[0059] 除了SEQ ID NO：1所示的拟南芥(Arabidopsis thaliana)HMGR以外，HMGR的例子包括来自下述的HMGR：橡胶树(Hevea brasiliensis)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥、马铃薯(Solanum tuberosum L.)、番茄(Solanum lycopersicum)、南苜蓿(Medicago polymorpha)、莴苣(Lactuca sativa Lettuce)、橡胶草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)(一种产生橡胶的蒲公英)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、杜仲(Eucommia ulmoides)、泽漆(Euphorbia helioscopia L.)。从这些之中，HMGR优选源自选自于由下述构成的组的至少一种植物：橡胶树、莴苣(Lactuca sativa Lettuce)、橡胶草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杜仲(Eucommia ulmoides)、泽漆(Euphorbia helioscopia L.)。橡胶树(Hevea brasiliensis)HMGR是特别优选的。

[0060] 本发明的HMGR可包括存在于一个生物物种中的多种HMGR，例如SEQ ID NO：1表示的HMG1(s)、在拟南芥HMGR的情况下，如SEQ ID NO：69等所示的HMG2、以及SEQ ID NO：10所示的HMG1、SEQ ID NO：70所示的HMG2、SEQ ID NO：71所示的HMG3、SEQ ID NO：72所示的HMG4、在橡胶树HMGR的情况下，如SEQ ID NO：73等所示的HMG5。其它例子如表1所示。

[0061] 本发明的突变的蛋白质可通过传统的已知方法制备，即通过如下所述地制备重组载体，以及使用能够表达靶蛋白的微生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物、昆虫、植物等，以制备具有导入的编码靶蛋白的基因的转化体以表达靶蛋白。也可使用传统已知方法纯化本发明的的突变的蛋白质，例如，如果该突变的蛋白质和融合到靶蛋白的组氨酸标签或类似物共同表达，则可以使用特定的柱子容易地纯化突变的蛋白质。

[0062] 可使用传统已知的方法来确定本发明的突变的蛋白质的酶活性，例如一种制备具有导入的编码靶蛋白的基因的转化体的方法，所述靶蛋白使用例如大肠杆菌来表达，并通过将酶活性测量方法对应确定其活性从而确定靶蛋白功能的存在与否。

[0063] (基因)本发明的基因是编码突变的蛋白质的基因。由于该基因编码突变的蛋白质，由该基因表达的突变的蛋白质可以用于控制HMGR酶活性以及甲羟戊酸产量。也可以控制类异戊二烯产量，因为HMGR是类萜生物合成通路的限速酶。

[0064] 本发明的基因的例子包括具有SEQ ID NO：12的第1至1776个核苷酸的核苷酸序列的DNA，在严谨条件下与核苷酸序列和SEQ ID NO：12的第1至1776个核苷酸的核苷酸序列互补的DNA杂交并编码具有HMGR活性的蛋白质的DNA；以及与SEQ ID NO：12的第1至1776个核苷酸的核苷酸序列的序列相似度具有至少60％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％，特别优选至少98％的DNA，所述DNA编码具有HMGR活性的蛋白质。

[0065] 此处所用的“杂交”是指将DNA与具有特定核苷酸序列的DNA，或该DNA的一部分进行杂交的步骤。因此，具有特定苷酸序列的DNA或该DNA的一部分的核苷酸序列的长度足够用作Northern或Southern杂交分析的探针，或用作PCR分析中的寡核苷酸引物。用作探针的该DNA可具有至少100个碱基的长度，优选至少200个碱基，更优选至少500个碱基，尽管它也可以是至少10个碱基，长度方面优选至少15个碱基的DNA。

[0066] 执行DNA杂交试验的技术是众所周知的。根据例如分子克隆(Molecular Cloning)，第2版和第3版(2001)、通用和分子细菌学方法(Methods for General and Molecular Bacteriology)，ASM出版社(1994)、免疫学方法手册，学院出版社(分子学)、以及很多其它标准教科书，可以确定实验进行的杂交条件。

[0067] 该严谨条件可包括，例如DNA固定化过滤器在42℃下过夜温育，以及DNA探针溶于包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20μg/l变性的鲑鱼精子DNA的溶液中，随后在大约65℃下，在例如0.2×SSC溶液中冲洗该过滤器。也可以使用较低的严谨条件。严谨性的变化可通过操控甲酰胺浓度(低比例的甲酰胺导致更低的严谨性)、盐浓度或温度完成。例如，较低的严谨条件包括在37℃下，在包含6×SSCE(20×SSCE:3mol/l氯化钠、0.2mol/l磷酸二氢钠、0.02mol/l的EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、以及100μg/l的变性鲑鱼精子DNA的溶液中过夜温育，然后在50℃下在包含0.1％SDS的1×SSC溶液中冲洗。除此之外，为了得到更低的严谨性，杂交之后的冲洗可在上述较低的严谨条件下在较高盐浓度(例如5×SSC)下完成。

[0068] 上述不同条件中的变化可通过包含或取代用于抑制杂交实验背景的封闭液来完成。为了兼容性，包含封闭液可能需要改变杂交条件。

[0069] 可使用传统已知方法来证实在上述严谨条件下与DNA杂交的DNA编码特定蛋白质，以及例如该核苷酸序列可通过例如测序仪来证实。

[0070] (重组载体)本发明的基因可以被导入到质粒中从而得到带有编码HMGR的基因的重组载体。该重组载体被用于在大肠杆菌等中表达靶蛋白，或作为制备另一转化体的载体。用于导入的质粒没有特别限定。

[0071] 当该重组载体被用于表达靶蛋白时，该宿主优选但不限定于真核生物，尽管也可使用任何能够表达靶蛋白的微生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物、昆虫、植物等。

[0072] (转化体)本发明的基因可以被导入到宿主中以获得带有编码上述HMGR的基因的转化体。由于HMGR酶活性是在体内带有导入基因的转化体中获得的，故使得增加、降低或控制甲羟戊酸的产量是可能的，其中所述靶蛋白在所述转化体中表达，以及所述甲羟戊酸是通过HMGR催化和生物合成的。因此，通过产类异戊二烯的植物的转化体可以推测控制类异戊二烯产量是可能的，因为HMGR活性在带有导入基因的转化体中被体内控制，所述HMGR是类异戊二烯生物合成通路的限速酶。

[0073] 用于该转化体的宿主没有特别的限定，只要是带有HMGR的有机物即可，但从这些之中，优选产类异戊二烯的植物以便于控制甲羟戊酸产量以及类异戊二烯产量。产类异戊二烯的植物的例子包括橡胶树以及其它橡胶品种；苦苣菜(Sonchus oleraceus)、花叶滇苦菜(Sonchus asper)、长裂苦苣菜(Sonchus brachyotus)和其它苦苣菜品种；高大一枝黄花(Solidago altissima)、毛果一枝黄花亚种Asiatica(Solidago  virgaurea subsp.Asiatica)、毛果一枝黄花亚种leipcarpa(Solidago  virgaurea subsp.Leipcarpa)、毛果一枝黄花亚种leipcarpa f.paludosa(Solidago virgaurea subsp.leipcarpa f.paludosa)、毛果一枝黄花亚种Gigantea(Solidago virgaurea subsp.Gigantea)、巨大一枝黄花leiophylla(Solidago gigantea Ait.var.leiophylla Fernald)和其它一枝黄花属品种；向日葵(Helianthus annuus)、绢毛葵(Helianthus argophyllus)、黑紫向日葵(Helianthus atrorubens)、瓜叶葵(Helianthus debilis)、千瓣葵(Helianthus decapetalus)、高葵花(Helianthus giganteus)和其它向日葵品种；蒲公英(Taraxacum)、蒲公英venustum H.Koidz(Taraxacum venustum H.Koidz)、蒲公英hondoense Nakai(Taraxacum hondoense Nakai)、宽果蒲公英(Taraxacum platycarpum Dahlst)、日本蒲公英(Taraxacum japonicum)、药蒲公英(Taraxacum officinale Weber)、橡胶草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)(一种产生橡胶的蒲公英)和其它蒲公英品种；无花果(Ficus carica)、橡胶榕(Ficus elastica)、薜荔(Ficus pumila L.)、天仙果(Ficus erecta Thumb.)、菲律宾榕(Ficus ampelas Burm.f.)、黄果榕(Ficus benguetensis Merr.)、涩叶榕(Ficus irisana Elm.)、厚叶榕(Ficus microcarpa L.f.)、常绿榕(Ficus septica Burm.f.)、孟加拉榕(Ficus benghalensis)和其它榕品种；灰白银胶菊(Parthenium argentatum)、银胶菊(Parthenium hysterophorus)、豚草(Ambrosia artemisiifolia)(银胶菊(Parthenium 
hysterophorus))和其它银胶菊品种；泽漆(Euphorbia helioscopia L.)、大戟属lasiocaula Boiss和其他大戟属品种；和莴苣(Lactuca sativa Lettuce)和其它莴苣品种；木薯(Manihot esculenta)和其它木薯品种；杜仲(Eucommia ulmoides)和其它杜仲品种；拟南芥(Arabidopsis thaliana)和其它拟南芥品种；及类似物。从这些之中产类异戊二烯的植物优选为选自于由以下植物构成的组的至少一种：橡胶树属、苦苣菜属、蒲公英属、银胶菊属、莴苣属、木薯属、鼠耳芥属、杜仲属和大戟属，更优选地为选自于由以下构成的组的至少一种：橡胶树(Hevea brasiliensis)、莴苣(Lactuca sativa)、橡胶草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)：,苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杜仲(Eucommia ulmoides)和泽漆(Euphorbia helioscopia L.)，并且更优选橡胶树(Hevea brasiliensis)、莴苣(Lactuca sativa)或橡胶草(Taraxacum koksaghyz)。

[0074] 上述重组载体可以用作表达载体，并可以使用能够在宿主细胞中进行自我复制的那些或能够包含到宿主细胞的染色体中的那些。

[0075] 可以使用已知的表达载体，例如pET160、pBI或pUC载体、Ti质粒，以及烟草花叶病毒载体。

[0076] 可以使用任何用于将DNA导入植物细胞的方法来导入重组载体。例子包括使用土壤农杆菌(JP-A S59-140885，JP-A S60-70080，WO 94/00977)、电穿孔方法(JP-A S60-251887)、以及使用粒子枪(JP-B 2606856，JP-B 2517813)等的方法。

[0077] 可以通过上述或其它方法制备转化体(转基因植物细胞)。

[0078] (点突变育种)也可通过突变育种技术制备具有修饰的HMGR的植物，所述突变育种技术使用相关位点的核苷酸序列作为育种标记物。可以使用下述作为突变育种技术：普通突变植物生产方法和普通突变筛选方法例如定向诱导基因组局部突变(TILLING)。由于本发明的基因作为点突变的结果被包含在突变体(突变的植物细胞)中，因此修饰后的HMGR被表达从而取代野生型HMGR以提供HMGR酶活性，从而可以增加、减少以及控制甲羟戊酸产量，所述甲羟戊酸是通过HMGR催化和生物合成的。因此，通过产类异戊二烯的植物的突变体，推测可以控制类异戊二烯产量，因此HMGR的活性在突变体中被控制，所述HMGR是类异戊二烯生物合成通路中的一个限速酶。

[0079] 本发明也提供一种带有本发明基因的产类异戊二烯的植物。该产类异戊二烯的植物没有特别限定，只要它是带有转基因植物细胞或突变的植物细胞的产类异戊二烯的植物即可。从概念上，该产类异戊二烯的植物不仅包括如上所述制备的转基因植物细胞或突变的植物细胞，而且也包括例如，它们的后代或克隆，甚至是通过这些细胞传代获得的后代植物。一旦得到具有导入到植物细胞基因组的DNA或载体的植物细胞或表达通过点突变修饰的HMGR的突变的植物细胞，可以通过有性繁殖或无性繁殖、组织培养、细胞培养、细胞融合、或其它技术从转基因植物细胞或突变的植物细胞中得到它们的后代或克隆。而且，该转基因植物细胞或突变的植物细胞，或它们的后代或克隆也可用于得到生殖材料(例如种子、水果、插条、块茎、块根、嫩枝、不定芽、不定胚、愈伤组织(calluse)、原生质体)，并且它们可以用于批量生产产类异戊二烯的植物。

[0080] 从转基因植物细胞或突变的植物细胞中使植物再生的技术是已知的，例如Doi等公开了用于桉树的技术(JP-A H11-127025)，Fujimura等公开了用于水稻的技术(Fujimura等(1995)，植物组织培养通讯，第2卷第74页)，Shillito等公开了用于玉米的技术((Shillito等(1989)，生物/技术，第7卷第581页-)，Visser等公开了用于马铃薯的技术(Visser等(1989)，理论与应用遗传学，第78卷第589页-)，以及Akama等公开了用于拟南芥的技术(Akama等(1992)，植物细胞报告，第12卷第7页-)。根据这些文件，本领域技术人员可以从转基因植物细胞或突变的植物细胞中再生植物。

[0081] 可以通过众所周知的方法确定靶蛋白基因是否在再生的植物中表达。例如，可使用蛋白质印迹分析(western blot analysis)来评估靶蛋白的表达。

[0082] 可以从转基因植物或突变的植物中得到种子，例如如下所述：将转基因植物或突变的植物植根于适当的介质中，然后移植到盆中含水的土壤中，在适当的培养条件下使其长大直至最终产生种子，然后收集种子。而且，植物也可以从种子开始长大，例如如下所述：将来自如上所述的转基因植物或突变的植物的种子播种在含水土壤中，在适当的培养条件下使其成长为植物。

[0083] 在本发明中，可以通过使用产类异戊二烯的植物来控制甲羟戊酸产量、类异戊二烯产量和类萜产量，所述产类异戊二烯的植物携带有本发明的基因以生产甲羟戊酸、类异戊二烯和类萜。具体而言，如上所述获得的转基因植物细胞或突变的植物细胞、从转基因植物细胞或突变的植物细胞得到的愈伤组织、从该愈伤组织再分化的细胞、或其类似物可以在适当的介质中被培养，或者从转基因植物细胞中再生的转基因植物、从突变的植物细胞中再生的突变的植物、由从转基因植物或突变的植物中得到的种子成长而来的植物、或其类似物可以在适当的培养条件下成长以生产甲羟戊酸、类异戊二烯和类萜。由于甲羟戊酸、类异戊二烯和类萜生物合成通路中的限速酶的酶活性被本发明的转化体或突变体中的修饰的蛋白质控制，因此可以控制通过所述蛋白质(酶)催化并生物合成的甲羟戊酸的产量，从而控制类异戊二烯产量以及进一步地，类萜产量。

[0084] 在说明书中，“类萜”是个通用术语，用于指具有异戊二烯(C5H8)单元的聚合物。类萜的例子包括聚合物例如单萜(C10)、倍半萜烯(C15)、双萜(C20)、二倍半萜(C25)、三萜烯(C30)、四萜烯(C40)以及天然橡胶。在说明书中，“类异戊二烯”是指具有异戊二烯(C5H8)单元的化合物，并且从概念上讲包括类萜。

[0085] 在本发明中，可以通过修饰上述9种氨基酸残基的至少一种氨基酸残基来控制甲羟戊酸产量、类异戊二烯产量和类萜产量，但是如果对这9种氨基酸残基中的两种以上进行修饰，则本发明的效果会更显著。实施例

[0086] 结合实施例，将详细解释本发明，但是本发明并不限于这些实施例。

[0087] (新的磷酸化位点存在的启发性证据)具有将拟南芥的HMGR1的第577位丝氨酸替换为丙氨酸的突变的HMGR1(以下称之为S577A-HMGR1)，被转染至缺少内源性HMGR1的拟南芥突变体以生产表达S577A-HMGR1的拟南芥转化体，其中已知丝氨酸577的磷酸化会降低酶活性。从表达S577A-HMGR1(HMGR是ER定位的膜蛋白)的该转基因植物中收集ER组分。当包含S577A-HMGR1的ER组分经磷酸酶处理后，发现其酶活性以与下述相同的方式增加：即当包含来自表达野生型HMGR1的拟南芥的野生型HMGR的ER组分经磷酸酶处理后。蛋白印迹法证实表达S577A-HMGR1的转基因植物和表达野生型HMGR1的转基因植物中积累的HMGR含量具有可比性。这表明除了已知的磷酸化位点(丝氨酸577)之外，还存在参与控制HMGR的酶活性的新的磷酸化位点(氨基酸残基)。

[0088] (计算机模拟(in silico)干扰HMGR磷酸化位点)对表1所示植物执行多个序列比对以寻找高度保守的序列部分(保守区域)。同时，从全长序列中筛选出可能经历磷酸化的氨基酸残基，并从这些残基中选择保守区域中包含的预期的磷酸化位点。该结果如表1所示。
用于进行多序列比对的软件被称为IdentityX，以及用于筛选可能经历磷酸化的氨基酸残基(磷酸化位点)的软件被称为PhosPhAt。

[0089] (构建HMGR表达载体)SEQ ID NO：12的序列，其为SEQ ID NO：1所示的源自拟南芥的HMGR的S型DNA序列(以下称之为HMG1S)，使用下述引物通过PCR进行扩增。使用大肠杆菌通过热休克方法将所得PCR产物克隆至pENTR/D-TOPO以得到被称为pENTR/HMG1S的入门载体。使用DH5α作为大肠杆菌通过pENTR Directional TOPO克隆试剂盒来制备入门载体。
(引物1：SEQ ID NO:13)
5'-CACCATGGATCTCCGTCGGAGGCCTC-3'
(引物2：SEQ ID NO:14)
5'-CGCCTCGAGTCATGTTGTTGTTGTTGTCG-3'

[0090] (制备表达载体(重组载体))使用以上得到的pENTR/HMG1S，将靶蛋白的部分基因序列重组并转染至pET160-DEST以得到pDEST/HMG1S表达载体。将Gateway系统(Invitrogen)的LR反应用于重组反应。

[0091] (制备突变的HMGR表达载体)使用pDEST/HMG1作为模板通过PrimeSTAR HS(Takara)执行PCR反应。每份PCR反应溶液的样品(25μl)的组成为1至5ng质粒，0.75μl各个如下所示的用于各突变的正向或反向引物(各10pmol/μl)、5μl的5×primestar缓冲液(Mg2+)、2μl的dNTPmix、0.25μl的primestar HS、以及15.75μl的milliQ水。使用下述预定的反应循环执行PCR：步骤1：98℃下2分钟，步骤2：
98℃下10秒，步骤3：60℃下15秒，步骤4：在68℃下8分钟，步骤2至4重复17次。一部分PCR产物(7μl)被电泳，当观察到扩增时，将0.2μl的DpnI添加到剩下的PCR产物中，并在37℃反应3小时。将2μl反应溶液添加到20μl自制的大肠杆菌(DH5α)化学感受态细胞，并且通过热休克方法转化细胞。所有的细菌培养均接种到包含50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基中并在37℃下过夜培养。在培养之后，通过克隆PCR筛选得到的克隆。使用Qiagen质粒小量提取试剂盒执行质粒提取，并通过测序确认突变插入以得到期望的突变的HMG1S表达载体。通过该方法制备总共34种突变的HMG1S表达载体。也包括作为阳性对照的丝氨酸-577突变的HMG1S。使用ABI3130XI测序仪通过BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.0Ready Reaction Kit(美国应用生物系统)进行序列确认。

[0092] 用于制备各突变的HMG1S的引物如下所示。

[0093] (用于HMG1S的第225位突变酪氨酸的引物)(用于pHMG1S/Y225F的引物)
(引物3(正向)：SEQ ID NO:15)
5’-ttgatTTTgaatcgattttggggcaatgc-3’
(引物4(反向)：SEQ ID NO:16)
5’-ttgatTTTgaatcgattttggggcaatgc-3’
(用于pHMG1S/Y225D的引物)
(引物5(正向)：SEQ ID NO:17)
5’-ttaccgttggatggatttgatGATgaatcgattttggggcaatgc-3’
(引物6(反向)：SEQ ID NO:18)
5’-gcattgccccaaaatcgattcGGCatcaaatccatccaacggtaa-3’
(用于pHMG1S/Y225E的引物)
(引物7(正向)：SEQ ID NO:19)
5’-ttaccgttggatggatttgatGAGgaatcgattttggggcaatgc-3’
(引物8(反向)：SEQ ID NO:20)
5’-gcattgccccaaaatcgattcCTCatcaaatccatccaacggtaa-3’

[0094] <用于HMG1S的第257位突变酪氨酸的引物>(用于pHMG1S/Y257F的引物)
(引物9(正向)：SEQ ID NO:21)
5’-atgagTTCtctgttcctatggctacaacc-3’
(引物10(反向)：SEQ ID NO:22)
5’-acagaGAActcataaccatcaagcaacaa-3’
(用于pHMG1S/Y257D的引物)
(引物11(正向)：SEQ ID NO:23)
5’-ttgttgcttgatggttatgagGACtctgttcctatggctacaacc-3’
(引物12(反向)：SEQ ID NO:24)
5’-ggttgtagccataggaacagaGTCctcataaccatcaagcaacaa-3’
(用于pHMG1S/Y257E的引物)
(引物13(正向)：SEQ ID NO:25)
5’-ttgttgcttgatggttatgagGAAtctgttcctatggctacaacc-3’
(引物14(反向)：SEQ ID NO:26))
5’-ggttgtagccataggaacagaTTCctcataaccatcaagcaacaa-3’

[0095] <用于HMG1S的第411位突变丝氨酸的引物>(用于pHMG1S/S411A的引物)
(引物15(正向)：SEQ ID NO:27)
5’-ggattgagggacgtggtaaaGCAgttgtttgcgaggctgtaatc-3’
(引物16(反向)：SEQ ID NO:28)
5’-gattacagcctcgcaaacaacTGCtttaccacgtccctcaatcc-3’
(用于pHMG1S/S411D的引物)
(引物17(正向)：SEQ ID NO:29)
5’-ggattgagggacgtggtaaaGATgttgtttgcgaggctgtaatc-3’
(引物18(反向)：SEQ ID NO:30)
5’-gattacagcctcgcaaacaacATCtttaccacgtccctcaatcc-3’
(用于pHMG1S/S411E的引物)
(引物19(正向)：SEQ ID NO:31)
5’-ggattgagggacgtggtaaaGAAgttgtttgcgaggctgtaatc-3’
(引物20(反向)：SEQ ID NO:32)
5’-gattacagcctcgcaaacaacTTCtttaccacgtccctcaatcc-3’

[0096] <用于HMG1S的第470位突变苏氨酸的引物>(用于pHMG1S/T470A的引物)
(引物21(正向)：SEQ ID NO:33)
5’-gctGCAggccaagatccagctcaaaacgtg-3’
(引物22(反向)：SEQ ID NO:34)
5’-ggccTGCagctatgaatacagcagacac-3’
(用于pHMG1S/T470D的引物)
(引物23(正向)：SEQ ID NO:35)
5’-gctGATggccaagatccagctcaaaacgtg-3’
(引物24(反向)：SEQ ID NO:36)
5’-ggccATCagctatgaatacagcagacac-3’
(用于pHMG1S/T470E的引物)
(引物25(正向)：SEQ ID NO:37)
5’-gctGAAggccaagatccagctcaaaacgtg-3’
(引物26(反向)：SEQ ID NO:38)
5’-ggccTTCagctatgaatacagcagacac-3’

[0097] <用于HMG1S的第509位突变苏氨酸的引物>(用于pHMG1S/T509A的引物)
(引物27(正向)：SEQ ID NO:39)
5’-ccatctatcgaggtggggGCAgtgggaggaggaacacagcttgc-3’
(引物28(反向)：SEQ ID NO:40)
5’-gcaagctgtgttcctcctcccacTGCccccacctcgatagatgg-3’
(用于pHMG1S/T509D的引物)
(引物29(正向)：SEQ ID NO:41)
5’-ccatctatcgaggtggggGATgtgggaggaggaacacagcttgc-3’
(引物30(反向)：SEQ ID NO:42)
5’-gcaagctgtgttcctcctcccacATCccccacctcgatagatgg-3’
(用于pHMG1S/T509E的引物)
(引物31(正向)：SEQ ID NO:43)
5’-ccatctatcgaggtggggGAAgtgggaggaggaacacagcttgc-3’
(引物32(反向)：SEQ ID NO:44)
5’-gcaagctgtgttcctcctcccacTTCccccacctcgatagatgg-3’

[0098] <用于HMG1S的第48位突变丝氨酸的引物>(用于pHMG1S/S48A的引物)
(引物33(正向)：SEQ ID NO:45)
5’-attgctcctccaccgaaagcaGCCgacgcgcttcctcttccgtta-3’
(引物34(反向)：SEQ ID NO:46)
5’-taacggaagaggaagcgcgtcGGCtgctttcggtggaggagcaat-3’
(用于pHMG1S/S48D的引物)
(引物35(正向)：SEQ ID NO:47)
5’-attgctcctccaccgaaagcaGACgacgcgcttcctcttccgtta-3’
(引物36(反向)：SEQ ID NO:48)
5’-taacggaagaggaagcgcgtcGTCtgctttcggtggaggagcaat-3’
(用于pHMG1S/S48E的引物)
(引物37(正向)：SEQ ID NO:49)
5’-attgctcctccaccgaaagcaGAAgacgcgcttcctcttccgtta-3’
(引物38(反向)：SEQ ID NO:50)
5’-taacggaagaggaagcgcgtcTTCtgctttcggtggaggagcaat-3’

[0099] <用于HMG1S的第91位突变苏氨酸的引物>(用于pHMG1S/T91A的引物)
(引物39(正向)：SEQ ID NO:51)
5’-aatacgcctcttcacgtcgtcGCAatcacagaactcggcgccatt-3’
(引物40(反向)：SEQ ID NO:52)
5’-aatggcgccgagttctgtgatTGCgacgacgtgaagaggcgtatt-3’
(用于pHMG1S/T91D的引物)
(引物41(正向)：SEQ ID NO:53)
5’-aatacgcctcttcacgtcgtcGATatcacagaactcggcgccatt-3’
(引物42(反向)：SEQ ID NO:54)
5’-aatggcgccgagttctgtgatATCgacgacgtgaagaggcgtatt-3’
(用于pHMG1S/T91E的引物)
(引物43(正向)：SEQ ID NO:55)
5’-aatacgcctcttcacgtcgtcGAAatcacagaactcggcgccatt-3’
(引物44(反向)：SEQ ID NO:56)
5’-aatggcgccgagttctgtgatTTCgacgacgtgaagaggcgtatt-3’

[0100] <用于HMG1S第339位突变丝氨酸的引物>(用于pHMG1S/S339A的引物)
(引物45(正向)：SEQ ID NO:57)
5’-cgagtagatttgcaagactgcaaGCCgttaaatgcacaatcgc-3’
(引物46(反向)：SEQ ID NO:58)
5’-gcgattgtgcatttaacGGCttgcagtcttgcaaatctactcg-3’
(用于pHMG1S/S339D的引物)
(引物47(正向)：SEQ ID NO:59)
5’-cgagtagatttgcaagactgcaaGATgttaaatgcacaatcgc-3’
(引物48(反向)：SEQ ID NO:60)
5’-gcgattgtgcatttaacATCttgcagtcttgcaaatctactcg-3’
(用于pHMG1S/S339E的引物)
(引物49(正向)：SEQ ID NO:61)
5’-cgagtagatttgcaagactgcaaGAAgttaaatgcacaatcgc-3’
(引物50(反向)：SEQ ID NO:62)
5’-gcgattgtgcatttaacTTCttgcagtcttgcaaatctactcg-3’

[0101] <用于HMG1S的第287位突变丝氨酸的引物>(用于pHMG1S/S287A的引物)
(引物57(正向)：SEQ ID NO:93)
5’-cttgtcaggtggggccaccGCCgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物58(反向)：SEQ ID NO:94)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacGGCggtggccccacctgacaag-3’
(用于pHMG1S/S287D的引物)
(引物59(正向)：SEQ ID NO:95)
5’-gctatgtttatctctggtggcgccaccGATaccgttcttaagga-3’
(引物60(反向)：SEQ ID NO:96)
5’-tccttaagaacggtATCggtggcgccaccagagataaacatagc-3’
(用于pHMG1S/S287E的引物)
(引物61(正向)：SEQ ID NO:97)
5’-cttgtcaggtggggccaccGAAgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物62(反向)：SEQ ID NO:98)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacTTCggtggccccacctgacaag-3’

[0102] <用于HMG1S的第574位突变酪氨酸的引物>(用于pHMG1S/Y574A的引物)
(引物113(正向)：SEQ ID NO:150)
5’-gtcaagagtcacatgaagGCCaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物114(反向)：SEQ ID NO:151)
5’-agacatatctttgctggatctgttGGCcttcatgtgactcttgac-3’
(用于pHMG1S/Y574F的引物)
(引物63(正向)：SEQ ID NO:99)
5’-gtcaagagtcacatgaagTTCaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物64(反向)：SEQ ID NO:100)
5’-agacatatctttgctggatctgttGAActtcatgtgactcttgac-3’
(用于pHMG1S/Y574D的引物)
(引物65(正向)：SEQ ID NO:101)
5’-gtcaagagtcacatgaagGACaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物66(反向)：SEQ ID NO:102)
5’-agacatatctttgctggatctgttGTCcttcatgtgactcttgac-3’
(用于pHMG1S/Y574E的引物)
(引物67(正向)：SEQ ID NO:103)
5’-gtcaagagtcacatgaagGAAaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物68(反向)：SEQ ID NO:104)
5’-agacatatctttgctggatctgttTTCcttcatgtgactcttgac-3’

[0103] <用于HMG1S的第577位突变丝氨酸的引物>(用于pHMG1S/S577A的引物)
(引物51(正向)：SEQ ID NO:63)
5’-caatagaGCCagccgagacatctctggagcaacg-3’
(引物52(反向)：SEQ ID NO:64)
5’-cggctGGCtctattgtatttcatgtgacttctcac-3’
(用于pHMG1S/S577D的引物)
(引物53(正向)：SEQ ID NO:65)
5’-gtcacatgaaatacaatagaGACagccgagacatctctggagc-3’
(引物54(反向)：SEQ ID NO:66)
5’-gctccagagatgtctcggctGTCtctattgtatttcatgtgac-3’
(用于pHMG1S/S577E的引物)
(引物55(正向)：SEQ ID NO:67)
5’-gtcacatgaaatacaatagaGAAagccgagacatctctggagc-3’
(引物56(反向)：SEQ ID NO:68)
5’-gctccagagatgtctcggctTTCtctattgtatttcatgtgac-3’

[0104] (制备表达突变的HMGR的转化体)使用上述得到的各突变的HMG1S表达载体，通过热休克方法转化大肠杆菌，以获得表达各突变的HMG1S的转化体。BL21star(DE3)用作大肠杆菌。

[0105] (突变的HMGR的表达)上述得到的表达各突变的HMG1S的各大肠杆菌转化体在2ml LB液体培养基中在37℃下过夜培养，培养之后的细菌培养物被转移至50ml LB液体培养基中，然后在37℃下摇床培养
2小时，随后添加IPTG至终浓度为0.5mM，并在20℃下培养细胞6小时。向全部LB液体培养基中添加氨苄青霉素至浓度为50μg/ml。在完成所有培养步骤之后，将全部量的各细菌培养物在4℃下以5000g离心5分钟以收集细胞，然后在–20℃下保存颗粒。

[0106] (收集和纯化突变的HMGR)将以上得到的各细菌细胞样品溶解到添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽、10mM DTT以及0.1％溶解酵素的结合缓冲液(40mM磷酸钠(pH8.0)、1mM EDTA、300mM氯化钠、0.1％TritonX-100、10％甘油、0.8mM咪唑)中。该细菌细胞在冰上冷却时通过Sonifier 450超声波仪(Branson)被破碎(破碎条件：工作周期(duty cycle)为50％，输出控制(output control)为2.5，1分钟×3)。然后在4℃下以15,000rpm离心15分钟，并将事先用结合缓冲液冲洗三次的100μl Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)添加到上清液中。将混合物在4℃下旋转摇动1小时，然后在4℃和8000rpm下离心5分钟。然后将树脂转移至空柱子上(Bio-Rad)，并使用冲洗缓冲液(20mM咪唑、其它成分与结合缓冲液类似)冲洗三次。将添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽和10mM DTT的15μl洗脱液(430mM咪唑，其它成分与结合缓冲液类似)添加到树脂上，然后将其在4℃以15,000rpm离心1分钟进行洗脱。将另外的20μl洗脱液添加到树脂，然后通过在4℃以15,000rpm离心1分钟来洗脱。得到总共35μl组氨酸标签纯化的突变的HMG1S蛋白质溶液。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认得到的各蛋白质的数量和纯度。针对定量，对BSA标准溶液(100ng、300ng、1μg)同时进行电泳，进行CBB染色之后使用Gel Doc XR+和Image Lab，从凝胶中检测并确定带的强度。

[0107] (确定突变的HMGR的酶活性)将1.65ng纯化之后得到的各HMG1S突变体添加到反应溶液(1mM NADPH、0.4mg/ml BSA、
40mM磷酸钠(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM氯化钠、1％TritonX-100、10％甘油、4mM DTT)中，并
14
在37℃下预温育5分钟，随后添加20μM  C标记的HMG-CoA(Perkin Elmer)(反应溶液终体积为26μl)，以及混合物在37℃反应15分钟。添加5μl的1mg/ml的甲羟戊酸内酯和5μl 6N盐酸，然后将混合物在室温下停留15分钟，然后通过添加125μl饱和的pH6.0的磷酸钾缓冲液来中和混合物。添加300μl乙酸乙酯，并剧烈混合，然后将混合物在20℃下以15,000rpm离心5分钟。在液体闪烁计数仪中，分析上清液中的乙酸乙酯层的放射性。各突变的HMG1S的酶活性结果如表2所示。酶活性表示为比活性，其中野生型HMG1S设置为等于1。

[0108] [表1]

[0109] 在表1中，括号中的数字代表与用作标准的拟南芥HMGR(S型)的各保守区域的序列相似度的百分比(％)。“-”是指不存在相应的保守区域或特定氨基酸残基。

[0110] 根据表1，可以发现在带有保守区域的其它类型HMGR中，存在对应前述氨基酸残基的氨基酸残基，其中所述保守区域相当于含有如SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR(HMG1S)的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基的保守区域。

[0111]

[0112] 在表2中，“-”意味着酶活性被消除，而分数为1或以上是指酶活性高于野生型。

[0113] 根据表2的结果，首先表明当选自由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代时，酶活性被降低或消除。

[0114] 同时它也表明，当选自由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被丙氨酸或苯丙氨酸取代时，与野生型相比，其酶活性降低但是也相对维持稳定。这表明其可以阻止体内磷酸化，并因此防止因那些位点的磷酸化而导致的酶活性抑制，因此可以维持稳定的酶活性。

[0115] 接下来，当选自由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位和339位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代时，酶活性增加。

[0116] 也表明，当丙氨酸取代SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位和/或339位氨基酸残基时，其酶活性与野生型HMGR相比增加，但是低于那些假磷酸化的突变体。这是显然的，因为在野生型中，这些氨基酸残基根据需要在体内被磷酸化，因此其酶活性被认为因为磷酸化而增加，在具有丙氨酸取代的能够抑制磷酸化的突变体中，酶活性被维持或被抑制。

[0117] 然而，结果表明，当丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第48位氨基酸残基时，酶活性与野生型没有区别，因此HMGR酶活性是不可控的。

[0118] 这些结果表明，HMGR酶活性可以通过使选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470、509和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸被缺失、或被其它氨基酸残基取代来控制。

[0119] 表1和2的结果也可以证明，HMGR酶活性可以通过使选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代来控制。

[0120] 这是显然的，在表达突变的蛋白质的转化体中甲羟戊酸产量以及类异戊二烯产量和类萜产量也是可控的，其中选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失或被其它氨基酸残基取代。

[0121] (构建HbHMGR表达载体)SEQ ID NO：105的序列，其为SEQ ID NO：10所示的来自橡胶树的HMG1的DNA序列(以下称之为HbHMG1)，使用下述引物通过PCR进行扩增。将得到的PCR产物使用大肠杆菌通过热休克方法克隆至pENTR/D-TOPO以得到称为pENTR/HbHMG1的入门载体。使用DH5α大肠杆菌，通过pENTR Directional TOPO克隆试剂盒制备入门载体。
(引物69：SEQ ID NO:106)
5'-CACCATGGACACCACCGGCCGGCTCCACCAC-3'
(引物70：SEQ ID NO:107)
5'-CGCCTCGAGTCAAGATGCAGCTTTAGACAT-3'

[0122] (制备表达载体(重组载体))使用pENTR/HbHMG1，将靶蛋白的部分基因序列进行重组并转染至pET160-DEST中以得到表达载体pDEST-HbHMG1。Gateway系统(Invitrogen)的LR反应用于重组反应。

[0123] (制备突变的HbHMGR表达载体)使用pDEST/HbHMG1作为模板通过PrimeSTAR HS(Takara)执行PCR反应。每份((25μl)PCR反应溶液样品的组成为1-5ng质粒、0.75μl如下所示的用于各突变的正向或反向引物、5μl用于primestar(Mg2+)的5×缓冲液、2μl dNTPmix、0.25μl primestar HS、以及15.75μl milliQ水。使用下述预定反应循环执行PCR：步骤1：在98℃下2分钟，步骤2：98℃下10秒钟，步骤3：60℃下15秒，步骤4：68℃下8分钟，步骤2至4重复17分钟。将一部分PCR产物(7μl)进行电泳，并且当观察到扩增时，向PCR残留产物中添加0.2μl DpnI，并在37℃下反应3小时。
将2μl反应溶液添加到20μl自制的大肠杆菌(DH5α)化学感受态细胞中，然后通过热休克方法转化细胞。将全部细菌培养物接种至包含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，并在37℃下过夜培养。在培养之后，通过克隆PCR筛选得到的克隆。通过Plasmid迷你试剂盒(Qiagen)执行质粒提取，并通过测序确认突变的插入以获得期望的突变的HbHMG1表达载体。通过该方法制备了总共21种突变的HbHMG1表达载体。包括作为阳性对照的丝氨酸-566位(相当于拟南芥的HMG1S的577位丝氨酸)突变的HbHMG1。使用ABI3130XI测序仪通过BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.0Ready Reaction Kit(美国应用生物系统公司)进行序列确认。

[0124] 制备各突变的HbHMG1中使用的引物如下所示。

[0125] <用于HbHMG1的第214位突变酪氨酸的引物>(用于pHbHMG1/Y214F的引物)
(引物71(正向)：SEQ ID NO:108)
5’-gtagaagggttcgatTTCgagtcgattttaggac-3’
(引物72(反向)：SEQ ID NO:109)
5’-gtcctaaaatcgactcGAAatcgaacccttctac-3’
(用于pHbHMG1/Y214E的引物)
(引物73(正向)：SEQ ID NO:110)
5’-gtagaagggttcgatGAAgagtcgattttaggaca-3’
(引物74(反向)：SEQ ID NO:111)
5’-tgtcctaaaatcgactcTTCatcgaacccttctac-3’

[0126] <用于HbHMG1的第246位突变酪氨酸的引物>(用于pHbHMG1/Y246F的引物)
(引物75(正向)：SEQ ID NO:112)
5’-gctgaacgggcgggagTTCtctgttccaatggc-3’
(引物76(反向)：SEQ ID NO:113)
5’-gccattggaacagaGAActcccgcccgttcagc-3’
(用于pHbHMG1/Y246E的引物)
(引物77(正向)：SEQ ID NO:114)
5’-gctgaacgggcgggagGAAtctgttccaatggc-3’
(引物78(反向)：SEQ ID NO:115)
5’-gccattggaacagaTTCctcccgcccgttcagc-3’

[0127] <用于HbHMG1的第400位突变丝氨酸的引物>(用于pHbHMG1/S400A的引物)
(引物79(正向)：SEQ ID NO:116)
5’-gaaggacgtggcaaaGCCgttgtttgtgag-3’
(引物80(反向)：SEQ ID NO:117)
5’-ctcacaaacaacGGCtttgccacgtccttc-3’
(用于pHbHMG1/S400D的引物)
(引物81(正向)：SEQ ID NO:118)
5’-tgaaggacgtggcaaaGACgttgtttgtgaggcaattatcaag-3’
(引物82(反向)：SEQ ID NO:119)
5’-cttgataattgcctcacaaacaacGTCtttgccacgtccttca-3’
(用于pHbHMG1/S400E的引物)
(引物83(正向)：SEQ ID NO:120)
5’-tgaaggacgtggcaaaGAAgttgtttgtgaggcaattatcaag-3’
(引物84(反向)：SEQ ID NO:121)
5’-cttgataattgcctcacaaacaacTTCtttgccacgtccttca-3’

[0128] <用于HbHMG1的第459位突变苏氨酸的引物>(用于pHbHMG1/T459C的引物)
(引物85(正向)：SEQ ID NO:122)
5’-ctgcaatctttattgccTGTggccaggatccagc-3’
(引物86(反向)：SEQ ID NO:123)
5’-gctggatcctggccACAggcaataaagattgcag-3’
(用于pHbHMG1/T459D的引物)
(引物87(正向)：SEQ ID NO:124)
5’-tcgtatctgcaatctttattgccGATggccaggatccagcacaga-3’
(引物88(反向)：SEQ ID NO:125)
5’-tctgtgctggatcctggccATCggcaataaagattgcagatacga-3’
(用于pHbHMG1/T459E的引物)
(引物89(正向)：SEQ ID NO:126)
5’-tcgtatctgcaatctttattgccGAAggccaggatccagcacaga-3’
(引物90(反向)：SEQ ID NO:127)
5’-tctgtgctggatcctggccTTCggcaataaagattgcagatacga-3’

[0129] <用于HbHMG1的第498位突变苏氨酸的引物>(用于pHbHMG1/T498C的引物)
(引物91(正向)：SEQ ID NO:128)
5’-ctccattgaggtgggtTGTgtcggaggtggaactc-3’
(引物92(反向)：SEQ ID NO:129)
5’-gagttccacctccgacACAacccacctcaatggag-3’
(用于pHbHMG1/T498D的引物)
(引物93(正向)：SEQ ID NO:130)
5’-accatgccctccattgaggtgggtGACgtcggaggtggaactcaac-3’
(引物94(反向)：SEQ ID NO:131)
5’-gttgagttccacctccgacGTCacccacctcaatggagggcatggt-3’
(用于pHbHMG1/T498E的引物)
(引物95(正向)：SEQ ID NO:132)
5’-accatgccctccattgaggtgggtGAAgtcggaggtggaactcaac-3’
(引物96(反向)：SEQ ID NO:133)
5’-gttgagttccacctccgacTTCacccacctcaatggagggcatggt-3’

[0130] <用于HbHMG1的第566位突变丝氨酸的引物>(用于pHbHMG1/S566A的引物)
(引物97(正向)：SEQ ID NO:134)
5’-gtcacatgaagtacaacagaGCCagcaaagatatgtctaaagct-3’
(引物98(反向)：SEQ ID NO:135)
5’-agctttagacatatctttgctGGCtctgttgtacttcatgtgact-3’
(用于pHbHMG1/S566D的引物)
(引物99(正向)：SEQ ID NO:136)
5’-gtcacatgaagtacaacagaGACagcaaagatatgtctaaagct-3’
(引物100(反向)：SEQ ID NO:137)
5’-agctttagacatatctttgctGTCtctgttgtacttcatgtgact-3’

[0131] <用于HbHMG1的第276位突变丝氨酸的引物>(用于pHbHMG1/S276A的引物)
(引物101(正向)：SEQ ID NO:138)
5’-cttgtcaggtggggccaccGCCgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物102(反向)：SEQ ID NO:139)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacGGCggtggccccacctgacaag-3’
(用于pHbHMG1/S276D的引物)
(引物103(正向)：SEQ ID NO:140)
5’-caggtggggccaccGACgtcttgttgaagg-3’
(引物104(反向)：SEQ ID NO:141)
5’-ccttcaacaagacGTCggtggccccacctg-3’
(用于pHbHMG1/S276E的引物)
(引物105(正向)：SEQ ID NO:142)
5’-cttgtcaggtggggccaccGAAgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物106(反向)：SEQ ID NO:143)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacTTCggtggccccacctgacaag-3’

[0132] <用于HbHMG1的第563位突变酪氨酸的引物>(用于pHbHMG1/Y563F的引物)
(引物107(正向)：SEQ ID NO:144)
5’-gtcaagagtcacatgaagTTCaacagatccagc-3’
(引物108(反向)：SEQ ID NO:145)
5’-gctggatctgttGAActtcatgtgactcttgac-3’
(用于pHbHMG1/Y563D的引物)
(引物109(正向)：SEQ ID NO:146)
5’-gtcaagagtcacatgaagGACaacagatccagc-3’
(引物110(反向)：SEQ ID NO:147)
5’-gctggatctgttGTCcttcatgtgactcttgac-3’
(用于pHbHMG1/Y563E的引物)
(引物111(正向)：SEQ ID NO:148)
5’-gtcaagagtcacatgaagGAAaacagatccagc-3’
(引物112(反向)：SEQ ID NO:149)
5’-gctggatctgttTTCcttcatgtgactcttgac-3’

[0133] (制备表达突变的HbHMGR的转化体)使用上述得到的各突变的HbHMG1表达载体，通过热休克方法转化大肠杆菌，以获得表达各突变的HbHMG1的转化体。BL21Star(DE3)用作大肠杆菌。

[0134] (突变的HbHMGR的表达)上述得到的表达各突变的HbHMG1的各大肠杆菌转化体在2ml LB液体培养基中在37℃下过夜培养，培养之后的细菌培养物被转移至50ml LB液体培养基中，然后在37℃下摇床培养2小时，随后添加IPTG至终浓度为0.5mM，并在20℃下培养细胞6小时。向全部LB液体培养基中添加氨苄青霉素至浓度为50μg/ml。在完成所有培养步骤之后，将全部量的各细菌培养物在4℃下以5000g离心5分钟以收集细胞，然后在–20℃下保存颗粒。

[0135] (收集和纯化突变的HbHMGR)将以上得到的各细菌细胞样品溶解到添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽、10mM DTT以及0.1％溶解酵素的结合缓冲液(40mM磷酸钠(pH8.0)、1mM EDTA、300mM氯化钠、0.1％TritonX-100、10％甘油、0.8mM咪唑)中。该细菌细胞在冰上冷却时通过Sonifier450超声波仪(Branson)被破碎(破碎条件：工作周期(duty cycle)为50％，输出控制(output control)为2.5，1分钟×3)。然后在4℃下以15,000rpm离心15分钟，并将事先用结合缓冲液冲洗三次的100μl Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)添加到上清液中。将混合物在4℃下旋转摇动1小时，然后在4℃和8000rpm下离心5分钟。然后将树脂转移至空柱子上(Bio-Rad)，并使用冲洗缓冲液(20mM咪唑、其它成分与结合缓冲液类似)冲洗三次。将添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽和10mM DTT的15μl洗脱液(430mM咪唑，其它成分与结合缓冲液类似)添加到树脂上，然后将其在4℃以15,000rpm离心1分钟进行洗脱。将另外的20μl洗脱液添加到树脂，然后通过在4℃以15,000rpm离心1分钟来洗脱。得到总共35μl组氨酸标签纯化的突变的HMG1S蛋白质溶液。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认得到的各蛋白质的数量和纯度。针对定量，对BSA标准溶液(100ng、300ng、1μg)同时进行电泳，进行CBB染色之后使用Gel Doc XR+和Image Lab从凝胶中检测并确定带的强度。

[0136] (确定突变的HbHMGR的酶活性)将1.65ng纯化之后得到的各HbHMG1突变体添加到反应溶液(1mM NADPH、0.4mg/ml BSA、40mM磷酸钠(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM氯化钠、1％TritonX-100、10％甘油、4mMDTT)中，
14
并在37℃下预温育5分钟，随后添加20μM  C标记的HMG-CoA(Perkin Elmer)(反应溶液终体积为26μl)，以及混合物在37℃反应15分钟。添加5μl的1mg/ml的甲羟戊酸内酯和5μl 6N盐酸，然后将混合物在室温下停留15分钟，然后通过添加125μl饱和的pH6.0的磷酸钾缓冲液来中和混合物。添加300μl乙酸乙酯，并剧烈混合，然后将混合物在20℃下以15,000rpm离心
5分钟。在液体闪烁计数仪中，分析上清液中的乙酸乙酯层的放射性。各突变的HbHMG1的酶活性结果如表3所示。酶活性表示为比活性，并且野生型HMG1S的酶活性设为等于1。

[0137]

[0138] 在表3中，“-”意味着酶活性被消除，而分数为1或以上是指酶活性高于野生型。

[0139] 根据表3的结果，首先表明当选自由SEQ ID NO：10所示的橡胶树HMG1的第214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代时，酶活性被降低或消除。

[0140] 同时它也表明，当选自SEQ ID NO：10所示的橡胶树HMG1的第214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位氨基酸残基的至少一种氨基酸残基被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代时，其酶活性与野生型相当或者低于野生型但是也相对维持稳定。这表明其可以阻止体内磷酸化，并因此防止因那些位点的磷酸化而导致的酶活性抑制，因此可以维持稳定的酶活性。
序列表部分的自由文字

[0141] SEQ ID NO:1：源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HMGR(S型)的氨基酸序列SEQ ID NO:2：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第48位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列SEQ ID NO:3：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第91位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:4：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第225位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:5：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第257位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:6：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第339位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:7：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第411位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:8：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第470位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:9：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第509位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:10：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG1的氨基酸序列
SEQ ID NO:11：源自橡胶草(Taraxacum koksaghyz)的HMGR的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：编码源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HMGR(S型)的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:13：引物1
SEQ ID NO:14：引物2
SEQ ID NO:15：引物3
SEQ ID NO:16：引物4
SEQ ID NO:17：引物5
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SEQ ID NO:68：引物56
SEQ ID NO:69：源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:70：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:71：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG3的氨基酸序列
SEQ ID NO:72：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG4的氨基酸序列
SEQ ID NO:73：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG5的氨基酸序列
SEQ ID NO:74：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC18019)的氨基酸序列SEQ ID NO:75：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC23858)的氨基酸序列SEQ ID NO:76：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC19509)的氨基酸序列SEQ ID NO:77：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC22046)的氨基酸序列SEQ ID NO:78：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC22228)的氨基酸序列SEQ ID NO:79：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC23348)的氨基酸序列SEQ ID NO:80：源自木薯(Manihot esculenta)的HMGR(003982m)的氨基酸序列SEQ ID NO:81：源自木薯(Manihot esculenta)的HMGR(004209m)的氨基酸序列SEQ ID NO:82：源自杜仲(Eucommia ulmondes)的HMGR的氨基酸序列
SEQ ID NO:83：源自泽漆(Euphorbia helioscopia L.)的HMGR的氨基酸序列
SEQ ID NO:84：源自水稻(Oryza sativa)的HMG1的氨基酸序列
SEQ ID NO:85：源自马铃薯(Solanum tuberosum L.)的HMG1的氨基酸序列
SEQ ID NO:86：源自马铃薯(Solanum tuberosum L.)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:87：源自马铃薯(Solanum tuberosum L.)的HMG3的氨基酸序列
SEQ ID NO:88：源自番茄(Solanum lycopersicum)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:89：源自南苜蓿(Medicago polymorpha)的HMG4的氨基酸序列
SEQ ID NO:90：源自南苜蓿(Medicago polymorpha)的HMG5的氨基酸序列
SEQ ID NO:91：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的第287位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:92：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的第574位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:93：引物57
SEQ ID NO:94：引物58
SEQ ID NO:95：引物59
SEQ ID NO:96：引物60
SEQ ID NO:97：引物61
SEQ ID NO:98：引物62
SEQ ID NO:99：引物63
SEQ ID NO:100：引物64
SEQ ID NO:101：引物65
SEQ ID NO:102：引物66
SEQ ID NO:103：引物67
SEQ ID NO:104：引物68
SEQ ID NO:105：编码源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG1的基因的核苷酸序列SEQ ID NO:106：引物69
SEQ ID NO:107：引物70
SEQ ID NO:108：引物71
SEQ ID NO:109：引物72
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SEQ ID NO:112：引物75
SEQ ID NO:113：引物76
SEQ ID NO:114：引物77
SEQ ID NO:115：引物78
SEQ ID NO:116：引物79
SEQ ID NO:117：引物80
SEQ ID NO:118：引物81
SEQ ID NO:119：引物82
SEQ ID NO:120：引物83
SEQ ID NO:121：引物84
SEQ ID NO:122：引物85
SEQ ID NO:123：引物86
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SEQ ID NO:125：引物88
SEQ ID NO:126：引物89
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SEQ ID NO:132：引物95
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SEQ ID NO:134：引物97
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SEQ ID NO:140：引物103
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SEQ ID NO:147：引物110
SEQ ID NO:148：引物111
SEQ ID NO:149：引物112
SEQ ID NO:150：引物113
SEQ ID NO:151：引物114